CN112626260B - 一种与花生百仁重主效qtl位点连锁的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与花生百仁重主效qtl位点连锁的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子遗传学和作物分子育种技术领域，尤其涉及一种与花生百仁重主效QTL位点连锁的分子标记及其应用。所述分子标记包括分子标记Ah011476，和/或，分子标记Ah011478；所述分子标记Ah011476为花生B06染色体上第14206230位，多态性为G或T；所述分子标记Ah011478为花生B06染色体上第17650027位，多态性为C或A。本发明筛选得到和花生百仁重主效QTL位点连锁的分子标记，使用这些分子标记可以有效地对花生的百仁重进行鉴定，并用于花生遗传改良，获得高百仁重的花生品种。

Description

一种与花生百仁重主效QTL位点连锁的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子遗传学和作物分子育种技术领域，尤其涉及一种与花生百仁重主效QTL位点连锁的分子标记及其应用。
背景技术
花生(Arachis hypogaea L.)是现有重要的油料作物和经济作物之一，种植面积大，产量高，可用于榨油，是目前重要的食用油来源之一。花生同时也是重要的食品加工原料，食品消费占总产的35％以上。目前，提高单位面积产量是进一步增加花生原料供给的有效途径之一。研究表明，花生百仁重对产量影响最大，是花生最重要的花生产量构成因子。因此，开展花生百仁重QTL定位研究，鉴定百仁重相关的QTL并开发成分子标记，对于揭示花生籽仁大小形成的机理、开展百仁重的分子标记辅助选择育种和培育高产品种具有重要的意义。
分子标记辅助育种技术是现阶段创造优异性状材料和培育优良品种的重要手段和技术，其应用可以大大加速育种的进程和速度，具体通过在杂交和回交过程中使用性状连锁分子标记对杂交群体中的重组个体进行精确筛选，将筛选到携带优异等位基因的个体继续用于后续杂交和回交过程，实现优异性状遗传位点的精准导入和转育，从而快速实现作物品种的性状改良。应用分子标记开展辅助育种的基础是鉴定到与性状紧密连锁且高度相关的分子标记，分子标记在育种中的效率与标记与性状的连锁紧密程度、表型贡献率密切相关，质量性状和数量性状主效QTL分子标记在辅助选择育种中的效果较好。花生的百仁重属于数量性状，其遗传机理非常复杂，受多基因控制且与环境存在互作，充分发掘花生百仁重相关的主效QTL位点紧密连锁的分子标记，有助于聚合多个百仁重主效QTL位点，加快高产品种选育进程。目前，国内外学者对花生百仁重QTL定位有一些报道(Wang et al.,2019；Huang et al.,2015；Fonceka et al.,2012；Li et al.,2011；Ravi et al.,2011)，但这些研究鉴定的QTL通常由于标记密度过于稀疏，导致鉴定到的QTL区间较大，连锁的分子标记的表型贡献率通常较低，其鉴定的百仁重连锁标记应用于分子育种的效果一般。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提供一种与花生百仁重主效QTL位点连锁的分子标记及其应用。
第一方面，本发明提供一种与花生百仁重主效QTL位点连锁的分子标记，所述分子标记包括分子标记Ah011476，和/或，分子标记Ah011478；
所述分子标记Ah011476为花生B06染色体上第14206230位，多态性为G或T；
所述分子标记Ah011478为花生B06染色体上第17650027位，多态性为C或A。
进一步地，所述分子标记Ah011476位于如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的第22位；SEQ ID NO.7所示序列为用Allele-specific-VIC-F和Common-primer-R扩增得到的序列，而Allele-specific-FAM-F和Common-primer-R的扩增得到的片段，分子标记Ah011476位于第19位。
所述分子标记Ah011478位于如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的第24位；SEQ IDNO.8所示序列为用Allele-specific-VIC-F和Common-primer-R扩增得到的序列，而Allele-specific-FAM-F和Common-primer-R的扩增得到的片段，分子标记Ah011476位于第21位。
第二方面，本发明提供一种用于扩增所述分子标记的KASP引物组合，所述KASP引物组合包括，用于检测分子标记Ah011476的KASP引物组合1和用于检测分子标记Ah011478的引物组合2；
所述引物组合1包括：
Allele-specific-FAM-F：5’-GTAGTTGCCGTGTTTGGCG-3’(SEQ IN NO.1)，
Allele-specific-VIC-F：5’-TCTGTAGTTGCCGTGTTTGGCT-3’(SEQ IN NO.2)，
Common-primer-R：5’-GAAGCTGAAAAGCTTGAGCCTCGTT-3’(SEQ IN NO.3)；
和/或，所述引物组合2包括：
Allele-specific-FAM-F：5’-GCGCTGTTTGTTGTGCTGTGC-3’(S EQ IN NO.4),
Allele-specific-VIC-F：5’-ATAGCGCTGTTTGTTGTGCTGTGA-3’
(SEQ IN NO.5),
Common-primer-R：5’-CCAGTTAACAAATCTCAACCTATAGAT GAA-3’(SEQ IN NO.6)。
本发明进一步提供包含所述引物组合的试剂盒。
第三方面，本发明提供一种检测花生百仁重的方法，包括：
提取待鉴定花生材料的DNA，通过PCR对所述鉴定花生材料的所述分子标记进行鉴定；
若鉴定分子标记Ah011476的多态性为G，和/或，鉴定分子标记Ah011478的基因型多态性为C，则所述待鉴定花生材料为高百仁重；
若鉴定分子标记Ah011476的多态性为T，和/或，鉴定分子标记Ah011478的基因型多态性为A，则所述待鉴定花生材料为低百仁重。
进一步地，所述高百仁重为至少具有一个百仁重QTL位点的优异等位基因。
进一步地，所述PCR的反应程序为：
94℃ 15min；94℃ 20s，61～55℃ 60s，10个循环，且每个循环降低0.6℃；95℃20s，55℃ 60s，27个退火循环。
第四方面，本发明提供一种与花生百仁重相关QTL位点连锁的分子标记的筛选方法，包括：
以百仁重存在差异的花生材料为亲本构建重组自交系群体；
针对重组自交系群体，所述利用极端混池方法，进行控制花生百仁重基因的初定位得到候选QTL区间；
在所述QTL区间中，对B06上百仁重主效位点中鉴定到候选SNP位点和侧翼序列进行验证得到多个分子标记；
利用所述多个分子标记在所述重组自交系群体中进行连锁分析，得到花生百仁重主效QTL位点以及和其连锁的分子标记。
本发明进一步提供所述分子标记、所述引物组合、所述试剂盒、和所述方法在花生遗传改良中的应用。
本发明进一步提供所述分子标记、所述引物组合、所述试剂盒、和所述方法在高百仁重花生选育中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明开发了一个花生百仁重稳定的主效QTL位点q100SDWB06.3并提供了与花生百仁重主效QTL位点连锁的分子标记Ah011476(SEQ ID NO:1-3)和Ah011478(SEQ ID NO:4-6)。通过这两个分子标记可以快速、准确地检测花生材料中是否具有增加花生百仁重的QTL和优异等位基因，以加快花生高产品种的培育过程。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的中花16和sd-H1的农艺性状差别示意图；
图2为本发明实施例1提供的基于BSA-seq的花生百仁重主效QTL位点定位结果图；
图3为本发明实施例1提供的花生B06染色体目标区域局部连锁图和百仁重QTL定位结果图；
图4为本发明实施例2提供的花生高、低百仁重与分子标记之间的连锁性检测结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种花生百仁重主效QTL位点连锁分子标记的筛选方法，具体包括如下步骤：
1、以中花16和sd-H1为亲本构建重组自交系(RIL)群体，母本中花16是珍珠豆型大果高产高油花生品种，父本sd-H1是多粒型小果低产花生品种，两个亲本在粒重(百仁重)等农艺性状上均有较大差异，如图1所示。
2、中花16、sd-H1及F6(2016)、F7(2017)、F8(2018)代RIL群体242个株系，采用完全随机区组3次重复播种于武汉和阳逻两个试验基地，待材料自然成熟后收获晾晒，按照《花生种质资源描述规范和数据标准》中的标准考察花生百仁重，随机选取100粒成熟饱满无发芽无破损的种子重量(单位为g)，每个家系随机取8-10株进行测量。从RIL群体中选取百仁重的极端材料各20个家系，构建子代混池(高百仁重的子代混池H-pool，低百仁重的子代混池L-pool)，开展深度重测序。
3、测序获得的原始数据经质量控制及数据过滤后，与栽培花生狮头企的基因组进行比对并对亲本及子代混池进行变异分析；然后以亲本中花16的SNP作为参考，亲本sd-H1的为突变型，筛选出在两亲本间纯合且不一致的变异位点，排除两个子代混池中任意样本为缺失的，排除两个子代混池中任意样本最低测序深度小于7的位点，排除两个子代混池中SNP-index均小于0.3的位点，最终筛选出可能与百仁重相关的SNP位点，计算子代混池中所有SNP位点的突变基因型的频率，即SNP-index。
4、通过计算两个子代混池样本之间的△SNP-index，基于子代混池样本数和测序深度，进行10000次置换检验，最终选取95％和99％置信水平最为筛选的阈值，将控制花生百仁重的的基因位点定位在花生16号染色体(B06)上0-50,220,000bp间约50.22Mb的候选区间内(见图2)。
5、基于B06上候选区间鉴定到的候选SNP，成功开发了23个KASP标记，并结合在双亲间有多态性的6个SSR标记，在RIL群体中开展特定区间的连锁分析，利用Join Map 4.0对RIL群体构建遗传距离为99.5cM的局部连锁图谱(见图3)。利用WinQTLCart2.5软件的复合区间作图法(CIM)，结合6个环境的花生百仁重的表型数据，开展花生百仁重QTL分析，在B06上定位到5个QTL区间：q100SDWB06.1,q100SDWB06.2,q100SDWB06.3,q100SDWB06.4和q100SDWB06.5(见图3)；其中6个环境表型数据均检测到了主效QTL位点q100SDWB06.3，显著加性效应为3.97～5.33，表型贡献率为10.51～14.89％。这一结果验证了BSA-seq候选区间的可靠性，并将BSA-seq鉴定到的候选区间从50.22Mb(B06:0-50,220,000bp))缩小到了3.44Mb(B06:14,206,230-17,650,027bp)。其中主效QTL位点q100SDWB06.3的侧翼标记是Ah011476和Ah011478，KASP标记Ah011476含有位于B06染色体第14206230bp处G/T多态性，基因型GG与高百仁重亲本中花16一致，基因型TT与低百仁重亲本sd-H1一致；KASP标记Ah011478含有位于B06染色体第17650027bp处C/A多态性，基因型CC与高百仁重亲本中花16一致，基因型AA与低百仁重亲本sd-H1一致；利用这两组标记可以对花生百仁重相关QTL位点进行杂交或回交过程中早期世代选择从而缩短育种周期，从而较快地筛选出籽粒较重的高产花生材料。
实施例2
本实施例针对实施例1得到两个与百仁重相关的分子标记在花生品种中与性状的连锁性进行了验证，具体如下：
本实施例挑选了6份高百仁重的花生和6份低百仁重的花生，两组材料表型存在极显著差异(见图4中的a)，其中6份高百仁重分别为：121.69g、123.44g、123.74g、125.35g、137.29g和182.23g，6份低百仁重分别为：29.58g、34.13g、36.89g、40.50g、46.25g和47.16g。用CTAB法提取中花16、sd-H1和上述12份待测样品的花生基因组DNA，利用分子标记Ah011476(SEQ ID NO:1-3)和Ah011478(SEQ ID NO:4-6)进行KASP分型检测，具体检测方法如下：
(1)提取基因组DNA和检测质量。取待测花生样品的叶片，选用CTAB法提取待测花生植株的基因组DNA，然后对待测花生样品的基因组DNA进行质量检测，1％琼脂糖凝胶电泳及Nanodrop 2000检测DNA浓度及质量，DNA质量要求满足如下标准：1.7<A260/280<1.9，A260/230>2.0。
(2)竞争性等位基因特异性PCR反应。将待测样本DNA稀释到20～30ng/μL，作为竞争性等位基因特异性PCR反应所需模板；利用分子标记Ah011476的引物组(SEQ ID NO:1-3)或Ah011478引物组(SEQ ID NO:4-6)，借助水浴PCR仪(LGC Soellex)或者荧光定量PCR仪(BIO Rad,CFX 96)完成待测基因组DNA的竞争性等位基因特异性PCR扩增。
(3)检测PCR扩增产物的荧光信号，并进行精准的SNP分型。在荧光读板仪(PHERAstar FSX，BMG LABTECH)读取待测花生样品PCR产物的荧光信号，采用KlusterCaller软件对荧光信号数据进行分型分析，或利用CFX96荧光定量PCR仪配套软件BioRad CFX Manager的基因分型模块，读取荧光信号并进行基因分型；按照分型明确、NTC(无样品阴性对照)无特异性扩增的原则对待测样品进行SNP分型。
上述方案中，所述PCR扩增的反应体系：DNA模板2μL(20～30ng/μL)，引物混合液0.08μL，2×KASP Master Mixture(LGC，KBS-1016-002)2μL，ddH2O补至5μL。
上述方案中，所述PCR扩增的反应程序：94℃ 15min；94℃ 20s，61～55℃ 60s，10个循环(每个循环降低0.6℃)；95℃ 20s，55℃ 60s，27个退火循环。
结果显示(见图4中的b)：6份高百仁重花生材料的基因型均为GGCC，与中花16的基因型一致；低百仁重的6份材料与sd-H1的基因型一致，基因型均为TTAA。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种与花生百仁重主效QTL位点连锁的分子标记及其应用
<130> KHP201119650.5
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtagttgccg tgtttggcg 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctgtagttg ccgtgtttgg ct 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagctgaaa agcttgagcc tcgtt 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgctgtttg ttgtgctgtg c 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atagcgctgt ttgttgtgct gtga 24
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccagttaaca aatctcaacc tatagatgaa 30
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctgtagttg ccgtgtttgg cgaaacgagg ctcaagcttt tcagcttc 48
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atagcgctgt ttgttgtgct gtgcaatgtt catctatagg ttgagatttg ttaactgg 58

Claims (7)

1.一种与花生百仁重主效QTL位点连锁的分子标记组合，其特征在于，所述分子标记组合由分子标记Ah011476和分子标记Ah011478组成；
所述分子标记Ah011476位于花生B06染色体上如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的第22位，多态性为G或T；
所述分子标记Ah011478位于花生B06染色体上如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的第24位，多态性为C或A。
2.一种用于扩增如权利要求1所述分子标记组合的KASP引物组合，其特征在于，所述KASP引物组合包括，用于检测分子标记Ah011476的KASP引物组合1和用于检测分子标记Ah011478的引物组合2；
所述引物组合1包括：
Allele-specific-FAM-F：5’-GTAGTTGCCGTGTTTGGCG-3’，
Allele-specific-VIC-F：5’-TCTGTAGTTGCCGTGTTTGGCT-3’，
Common-primer-R：5’-GAAGCTGAAAAGCTTGAGCCTCGTT-3’；
所述引物组合2包括：
Allele-specific-FAM-F：5’-GCGCTGTTTGTTGTGCTGTGC-3’,
Allele-specific-VIC-F：5’-ATAGCGCTGTTTGTTGTGCTGTGA-3’,
Common-primer-R：5’-CCAGTTAACAAATCTCAACCTATAGATGAA-3’ 。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的KASP引物组合。
4.一种检测花生百仁重的方法，其特征在于，包括：
提取待鉴定花生材料的DNA，通过PCR对所述待鉴定花生材料的如权利要求1所述分子标记组合进行鉴定；
若鉴定分子标记Ah011476的多态性为G，且鉴定分子标记Ah011478的基因型多态性为C，则所述待鉴定花生材料为高百仁重；
若鉴定分子标记Ah011476的多态性为T，且鉴定分子标记Ah011478的基因型多态性为A，则所述待鉴定花生材料为低百仁重。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应程序为：
94℃ 15min；94℃ 20s， 61~55℃ 60s，10个循环，且每个循环降低0.6℃；95℃ 20s，55℃ 60s，27个退火循环。
6.权利要求1所述分子标记组合、或权利要求2所述引物组合、或权利要求3所述试剂盒、或权利要求4或5所述方法在花生遗传改良中的应用。
7.权利要求1所述分子标记组合、或权利要求2所述引物组合、或权利要求3所述试剂盒、或权利要求4或5所述方法在高百仁重花生选育中的应用。
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