CN112175965B - 增强水稻稻瘟病和白叶枯病抗性的基因、蛋白及提高水稻稻瘟病和白叶枯病抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了增强水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的基因Os08g0190300、蛋白及其应用，所述基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码一种NBS‑LRR类蛋白，由1032个氨基酸组成。本发明从水稻品种红脚占中克隆并鉴定到控制水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的基因Os08g0190300。本发明通过构建基因过表达载体pC1300s‑Os08g0190300，借助农杆菌介导的水稻成熟胚遗传转化技术获得基因过表达植株，通过对野生型和转基因植株进行接种实验，结果显示过表达Os08g0190300提高了水稻植株对稻瘟病菌和白叶枯病菌的抗性，表明该基因同时具有抗稻瘟病和抗白叶枯病的功能。

Description

增强水稻稻瘟病和白叶枯病抗性的基因、蛋白及提高水稻稻 瘟病和白叶枯病抗性的方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及稻瘟病抗性基因与白叶枯病抗性基因及其编码蛋白与应用及提高水稻稻瘟病和白叶枯病抗性的方法。
背景技术
水稻是一种重要的粮食作物，随着世界人口数量的逐步增长，人类对水稻产量的需求在逐步提高，因此维持水稻的稳定生产和供给平衡是粮食安全的重要保证。水稻病害是影响水稻生产的重要因素之一，降低病害对水稻生产的影响是保障粮食安全的重要工作。稻瘟病和白叶枯病分别是由稻瘟病菌和白叶枯病菌引起的最为严重的真菌性病害和细菌性病害，每年我国因这两种病害流行造成的产量损失巨大。实践表明，种植抗病品种是防治病害流行最经济有效的方式。
抗病基因克隆是研究抗病机制，选育抗病品种的理论基础。截止目前已经报道了水稻基因组上百个稻瘟病抗性基因和近40个白叶枯病抗性基因。NLR蛋白是一类重要的抗病蛋白，其氨基端为核酸结合位点(Nucleotide-binding-site，NBS)结构域，羧基端为富亮氨酸重复(Leucine-rich repeat,LRR)结构域。研究表明，NBS结构域具有保守基序，通常作用为结合和水解ATP、GTP；LRR结构域具有互作功能，决定基因抗谱，不同NLR蛋白的LRR结构域在重复片段的数量、长短及组合上差别较大，造成基因的抗谱差异多样。在已经克隆的稻瘟病抗性基因中，多数均属于NLR蛋白编码基因，而在已克隆的白叶枯病抗性基因中，Xa1也编码NLR蛋白，说明NLR蛋白在水稻抗病应答过程中具有重要作用。
在植物体内存在两种免疫机制，即病原菌相关分子模式(Pathogen-associatedmolecular patterns)诱导的免疫反应(PAMP triggered immunity,PTI)和效应子触发的免疫反应(Effector triggered immunity,ETI)。在植物细胞内部，NLR蛋白主要参与ETI免疫过程，作用为识别病原菌分泌的效应分子，触发迅速强烈的免疫反应植物免疫反应，抑制病原菌生长。
目前，尽我们所知，并没有NLR蛋白同时调控水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的报道。同时抗稻瘟病和白叶枯病的水稻抗病相关基因具有重要价值，鉴定此类抗病相关基因对于深入研究水稻抗病的分子机制，改良水稻品种抗性具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种提高水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的基因Os08g0190300。为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种水稻基因Os08g0190300，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的在于提供一种提高水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的蛋白。为实现上述目的，采用以下技术方案：
一种提高水稻稻瘟病抗性和白叶枯病抗性的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
获得上述基因Os08g0190300的引物对，其正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示。
含有水稻基因Os08g0190300的植物表达载体，所示载体含有CaMV35S强启动子。
本发明还提供了水稻基因Os08g0190300在水稻抗稻瘟病和抗白叶枯病中的应用，可以通过该基因的过量表达进行水稻遗传改良
本发明还提供了一种提高水稻稻瘟病和白叶枯病抗性的方法，其特征在于：将基因Os08g0190300进行克隆并构建至植物表达载体，借助该载体将基因转化至水稻体内获得过表达植株后代。
通过本发明的实验验证，将含有水稻基因Os08g0190300的植物表达载体转化至农杆菌EHA105，借助农杆菌介导的水稻成熟胚转化技术获得Os08g0190300过表达植株，对转基因植株进行白叶枯病和稻瘟病鉴定，抗性鉴定结果表明，过表达水稻基因Os08g0190300使得水稻对稻瘟病和白叶枯病的抗性显著增强。本发明具有以下有益效果：
本发明的水稻基因Os08g0190300在水稻中高表达之后相比于野生型水稻可显著提高抗稻瘟病和抗白叶枯病的能力。
附图说明
图1为基因Os08g0190300过表达载体图谱；
图2为转基因水稻表达量分析；
图3为转基因植株接种稻瘟病菌生理小种CH182的抗病性实例对照图；
图4为转基因植株接种白叶枯病菌生理小种CR1的抗病性实例对照图。
具体实施方式
实施例1
(1)总RNA的提取与反转录反应
选用水稻品种红脚占，经浸种催芽后播种于准备好的土壤中，放置于植物培养箱中生长，条件为32℃光照14h/28℃黑暗10h。待水稻幼苗生长至四叶一心期间取幼嫩叶片，使用RNA提取试剂盒(Takara)提取叶片总RNA，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。取5μLRNA样品进行反转录反应(50μL体系，Takara)合成第一链cDNA，反应程序为37℃，15min；85℃，5s。
(2)水稻基因Os08g0190300的克隆与植物表达载体构建
引物设计(5’端添加有载体同源克隆序列)：
Kpn1-F：tcgcgagctcggtacATGACGGAGGGCGTGGTGAAGT(SEQ ID NO.3)
Xba1-R：gcctgcaggtcgactCTATTTGGGGGCAGTCATCACC(SEQ ID NO.4)
以第一步中获得的第一链cDNA为模板，使用高保真聚合酶KOD-PLUS-NEO(Toyobo)进行PCR扩增，反应体系为50μL(2μL cDNA模板，各1.5μL正反引物，3μL MgSO4，5μL 10×Buffer，5μL dNTP，1μL KOD-PLUS-NEO，31μL H2O)，反应程序为：95℃5min；98℃15s，55℃30s，68℃2min；34个循环，68℃5min。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取3.1kb左右的条带进行回收(DNA回收试剂盒，Axygen)。使用Kpn1和Xba1限制性内切酶对1300s(图1)进行双酶切反应，反应体系50μL(5μL质粒，10×M Buffer，2.5μL Kpn1,2.5μL Xba1，30μL H2O)，37℃水浴4h后进行纯化回收获得线性化质粒(DNA回收试剂盒，Axygen)。使用10μL重组连接体系(Multi S，Vazyme)进行片段与质粒的连接反应，37℃水浴30min，连接完成后立即转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，并涂布LB平板(含50mg/L卡那霉素)。待平板生长出单克隆以后进行菌落PCR鉴定阳性克隆，测序正确的克隆进行扩繁并提取质粒备用(质粒小量提取试剂盒，Axygen)。
(3)转基因植株获得
将步骤2中获得的重组表达质粒通过电击法转化至农杆菌感受态细胞EHA105，进一步通过水稻成熟胚遗传转化技术将携带有目的基因的T-DNA片段导入水稻粳稻品种KL，对获得的转基因阳性植株进行qRT-PCR验证基因表达量(图2)。
实施例2
1)Os08g0190300转基因水稻抗稻瘟病鉴定：
将转基因植株和对照亲本KL于装有10cm厚土壤的塑料方盘中正常培养至三叶一心时期，喷雾接种稻瘟病菌CH182孢子液，孢子浓度为1×10-5个/mL，用定制的有机玻璃罩子盖住幼苗保湿，随后放入26℃环境中保持黑暗24h，再转移至正常光照条件(32℃光照14h/28℃黑暗10h)继续保湿培养，7d后调查发病情况。水稻植株稻瘟病发病情况如图3所示，对照品种KL具有较大的病斑面积，叶片组织出现多处坏死，过表达植株表现出较少的病斑面积，并未发现严重坏死斑点，说明过表达Os08g0190300可提高水稻的抗稻瘟病能力。
2)Os08g0190300转基因水稻抗白叶枯病鉴定：
将转基因植株和对照品种KL种植于转基因试验田，正常肥水管理，待生长至孕穗期接种白叶枯病菌。接种方法采用叶片剪口法，剪口三周后调查发病情况。水稻植株叶片发病情况见图4，对照植株具有较长的白色病斑，而过表达植株的病斑长度则显著较短，说明Os08g0190300过表达植株可显著提高水稻的白叶枯病抗性。
以上所述为本发明的较佳实施案例，凡以本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Figure BDA0002114255730000061
Figure BDA0002114255730000071
Figure BDA0002114255730000081

Claims (3)

1.一种水稻基因Os08g0190300在增强水稻对稻瘟病和白叶枯病抗性中的应用，其特征在于：所述基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种蛋白在增强水稻对稻瘟病和白叶枯病抗性中的应用，其特征在于：所述蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一种提高水稻稻瘟病和白叶枯病抗性的方法，其特征在于：将基因Os08g0190300进行克隆并构建至植物表达载体，借助该载体将基因转化至水稻体内获得过表达植株后代，所述基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
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