CN103789306B - 一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记及其方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记，所述SNP位点位于水稻基因组11号染色体第6525745位核苷酸，该位点核苷酸由C突变为T，氨基酸由半胱氨酸（Cys）突变为酪氨酸（Tyr），由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列，经特异性酶切之后电泳检测，与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的分子标记。还公开了所述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记PiaSNP的检测方法及其应用，本发明的Pia功能特异性分子标记以PCR技术为基础，不仅能区分水稻品种的基因型，而且能够方便、快捷、直接地实现了目标基因Pia在水稻种质资源以及育种后代中的鉴定，特别是等位基因之间的鉴别，且不受环境以及人为因素的影响。

Description

一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记及其方法与应用

技术领域

本发明涉及一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记及其方法与应用，属于分子生物学和水稻育种领域。

背景技术

稻瘟病是水稻最严重的病害之一。由子囊菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病是一种世界性的水稻流行性病害，全球每年因稻瘟病水稻产量损失约占总产量的10%-15%，稻瘟病还导致稻米品质下降，每年经济损失高达50亿美元。稻瘟病是我国三大水稻病害之一，每年都有不同程度的发生。近年，在西南、长江中游和东北等稻区严重发生，年发病面积330万-570万公顷，产量损失达数亿公斤，严重影响我国水稻生产和粮食安全。防治稻瘟病最有效、最经济、最根本的控制措施是发掘水稻自身的抗性基因资源，培育和利用持久、高抗品种资源。

全基因组关联分析（Genome-wideAssociationStudy，GWAS）是一种对全基因组范围内的常见遗传变异（单核苷酸多态性和拷贝数）总体关联分析的方法，它能够在全基因组范围内进行整体研究，能够一次性对疾病进行轮廓性概览，适用于复杂疾病的研究。在全基因组层面上，开展大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，可以全面揭示疾病发生、发展与治疗相关的遗传基础。与图位克隆法（map-basedcloning）相比，全基因组关联分析具有以下几个方面优点：1）GWAS研究不再需要在研究之前构建任何假设；2）可用自然群体，无需一定是遗传群体，大大缩短了研究年限；3）能够一次性通过监测成千上万个SNPs，对全基因组范围内整体研究；4）GWAS研究的精度大大提高，例如由玉米的作图精度10-30cM（Salvi，2005）提高到GWAS的精度1500bp（Remington，2001）。随着基因组测序技术的提高及测序成本的降低，并结合生物信息学的高度发展，GWAS成为挖掘和剖析水稻抗稻瘟病基因及其相关遗传机制最有效的方法之一。

水稻稻瘟病抗性基因按抗性表现程度可以分为完全抗性和部分抗性两种类型。前者由1-3对主效显性基因控制，也有隐性基因、不完全显性基因、修饰基 因和各种基因互作的控制方式；表现为病菌不能侵染或不能繁殖产生孢子，具有小种特异性，如已报道的Pi-b（Wang等，1999）、Pi-ta（Bryan等，2000）、Pi-9（Qu等，2006）。而后者一般由多个微效基因控制，具有一效多因特征；表现为病叶面积较小，病斑数目较少以及病斑大小较小，具有部分抗性的水稻在一定程度上能控制病原菌的无限繁殖，避免毁灭性病害发生，无小种特异性，具有持久抗性，如pi-21（Fukuoka等，2001）。截至2013年8月，已至少报道68个抗稻瘟病位点共83个主效基因，其中Pi-a、Pb1、Pi-56等24个基因已被成功克隆，主要集中分布在11号、12号及6号染色体上，而在3号染色体至今尚未报道存在与稻瘟病抗性相关位点（www.ricedata.cn/gene）。

发明内容

为解决上述现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记PiaSNP的检测方法。

本发明的再一目的在于提供上述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记PiaSNP的应用。

本发明目的是通过如下技术方案来实现的：

一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记，所述SNP位点位于水稻基因组11号染色体第6525745位核苷酸（Chr11_6525745），该位点核苷酸由C突变为T，氨基酸由半胱氨酸（Cys）突变为酪氨酸（Tyr），由引物对SEQ ID NO.1和SEQIDNO.2从水稻基因组DNA中扩增出来的核苷酸序列，经特异性酶切之后电泳检测，与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的分子标记。

所述引物对的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.1：5’-GCTCCTTCTTCAATTACTGGGAATGGTCGA-3’；

SEQ ID NO.2：5’-CTTGCAGTATCTCAAACTGG-3’。

所述的特异性酶切为SalI酶切。

所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaSNP的检测方法，通过805,158个高质量的SNP对IN366群体进行全基因组关联分析，获得能与稻瘟病抗性基因Pia紧密连锁的1处SNP位点（Chr11_6525745），再通过引物设计分 别得到SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，对水稻DNA扩增得到稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaSNP。

所述的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性分子标记PiaSNP的方法，包含以下步骤：

（1）通过常规PCR法扩增，获得稻瘟病抗性基因Pia的1个等位基因与1个感病等位基因序列；

（2）利用多序列比对软件工具（如MegAlign），将步骤（1）所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到稻瘟病抗性基因Pia所特异的1处单碱基差异，该差异位于该基因的外显子，最终导致功能特异性氨基酸的改变；

（3）根据步骤（2）所得到的1处SNP，设计出引物对SEQ ID NO.1和SEQIDNO.2；并用该引物对对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，所得扩增产物经特异性酶切之后电泳检测验证，获得与稻瘟病抗性基因Pia呈特异性带型的核苷酸片段；

（4）对步骤（3）所获得的分子标记在不同的水稻品种中进行验证，从而确定稻瘟病抗性基因Pia的功能特异性分子标记PiaSNP。步骤（3）中在上述SNP处设计带有错配碱基的功能特异性上游引物PiaSNP-F，如SEQ ID NO.1所示；在上述SNP下游100～200bp处设计功能特异性下游引物PiaSNP-R，如SEQ ID NO.2所示；

进一步的，所述PiaSNP的PCR扩增反应体系如下：

反应在ABI2720PCR仪进行扩增，反应流程如下：94℃预变性2分种；94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30个循环；72℃8分种；4℃保存。

进一步的，PCR结束后，利用限制性内功酶SalI对所获得的PCR产物进行 酶切，反应体系如下：

在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为140V。扩增产物为119bp，能够被酶切的（酶切后为89bp）即为稻瘟病抗性基因Pia的功能特异性分子标记PiaSNP。

所述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记PiaSNP的应用，包括对水稻种质资源的筛选和鉴定，以及作为分子标记辅助育种。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的稻瘟病抗性基因Pia功能特异性SNP位点是通过全基因组关联分析所获得，该技术能够一次性检测到多个核苷酸多态位点，从而有利于大批量地开发功能特异性SNP分子标记。选择标记以PCR技术为基础，可以直接用于稻瘟病抗性基因Pia及其等位基因的鉴别，从而实现分子标记辅助育种。

附图说明

图1为全基因组关联分析获得Chr11_6525745的Mahattan图；

图2为全基因组关联分析获得Chr11_6525745的QQ-plot图；

图3为具有功能特异性SNP的稻瘟病抗性基因Pia的1个Pia等位基因（Resistance）与1个感病等位基因（Sensibility）的氨基酸序列比对图；黑色方框表示由PiaSNP造成的功能特异性氨基酸的改变；

图4为分子标记PiaSNP扩增产物的检测结果。

其中，泳道1为感病品种日本晴；泳道2为抗病品种Chokoto（Pik）；泳道3为抗病品种K59（Pit）；泳道4为抗病品种K1（Pita）；泳道5为抗病品种福锦（Piz）；泳道6为抗病基因Pia供体品种爱知旭（Pia）；泳道7为抗病品种C104PKT（Pia）；泳道8为抗病品种Shimokita（Pia）；泳道9为抗病品种Vsen（Pia）；泳道10为抗病品种新雪（Pia）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP的鉴定。

一、供试材料

选取来自全国各地的具有较高遗传多样性的共366份籼稻地方品种资源（IN366）。使用IlluminaGenomeAnalyzerII测序仪，采用条形码多重测序技术对供试材料进行大约一倍覆盖测序从而进行基因分型，3个额外的已知准确基因组序列的品种也被测序，作为评价序列精度的内部参考序列（日本晴，农垦58，广陆矮4号），已在文献“HuangXH,WeiXH,SangT,etal.Genome-wide associationstudiesof14agronomictraitsinricelandraces.Naturegenetics,2010,42:961-967；HuangXH,ZhaoY,WeiXHetal.Genome-wideassociationstudyoffloweringtimeandgrainyieldtraitsinaworldwidecollectionofricegermplasm.Naturegenetics,2011,44:32-39”公开过。

二、苗瘟鉴定方法

从全国各地收集分布广、致病力强的主要稻瘟菌代表性生理小种。共16个，分别为CH102、CH122、CH131、CH149、CH154、CH159、CH171、CH172、CH182、CH186、CH193、CH212、CH218、CH242、CH251、CH362。采用“特特勃”、“珍龙13”、“四丰43”、“东农363”、“关东51”、“合江18”及“丽江新团黑谷”作为稻瘟病菌生理小种鉴别品种。

1.制备菌种

将琼脂10-15g放入1000ml水中加热溶化，再加入可溶性淀粉（或蔗糖）10g，酵母2g，分装入试管中，进行高压灭菌。取出后制成斜面，接入所采集的稻瘟菌菌种，放在26-28℃恒温箱中培养3-4天后，摇动三角瓶中的大麦粒，使菌丝均匀生长。待菌丝体长满大麦粒并变黑时，用蒸馏水冲洗大麦粒上的菌丝，再将大麦粒薄摊于搪瓷盘中，用1-2层纱布覆盖以保湿，置于25-28℃下培养48小时，即可产生出大量孢子，以备接种之用。

2.育秧

将供试材料的种子进行粒选，各取30-40粒，用抗菌素402浸种3天后，用清水冲洗后催芽1-2天，播于育秧盘内（每盘6行、10列），3次重复。在幼苗2叶期定株，每份材料选留10株生长一致的秧苗。定株后酌施2-3次氮肥，最后一次施氮肥应在接种前3-4天施用，使幼苗嫩绿。

3.接种

当秧苗达3-4叶期时接种，先按病菌小种分别配制孢子悬浮液，用100倍显微镱检测孢子密度，平均每个视野应有孢子20-25个（孢密度则为20-25万个/ml）。采用专用喷雾器喷雾接种，喷雾时要将叶片充分均匀湿润。接种后，在温度26-28℃、湿度在70-85%条件下，用薄膜覆盖保湿24小时。然后移至室外，在20-30℃下保持高湿。接种时，日平均气温25-28℃和阴雨高温，叶面长时间（12小时以上）持有水珠的时期，最有利于发病。

4.病情鉴定

一般在接种后7天左右进行病情鉴定。病情鉴定的方法参考国际水稻研究所（InternationalRiceResearchInstitute，IRRI）将稻瘟病的抗性分级标准分为10级。0级：叶上无病斑；1级：病斑为针头大小的褐点；2级：褐点稍大；3级：圆形至椭圆形的灰色病斑，边缘褐色，病斑直径1-2mm；4级：梭形病斑，长1-2cm通常局限于两条叶脉间，受害面积不超过叶面积的2%；5级：梭形病斑，受害面积不超过叶面积的10%；6级：梭形病斑，受害面积不超过叶面积的11-25%；7级：梭形病斑，受害面积不超过叶面积的26-50%；8级：梭形病斑，受害面积不超过叶面积的51-75%；9级：全叶枯死。

三、全基因组关联分析

为了在较多的显著关联信号中鉴定到唯一可能的因果突变基因，计算同一染色体上的显著性信号位点，过滤掉最小等位基因（MAF）小于0.05的SNP位点。使用805,158个高质量的SNP对IN366群体采用优化后混合线性模型（CompressedMixedLinearModel）校正群体结构效应后，与16个稻瘟病菌种抗性表型进行高密度标记的全基因组关联分析。

为了降低假阳性频率，本研究使用5%基因组显著性阈值筛选关联位点（P<10^-8）（建议水平显著性阈值为1/N=2.17×10^-7以及5%基因组显著性阈值为0.05/N=1.09×10^-8）。在定位到的单一的显著性信号中，有若干个位点位于或者临近于（±100Kb）被前人证实报道过的已知基因内，它们在本研究中再次得到了验证。与已知的稻瘟病抗性相关基因较远的关联位点很可能是与稻瘟病抗性相关基因紧密连锁，则距离最近的稻瘟病抗性基因很可能就是本研究的候选基因。

利用366份材料关联分析结果发现，其位于水稻基因组（RiceAnnotationProjectDatabase，http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）Chr11_6525745的SNP位点（图1， 图2），由T突变为C，氨基酸由半胱氨酸（Cys）突变为酪氨酸（Tyr），如图3所示，为具有功能特异性SNP的稻瘟病抗性基因Pia的1个Pia等位基因（Resistance）与1个感病等位基因（Sensibility）的氨基酸序列比对图；黑色方框表示由PiaSNP造成的功能特异性氨基酸的改变。其中T为最大等位基因，C为最小等位基因，最小等位基因频率为0.25，图1为全基因组关联分析获得Chr11_6525745的Mahattan图；图2为全基因组关联分析获得Chr11_6525745的QQ-plot图；该位点与水稻抗稻瘟病性状极显著相关，能解释16.37%的表型变异，该位点与水稻稻瘟病抗性基因Pia紧密连锁。

表1所示：a在检测到的极显著的抗稻瘟病相关性状中最极显著相关的性状；b主效SNP的位置根据水稻参考基因组序列确定（RiceAnnotationProjectDatabase，http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）；c第一个为最大等位基因；d优化后混合线性模型的计算过程使用EMMA软件完成；e给出的基因的名称是所定位的极显著位点内极可能相关的功能候选基因或者与最极显著关联SNP（主效SNP）最近的已注释基因；f所用的候选基因基于RiceAnnotationProjectDatabase（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）所注释的基因。

实施例2：一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记及其引物设计与检测

根据dCAPS的设计原理（NeffMM,TurkE,KalishmanM.Web-basedprimerdesignforsinglenucleotidepolymorphismanalysisTRENDSinGenetics,2002,18(12):613-615.）在上述SNP上游100～200bp处设计上游引物PiaSNP-F，如SEQ IDNO.1所示；在上述SNP处设计带有错配碱基的下游引物PiaSNP-R，如SEQ ID NO.2所示。通过这组引物对携带Pia基因以及其他等位基因的稻种资源DNA进行扩增，得到扩增产物后进行酶切电泳验证。

PiaSNP的PCR扩增反应体系如下：

反应在ABI2720PCR仪进行扩增，反应流程如下：94℃预变性2分种；94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，30个循环；72℃8分种；4℃保存。

PCR结束后，利用限制性内功酶SalI对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系如下：

在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为140V。扩增产物为119bp，能够被酶切的（酶切后为89bp）即为稻瘟病抗性基因Pia的功能特异性分子标记PiaSNP。

采用含有不同的稻瘟病抗性基因的8个稻种资源（分别为）的基因组DNA，并以此为模板，利用分子标记PiaSNP进行PCR扩增、酶切、电泳检测。电泳结果如图4所示，含有抗性基因Pia和不含有抗性基因Pia的稻种资源能够被鉴定区分。因此，本发明中抗性基因Pia的SNP分子标记可以用于鉴别稻种资源中是否含有稻瘟病抗性基因Pia或其等位基因，从而指导育种。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记及其方法与应用

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>1

gctccttctt caattactgg gaatggtcga 30

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<400>2

cttgcagtat ctcaaactgg 20

Claims (2)

1.一种稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP位点位于水稻基因组11号染色体第6525745位核苷酸(Chr11_6525745)，该分子标记位点核苷酸由C突变为T，氨基酸由半胱氨酸(Cys)突变为酪氨酸(Tyr)，该分子标记为由引物对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2从水稻基因组DNA中扩增出来并能够被特异性酶切的核苷酸序列，即为确定稻瘟病抗性基因Pia的功能特异性分子标记PiaSNP；

所述引物对的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.1：5’-GCTCCTTCTTCAATTACTGGGAATGGTCGA-3’；

SEQ ID NO.2：5’-CTTGCAGTATCTCAAACTGG-3’；

所述的特异性酶切为Sal I酶切；

所述水稻为福锦。

2.权利要求1所述稻瘟病抗性基因Pia的SNP分子标记PiaSNP的应用，包括对水稻种质资源的筛选和鉴定，以及作为分子标记辅助育种方面的应用。