CN116574829B - 与水稻中胚轴伸长基因qML3相连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与水稻中胚轴伸长基因qML3相连锁的分子标记及其在水稻中胚轴伸长性状鉴定中的应用。本发明利用一套东乡野生稻和日本晴构建的染色体片段置换系，在水稻第3染色体上定位到与水稻中胚轴伸长相关的基因位点qML3，其中胚轴伸长的增效效应来源于东乡野生稻，与分子标记BS3‑7连锁，并基于分子标记BS3‑7提供了鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴伸长特性的方法，可用于适宜直播的长中胚轴水稻品种的分子选择育种。

Description

与水稻中胚轴伸长基因qML3相连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和生物技术领域，具体涉及与水稻中胚轴伸长基因qML3相连锁的分子标记及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa.L)是我国主要粮食作物之一，有一半以上的人口以稻米为主食，因此水稻生产的稳定与发展对我国粮食安全至关重要。近年来随着农村劳动力的减少和水稻生产成本的不断提高，水稻栽培方式逐渐从移栽栽培向直播栽培改变，直播稻面积增加速度较快。但直播稻栽培方式存在出苗率低、出苗速度慢等问题，限制了直播稻生产的稳产与高产。中胚轴伸长是水稻幼苗快速出苗的主要驱动力，也是水稻品种是否适合直播栽培的重要指标。因此，挖掘与中胚轴伸长相关基因对于培育直播稻品种具有重要意义。

现有研究发现，水稻中胚轴伸长特性是复杂的数量性状，涉及效应不同的多个基因，而且基因还与环境存在明显的互作效应，依靠传统的育种方法很难提高水稻中胚轴伸长长度、进而培育适宜直播的品种。随着分子生物学和功能基因组学的发展，使难以鉴定、易受环境影响的农艺性状采用分子辅助育种已成为可能，该技术可在早世代进行准确、稳定的选择，从而加速育种进程，提高育种效率，但该技术的基础是必须明确性状控制基因的优良等位变异或者与其紧密连锁的分子标记。

发明内容

针对上述研究背景，本发明目的在于提供一种快速鉴定水稻中胚轴伸长特性的方法。为了解决该问题，本发明利用一套东乡野生稻和日本晴构建的染色体片段置换系，在第3染色体上定位到与水稻中胚轴伸长相关的基因位点qML3，其中胚轴伸长的增效效应来源于东乡野生稻，与分子标记BS3-7连锁。利用分子标记BS3-7，可用于品种中胚轴伸长特性的鉴定和分子育种。

为了解决上述问题，本发明首先提供一种水稻中胚轴伸长基因qML3相连锁的分子标记，其位于水稻第3染色体的BS3-7在染色体位置为chr 3:28482071---20482167，对于长中胚轴品种而言，在位点是28482115处有CCTAC的5bp插入。更具体地，短中胚轴的该段核苷酸序列为97bp：GCTTCAAAGCACCAGATATAGCATCTTCCTGCTTCTCATCAACAGCCTACCACAGT AAGATTTGGGTTAATATGTCAATATAATGCCTCACAATTTG(SEQ ID NO：3)；而长中胚轴品种相应的该段核苷酸序列为102bp：GCTTCAAAGCACCAGATATAGCATCTTCCTGCTTCTCATCAACAGCCTACCCTA CCACAGTAAGATTTGGGTTAATATGTCAATATAATGCCTCACAATTTG(SEQ ID NO：4)。

本发明进而提供了鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴伸长特性的引物对。

本发明提供的引物对由引物A和引物B组成；

所述引物A为如下：GCTTCAAAGCACCAGATATAGCA(SEQ ID NO：1)所示的单链DNA分子；

所述引物B为如下：CAAATTGTGAGGCATTATATTGACA(SEQ ID NO：2)所示的单链DNA分子。

上述引物对中，所述引物A和所述引物B的摩尔浓度比为1:1。

为了解决上述问题，本发明又提供可上述引物对的新用途。

本发明提供了上述引物对在鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴伸长特性中的应用。

本发明提供了上述引物对在选育适宜直播的长中胚轴水稻品种的应用。

本发明提供了上述引物对在水稻育种中的应用。

为了解决上述问题，本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴伸长特性的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴伸长特性的方法包括如下过程：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；根据PCR产物大小鉴定待测水稻的中胚轴伸长特性：

若PCR产物大小为102bp，则待测水稻为或候选为长中胚轴的水稻品种；

若PCR产物大小为97bp，则待测水稻为或候选为短中胚轴的水稻品种。

为了解决上述问题，本发明还提供了一种选育适宜直播的长中胚轴水稻品种的方法。

本发明提供的选育适宜直播的长中胚轴水稻品种的方法包括如下过程：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；选择PCR产物大小为102bp的待测水稻材料进行育种。

本发明的优点是：本发明首次利用普通野生稻染色体片段置换系为研究材料，定位到与水稻中胚轴伸长相关的基因位点qML3，利用与该基因紧密连锁的分子标记BS3-7可以鉴定筛选长中胚轴水稻资源，为培育适宜直播的水稻品种提供亲本资源。本发明的分子标记可用于水稻苗期基因型鉴定和筛选，获得携带优异等位变异的植株，可以缩短育种周期。

附图说明

图1为CSL126/日本晴F2分离群体和亲本在BS3-7位点的电泳谱带图。P1和P2分别表示日本晴和CSL126；1-34表示F2分离群体中随机选择的34个单株；CSL126为携带东乡野生稻qML3等位基因的染色体片段置换系，表现为长中胚轴；日本晴表现为短中胚轴。

图2为分子标记BS3-7鉴定水稻品种中胚轴伸长特性的电泳谱带图。P1和P2分别表示日本晴和CSL126；1-10表示开展中胚轴伸长特性鉴定的10个水稻品种。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置3次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的水稻品种：CSL126、日本晴、新叶冠、中国31号、广津稻、曲阳小黄芒、谷米、加巴拉、小白芒、太选3号、五一水稻、黄毛稻子均来自国家作物种质库，公众可以从国家作物种质库申请并无偿获得。

实施例1、水稻中胚轴伸长基因qML3及其紧密连锁的分子标记的获得

一、水稻中胚轴伸长相关QTL的定位及中胚轴伸长基因qML3的获得

1、供试材料

将东乡野生稻与日本晴杂交，以日本晴为轮回亲本，通过回交结合分子标记筛选，构建一套染色体片段置换系，包括104个家系，已种植到BC5F8世代。

2、基因型鉴定

在海南三亚中国农业科学院作物科学研究所南繁基地种植供试材料，分蘖期取幼嫩叶片，按照Doyle和Dickson(1987)的十六烷基三乙基溴化铵法(CTAB)进行基因组DNA提取。利用均匀分布于12条染色体的203对引物鉴定染色体片段置换系基因型。

PCR扩增反应体系20μl，包括2μl DNA(20ng/μl)模板，2μl(2pmol，F+R)引物，2μl10×Buffer(Mg²⁺Free)，1.2μl MgCl₂(25mM)，0.1μl dNTP(2.5mM)，0.2μlrTaq(5U/μl，TaKaRa)和12.5μl ddH₂O；扩增反应在Professional Thermocycler(Biometra Inc.)扩增仪上进行，反应程序为：94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，34个循环；72℃延伸5min。PCR产物用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(200V恒定电压，1.5小时)。

3、中胚轴伸长鉴定

将待测种子置于45℃的烘箱中放置1周，以打破休眠。每个家系选择100粒饱满完整的种子放入50mL离心管中，用10％次氯酸钠灭菌；35℃烘箱浸种2天；每个家系选30粒催芽均匀的种子置于96孔发芽板中，将发芽板放入盛有2L纯水的塑料盆(55cm×40cm×10cm)中，在28℃电热恒温培养箱内黑暗培养7天；去除生长不良的幼苗后，用刻度尺测量每个幼苗中胚轴长度。每份材料中胚轴伸长鉴定试验重复3次。

4、QTL定位

采用QTL IciMapping软件进行QTL定位分析，采用逐步回归的加性QTL似然比检验(RSTEP-LRT-ADD)和单标记分析(SAM)；使用1000次测试的排列(permutation＝1000times)来确定LOD阈值显著的QTL(p<0.05)，并计算每个QTL[145]的全基因组I型错误。

QTL定位结果表明，位于第3染色体的qML3位点(连锁标记为BS3-7)在RSTEP-LRT-ADD和SMA两种分析方法下都能被检测到，LOD值分别为4.93和3.59，表型贡献率分别为15.53％和13.50％；加性效应来自于东乡野生稻。

5、qML3位点的验证与精细定位

为了验证和进一步精细定位该位点，针对包含野生稻qML3等位基因的家系CSL126与日本晴构建的F2群体，利用BSA分析，基于ED和G-Value两种方法进行分析，以定位候选区间。

取300个F_2:3群体单株的种子，利用上述中胚轴伸长的鉴定方法开展表型鉴定；将两地表型鉴定数据进行排序，从中选取了33个中胚轴极端长和33个极端短的单株，组成2个极端混池(M15L和M15S)进行BSA分析。

基于ED分析法，选取滑窗窗口大小为1Mb，步长100kb，取窗口内的平均值作为拟合后的值，选择99％置信水平，仅在第3染色体发现超过阈值的候选区间，包括2个候选区间，分别是15.10～18.10Mb和26.50～29.70Mb；基于G-value分析法，滑窗时使用的窗口大小为1Mb，使用的步长大小为100kb，取窗口内的平均值作为拟合后的值，仅在第3染色体发现1个超过阈值的候选区间：20.10～28.90Mb。

通过次级分离群体的分析，验证了qML3位点；综合连锁分析和BSA定位，将qML3候选区间确定为第3染色体26.50～28.90Mb。

二、与水稻中胚轴伸长基因qML3紧密连锁的分子标记

本发明与水稻中胚轴伸长基因qML3紧密连锁的分子标记是位于水稻第3染色体的BS3-7，其具体染色体位置为chr 3:28482071---20482167,5bp插入位点是28482115。

引物扩增的全序列，具体染色体位置为chr 3:28482071---20482167,5bp插入位点是28482115。并就此设计检测的引物对，即利用primer Premier 5软件，根据多态性位点、引物序列特异性、引物错配数和PCR产物长度等因素综合考虑，设计InDel分子标记。引物对如下：

正向引物：GCTTCAAAGCACCAGATATAGCA(SEQ ID NO：1)；

反向引物：CAAATTGTGAGGCATTATATTGACA(SEQ ID NO：2)。

其中，扩增短中胚轴的该段核苷酸序列为97bp：

GCTTCAAAGCACCAGATATAGCATCTTCCTGCTTCTCATCAACAGCCTACCACAG TAAGATTTGGGTTAATATGTCAATATAATGCCTCACAATTTG(SEQ ID NO：3)。

而长中胚轴品种中，扩增该段核苷酸序列在位点是28482115处插入了CCTAC(长5bp)故长为102bp：GCTTCAAAGCACCAGATATAGCATCTTCCTGCTTCTCATCAACAG【CCTAC】CCTACCACAGTAAGATTTGGGTTAATATGTCAATATAATGCCTCACAATTTG(SEQ ID NO：4)。

实施例2、水稻中胚轴伸长鉴定方法

1、提取待测水稻的基因组DNA，以DNA为模板、BS3-7分子标记为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；

PCR反应体系、扩增程序和PCR产物检测同实施例1。

2、根据PCR产物大小确定待测水稻中胚轴伸长特性：

若PCR产物大小为102bp，则待测水稻为或候选为长中胚轴水稻品种；

若PCR产物大小为97bp，则待测水稻为或候选为短或者稍短中胚轴水稻品种。

实施例3、BS3-7分子标记在水稻品种中胚轴伸长特性鉴定中的应用

一、供试材料

供试材料为日本晴、CSL126、新叶冠、中国31号、广津稻、曲阳小黄芒、谷米、加巴拉、小白芒、太选3号、五一水稻和黄毛稻子；于海南三亚中国农业科学院作物科学研究所南繁基地种植。

二、中胚轴伸长表型鉴定

按照实施例1步骤一中的方法对上述供试材料的中胚轴伸长特性进行鉴定。

结果如表1所示。新叶冠、谷米、小白芒、五一水稻和黄毛稻子的中胚轴伸长长度均超过了10.0mm，与CSL126长中胚轴材料类似，均为长中胚轴品种；中国31号、广津稻、曲阳小黄芒、加巴拉和太选3号的中胚轴伸长长度小于6.0mm，与日本晴短中胚轴材料类似，均为短或者较短中胚轴品种。

表1.供试水稻品种的基因型及中胚轴伸长长度鉴定结果

三、基因型鉴定

提取待测水稻的基因组DNA，以DNA为模板、BS3-7分子标记为引物进行PCR扩增，获得PCR产物；PCR反应体系、扩增程序和PCR产物检测同实施例1。

电泳结果如图2所示。泳道1-10分别为新叶冠、中国31号、广津稻、曲阳小黄芒、谷米、加巴拉、小白芒、太选3号、五一水稻和黄毛稻子；其中新叶冠、谷米、小白芒、五一水稻和黄毛稻子的PCR产物均为102bp，按照实施例2中本发明的水稻中胚轴伸长特性鉴定方法，这5个品种均为长中胚轴水稻品种。中国31号、广津稻、曲阳小黄芒、加巴拉和太选3号的PCR产物均为97bp，按照实施例2中本发明的水稻中胚轴伸长特性鉴定方法，这5个品种均为短或者较短中胚轴水稻品种。

由此可见，本发明的水稻中胚轴伸长特性的鉴定方法与步骤二中的中胚轴伸长长度鉴定结果完全一致。说明本发明的水稻中胚轴伸长特性鉴定方法准确、可靠。

Claims (10)

1.一种水稻中胚轴伸长基因qML3相连锁的分子标记，其特征在于，其位于水稻第3染色体的BS3-7在染色体位置为chr 3:28482071---28482167，其中，短中胚轴的该段核苷酸序列为97 bp：

GCTTCAAAGCACCAGATATAGCATCTTCCTGCTTCTCATCAACAGCCTACCACAGTAAGATTTGGGTTAATATGTCAATATAATGCCTCACAATTTG；而长中胚轴品种在28482115处有CCTAC的5bp 插入，其相应的该段核苷酸序列为102bp：GCTTCAAAGCACCAGATATAGCATCTTCCTGCTTCTCATCAACAGCCTACCCTACCACAGTAAGATTTGGGTTAATATGTCAATATAATGCCTCACAATTTG。

2.如权利要求1所述的水稻中胚轴伸长基因qML3相连锁的分子标记作为检测靶点鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴伸长特性的应用。

3.如权利要求1所述的水稻中胚轴伸长基因qML3相连锁的分子标记在与胚轴伸长特性相关的水稻品种育种中的应用。

4.鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴伸长特性的引物对，其由引物A和引物B组成；

所述引物A为如下：GCTTCAAAGCACCAGATATAGCA所示的单链DNA分子；

所述引物B为如下：CAAATTGTGAGGCATTATATTGACA所示的单链DNA分子。

5.如权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述引物A和所述引物B的摩尔浓度比为1:1混合。

6.如权利要求4或5所述的引物对在鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴伸长特性中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是指选育适宜直播的长中胚轴水稻品种。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，以待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求4或5所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；根据所述PCR产物鉴定待测水稻的中胚轴伸长特性：

若PCR产物大小为102 bp，则待测水稻为或候选为长中胚轴的水稻品种；

若PCR产物大小为97 bp，则待测水稻为或候选为短中胚轴的水稻品种;

进一步地，选择PCR产物大小为102 bp的待测水稻材料进行后续育种。

9.一种鉴定或辅助鉴定水稻中胚轴伸长特性的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求4或5所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；根据所述PCR产物鉴定待测水稻的中胚轴伸长特性：

若PCR产物大小为102 bp，则待测水稻为或候选为长中胚轴的水稻品种；

若PCR产物大小为97 bp，则待测水稻为或候选为短中胚轴的水稻品种。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，通过电泳或测序的方法检测PCR产物的大小。