CN116640878B - 基于多-单-合-标-证之新模式开发的小麦每小穗小花数qtl的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于多‑单‑合‑标‑证之新模式开发的小麦每小穗小花数QTL的分子标记及其应用，涉及小麦分子育种领域。所述分子标记与小麦每小穗小花数QTL QTFS.sau‑MC‑1A共定位于小麦1A染色体短臂上，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述核苷酸序列的21bp处碱基存在一个SNP位点，所述SNP位点为A/G突变。该分子标记与小麦每小穗小花数QTL QTFS.sau‑MC‑1A紧密连锁，能准确跟踪小麦每小穗小花数或QTL QTFS.sau‑MC‑1A，预测小麦的每小穗小花数特性，进而方便进行分子设计育种，加快小麦高产品种的培育进程。
Description
技术领域
本发明涉及小麦分子育种领域，特别是涉及基于多-单-合-标-证之新模式开发的小麦每小穗小花数QTL的分子标记及其应用。
背景技术
普通小麦(Triticum aestivum L.AABBDD)是供应世界粮食需求的最重要谷物之一，提高小麦产量有利于降低全球饥饿指数。小麦产量是一个复杂的性状，主要由千粒重、单位面积穗数和穗粒数三要素组成。由于品种和生产环境的限制，三要素对产量的影响存在差异，因此，在大田生产中，三要素的有机协调是实现高产的关键。此外，小麦产量是一个由多基因控制且复杂的数量性状，具有遗传力低、受环境影响大、选择难度高等特点。小麦产量＝穗数×穗粒数×粒重，这些构成因素与产量相比对环境更具有适应力，遗传较为稳定。在小穗数及粒重稳定的情况下，每小穗粒数的提高在很大程度上决定了小麦的最终产量。此外，在小麦每小穗粒数的形成过程中，首先形成小花原基，小花原基由于营养和遗传的原因形成可育小花和不可育小花，而小花多的小穗往往可获得更多的籽粒(可育小花)或具有获得更多籽粒的潜力，因此，每小穗小花数对产量具有重要的影响。鉴定控制每小穗小花数的稳定主效的遗传位点对于阐明小麦产量性状的遗传基础具有非常重要的意义。
小麦的传统育种工作依赖于育种家的经验和机遇，往往存在很大的盲目性、不可预测性、耗时、成本高和回报低等问题，而分子育种能显著提高育种效率，为保障我国粮食安全、生态安全提供更强有力的技术支撑。分子标记辅助育种，不依赖于表型选择，不受环境和基因互作等因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)指的是基因组内DNA在某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入和缺失等变化从而引起的DNA序列多态性。其技术是利用己知序列信息来比对寻找SNP位点，再利用发掘的变异位点设计特异性的引物来对基因组DNA或cDNA进行PCR扩增，得到基于SNP位点所特定的多态性产物，最后利用电泳技术分析产物的多态性。SNP标记的优点是数量多，分布广泛；在单个基因和整个基因组中分布不均匀；SNP等位基因频率容易估计。
KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)，即竞争性等位基因特异性PCR，是由LGC公司(Laboratory of the Government Chemist)(http://www.lgcgenomics.com)研发的具有低成本、高通量特点的新型基因分型技术，原理上与TaqMan检测法类似，都是基于终端荧光信号的读取量特点的新型基因分型技术，原理上与TaqMan检测法类似，都是基于终端荧光信号的读取判断，每孔反应都是采用双色应该检测一个SNP位点的两种基因型，不同的SNP对应着不同的荧光信号。因此在医学、农学检测方面KASP技术都有很好的应用潜力，如癌症、代谢疾病、心脑血管疾病、糖尿病、动植物育种、水产养殖等研究。截至目前，KASP分型在水稻、小麦、大豆等粮食作物的分子标记辅助选择中已得到了广泛应用。
在前人研究中，关于小麦每小穗小花数的QTL定位的研究少有报道，而目前也未见与小麦每小穗小花数相关且可用于实际分子标记辅助选择育种的紧密连锁的分子标记。因此研究获得与每小穗小花数相关的QTL或基因，利用分子生物学技术，增加每小穗小花数，进而增加小穗粒数，最终达到选育多花多粒的小麦高产新品种的目的，将这对于小麦育种工作产生重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供基于多-单-合-标-证之新模式开发的小麦每小穗小花数QTL的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该SNP分子标记与小麦每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A紧密连锁，能准确跟踪小麦每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A，预测小麦的每小穗小花数特性，进而方便进行分子设计育种，加快小麦高产品种的培育进程。
每小穗小花数是一个典型的受多基因控制的产量性状，挖掘和鉴定控制这类性状的主效且稳定表达的基因或者位点通常难度较大。为此，研究者们可通过在3个及以上的多年多点的环境下对表型进行精准鉴定，针对单个性状集中深入分析，挖掘主效基因或者位点，再根据连锁图谱和侧翼标记开发高通量分子标记，在其他具有不同遗传背景的群体进行验证。另外，同时分析这些位点的遗传效应及兼顾位点对其他重要产量性状的效应，从而进一步综合评价其育种利用潜质。基于此，创立了“多个环境评价-单个性状深入-综合性状兼顾-友好标记开发-不同背景验证”(简称：“多-单-合-标-证”五步法)的遗传解析新模式，以此方法为基础，进行SNP分子标记开发。
本发明利用多小穗多小花多粒自然突变体‘msf’为母本，以国审小麦品种‘川农16’为父本杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单粒传法，直至F6代，获得含有198个单株的重组自交系，作为遗传作图群体。对重组自交系群体的每小穗小花数进行调查鉴定，送石家庄博瑞迪公司提取亲本msf、川农16和重组自交系群体植株DNA，利用16K SNP液相芯片技术获得每个株系的基因型，基于16K SNP液相芯片测序结果构建遗传图谱。该小麦16K SNP液相芯片产品开发依托于西北农林科技大学康振生院士科研团队，以课题组20份重测序数据为基础，利用1,520份世界范围收集的种质资源的多平台基因分型数据、已公开发表的重测序、外显子捕获数据进行SNP筛选，使用博瑞迪GenoBaits技术进行开发和优化，最终保留14,868个mSNP区段(37,669个SNP标记)构成GBW16K产品(以下称之为16KSNP芯片)。37,669个SNP均匀分布在21条染色体上，每条染色体上平均有1,794个标记。该16K SNP芯片极大程度降低了分子辅助育种的使用成本，性价比高，产品较同类型其他产品价格低20％。在科学研究上适用于遗传图谱构建、QTL分析和全基因组关联分析等研究，在育种应用上适用于种质资源基因型鉴定、分子标记辅助育种、全基因组选择育种、遗传相似度分析、亲缘关系分析、品种保护和真实性鉴定等。
根据16K SNP芯片数据，利用JoinMap 4.0构建遗传图谱。结合定位作图群体的每小穗小花数表型数据，用QTL IciMapping 4.1中的完备区间作图法(Inclusive CompositeInterval Mapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，结合2021-2022两个年份共4个环境点以及其4个环境点每小穗小花数的BLUP(最佳线性无偏预测，best linearunbiased prediction)值来检测每小穗小花数QTL，在1A染色体短臂上的6.22cM区间鉴定到了一个稳定表达的每小穗小花数主效QTL QTFS.sau-MC-1A，根据侧翼标记在定位群体msf/CN16中的基因型将198个株系分为携带msf、CN16和杂合这三种基因型的组，接着本发明基于分别携带msf和CN16基因型的两组株系的其他重要产量性状(包括有效分蘖、株高、穗长、小穗数和开花期)的BLUP数据进行显著性比较以评价每小穗小花数主效位点QTFS.sau-MC-1A对这些产量性状的效应，最后利用侧翼标记序列进行分子标记的开发，共设计了5对共15条KASP引物(表2)，最终得到标记KASP-1A-2与每小穗小花数QTLQTFS.sau-MC-1A紧密连锁。
基于此，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种与小麦每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记与所述QTL QTFS.sau-MC-1A共定位于小麦1A染色体短臂上，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述核苷酸序列的21bp处碱基存在一个SNP位点，所述SNP位点为A/G突变。
本发明还提供一种扩增上述的SNP分子标记的KASP引物组合，包括如SEQ IDNO.4-5所示的两条特异性上游引物和如SEQ ID NO.6所示的通用下游引物。
本发明还提供上述的KASP引物组合在制备鉴别小麦每小穗小花数性状的产品中的应用。
进一步地，所述产品包括试剂盒或芯片。
本发明还提供一种鉴别小麦每小穗小花数性状的产品，包括上述的KASP引物组合。
进一步地，所述产品包括试剂盒或芯片。
本发明还提供上述的SNP分子标记、KASP引物组合或产品在以下(1)-(4)任一项中的应用：
(1)小麦分子遗传育种；
(2)培育转基因小麦；
(3)小麦种质资源改良；
(4)鉴别小麦每小穗小花数性状。
本发明还提供一种鉴别小麦每小穗小花数性状的方法，包括以下步骤：
S1.获取待测植株的基因组DNA；
S2.以所述基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的KASP引物组合进行PCR扩增，利用扩增结果进行基因分型，根据基因分型结果对所述待测植株的性状进行判断：当所述待测植株的基因型为AA时，其小麦每小穗小花数高于GG基因型。
进一步地，在步骤S2中，所述PCR扩增的反应体系为：5μLMaster Mix，1.4μL混合引物，5ng模板DNA，ddH2O加至总量为10μL；所述混合引物由60μL 10ng/μL的如SEQ ID NO.4所示的特异性上游引物、60μL 10ng/μL的如SEQ ID NO.5所示的特异性上游引物和120μL10ng/μL的如SEQ ID NO.6所示的通用下游引物，添加230μL ddH2O进行混合得到。
进一步地，在步骤S2中，所述PCR扩增的反应程序为：94℃15min；94℃20s，64℃60s，共12个循环；94℃20s，55℃1min，共28个循环。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了位于小麦1A染色体上的与小麦每小穗小花数连锁的分子标记KASP-1A-2，该分子标记是小麦1A染色体短臂上每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A的侧翼标记，连锁度高。该标记可用来检测小麦1A染色体上的每小穗小花数QTL，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高产小麦的分子辅助育种。本发明提供的分子标记KASP-1A-2与小麦1A上的每小穗小花数QTLQTFS.sau-MC-1A紧密连锁，可用来对小麦每小穗小花数这一性状进行定位，从而在育种过程中淘汰每小穗小花数较少的植株，提高育种工作效率，并为小麦每小穗小花数的遗传解析研究提供一定基础。
本发明首次公开了来自小麦‘msf’的每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A，位于小麦1A染色体短臂上，显著增加小麦每小穗小花数。该QTL在小麦产量(调控每小穗小花数)育种中具有较高的利用价值。
本发明首次公开了基于荧光定量PCR平台精确检测小麦‘msf’的每小穗小花数QTLQTFS.sau-MC-1A的分子标记KASP-1A-2，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。
本发明公开的分子标记KASP-1A-2与每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A极显著相关，用于分子标记辅助选择的准确性高，提高适应不同环境的小麦小穗数多小花数品种的选择鉴定效率，且成功率高。
本发明基于“多个环境评价-单个性状深入-综合性状兼顾-友好标记开发-不同背景验证”(“多-单-合-标-证”五步法)这一遗传基础解析新模式，还将分子标记KASP-1A-2应用于每小穗小花数主效QTLQTFS.sau-MC-1A对有效分蘖、株高、穗长、小穗数和开花期五个性状的多效性鉴定，拓展了分子标记KASP-1A-2的应用范围，并为以后在利用此类数量性状标记进行分子标记辅助选择育种奠定一定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中小麦每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A在1A染色体上的定位；
图2为实施例2中每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A对有效分蘖、株高、穗长、小穗数和开花期的多效性评价结果；
图3为实施例2中小麦‘msf’×小麦品系‘川麦104’的F2株系植株分子标记KASP-1A-2检测的荧光读值结果；其中，FAM(橙色，‘msf’)荧光为每小穗具有较多小花数的株系，HEX(蓝色，‘川麦104’)荧光为每小穗具正常小花数株系，黑色荧光为空白对照。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1小麦每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A及其分子标记KASP-1A-2的获得
(1)‘msf’是一个天然突变的多小花多籽粒突变体，该突变体具有穗子大、旗叶大和结实率高等优良性状，该突变体保存于四川农业大学小麦研究所种质资源库。‘川农16’是一个由四川农业大学小麦研究所于2003年所培育的国家审定品种，该品种具有株型好、抗病性表现良好(中抗条锈和高抗白粉)和稳定性好等优点。利用突变体小麦‘msf’为母本，以小麦品种‘川农16’为父本进行杂交，得到杂种F1，F1代单株自交获得F2，在F2使用单穗传法，直至F6代，获得含有198个系的重组自交系，构成遗传作图群体。
(2)重组自交系群体每小穗小花数表型鉴定：小麦蜡熟期对重组自交系每小穗小花数进行分析鉴定，排除边际效应，分别收取五个长势一致的单株，计算主穗总小花数对应主穗小穗数的比值为每小穗小花数，并求得五个数据的平均值，代表该株系的每小穗小花数。
(3)16K SNP液相芯片分析
a)DNA提取：用CTAB法提取亲本‘msf’、‘川农16’(简写为CN16)和重组自交系群体植株DNA。
b)使用超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国制造)对提取的DNA进行质量检测，合格后送样至公司进行基因型分析，在本研究中双亲和作图群体的基因型分析由石家庄博瑞迪生物技术有限公司(http://www.molbreeding.com)的16K SNP芯片完成。
c)连锁图谱的构建：根据16K SNP芯片数据，利用JoinMap 4.0构建遗传图谱。结合群体的每小穗小花数表型数据，用QTL IciMapping 4.1中的完备区间作图法(InclusiveComposite Interval Mapping-ADD，ICIM-ADD)，设置阀值LOD≥2.5的条件下，用2021-2022两个年份共4个环境点及4个环境点每小穗小花数的BLUP(最佳线性无偏预测，best linearunbiased prediction)值来检测每小穗小花数QTL(表1)，定位出每小穗小花数主效QTLQTFS.sau-MC-1A，并计算QTFS.sau-MC-1A的位置和分子标记之间的遗传距离。
d)紧密连锁分子标记的获得：基于侧翼标记的序列信息，利用小麦多组学网站(http://202.194.139.32/blast/viroblast.php)中的CAPS/KASP(Beta)进行KASP引物设计(共设计6条，2对KASP引物)(表2)，并在亲本‘msf’和‘川农16’进行基因分型，获得多态性位点，最终确定分子标记KASP-1A-2与每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A紧密连锁。
分子标记KASP-1A-2与小麦每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A共定位于小麦1A染色体短臂上，且与QTL QTFS.sau-MC-1A间的遗传距离为6.22cM，KASP-1A-2的核苷酸序列(SEQ ID NO.16)如下：
GCAACATGTATGTCCGACCTRACTGCTCCACCATCAACGCACCATTTGC(其中R为A/G)；上述序列的21bp处碱基存在A/G突变。
表1 msf/CN16重组自交系群体四个环境下的每小穗小花数表型
注：“RIL”为重组自交系；“A”、“B”和“H”分别为“msf”、“CN16”基因型和杂合基因型；”“-”表示信息缺失；环境1-4分别为2021年温江、2021崇州、2022年温江和2022年崇州。
表2 KASP引物序列
/>
设计的5对侧翼标记的KASP引物中最终得到了1个分子标记KASP-1A-2，其与每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A紧密连锁，结果见图1。
实施例2每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A对有效分蘖、株高、穗长、小穗数和开花期的多效性评价
根据16K SNP芯片基因分型结果，标记KASP-1A-2将定位作图群体‘msf’ב川农16’F6的198个株系分为三种基因型。其中，与‘msf’基因型AA相同的具有100个株系，与‘川农16’基因型GG相同的具有91个株系，其余为杂合基因型，未进行比较分析。根据其BLUP值，具有‘msf’基因型AA的株系的每小穗小花数显著高出具有‘川农16’基因型GG的株系7.45％(图2)。基于此，本发明在该定位群体中对有效分蘖、株高、穗长、小穗数和开花期也进行了效应分析，根据这些性状的BLUP值，具有‘msf’基因型AA的株系的有效分蘖(-56.42％)、株高(-6.92％)、穗长(+5.87％)、小穗数(+1.41％)和开花期(+0.53％)与具有‘川农16’基因型GG的株系差异显著(P＜0.05，图2)。综上结果，每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A的效应对这些重要的农艺性状的起到重要的兼顾作用，为该每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A在育种上的利用奠定基础。
实施例3利用KASP分子标记KASP-1A-2对控制每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A在不同的遗传背景下进行验证。
(1)利用多小穗多小花突变体小麦‘msf’为母本，每小穗小花数正常的普通小麦品种‘川麦104’为父本构建F2验证群体，‘川麦104’是一个由四川省农业科学院作物研究所育成的国审春性小麦，具有分蘖力强、抗倒伏性强和熟相好等优良性状。在‘msf’ב川麦104’的F2群体中随机选择96个株系。
(2)对所选择的96个株系进行KASP-1A-2标记检测，具体方法为：采用CTAB法提取96个株系处于三叶期时的基因组DNA，将其作为模板，以开发的分子标记KASP-1A-2的特异性引物对为引物进行PCR扩增并进行荧光读值，所述引物为：
FAM标签上引物：(下划线部分为FAM标签序列)；
5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCAACATGTATGTCCGACCTA-3'(SEQ ID NO.4)
HEX标签上引物：(波浪线部分为HEX标签序列)；
通用下游引物：
5'-ACCATCAACGCACCATTTGC-3'(SEQ ID NO.6)。
(3)上述PCR扩增的扩增体系为：5μLMaster Mix，1.4μL混合引物，5ng模板DNA，ddH2O加至总量为10μL；所述混合引物由60μL 10ng/μL的如SEQ ID NO.4所示的特异性上游引物、60μL 10ng/μL的如SEQ ID NO.5所示的特异性上游引物和120μL 10ng/μL的如SEQ IDNO.6所示的通用下游引物，添加230μL ddH2O进行混合得到。同时添加至3个独立的以ddH2O代替DNA模板的空白。
(4)上述PCR扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、64℃复性/延伸60s，共12个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸1min，共28个循环；完成后37℃进行荧光读值1min，根据结果进行基因型分型。
(5)荧光读值结果(见图3)，将检测到与‘msf’一致的FAM(蓝色)荧光的植株基因型记为A(即AA基因型)，为每小穗多小花型株系，同‘川麦104’一样表现为HEX(橙色)荧光的植株基因型记为B(即GG基因型)，为正常的每小穗小花数型株系。其中，与‘msf’和‘川麦104’基因型一致的株系分别有23和43株。各个株系基因型(本发明分子标记方法鉴定的基因型)与成熟期每小穗小花数田间表型值如表3所示。
表3‘msf’ב川麦104’杂交F2群体中66个样本在KASP-1A-2下的基因型与表型对应结果
/>
/>
注：“-”表示信息缺失。
(6)结果显示，与含有每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A的‘msf’类型相同的植株平均每小穗小花数为5.93个，极显著高于(P＜0.01)‘川麦104’类型的植株每小穗小花数(4.75个)。实际结果与预期结果一致，说明本发明的每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A确实具有显著增加每小穗小花数的作用；每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A在验证群体中被成功地验证。同时本发明的分子标记KASP-1A-2可以用于跟踪鉴定小麦每小穗小花数QTLQTFS.sau-MC-1A。
综合实施例1-3形成了“多-单-合-标-证”这一遗传解析新模式，基于该模式对开发小麦每小穗小花数主效QTL连锁的SNP分子标记开发及其应用进行了全面清晰的阐述。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种扩增与小麦每小穗小花数QTL QTFS.sau-MC-1A连锁的SNP分子标记的KASP引物组合，其特征在于，所述KASP引物组合包括如SEQ ID NO.4-5所示的两条特异性上游引物和如SEQ ID NO.6所示的通用下游引物；
所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述核苷酸序列的21bp处碱基存在一个SNP位点，所述SNP位点为A/G突变。
2.一种如权利要求1所述的KASP引物组合在制备鉴别小麦每小穗小花数性状的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒或芯片。
4.一种鉴别小麦每小穗小花数性状的产品，其特征在于，包括权利要求1所述的KASP引物组合。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂盒或芯片。
6.一种如权利要求1所述的KASP引物组合或权利要求4或5所述的产品在鉴别小麦每小穗小花数性状中的应用，其中待测植株的基因型为AA时，其小麦每小穗小花数高于GG基因型。
7.一种鉴别小麦每小穗小花数性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.获取待测植株的基因组DNA；
S2.以所述基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的KASP引物组合进行PCR扩增，利用扩增结果进行基因分型，根据基因分型结果对所述待测植株的性状进行判断：当所述待测植株的基因型为AA时，其小麦每小穗小花数高于GG基因型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述PCR扩增的反应体系为：5µL Master Mix，1.4µL混合引物，5ng模板DNA，ddH2O加至总量为10µL；所述混合引物由60µL10ng/µL的如SEQ ID NO.4所示的特异性上游引物、60µL 10ng/µL的如SEQ ID NO.5所示的特异性上游引物和120µL 10ng/µL的如SEQ ID NO.6所示的通用下游引物，添加230µLddH2O进行混合得到。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述PCR扩增的反应程序为：94℃ 15min；94℃ 20s，64℃ 60s，共12个循环；94℃ 20s，55℃ 1min，共28个循环。
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