CN111979349A - 控制莲花色性状的主效qtl、snp分子标记及其检测引物和应用 - Google Patents

控制莲花色性状的主效qtl、snp分子标记及其检测引物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了控制莲花色性状的主效QTL、SNP分子标记及其检测引物和应用。本发明首先提供了控制莲的花色性状的主效QTL位点，其定位在第6连锁群，在两个SNP标记之间；该主效QTL与SNP分子标记紧密连锁，对莲的花色性状的贡献率较高，参与调控莲的红花或白花表型，可用于图位克隆挖掘控制花色性状的功能基因和分子标记辅助选择。本发明还提供了与主效QTL紧密连锁的SNP分子标记，用于高效选择目标花色的莲品种以及子莲和藕莲的分子标记辅助育种。本发明更进一步提供了检测所述的SNP标记的PARMS引物组以及鉴定莲的红花和白花性状的方法，实现了只通过PCR扩增，不经电泳检测，即可分析获得莲的花色基因型数据。

Description

控制莲花色性状的主效QTL、SNP分子标记及其检测引物和 应用
技术领域
本发明涉及SNP分子标记以及检测引物，尤其涉及控制莲红花和白花性状的主效QTL、SNP分子标记、检测引物及其在分子辅助育种中的应用，属于莲分子辅助育种领域。
背景技术
莲(Nelumbo nucifera)作为莲科莲属的园林水生植物，经过长期的栽培驯化可分为子莲、藕莲、花莲三种类型。子莲以生产莲子为主，开花繁茂，多红花，但地下茎形态细长；藕莲以采收地下根状茎为主，开花较少且均为白色。相对而言，花莲的花型花色最为丰富，具有较高的观赏价值，但有些品种的结实率低。莲是中国十大传统名花之一，花色是其重要的特征，具有维持花组织能量平衡、吸引和指示传粉者促进植物繁殖、保护花器官内部结构等功能。花色的观赏性也决定着消费者的吸引力。近年来，培育“赏食两用”的莲品种是莲遗传育种的重要方向，对莲产业的转型升级具有关键意义。目前关于控制莲的花色性状的QTL鲜有报道，还没有与莲花色性状紧密连锁的分子标记被开发并利用于育种工作中。而依靠传统育种技术培育优良品种,工作量大、周期长、效率不高。
随着分子生物学的深入发展，植物全基因组测序的陆续完成，分子标记的开发和生物信息学取得突破，大大缩短了育种年限，为揭示相关性状的遗传机理和分子机制奠定基础。简化基因组测序(Specific Length Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq)技术是以生物信息学为基础的高度自动化高通量测序技术，可重复性高，测序时间短，信息量大，可利用多态性SNP标记多，在遗传图谱构建和分子标记开发中已有广泛运用。与SSR、ALFP等相比，基于SNP的分子标记技术具有快速、高效、自动化批量检测等优越性，更易于进行基因分型。
利用常规杂交育种技术，选择具有相对性状的品种作为亲本，杂交后获得F1，在用F1连续自交，直到获得稳定遗传的纯合品种。此外，花色表型需要在开花之后进行田间观察确定。周期长，流程重复繁琐，占用大量栽培空间，效率低，人工成本高。
如果获得控制莲红花和白花性状的主效QTL位点，进而在定位区段内设计引物开发出特异性强、准确率高的共显性荧光分子标记，能够为子莲和藕莲分子标记辅助育种提供可行性方法，从而克服常规育种周期长，工作量大等缺点，在苗期即可筛选目标花色的植株，简化选择方法和提高育种效率，加快莲育种的进程。
发明内容
本发明的目的之一是提供控制莲的花色性状的主效QTL位点；
本发明的目的之二是与主效QTL紧密连锁的SNP分子标记；
本发明的目的之三是提供所述的SNP分子标记的检测引物对；
本发明的目的之四将所述的SNP分子标记或检测引物对应用于鉴定莲的红花和白花性状或子莲和藕莲分子标记辅助育种。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供了控制莲的花色性状的主效QTL位点，其定位在第6连锁群，在两个SNP标记Marker153799和Marker54993之间，区间从63.446cM到63.732cM。
本发明所提供的控制莲花色性状的主效QTL位点，其与SNP分子标记紧密连锁，对莲的花色性状的贡献率较高，参与调控莲的红花或白花表型，可用于图位克隆挖掘控制花色性状的功能基因和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。
本发明还提供了主效QTL紧密连锁的三个SNP分子标记，其中第一SNP分子标记，命名为Marker54975，等位变异碱基为G/A；第二SNP分子标记，命名为Marker153798，等位变异碱基为G/A；第三SNP分子标记，命名为Marker153787，等位变异碱基为G/A。
本发明提供的莲花色的主效QTL位点的SNP分子标记可以高效选择目标花色的莲品种，还可以用于子莲和藕莲的分子标记辅助育种，加速莲的育种的进程。
本发明进一步提供了检测所述的SNP标记的PARMS引物组，包括正向引物1、正向引物2和反向引物，核苷酸序列为5’-3’；其中，用于检测第一SNP分子标记的引物组由SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的三条引物组成；用于检测第二SNP分子标记的引物组由SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的三条引物组成；用于检测第三SNP分子标记的引物组由SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的三条引物组成。
此外，检测所述的SNP标记的PARMS引物组还有两条通用引物，这两条通用引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；其中，在SEQ ID No.10所示核苷酸序列的5’端连接FAM荧光集团，在SEQ ID No.11所示核苷酸序列的5’端连接HEX荧光集团。
本发明进一步提供了一种鉴定莲的红花和白花性状的PCR检测试剂盒，包括：PARMS检测引物组，PARMSmastermix以及ddH2O。
本发明更进一步提供了一种应用所述PARMS检测引物组鉴定莲的红花和白花性状的方法，包括
(1)提取待检测莲的基因组DNA；
(2)将PARMS检测引物组(包括两条通用引物)同时加入到PCR反应体系中进行扩增获得PCR产物；
其中，PCR的反应程序为：94℃，3min；然后10个循环94℃、20sec，65℃(在此设置每个循环退火温度降低0.8℃，10个循环运行完毕，此时退火温度为57℃)、1min；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min。
(3)将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值结合标记信息，进行基因分型，获得基因型结果；
(4)根据荧光信号值进行分析，如果扫描获得HEX荧光信号，则表现为白花性状；如果扫描获得FAM荧光信号，则表现为红花性状；如果扫描结果为同时有HEX和FAM信号，该位点为杂合基因型，莲的花色介于红和白之间。
本发明整体技术方案的详述
本发明以藕莲“巨无霸”为父本，子莲“满天星”为母本，构建了F2遗传群体；其中，父本为白花，母本为红花；对父母本、F1及每个F2单株的花瓣颜色进行田间鉴定并统计；采用CTAB法提取基因组DNA将DNA样品用于SLAF-seq测序并构建SLAF文库。
本发明以连锁群为单位，采用HighMap软件分析获得连锁群内Marker的线性排列，并估算相邻Marker间的遗传距离，最终得到莲高密度遗传连锁图谱，共构建了8个连锁群，6376个标记紧密连锁，总图距为1,046.82cM，平均标记间图距0.16cM，最短连锁群58.13cM，最长186.26cM。
本发明利用QTL-IciMapping4.1软件，采用加性-完备复合区间作图法(ICIM-ADD)对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算，在8条连锁群进行QTL检测，设定的LOD值为2.5或2.0。最终将花色性状的QTL定位在第6连锁群，定位在两个SNP标记Marker153799和Marker54993之间，区间从63.446cM到63.732cM
基于上述定位区间的标记序列，根据SNP的突变特点，设计竞争性等位基因特异性PCR引物对，包括正向引物1、正向引物2和反向引物。两条正向引物末端为等位变异碱基均为G/A。正向引物的5’端连接有荧光标签序列，其中正向引物1的5’端连接为FAM序列5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，正向引物2的5'端连接为HEX序列5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
利用本发明所设计的特异性PARMS引物组实现只通过PCR扩增，不经电泳检测，即可分析获得莲的花色基因型数据；实验操作简便、快速，成本低，结果准确，安全无毒。
本发明涉及缩略语和关键术语定义
QTL：数量性状基因座；
SNP：单核苷酸多态性；
SSR：简单重复序列；
ALFP：扩增片段长度多态性；
PARMS:五引物扩增受阻技术体系；
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵。
附图说明
图1莲高密度遗传连锁图谱。
图2莲花色性状的QTL定位。
图3应用PARMS检测引物组进行PCR扩增的产物SNPdecoder工具的扫描结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1利用SLAF-seq方法确定控制莲的红花和白花性状的主效QTL候选区域及连锁标记的开发
1.构建莲的花色性状分离群体
在本实施例中，以藕莲“巨无霸”为父本，子莲“满天星”为母本，构建了F2遗传群体。其中父本为白花，母本为红花。
2.莲的花色表型田间鉴定
对父母本、F1及每个F2单株的花瓣颜色进行田间鉴定并统计。
3.基因组DNA的提取以及SLAF文库的构建
对F2遗传分离群体中2个亲本和175个子代的每份样品播种一粒莲子，萌发后取幼叶，采用CTAB法提取基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测DNA质量与浓度；将DNA样品送至百迈克生物技术有限公司，用于SLAF-seq测序。
SLAF文库的构建流程如下：
(1)首先对莲参考基因组进行电子酶切，筛选双酶切方案，最终选用的酶为RsaI+HaeIII酶；
(2)利用酶切方案对样本DNA酶切、建库；采用Illumina平台Hiseq2500进行双端测序，测序长度为PE150；
(3)初过滤后，利用SLAF技术进行SLAF标记开发。采用GATK和samtools挖掘和筛选高质量的纯合SNP位点(具体流程参考GATK官方网站)。
4.莲高密度遗传连锁图谱的构建
以连锁群为单位，采用HighMap软件分析获得连锁群内Marker的线性排列，并估算相邻Marker间的遗传距离，最终得到莲高密度遗传连锁图谱(图1)，共构建了8个连锁群，6376个标记紧密连锁，总图距为1,046.82cM，平均标记间图距0.16cM，最短连锁群58.13cM，最长186.26cM。
5.莲花色性状的QTL定位
利用QTL-IciMapping4.1软件，采用加性-完备复合区间作图法(ICIM-ADD)对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算，在8条连锁群进行QTL检测，设定的LOD值为2.5或2.0。最终将花色性状的QTL定位在第6连锁群(图2)，定位在两个SNP标记Marker153799和Marker54993之间，区间从63.446cM到63.732cM6花色性状QTL区间标记的开发
基于上述定位区间的标记序列，根据SNP的突变特点，设计竞争性等位基因特异性PCR引物对，包括正向引物1、正向引物2和反向引物。两条正向引物末端为等位变异碱基均为G/A。正向引物的5’端连接有荧光标签序列，其中正向引物1的5’端连接为FAM序列5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，正向引物2的5'端连接为HEX序列5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
引物序列如下：
975ColF_G:
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACCATACCGATTCCTTATCCTCAG(SEQ ID No.1)
975ColF_A:
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCATACCGATTCCTTATCCTCAA(SEQ ID No.2)
975ColR:GTACCTGAATGGACAGATGCAATG(SEQ ID No.3)
798ColF_G:
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTTATCCATGTTCTCCATTTTCCG(SEQ ID No.4)
798ColF_A:
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTTATCCATGTTCTCCATTTTCCA(SEQ ID No.5)
798ColR:CACAGGTGAACGTAGAACAACTTC(SEQ ID No.6)
787ColF_G:
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGAAGGGGTATTACTGTTATGACCTAG(SEQ ID No.7)
787ColF_A:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGAAGGGGTATTACTGTTATGACCTAA(SEQ IDNo.8)
787ColR：ACTCGAGAAGAAGGTGGATTCAAA(SEQ ID No.9)。
试验例1应用分子标记检测F2群体以及两个亲本的试验
1.试验方法
1.1提取莲基因组DNA
对F2群体中随即取出96株，取其幼叶，通过CTAB提取法获得莲植株的基因组DNA。
1.2PCR扩增
PCR反应体系为表1所示。
表1PCR反应体系
Figure BDA0002678363110000111
PCR反应程序为：94℃，3min；然后10个循环94℃，20sec，65℃(在此设置每个循环退火温度降低0.8℃，10个循环运行完毕，此时退火温度为57℃)，1min；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min；
1.3基因分型
将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNPdecoder工具(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)，自动进行基因分型，获得基因型结果。
2.试验结果
SNPdecoder工具的扫描结果如图3所示，其中聚合在X轴的样本为红花基因型；聚合在Y轴的样本为白花基因型；在中间的样本为杂合基因型。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉市农业科学院
<120> 控制莲花色性状的主效QTL、SNP分子标记及其检测引物和应用
<130> WH-2001-200606A
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc taccataccg attccttatc ctcag 45
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat taccataccg attccttatc ctcaa 45
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
gtacctgaat ggacagatgc aatg 24
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc ttgttatcca tgttctccat tttccg 46
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat ttgttatcca tgttctccat tttcca 46
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 6
cacaggtgaa cgtagaacaa cttc 24
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tcgaaggggt attactgtta tgacctag 48
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tcgaaggggt attactgtta tgacctaa 48
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
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actcgagaag aaggtggatt caaa 24
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<212> DNA
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gaaggtgacc aagttcatgc t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims (10)

1.控制莲的花色性状的主效QTL位点，其特征在于，所述主效QTL位点定位在第6连锁群，在两个SNP标记Marker153799和Marker54993之间。
2.按照权利要求1所述的主效QTL位点，其特征在于，其区间从63.446cM到63.732cM。
3.与权利要求1所述的主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记。
4.按照权利要求3所述的SNP分子标记，其特征在于，所述的SNP分子标记包括三个SNP分子标记，其中第一SNP分子标记，命名为Marker54975，等位变异碱基为G/A；第二SNP分子标记，命名为Marker153798，等位变异碱基为G/A；第三SNP分子标记，命名为Marker153787，等位变异碱基为G/A。
5.检测权利要求3或4所述的SNP标记的PARMS引物组，其特征在于，用于检测第一SNP分子标记的引物组由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的三条引物组成；用于检测第二SNP分子标记的引物组由SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的三条引物组成；用于检测第三SNP分子标记的引物组由SEQ ID No.7、SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示的三条引物组成。
6.按照权利要求5所述的PARMS引物组，其特征在于，还有两条通用引物，这两条通用引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；其中，在SEQ ID No.10所示核苷酸序列的5’端连接FAM荧光集团，在SEQ ID No.11所示核苷酸序列的5’端连接HEX荧光集团。
7.鉴定莲的红花和白花性状的PCR检测试剂盒，包括：PARMS检测引物组，PARMSmastermix以及ddH2O；其特征在于，所述的PARMS检测引物组是权利要求5所述的PARMS检测引物组。
8.一种鉴定莲的红花和白花性状的方法，其特征在于，包括
(1)提取待检测莲的基因组DNA；
(2)将权利要求5所述的PARMS检测引物组同时加入到PCR反应体系中进行扩增获得PCR产物；
(3)将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值结合标记信息，进行基因分型，获得基因型结果；
(4)根据荧光信号值进行分析，如果扫描获得HEX荧光信号，则表现为白花性状；如果扫描获得FAM荧光信号，则表现为红花性状；如果扫描结果为同时有HEX和FAM信号，该位点为杂合基因型，莲的花色介于红和白之间。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中PCR的反应程序为：94℃，3min；然后10个循环94℃、20sec，65℃、1min；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于，在65℃时，在此设置每个循环退火温度降低0.8℃，10个循环运行完毕，此时退火温度为57℃。
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