CN103866006A - 小麦抗穗发芽QTL位点QPhs.sicau-3B.1的分子标记M3B-1a和M3B-2a及其应用 - Google Patents

小麦抗穗发芽QTL位点QPhs.sicau-3B.1的分子标记M3B-1a和M3B-2a及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了小麦分子育种领域的两对用于筛选新的与小麦抗穗发芽相关的QTL位点的引物对及方法和应用。经过分析表明，开发出的分子标记M3B-1a和M3B-2a能准确跟踪斯卑尔脱小麦CSCR6的抗穗发芽主效QTL位点QPhs.sicau-3B.1，预测小麦的穗发芽抗性，从而更加方便地在实验室条件下对抗穗发芽材料进行鉴定和筛选。利用分子辅助育种技术能避免环境因素及人为因素对表型造成的影响，本发明中的主效QTL QPhs.sicau-3B.1及开发出的两对与该QTL紧密连锁的STS标记M3B-1a和M3B-2a，能提供新的候选基因，提高抗穗发芽育种材料选择的准确性，实现小麦抗穗发芽育种的目标。

Description

小麦抗穗发芽QTL位点QPhs.sicau-3B.1的分子标记M3B-1a和M3B-2a及其应用
技术领域
本发明涉及小麦分子育种领域，具体涉及一种鉴定和筛选小麦新抗穗发芽主效QTL位点QPhs.sicau-3B.1的引物对、分子标记、分子标记方法及应用。
背景技术
小麦是全球被普遍种植的粮食作物，也是我国种植量仅次于水稻的作物，小麦穗发芽（Pre-harvest Sprouting，PHS）是指小麦种子在收获前期遇到连绵不断的阴雨天气而在穗上发芽的情况。穗发芽是一种世界性灾害。据报道，在北欧和西欧沿海、智利大部、阿根廷、巴西、南非、津巴布韦、加拿大萨斯坎切温和曼尼托巴地区、新西兰东部地区种植的小麦较容易受到穗发芽的危害，美国西太平洋州以及东部，加拿大的安大略省和澳大利亚的东部小麦带都是穗发芽威胁特别严重的地区（肖世和，闫长生，张海萍等，小麦穗发芽研究，北京：中国农业科学技术出版社，2004年第1版：第5-8页）。我国受穗发芽危害的麦区约占全国小麦总面积的83%，在东北春麦区、西北春麦区、黄淮冬麦区、北部冬麦区、长江中下游冬麦区、西南冬麦区均有不同程度的穗发芽情况的报道。其中，长江中下游冬麦区是穗发芽严重危害的地区，西南冬麦区的四川盆地和陕南鄂西山地丘陵历来是穗发芽的重灾区。
在小麦种子收获前发生穗发芽会导致小麦子粒中相关水解酶活性迅速升高，降解子粒中的储藏物质，使容重（testing weight）、出粉率和面粉降落值（Falling number）下降，造成小麦各种食品加工品质恶化，更会严重影响小麦的储存和次年的播种质量。这些都会对小麦的生产加工造成严重的经济损失。因此，发掘具有抗穗发芽能力的小麦资源对于小麦育种具有重要的意义。
分子标记辅助育种选择技术，即不依赖表型选择，直接针对基因型进行选择，具有不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作影响等优点，能够快速高效地选育出目标资源材料。DArT标记是一项基于于DArT技术（Diversity arrays technology，多样性微阵列技术）来区分DNA多态性差异的分子标记，其基本原理在于用相应的探针组合与固定到芯片上的基因组限制性内切酶片段进行杂交，只有与探针互补杂交的部分才有杂交信号，再通过扫描仪识别杂交信号的强弱和有无来获得DArT标记的多态性信息，是一种高通量的分子标记技术。而简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）则是一类广泛存在与基因组上的由几个核苷酸重复单位组成的串联重复序列，在基因组上具有广泛分布，多态性高，操作技术简单，费用较低等特点。结合DArT标记与SSR标记进行QTL定位不仅能有效地将主效QTL定位到较小的区段内，结合物理图谱更能比较方便地将目标QTL锚定到相对准确的位置，这大大减少了目标QTL的后续研究的工作量。因此，筛选出与抗穗发芽主效QTL紧密连锁的分子标记，并将该标记开发为能准确鉴定特定QTL的STS标记，对抗穗发芽材料选择，在选育小麦抗穗发芽材料，提高小麦群体产量和品质具有重要的意义。
小麦品种CSCR6属于斯卑尔脱小麦（Ma J,Li H B,Zhang C Y,etal.Identification and validation of a major QTL conferring crown rotresistance in hexaploid wheat[J].Theoretical and applied genetics,2010,120(6):1119-1128.），经过穗发芽鉴定发现该品种具有较好的穗发芽抗性。利用该材料为抗源并与澳大利亚感穗发芽品种Lang构建F7代重组自交系，并结合84对具有多态性的SSR标记数据和随机选取的967个覆盖小麦全基因组的DArT标记数据构建遗传图谱，同时还考察了2011年、2012年两年该重组自交系的穗发芽表型数据，通过软件MapQTL5.0进行QTL计算，最终在3B长臂上发现了一个与穗发芽相关的主效QTL QPhs.sicau-3B.1位于wPt-3107和wPt-6785区间内，该QTL能解释15.4%的表型变异。针对该抗性主效QTL展开进一步研究，并将与主效QTL紧密连锁的标记开发为可用于辅助育种选择的STS标记，能有效提高小麦育种中对抗穗发芽材料的选择的效率和准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供与小麦CSCR6的抗穗发芽QTLQPhs.sicau-3B.1紧密连锁的分子标记。
本发明的另一个目的是提供鉴定上述分子标记的引物对。
本发明的第三个目的是提供上述分子标记的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明的新抗穗发芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1来自斯卑尔脱小麦CSCR6，该QTL位于小麦的3B染色体长臂，靠近端粒处，LOD值大于3.0，能解释15.4%的表型变异。
本发明用于鉴定该QTL的分子标记是根据与目标QTL紧密连锁的DArT标记序列设计的特异性引物，并将其应用于由CSCR6构建的重组自交系中进行筛选，结合表型分析，发现不同带型对应的穗发芽强弱差异达到了显著或极显著水平。
本发明用于鉴定该QTL的分子标记的引物对的核苷酸序列如下：（如SEQ ID NO.1-NO.4所示）。
M3B-1a：
正向引物：5’－3’TGCAGCGTGGTTTGGG（SEQ ID NO.1）
反向引物：5’－3’TGCAGAGTCAAAGAACTATGATAG（SEQID NO.2）
M3B-2a：
正向引物：5’－3’TTAGTCCACTGAGAACATGGCG（SEQ IDNO.3）
反向引物：5’－3’ACGTGGGAGGATGTGCAAAG（SEQ IDNO.4）
所述分子标记M3B-1a和M3B-2a，是以小麦CSCR6和Lang的基因组DNA为底物进行PCR扩增所得的片段，与QPhs.sicau-3B.1之间遗传距离分别为3.9cM和2.0cM。
发明人提供了一种鉴定小麦抗穗发芽QTL QPhs.sicau-3B.1的分子标记方法，包括：以待鉴定材料的DNA作为模板，用上述的分子标记的引物对进行PCR扩增；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，再用成像仪进行检测；能扩增出与CSCR6相同片段的植株为含有抗穗发芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1的植株。
上述步骤中PCR具体的步骤是：
1）以待鉴定材料DNA作为模板，利用SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示的引物对模板进行PCR扩增。
a.PCR扩增体系：2.5μl10×PCR buffer、0.75U plus Taq DNA聚合酶、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各3μmol、模板DNA200ng、双蒸水加至总量为25μl；
b.PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min；
c.PCR产物检测：PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TAE，恒定电压150伏；凝胶最后用成像仪检测；
2）以待鉴定材料DNA作为模板，利用SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示的引物对模板进行PCR扩增。
a.PCR扩增体系：2.5μl10×PCR buffer、0.5U plus Taq DNA聚合酶、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各2μmol、模板DNA200ng、双蒸水加至总量为25μl；
b.PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；
c.PCR产物检测：PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TAE，恒定电压150伏；凝胶最后用成像仪检测；
3）鉴定结果为：能扩增出与CSCR6相同片段的植株为含有抗穗发芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1的植株。反之，能扩增出与Lang相同片段的植株为不含有该主效QTL的植株。
所述鉴定小麦抗穗发芽的引物对或所述检测小麦抗穗发芽能力强弱的方法在如下(a)-(e)中的应用也属于本发明的保护范围：
(a)筛选抗穗发芽能力强的小麦品种。
(b)筛选抗穗发芽能力弱的小麦品种。
(c)培育抗穗发芽/强休眠性的小麦品种。
(d)所述QTL在小麦特异抗穗发芽材料创制中的应用。
(e)所述分子标记引物对在小麦特异抗穗发芽材料创制中的应用。
本发明小麦CSCR6抗穗发芽QTL及其分子标记是通过以下方法获得的：
1）利用抗穗发芽小麦材料CSCR6为母本，以澳大利亚感穗发芽品种Lang为父本杂交，得到杂交种F1，按照单粒传法构建得到由92个子代够成的重组自交系F7作图群体。
2）RIL F7穗发芽鉴定
收获小麦蜡熟期种子，将其悬挂于阴凉通风处自然风干7d后，进行人工脱粒。在有盖塑料培养皿中垫上用3-5ml蒸馏水润湿的滤纸进行发芽试验，试验设计三个重复，每个重复50粒种子。每隔一天挑出已露白和已发霉的种子，并分别计数，种子发芽率以第7天发芽种子数占总种子数百分比表示，计算发芽率。
发芽率（%）=发芽种子数/（种子总数-发霉数）×100%
3）基因型分析
a)基因组DNA提取：采用CTAB法提取亲本CSCR6、Lang和F7代群体植株DNA。
b)SSR、DArT分析
①亲本之间多态性SSR分子标记的筛选：选取GrainGenes数据库（http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes）上公布的覆盖六倍体小麦A、B、D基因组的SSR引物，以亲本CSCR6和Lang的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得84对多态性SSR分子标记；
②F7群体的SSR分析：以上述步骤获得的84对具有多态性的标记为引物，同时扩增亲本CSCR6和Lang以及F7群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得SSR标记数据。亲本CSCR6的带型记为a，亲本Lang的带型记为b。F7群体带型来源于CSCR6的记为a，来源于Lang的记为b。
③F7群体的DArT分析：选取在小麦21条染色体上随机分布的967个DArT标记探针对亲本CSCR6、Lang和F7代群体进行匹配分析，获得DArT标记数据
④连锁图谱构建：根据SSR和DArT标记数据，利用作图软件JoinMap4.0构建遗传图谱。软件MapQTL 5.0的区间作图模型（Interval Mapping）和多QTL作图模型（Multiple QTL Model），并结合F7群体穗发芽表型数据定位抗穗发芽QTL。发现小麦CSCR6的3B染色体上显著存在一个与抗穗发芽相关的主效QTLQPhs.sicau-3B.1，能解释15.4%的表型变异，DArT标记wPt-5769、wPt-6785与其紧密连锁，遗传距离分别为3.9cM、2.0cM。
4）STS标记的开发
为了方便对小麦抗穗发芽候选材料进行该QTL位点Qphs.sicau-3B.1的鉴定和辅助选择，同时为了降低育种成本和工作量，增强育种工作中的可操作性，需要将与目标QTL紧密连锁的DArT标记探针序列开发为基于常规分子生物学手段可用于鉴定和筛选的STS标记，以下是相关STS标记开发过程中的主要步骤：
①引物设计:
为开发基于常规PCR技术的分子标记，方便用于分子标记辅助育种及应用，本发明开展了将与QTL位点QPhs.sicau-3B.1紧密连锁的DArT标记wPt-5769、wPt-6785的探针序列转化为常规分子标记的实验，根据已知的DArT标记wPt-5769探针序列设计如下引物：
M3B-1a：
正向引物：5’－3’TGCAGCGTGGTTTGGG（SEQ ID NO.1）
反向引物：5’－3’TGCAGAGTCAAAGAACTATGATAG（SEQID NO.2）
M3B-1b：
正向引物：5’－3’GTGGTTTGGGCAGTTGAGAT（SEQ IDNO.5）
反向引物：5’－3’ACTATGATAGACTGATTGCAGGT（SEQ IDNO.6）
M3B-1c：
正向引物：5’－3’GTGGTTTGGGCAGTTGAGATT（SEQ IDNO.7）
反向引物：5’－3’AGAACTATGATAGACTGATTGCAGG（SEQID NO.8）
根据已知的DArT标记wPt-6785探针序列设计如下引物：
M3B-2a：
正向引物：5’－3’TTAGTCCACTGAGAACATGGCG（SEQ IDNO.3）
反向引物：5’－3’ACGTGGGAGGATGTGCAAAG（SEQ IDNO.4）
M3B-2b：
正向引物：5’－3’GTCCACTGAGAACATGGCGT（SEQ IDNO.9）
反向引物：5’－3’AAGAGACGTGGGAGGATGTG（SEQ IDNO.10）
M3B-2c：
正向引物：5’－3’GTCCACTGAGAACATGGCGTC（SEQ IDNO.11）
反向引物：5’－3’GAAAGGGAAGAGACGTGGGAG（SEQ IDNO.12）
M3B-2d：
正向引物：5’－3’ATTTAGTCCACTGAGAACATGGC（SEQ IDNO.13）
反向引物：5’－3’GTGGGAGGATGTGCAAAGGA（SEQ IDNO.14）
M3B-2e：
正向引物：5’－3’TTAGTCCACTGAGAACATGGC（SEQ IDNO.15）
反向引物：5’－3’GACGTGGGAGGATGTGCAA（SEQ IDNO.16）
M3B-2f：
正向引物：5’－3’TGCAGTAACAAATGACCAGTT（SEQ IDNO.17）
反向引物：5’－3’GCAGAAAGGGAAGAGACG（SEQ IDNO.18）
以CSC6和Lang基因组DNA为模板，分别利用以上引物进行PCR扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物发现，M3B-1a能够特异并稳定地在亲本CSCR6中扩增出大小片段为400bp左右的条带，而M3B-1b不能扩增出任何条带，M3B-1c虽能扩增出条带但片段大小在1000bp左右，而探针wPt-5769序列仅为400bp，因此扩增出的也不是目的条带。将用M3B-1a扩增出的片段与wPt-5769探针序列进行比对，二者比对结果一致，因此选定M3B-1a引物对作为扩增该标记wPt-5769的引物。
另外，利用根据探针wPt-6785设计的6对引物在以CSC6和Lang基因组DNA为模板扩增时，发现M3B-2b和M3B-2c产生了大量非特异性扩增，导致泳道带型不清晰，M3B-2d和M3B-2f不能扩增出任何条带，M3B-2d虽然能扩增出特异性条带，但是扩增出条带仅为700bp左右，将扩增出的片段测序并与探针wPt-6785进行比对，发现相似性很低，且将该引物在作图群体中扩增出的条带无法准确反应子代基因型不对应。仅有M3B-2a能够稳定地在感穗发芽亲本Lang中扩增出大小片段为1000bp左右的条带，将扩增出的片段与探针wPt-6785序列进行比对，相似度达到了100%，而其余引物均不能扩增出目的条带或产生较多非特异性扩增，因此选定M3B-2a引物对作为扩增标记wPt-6785的引物。
②PCR扩增程序优化
进行PCR扩增时，退火温度分别设置45℃-65℃的梯度，扩增完成后检测扩增产物，发现引物对M3B-1a在退火温度梯度在45℃-52℃的温度区间内时，扩增产物中有大量非特异性杂带出现，53℃-58℃时在亲本中存在有差异的特异性扩增条带，在55℃时该特异的扩增条带亮度最大，而当退火温度高于58℃时，该特异性扩增条带较弱甚至无带。因此确定55℃为标记M3B-1a的最佳退火温度。引物对M3B-2a的退火温度梯度在45℃-57℃的温度区间内时，扩增产物中有大量非特异性杂带出现，58℃-61℃时在亲本中存在有差异的特异性扩增条带，在60℃时该特异的扩增条带亮度最大，而当退火温度高于62℃时，该特异性扩增条带较弱甚至无带。最后确定60℃为标记M3B-2a的最佳退火温度。
③PCR扩增体系优化
体系优化主要针对DNA模板、引物和DNA聚合酶含量的多少进行调整，以减少非特异性扩增。实验结果表明，DNA模板、引物、DNA聚合酶含量的不同都会影响扩增质量。M3B-1a体系实验中设计了8组不同含量扩增体系组合，如下表所示：
表1 标记M3B-1a体系优化内容
Figure BDA0000465442750000101
实验检测结果显示，第8个组合，即各组分含量为0.75U plus TaqDNA聚合酶、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各3μmol、模板DNA200ng时，扩增效果最佳。
M3B-2a体系实验中设计了12组不同含量扩增体系组合，如下表所示：
表2 标记M3B-2a体系优化内容
Figure BDA0000465442750000111
实验检测结果显示，第12个组合，即各组分含量分别为0.5U plusTaq DNA聚合酶、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各2μmol、模板DNA200ng时，扩增效果最佳。
附图说明
图1：小麦CSCR6抗穗发芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1在3B染色体上的位置及与本发明分子标记之间的连锁遗传图谱信息。
图2：CSCR6×Lang的F7植株分子标记M3B-1a检测的电泳图谱；其中P1和P2分别为CSCR6和Lang，1-5为抗穗发芽基因型植株，6-10为感穗发芽基因型植株。
图3：CSCR6×Lang的F7植株分子标记M3B-2a检测的电泳图谱；其中P1和P2分别为CSCR6和Lang，1-5为感穗发芽基因型植株，6-10为抗穗发芽基因型植株。
图4：STS标记M3B-1a和M3B-2a在验证群体CSCR6×BellaroiF7子代中检测不同的带型对应的两年穗发芽表型对比结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 小麦CSCR6抗穗发芽主效QTL的定位及分子标记的获得
1）利用抗穗发芽小麦材料CSCR6为母本，以澳大利亚感穗发芽品种Lang为父本杂交，得到杂交种F1，按照单粒传法构建得到由92个子代构成的重组自交系F7作图群体。
2）RIL F7穗发芽鉴定
收获小麦蜡熟期种子，将其悬挂于阴凉通风处自然风干7d后，进行人工脱粒。在有盖塑料培养皿中铺上用3-5ml蒸馏水润湿的滤纸进行发芽试验，试验设计三个重复，每个重复50粒种子。每隔一天挑出已露白和已发霉的种子，并分别计数，种子发芽率以第7天发芽种子数占总种子数百分比表示，计算发芽率。
发芽率（%）=发芽种子数/（种子总数-发霉数）×100%
3）基因型分析
a)基因组DNA提取：采用CTAB法提取亲本CSCR6、Lang和F7代群体植株DNA。
b)SSR、DArT分析
①亲本之间多态性SSR分子标记的筛选：选取GrainGenes数据库（http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes）上公布的覆盖六倍体小麦A、B、D基因组的SSR引物，以亲本CSCR6和Lang的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得84对多态性SSR分子标记；
②F7群体的SSR分析：以上述步骤获得的84对具有多态性的标记为引物，同时扩增亲本CSCR6和Lang以及F7群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得SSR标记数据。亲本CSCR6的带型记为a，亲本Lang的带型记为b。F7群体带型来源于CSCR6的记为a，来源于Lang的记为b。
③F7群体的DArT分析：选取在小麦21条染色体上随机分布的967个DArT标记探针对亲本CSCR6、Lang和F7代群体进行匹配分析，获得DArT标记数据
④连锁图谱构建：根据SSR和DArT标记数据，利用作图软件JoinMap4.0构建遗传图谱。软件MapQTL5.0的区间作图模型（IntervalMapping）和多QTL作图模型（Multiple QTL Model），并结合F7群体穗发芽表型数据定位抗穗发芽QTL。发现小麦CSCR6的3B染色体上显著存在一个与抗穗发芽相关的主效QTL QPhs.sicau-3B.1，能解释15.4%的表型变异，DArT标记wPt-5769、wPt-6785与其紧密连锁，遗传距离分别为3.9cM、2.0cM。
4)M3B-1标记开发：利用CTAB法提取CSCR6×Lang重组自交系亲本及F7子代单株的DNA，以基因组为底物，分别用M3B-1a、M3B-1b、M3B-1c引物进行扩增。扩增体系中的上下游引物和plus TaqDNA聚合酶含量根据扩增检测结果进行调整优化，退火温度设置45℃-65℃的梯度，优化后的扩增条件如下：
PCR扩增体系：2.5μl10×PCR buffer、0.2mmol/L dNTP、模板DNA200ng、0.75U plus Taq DNA聚合酶、上下游引物各3μmol、双蒸水加至总量为25μl；
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；
PCR产物检测：PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TAE，恒定电压150伏；凝胶最后用成像仪检测。
电泳结果显示，仅有引物M3B-1a能够特异、稳定地扩增出400bp的目标条带，该条带序列与探针wPt-6187序列能够完全匹配。且将该引物在子代中扩增时，与CSCR6扩增出相同条带的子代均对应抗穗发芽基因型，不能扩出与CSCR6相同条带的子代均对应感穗发芽基因型。将扩增出不同带型的植株对应的发芽率进行t检验，发现差异均达到了显著或极显著水平。
5）M3B-2标记开发：利用CTAB法提取CSCR6×Lang重组自交系亲本及F7子代单株的DNA，以基因组为底物，分别用因为M3B-2a、M3B-2b、M3B-2c、M3B-2d、M3B-2e、M3B-2f为引物进行扩增。扩增体系中的上下游引物和plus Taq DNA聚合酶含量根据扩增检测结果进行调整优化，退火温度设置45℃-65℃的梯度，优化后的扩增条件如下：
PCR扩增体系：2.5μl10×PCR buffer、0.2mmol/L dNTP、模板DNA200ng、0.5U plus Taq DNA聚合酶、上下游引物各2μmol、双蒸水加至总量为25μl；
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；
PCR产物检测：PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TAE，恒定电压150伏；凝胶最后用成像仪检测。
电泳结果显示，仅有引物M3B-2a能够特异、稳定地在Lang的基因组中扩增出1000bp的目标条带，该条带序列与探针wPt-6785序列能够完全匹配。且将该引物在子代中扩增时，与Lang扩增出相同条带的子代均对应感穗发芽基因型，不能扩出与CSCR6相同条带的子代均对应抗穗发芽基因型。将扩增出不同带型的植株对应的发芽率进行t检验，发现差异均达到了显著或极显著水平。
实施例2 本发明分子标记在选择抗穗发芽主效QTLQPhs.sicau-3B.1上的应用试验
1）利用小麦抗穗发芽材料CSCR6为母本，以感穗发芽小麦品种Bellaroi为父本，采用单粒传方法构建得到一个由108份材料组成的F7代重组自交系（RILs）。
2）对所获得的F7子代进行标记检测，具体方法为：在苗期提取F7代单株的基因组DNA；以基因组DNA为底物，以开发出的STS标记M3B-1a、M3B-2a的引物对为引物分别进行PCR扩增，所述引物为：
M3B-1a：
正向引物：5’－3’TGCAGCGTGGTTTGGG
反向引物：5’－3’TGCAGAGTCAAAGAACTATGATAG
M3B-2a：
正向引物：5’－3’TTAGTCCACTGAGAACATGGCG
反向引物：5’－3’ACGTGGGAGGATGTGCAAAG
PCR扩增体系：
M3B-1a：
2.5μl10×PCR buffer、0.75U plus Taq DNA聚合酶、0.2mmol/LdNTP、上下游引物各3μmol、模板DNA200ng、双蒸水加至总量为25μl；
M3B-2a：
2.5μl10×PCR buffer、0.5U plus Taq DNA聚合酶、0.2mmol/LdNTP、上下游引物各2μmol、模板DNA200ng、双蒸水加至总量为25μl；
PCR扩增程序：
M3B-1a：
94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；
M3B-2a：
94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；
PCR产物检测：PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TAE，恒定电压150伏；凝胶最后用成像仪检测
电泳结果发现，用引物对M3B-1a扩增时，有22个子代扩增出了与CSCR6相同的条带，有86个子代没有扩增出与CSCR6相同的条带，而用引物对M3B-2a扩增时，有84个子代扩增出了与Bellaroi相同的条带，有24个子代没有扩增出与Bellaroi相同的条带。预测在用M3B-1a扩增时，扩增出与CSCR6相同条带的材料平均发芽率将会低于不能扩出条带材料的平均发芽率。而用M3B-2a扩增时，能扩增出与Bellaroi相同条带的材料平均发芽率将会高于不能扩出条带材料的平均发芽率。
统计连续两年田间材料表型数据，分析发现，用M3B-1a扩增时，能扩增出与CSCR6相同条带材料的平均发芽率均低于不能扩增出条带的材料；而用M3B-2a扩增时，能扩增出与Bellaroi相同条带材料的平均发芽率均高于不能扩增出条带的材料。分别将在两对引物扩增出的不同条带的材料对应的发芽率进行t检验，发现在有带和无带的材料中，发芽率差异均达到了显著或极显著水平，实际结果与预期结果一致。说明本发明的抗穗发芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1确实有抗穗发芽的作用，同时本发明开发的STS标记M3B-1a、M3B-2a可以共同用于主效QTL QPhs.sicau-3B.1的选择。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0000465442840000011
Figure IDA0000465442840000021
Figure IDA0000465442840000031
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Claims (9)

1.两个用于鉴定小麦新抗穗发芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1的分子标记M3B-1a和M3B-2a，其特征在于，所述分子标记与QPhs.sicau-3B.1之间的遗传距离分别为3.9cM和2.0cM。
2.扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，该两个分子标记的上游引物序列和下游引物序列分别如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.4所示。
3.鉴定权利要求1所述分子标记的方法，其特征在于，
以待鉴定材料的DNA作为模板，分别用如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示的引物对及SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物对模板进行PCR扩增；
分析PCR产物；
能扩增出与CSCR6相同片段的鉴定材料为含有抗穗发芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1的植株，反之则为不含有抗穗发芽主效QTLQPhs.sicau-3B.1的植株。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）以待鉴定材料DNA作为模板，利用SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2所示的引物对模板进行PCR扩增：
a.PCR扩增体系：2.5μl10×PCR buffer、0.75U plus Taq DNA聚合酶、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各3μmol、模板DNA200ng、双蒸水加至总量为25μl；
b.PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸7min；
c.PCR产物检测：PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TAE，恒定电压150伏；凝胶最后用成像仪检测；
2）以待鉴定材料DNA作为模板，利用SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示的引物对模板进行PCR扩增。
a.PCR扩增体系：2.5μl10×PCR buffer、0.5U plus Taq DNA聚合酶、0.2mmol/L dNTP、上下游引物各2μmol、模板DNA200ng、双蒸水加至总量为25μl；
b.PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；
c.PCR产物检测：PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，电极缓冲液为1×TAE，恒定电压150伏；凝胶最后用成像仪检测；
3）鉴定结果为：能扩增出与CSCR6相同片段的植株为含有抗穗发芽主效QTL QPhs.sicau-3B.1的植株；反之，能扩增出与Lang相同片段的植株为不含有该主效QTL的植株。
5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物对在小麦抗穗发芽材料创制中的应用。
6.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物对在分子标记辅助小麦抗穗发芽育种中的应用。
7.含有权利要求2所述的引物对的试剂盒。
8.权利要求7所述的试剂盒在小麦抗穗发芽材料创制中的应用。
9.权利要求7所述的试剂盒在分子标记辅助小麦抗穗发芽育种中的应用。
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