CN112779271A

CN112779271A - 水稻基因OsFd2及其在水稻抗稻瘟病中的应用

Info

Publication number: CN112779271A
Application number: CN202110347668.3A
Authority: CN
Inventors: 王莫; 陆民锋; 时华
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2021-03-31
Filing date: 2021-03-31
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2041-03-31
Also published as: CN112779271B

Abstract

本发明提供了一种水稻基因OsFd2及其抗稻瘟病的应用，本发明采用CRISPR/Cas9的方法对水稻基因OsFd2进行敲除，并通过过表达载体遗传转化方法进行突变体植株表型回补。分别对野生型、敲除突变体与过表达回补植株进行稻瘟病菌接种实验。结果显示，敲除OsFd2明显提高了水稻植株对稻瘟病菌的抗性，但产生苗期致死表型；而OsFd2过表达回补植株与突变体相比，生长恢复正常，表现为比野生型更感稻瘟病。上述结果表明，OsFd2为负调控水稻抗稻瘟病免疫的基因，也是水稻正常生长所必需的关键基因。本发明内容为田间稻瘟病发生时通过诱导沉默方式提高水稻抗性提供一种内源基因靶标。

Description

水稻基因OsFd2及其在水稻抗稻瘟病中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水稻基因OsFd2及其在抗稻瘟病中的应用。

背景技术

水稻（Oryza sativa）是我国最重要的粮食作物，水稻的稳定高产是我国粮食安全的重要保障。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起稻瘟病长期以来都是危害水稻生产的最严重真菌病害。我国每年由稻瘟病直接造成的稻米损失高达30亿公斤，发病严重时可导致水稻减产40%-50%，甚至绝收。

植物依靠自身的免疫体系可以对外界病原微生物侵染产生快速、有效的防御反应。植物先天防御系统主要由两个层次的免疫反应组成，即病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）激发的免疫反应（PAMP-triggered immunity，PTI）和效应蛋白激发的免疫反应（Effector-triggered immunity，ETI）。在病原菌侵染植物早期，定位于植物细胞膜表面的模式识别受体，包括类受体激酶（RLKs）或类受体蛋白（RLPs），识别病原菌保守的PAMPs，从而激活PTI反应。这一层次的防御反应包括ROS（Reactive Oxygen Species）爆发、抗性基因表达、胼胝质沉积等。为突破植物的PTI防御体系，病原菌通过向植物细胞内或胞间质区分泌效应因子（effectors）以阻碍PTI的反应通路。而植物可以进一步通过一类结构保守的抗性（R）蛋白识别病原菌所产生的effectors，进而激活具有病原小种特异性且常伴有局部细胞死亡（hypersensitive response）的ETI反应。

越来越多的研究表明，叶绿体作为植物进行光合反应的细胞器也在抗病反应中发挥重要作用。叶绿体铁氧化还原蛋白（Ferredoxin，Fd）分布于基质中，是光合反应电子传递过程中最上游的可溶电子受体，负责将电子传递到下游各代谢反应通路。因此，Fd 对于调控植物细胞内的氧化还原状态起着关键作用。我们之前的研究表明，敲除拟南芥叶绿体中主要形式Fd蛋白编码基因的突变体Fd2-KO表现为对PstDC3000和白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）更为感病，且Fd2-KO在PTI激活时产生的ROS的积累水平也显著低于野生型。上述感病表型可能是由于Fd2-KO在受到病原菌侵染的情况下，体内积累高水平的茉莉酸（JA），进而抑制了水杨酸（SA）介导的抵抗活体病原菌的免疫信号通路。此外，已有报道发现，在水稻中异源表达甜椒Fd类似蛋白AP1可以增强转基因植株对白叶枯病原菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，Xoo）的抗性。以上结果说明叶绿体Fd蛋白在植物免疫反应通路中发挥重要的调控作用。

截止目前，尚没有关于水稻中叶绿体Fd编码基因在水稻抗稻瘟病应用中的报道。本发明研究发现，采用生物技术手段降低水稻OsFd2的表达水平，可提高水稻抗稻瘟病能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻基因OsFd2及其在水稻抗稻瘟病中的应用，具体采用CRISPR/Cas9方法对OsFd2基因进行敲除以及过表达载体转化进行突变体回补，明确了OsFd2基因对水稻稻瘟病抗性的负调控功能，为防控稻瘟病发生提供可调控的内源基因靶标。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种水稻基因OsFd2，其开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述水稻基因OsFd2编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种水稻基因OsFd2在水稻抗稻瘟病中的应用，其具体操作包括：在OsFd2基因的开放阅读框编码区中选取两个靶位点，构建OsFd2敲除载体，然后将重组质粒转化至根癌农杆菌中，借助农杆菌介导的水稻成熟胚转化技术获得OsFd2敲除突变体。构建OsFd2过表达载体，借助农杆菌介导转化OsFd2杂合敲除突变体成熟胚愈伤组织，获得过表达回补植株。对上述遗传材料进行稻瘟病菌喷雾接种后，鉴定发病表型。

上述敲除靶位点的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

水稻基因OsFd2在水稻抗稻瘟病中的应用，敲除OsFd2基因明显提高水稻对稻瘟病的抗性；而过表达回补植株则表现为比野生型更为感病。

本发明具有以下有益效果：

本发明的水稻基因OsFd2敲除之后，与野生型水稻相比显著提高了抗稻瘟病的能力，该基因为防控稻瘟病发生提供可调控的内源基因靶标。

附图说明

图1中间载体SK-gRNA中OsU3: gRNA的结构图。

图2双元载体pC1300-Cas9中2×35S：Cas9的结构图。

图3 OsFd2敲除突变体的鉴定。 Reference：为参考基因序列；osfd2为OsFd2基因纯合突变株系。

图4 OsFd2敲除突变体及过表达回补植株生长表型鉴定。ZH11：野生型水稻品种中花11；osfd2：OsFd2基因纯合突变植株； osfd2/UBQ:OsFd2：OsFd2过表达回补植株。

图5 OsFd2敲除突变体喷雾接种调查结果。Guy11：稻瘟病菌Guy11；ZH11：野生型水稻品种中花11；osfd2：OsFd2基因纯合突变植株。

图6 OsFd2过表达回补植株转录水平鉴定以及喷雾接种调查结果。Guy11：稻瘟病菌Guy11；ZH11：野生型水稻品种中花11；osfd2/UBQ:OsFd2：OsFd2过表达回补植株。

具体实施方式：

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1 OsFd2基因的获得

利用拟南芥中 Fd2 的蛋白序列在 NCBI 数据库中进行序列比对，我们确定基因号为LOC_Os08g01380 和 LOC_Os03g61960的两个水稻中拟南芥Fd2的同源蛋白，其相似度分别为 72% 和 68%。LOC_Os08g01380 和 LOC_Os03g61960基因编码的蛋白长度分别为139 和 153 个氨基酸，且其 N 端都具有叶绿体定位信号肽。根据 NCBI 网站上对水稻品种日本晴基因组中该基因的预测 cDNA 序列（XM_015794929.2），我们成功从中花11叶片总cDNA中克隆到 OsFd2 的开放阅读框，全长 420 bp，经测序发现与预测序列一致。克隆OsFd2开放阅读框所用引物的核苷酸序列如下：

OsFd2ORF-F SEQ ID NO.5：5’-ATGGCGGCGACGGCACTGAG-3’，

OsFd2ORF-R SEQ ID NO.6：5’-TTAGATGAGGTCGTCCTCCT-3’

通过实时荧光定量PCR检测发现，在正常生长的水稻品种中花11叶片中，LOC_Os08g01380 的转录水平约为 LOC_Os03g61960的35倍，这表明LOC_Os08g01380编码蛋白是水稻叶片中Fd 的主要存在形式。因此，我们将 LOC_Os08g01380 和 LOC_Os03g61960 分别命名为OsFd2 和 OsFd1。据此，我们推测 OsFd2 可能在水稻免疫反应激活过程中具有重要调节作用。所述OsFd2基因的开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2 OsFd2敲除载体的构建

在OsFd2基因的开放阅读框编码区中选取两个靶位点（序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示），构建gRNA表达盒，然后将两个靶标gRNA表达盒连接到敲除载体pC1300-Cas9中，获得OsFd2敲除载体。详细载体构建方法参照专利“植物多基因敲除载体的构建及应用，ZL201510485573.2”，具体如下：

（1）靶标序列的选择及引物设计

在OsFd2基因的开放阅读框编码区中找含有5’-（N）_X-NGG-3’结构的靶标序列，其中N表示A、T、C和G中的任意一个，X为19。根据以上原则设计两条靶标序列，分别为OsFd2-T1和OsFd2-T2，序列如：

OsFd2-T1 SEQ ID NO.3：5’-TTGCCGATGTCCCTGCGGGTGG-3’

OsFd2-T2 SEQ ID NO.4：5’-TGCCGGCGAGCAACAAGCTGGG-3’

设计用于构建gRNA的引物对：在OsFd2-T1和OsFd2-T2正向序列前加GGCA获得引物OsFd2-T1F和OsFd2-T2F；在OsFd2-T1和OsFd2-T2反向互补序列前加AAAC，获得引物OsFd2-T1R和OsFd2-T2R。具体序列如下：

OsFd2-T1F SEQ ID NO.7：5’-ggcaTTGCCGATGTCCCTGCGGG -3’，

OsFd2-T1R SEQ ID NO.8：5’-aaacCCCGCAGGGACATCGGCAA -3’;

OsFd2-T2F SEQ ID NO.9：5’-ggcaTGCCGGCGAGCAACAAGCT -3’，

OsFd2-T2R SEQ ID NO.10：5’-aaacAGCTTGTTGCTCGCCGGCA -3’

（2）单个gRNA表达盒的构建：

SK-gRNA（图1）进行AarI酶切(购自Ferment公司)，形成带有粘性末端的载体，酶切反应体系如下：

37℃酶切3小时，用Biomed胶回收试剂盒（Biomed，DR0103）按产品说明书进行纯化；得线性载体SK-gRNA/AarI。

100μM的引物OsFd2-T1F与OsFd2-T1R各20μL混合，100℃放置5分钟后置于室温，逐渐冷却，变性退火，形成带有粘性末端的片段。将载体和片段进行T4酶（购自NEB公司）连接，反应如下：

室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。用SK上的引物T7 SEQ ID NO.11：5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’，测序确定克隆构建正确，获得gRNA表达盒SK-gRNA-1。同样利用引物对OsFd2-T2F/T2R的退火产物与线性载体SK-gRNA/AarI连接获得SK-gRNA-2。

(3) SK-gRNA-1与SK-gRNA-2的聚合

利用Bam HI和BglII是同尾酶的属性，进行两个SK-gRNA中间载体的聚合。SK-gRNA-1质粒用BamH I和KpnI双酶切，用Biomed胶回收试剂盒（Biomed，DR0103）按产品说明书进行纯化，得线性载体SK-gRNA-1/BamH I+KpnI。SK-gRNA-2质粒用BglII和KpnI双酶切，切胶回收约0.56 kb大小的SK-gRNA-2/Bgl II+KpnI片段；将gRNA-2片段连入SK-gRNA-1载体的BamH I和KpnI识别位点间，获得SK-gRNA-1-gRNA-2质粒。

载体和片段进行T4酶（购自NEB公司）连接反应如下：

室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。用SK上的通用引物T7 SEQ ID NO.11: 5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’和T3 SEQ ID NO.12: 5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’ 菌落PCR检测克隆是否成功。当扩增得到约1.1 kb条带时，判定克隆成功；反之，则为克隆不成功。

（4）靶标gRNA表达盒与敲除载体pC1300-Cas9的连接

SK-gRNA-1-gRNA-2质粒用Bgl II和Kpn I双酶切，切胶回收约1.1 kb大小的条带，将此片段连入pC1300-Cas9（图2）双元载体的Kpn I和BamH I识别位点间，得到最终敲除OsFd2的双元表达载体pC1300-Cas9-SK-gRNA-1-gRNA-2。

连接反应如下：

室温反应1小时。连接产物5μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。

用引物pC1300-F SEQ ID NO.13：5’-ACACTTTATGCTTCCGGCTC-3’，OsFd2-T2R测序确定克隆构建正确。当测序结果与设计序列比对相符合时，判定构建正确；反之，则为构建不正确。

实施例3 OsFd2敲除突变体的获得

将测序正确的双元表达载体pC1300-Cas9-SK-gRNA-1-gRNA-2通过电击的方法转化到根癌农杆菌EHA105中，转化子验证无误后，进行水稻粳稻品种中花11愈伤组织转化，以获得OsFd2基因敲除突变体水稻植株。

实施例4 OsFd2敲除突变体的验证

在OsFd2基因靶位点前后两端附近设计引物，引物序列分别为

OsFd2-F SEQ ID NO.14：5’-CTTGCTAGCTCACTCCTCT-3’和OsFd2-R SEQ ID NO.15：5’-GGAGCTTGCTTGATTGATT-3’，以OsFd2杂合敲除突变体后代分离水稻单株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物经测序比对，结果见图3所示。

实施例5 OsFd2过表达载体的构建

将OsFd2开放阅读框构建到含有新霉素抗性植物筛选标记的过表达载体（购自杭州百格生物公司，BGV007）上，进行突变体植株回补转化。载体构建方法具体如下：

（1）引物设计

采用双酶切方法将5’端融合HA标签DNA序列的OsFd2全长开放阅读框片段构建到BGV007过表达载体（购自杭州百格生物公司）上，载体上选择酶切位点为Kpn1与BamH1。为构建以上载体，克隆OsFd2开放阅读框所用引物的核苷酸序列如下：

OsFd2-2F SEQ ID NO.16：5’-ACTGGGTACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTCCAATACTTATGGCGGCGACGGCACTGAG-3’，OsFd2-2R SEQ ID NO.17：5’-ACTGGGATCCTTAGATGAGGTCGTCCTCCT-3’。

（2）目的片段获得

使用引物OsFd2-2F与OsFd2-2R，以水稻基因组为模板，通过PCR扩增得到5’端融合HA DNA序列的融合片段HA-OsFd2。扩增产物用Biomed胶回收试剂盒（Biomed，DR0103）按产品说明书进行纯化。

（3）酶切连接、转化验证获得目的载体

将目的基因片段HA-OsFd2与BGV007载体分别进行酶切，酶切反应体系如下：

37℃酶切5小时，酶切产物用Biomed胶回收试剂盒（Biomed，DR0103）按产品说明书进行纯化。然后，通过T4连接酶进行连接，连接反应如下：

16℃过夜，连接产物10 μL转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到连接质粒。用引物OsFd2ORF-F与 OsFd2ORF-R测序确定克隆构建正确。当测序结果与设计序列比对相符合时，判定构建正确；反之，则为构建不正确。

实施例5 回补植株的获得

将测序正确的过表达载体BGV007-HA-OsFd2通过电击的方法转化到根癌农杆菌EHA105中，转化子验证无误后，进行OsFd2杂合敲除突变体成熟胚愈伤组织转化，以获得OsFd2纯合敲除突变体过表达回补植株。

实施例6 回补植株的鉴定

在BGV007载体上设计转化植株鉴定引物，其序列如下：

BGV007-F SEQ ID NO.18：5’-AGCCCTGCCTTCATACGCTA-3’ BGV007-R SEQ IDNO.19：5’-TGCCAAATGTTTGAACGATC-3’

以过表达回补T0代转基因植株基因组DNA为模板进行PCR扩增，能扩增出约500 bp大小条带的为阳性转化植株。以筛选得到阳性植株DNA为模板，使用鉴定引物OsFd2-F与OsFd2-R再次进行PCR扩增，经PCR测序比对，确定OsFd2纯合敲除突变体背景下的过表达回补植株osfd2/UBQ:OsFd2。经实时荧光定量PCR检测分析表明，osfd2/UBQ:OsFd2植株中OsFd2的转录水平显著高于在野生型中的转录水平。

实施例7 OsFd2敲除突变体与回补植株喷雾接种鉴定

将水稻中花11和OsFd2的杂合敲除突变体后代分离水稻植株与回补植株置于人工智能培养箱培养。同时观察其生长表型，结果见图4所示。在中花11与OsFd2的杂合敲除突变体后代分离水稻植株培养至2周时，进行喷雾接种稻瘟病菌株Guy11孢子液（浓度约为1×10⁵个/mL）；在中花11与回补植株培养至3周时，进行喷雾接种稻瘟病菌Guy11孢子液（浓度约为2×10⁵个/mL）。接种后，26℃黑暗保湿培养24小时后，转移到正常光照条件下继续培养。3天后比较中花11与OsFd2纯合敲除突变体的发病情况；5天后比较中花11与回补植株发病情况。结果见图5所示，与野生型中花11相比OsFd2纯合敲除突变体几乎没有病斑出现，表明OsFd2基因的敲除突变可以显著增强水稻对稻瘟病的抗性；而回补植株与野生型中花11相比，发病更为严重，结果见图6所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 水稻基因OsFd2及其在水稻抗稻瘟病中的应用

<130> 19

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcggcga cggcactgag cagccaggtc cggttgccga tgtccctgcg ggtggcgacg 60

gcgccggcgc cggcgcgcgt gtcggtgctg ccggcgagca acaagctggg agacaggctg 120

cggatgcagg cgacgtacaa cgtgaagctg atcacaccgg acggcgaggt ggagctgcag 180

gtgccggacg acgtgtacat cctggaccag gcggaggagg aagggatcga cctgccttac 240

tcctgccgcg cgggctcctg ctcctcctgc gccggcaagg tggtctccgg cgagatcgac 300

cagtccgacc agagcttcct cgacgacgac caggttgccg ccggctgggt cctcacctgc 360

cacgcctacc ccaagtccga cgtcgtcatc gagacccaca aggaggacga cctcatctaa 420

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Ala Thr Ala Leu Ser Ser Gln Val Arg Leu Pro Met Ser Leu

1 5 10 15

Arg Val Ala Thr Ala Pro Ala Pro Ala Arg Val Ser Val Leu Pro Ala

20 25 30

Ser Asn Lys Leu Gly Asp Arg Leu Arg Met Gln Ala Thr Tyr Asn Val

35 40 45

Lys Leu Ile Thr Pro Asp Gly Glu Val Glu Leu Gln Val Pro Asp Asp

50 55 60

Val Tyr Ile Leu Asp Gln Ala Glu Glu Glu Gly Ile Asp Leu Pro Tyr

65 70 75 80

Ser Cys Arg Ala Gly Ser Cys Ser Ser Cys Ala Gly Lys Val Val Ser

85 90 95

Gly Glu Ile Asp Gln Ser Asp Gln Ser Phe Leu Asp Asp Asp Gln Val

100 105 110

Ala Ala Gly Trp Val Leu Thr Cys His Ala Tyr Pro Lys Ser Asp Val

115 120 125

Val Ile Glu Thr His Lys Glu Asp Asp Leu Ile

130 135

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgccgatgt ccctgcgggt gg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgccggcgag caacaagctg gg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggcggcga cggcactgag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttagatgagg tcgtcctcct 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcattgccg atgtccctgc ggg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaaccccgca gggacatcgg caa 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggcatgccgg cgagcaacaa gct 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaacagcttg ttgctcgccg gca 23

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

taatacgact cactatagg 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

attaaccctc actaaaggga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acactttatg cttccggctc 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cttgctagct cactcctct 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggagcttgct tgattgatt 19

<210> 16

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

actgggtacc atgtacccat acgatgttcc agattacgct ccaatactta tggcggcgac 60

ggcactgag 69

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

actgggatcc ttagatgagg tcgtcctcct 30

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

agccctgcct tcatacgcta 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tgccaaatgt ttgaacgatc 20

Claims

1.水稻OsFd2基因在增强水稻对稻瘟病菌的抗性中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsFd2基因的开放阅读框核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：在OsFd2基因的开放阅读框编码区中选取两个靶位点，构建OsFd2敲除载体，然后将重组质粒转化至根癌农杆菌中，借助农杆菌介导的水稻成熟胚转化技术获得OsFd2敲除突变体；构建OsFd2过表达载体，借助农杆菌介导转化OsFd2杂合敲除突变体成熟胚愈伤组织，获得过表达回补植株。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述靶位点的序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。