CN102433311B - 一种调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR及其基因和应用。本发明提供了一种调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明还提供了编码上述调控植物花药开裂相关蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，以及包含该基因的重组载体及其应用。本发明的基因与植物育性相关，能提高植物花药开裂率和结实率，对于提高粮食产量及二系杂交小麦理论的发展具有十分重要的理论和实际意义。

Description

一种调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR及其基因和应用。

背景技术

现代农业生产中，人们广泛利用杂种优势来改良品种。杂种优势是指两个遗传组成不同的亲本杂交产生的杂种一代在生活力、生长势、繁殖力、抗逆性、产量和品质上比其双亲优势的现象。杂种优势利用被认为是今后小麦生产水平大幅度提高的主要途径。雄性不育是植物界一种普遍存在的现象。雄性不育(male sterility)是指植物因不能产生有功能的花粉囊、花粉或者雄配子而导致的不育。

茉莉酮酸酯类(Jasmonates，JA)做为植物应答外界生物或非生物胁迫以及调控植物生长发育过程的一种重要的植物激素，在植物体内广泛存在。MeJA做为茉莉酮酸酯类的甲基酯类化合物与1962年首次从素馨的精油中被分离出来(Demole et al.，1962)。然而20年后人们才真正发现了MeJA和它的自由酸类化合物：茉莉酸(JA)的生理效应。植物体内存在六种调控酶参与JA代谢途径：DAD1，triacylglycerol lipase(lipase gene)，三酰甘油酯酶，在拟南芥中发现其具有磷酯酶A1功能(Sumie Ishiguro等，2001)，能将膜质类物质转化成α-亚麻酸(α-linolenic acid，α-LA)从而进入JA合成途径；FAD，omega-3 fatty acid desaturase，脂肪酸脱饱和酶(使α-亚油酸(α-linoleicacid)脱饱和形成α-亚麻酸，进入JA代谢途径)；LOX，lipoxygenase，脂加氧酶，该酶能在α-亚麻酸13号碳上添加一个氧原子，生成13-过氧化羟-十八碳三烯酸(13-hydroperoxy-octadecatrienoic acid，13(S)-HPOT)进入下一环节；AOS，allene oxidesynthase，丙二烯氧化物合成酶，将上步反应产物合成12，13-过氧化羟-十八碳三烯酸环氧化物(12，13-epoxy-9(Z)，11，15(Z)-octadecatrienoic acid，12，13-EOT)；AOC，alleneoxide cyclase，丙二烯氧化物环化酶，将12，13-过氧化羟-十八碳三烯酸环氧化物进一步环化生成(9S，13S)-12-氧代-(10，15Z)-植物二烯酸((9S，13S)-12oxo-(10，15Z)-phytodienoic acid，OPDA)；OPR，12-oxo-phytodienoate reductase，12-氧代-植物二烯酸盐还原酶，该酶催化JA反应途径中最关键一步，生成的前体3-氧代-2-(2`(Z)-戊烯)-环戊烷-1-辛酸(3-oxo-2-(2-(Z)-pentenyl)-cyclopentane-loctanoic acid，OPC-8：0)再经三轮β-氧化最终生成JA(John G.Turner，2002)。由此可见，六大调控基因共同维系JA代谢途径的畅通，其中任何一个基因的表达出现异常均会影响JA或MeJA的最终生成，而植物体内适当的内源JA或MeJA水平是均衡整个植物生长发育过程以及帮助植物应激外界刺激的必要保证。

1997年Schaller F和Weiler EW从悬浮培养的细胞中纯化出12-oxo-phytodienoatereductase(OPR)，该酶为可溶性蛋白呈单体结构，分子量为41kDa。作为辅酶，NADPH比NADH能更好的协助OPR将OPDA 10和11位上的双键进行催化还原；同时二人从紫堇属植物中分离OPR并从拟南芥中克隆其同源酶基因序列，该序列开放读码框编码372个氨基酸，含有OYE(Old Yellow Enzyme)家族蛋白保守域。该同源酶基因cDNA在大肠杆菌中表达的蛋白具有OPR酶活性说明拟南芥中该基因就是编码OPR(Schaller F和Weiler EW，1997)。Biesgen C和Weiler EW于1999年从拟南芥中获得包含两个同家族基因OPR1和OPR2的基因组序列，长7079 bp。通过将这两个基因的启动子分别与GUS在花和根中进行融合表达发现OPR1启动子定位于幼嫩的种子而OPR2则在花粉中特异表达，根中二者都显著表达。通过胁迫诱导发现在局部和系统损伤、紫外投射及冷环境下会导致OPRmRNA水平的瞬间改变，但对应的蛋白表达水平和酶活性并无变化。2000年Schaller F等在拟南芥中鉴定了第三种OPR，是OPR1和OPR2的同工酶，也参与JA代谢途径，该酶为OPR3。该酶基因OPR3的表达不仅受外界环境刺激(如：触摸、风、损伤、紫外线以及去污剂处理)的诱导，同时还受油菜素类固醇的影响(Schaller F等，2000)。Sanders PM等人于2000年通过T-DNA插入技术筛选出一株雄性不育拟南芥突变株，该突变株花药开裂延迟以至于花粉不能及时散出，受精作用不能及时完成。

单子叶植物中OPR相关研究从2003年开始。首先是水稻OPR基因(OsOPR1)通过cDNA文库筛选的方法从悬浮培养的水稻细胞中分离得到，该基因与拟南芥OPR1和OPR2高度同源，具有AtOPR1、AtOPR2和LeOPR1相同的酶活性。通过人工敲除和突变OsOPR1的启动子区域再经过双重荧光素酶分析最终确定了OsOPR1基因相应JA信号的区域，该区域仅有19bp(Sobajima H等，2003；SobajimaH等，2007)。随后水稻中又一OPR亚家族基因OsOPR7被鉴定。它与OsOPR1最大本质的不同在于：OsOPR1偏向于将OPDA还原成(-)-cis-OPDA，而OsOPR7则偏向于催化生成(+)-cis-OPDA，后者才是产生JA的自然前体。OsOPR7与拟南芥中AtOPR3功能相近(Tani T，2007)。在玉米中，通过对各种基因组和EST数据库进行分析发现玉米基因组编码8个OPR基因(ZmOPRs)，其中ZmOPR1和ZmOPR2由于受水杨酸诱导推测它们可能与玉米抵御病原体防御机制有关；ZmOPR6、ZmOPR7和ZmOPR8受机械损伤或机械损伤信号分子(如JA、乙烯和脱落酸)的高度诱导却不受水杨酸或病原体的诱导；而ZmOPR3、4和5在任何一种情况下的转录水平都不受影响(Zhang J等，2005)。Zhang JP等人采用RACE技术在粟中克隆到一段cDNA，该序列编码推定的12-oxophytodienoic acid reductase 1(SiOPR1)，多序列比对结果发现OPR1蛋白在禾本科作物中高度保守。RNA凝胶杂交分析在渗透压胁迫环境下该基因在粟根中的表达受诱导，但却不受脱落酸影响，因此推测SiOPR1基因在粟应答干旱胁迫的生理过程中起到重要作用(Zhang JP等，2007)。但是，目前还未有小麦中OPR的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR。

本发明的另一目的是提供编码上述调控植物花药开裂相关蛋白的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供上述调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR在调控植物育性方面的应用。

本发明的另一目的是提供一种调控植物花药开裂的方法。

本发明提供了一种调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR，来源于杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MTASGRFTIG FSPRPLFPLL SPASPTAPLD PARELQMDRP APDQRSTLFS

PYQMRRFSLA      60

HRVVLAPMTR CRAIGGLPGP ALAEYYSQRS TQGGLLISEG TVVSPAGPGF

PHVPGIYNQE      120

QIDGWKKVVD AVHAKGGIFF CQLWHVGRAS HQVYQPDGAA PISSTGKPIS

ARWKILLPDG      180

SYGTYPTPRR LATSEIPDIV EQYRQAAINA IKAGFDGIEI HGAHGYIIDQ

FLKDGINDRT      240

DEYGGSLTNR CKFLLEVTRA VVSAIGAERT AVRVSPAIDH LDAYDSNPMQ

LGMAVVERVN      300

ALQQEAGQLA YLHVTQPRYA AYGQTESGPH GSAEEESRLM RTLRGAYQGT

FMCSGGYTRE      360

LGLEAVESGD ADLVSFGRLF ISNPDLVERL RLNAGLNKYV RKTFYTPDPV

VGYTDYPFLG      420

KPKSRM          426

本发明的蛋白由426个氨基酸残基组成，具有1个依赖于cAMP和cGMP蛋白激酶磷酸化位点、2个酪蛋白(Casein kinase II，CK2)磷酸化位点、1个C-微体靶标信号、7个N-豆蔻酰化位点、8个蛋白激酶C磷酸化位点、1个内披蛋白序列重复、2个NADH氧化酶家族基序和1个该家族保守域、1个马铃薯II型蛋白酶抑制剂家族基序、1个肠毒素基序、1个酰胺肽家族基序及1个NADPH脱氢酶保守域。

为了使蛋白TaOPR便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

根据本发明所公开的SEQ ID NO.1序列，本发明的转录因子TaOPR可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明的编码上述调控植物花药开裂相关蛋白的基因TaOPR，其表达受茉莉酸途径的诱导，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

acgagggcag tgcaagagca tgacggcaag tggacgattc acaattggct tctcgccgcg     60

ccctcttttc cccctcctct cccccgcctc gcccactgcc cctctcgatc cagcgcgaga    120

gctccagatg gatcggccgg cgccggacca gcggtccacg ctcttctcgc cgtaccagat    180

gcgccgcttc agcctcgccc accgggtggt gctggcgccg atgacgaggt gcagggccat    240

cggcgggctg ccggggccgg cgctggcgga gtactactcg cagcgctcca cccagggagg    300

gctgctcatc tccgagggca ccgtcgtctc gccggccggg ccggggtttc ctcatgtccc    360

tggaatatac aatcaagagc agatagatgg atggaaaaag gtggtggatg ctgttcatgc    420

caagggaggc atctttttct gccaattatg gcacgtaggc agagcttctc accaagtata    480

ccagccagac ggcgctgctc caatatcctc aactggtaag ccgatatcag caaggtggaa    540

gatattgttg cctgatggtt catatggaac gtatcccacg ccaaggcgcc ttgcgacatc    600

ggaaataccg gacatagttg agcaatatcg ccaagccgcc ataaacgcca tcaaagcagg    660

cttcgatggc attgagatcc acggcgctca tggctacatc atcgatcagt ttctcaagga    720

cggcataaac gaccgcaccg atgagtacgg cggatcgctc accaaccgtt gcaagtttct     780

actcgaggtg acccgagccg tggtatctgc catcggagca gaacgaactg cggtgagggt     840

gtcaccggcc attgaccacc ttgacgctta cgactcgaac ccgatgcagc tcggcatggc     900

cgtcgttgag cgggtcaacg ccctccagca ggaagccggg cagctcgcct acctccacgt     960

gacgcagccg aggtacgcgg cctacgggca gacggagtca ggcccgcacg gcagcgccga    1020

ggaagagagc cgcctgatgc gcaccttgcg gggtgcatac cagggcacgt tcatgtgcag    1080

cggcggctac acgcgggagc tcgggctgga ggcggtggag agcggcgacg ccgacctggt    1140

gtcgttcggg cggctgttca tttccaaccc ggacctggtc gagcggctca ggctcaacgc    1200

cggcctcaac aagtacgtga ggaagacgtt ctacacccct gaccccgtcg tgggctacac    1260

cgactacccg ttcctcggca agcctaaatc gcgcatgtag tgtgtacaag gttagtgatc    1320

ggagttggga tttactgtga agtgtatttg gagaaataag gtcatatacg cgcatgtagt    1380

gtacacgagt tagcgatctg agatgggaat ctccagagga tcgccgggaa ccgaggacga    1440

gtcgtaatca g                                                         1451

其中，5’末端第20至1300位脱氧核糖核苷酸为TaOPR基因的开放阅读框(ORF)，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

atgacggcaa gtggacgatt cacaattggc ttctcgccgc gccctctttt ccccctcctc     60

tcccccgcct cgcccactgc ccctctcgat ccagcgcgag agctccagat ggatcggccg    120

gcgccggacc agcggtccac gctcttctcg ccgtaccaga tgcgccgctt cagcctcgcc    180

caccgggtgg tgctggcgcc gatgacgagg tgcagggcca tcggcgggct gccggggccg    240

gcgctggcgg agtactactc gcagcgctcc acccagggag ggctgctcat ctccgagggc    300

accgtcgtct cgccggccgg gccggggttt cctcatgtcc ctggaatata caatcaagag    360

cagatagatg gatggaaaaa ggtggtggat gctgttcatg ccaagggagg catctttttc    420

tgccaattat ggcacgtagg cagagcttct caccaagtat accagccaga cggcgctgct    480

ccaatatcct caactggtaa gccgatatca gcaaggtgga agatattgtt gcctgatggt    540

tcatatggaa cgtatcccac gccaaggcgc cttgcgacat cggaaatacc ggacatagtt    600

gagcaatatc gccaagccgc cataaacgcc atcaaagcag gcttcgatgg cattgagatc    660

cacggcgctc atggctacat catcgatcag tttctcaagg acggcataaa cgaccgcacc    720

gatgagtacg gcggatcgct caccaaccgt tgcaagtttc tactcgaggt gacccgagcc    780

gtggtatctg ccatcggagc agaacgaact gcggtgaggg tgtcaccggc cattgaccac    840

cttgacgctt acgactcgaa cccgatgcag ctcggcatgg ccgtcgttga gcgggtcaac    900

gccctccagc aggaagccgg gcagctcgcc tacctccacg tgacgcagcc gaggtacgcg    960

gcctacgggc agacggagtc aggcccgcac ggcagcgccg aggaagagag ccgcctgatg   1020

cgcaccttgc ggggtgcata ccagggcacg ttcatgtgca gcggcggcta cacgcgggag    1080

ctcgggctgg aggcggtgga gagcggcgac gccgacctgg tgtcgttcgg gcggctgttc    1140

atttccaacc cggacctggt cgagcggctc aggctcaacg ccggcctcaa caagtacgtg    1200

aggaagacgt tctacacccc tgaccccgtc gtgggctaca ccgactaccc gttcctcggc    1260

aagcctaaat cgcgcatgta g                                              1281

本发明还提供了包含上述调控植物花药开裂相关蛋白基因TaOPR的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，优选将调控植物花药开裂相关基因TaOPR构建到pAHC25载体CaMV 29A启动子之后的BamHI和SacI酶切位点之间，得重组质粒pAHC-TaOPR。植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用TaOPR构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明还提供了上述调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR在调控植物育性方面的应用，优选其在调控植物花药开裂方面的应用。

本发明还提供了一种调控植物花药开裂的方法，所述方法包括将上述调控植物花药开裂相关基因TaOPR导入植物中并表达的步骤。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的TaOPR的编码基因导入植物细胞，可获得提高植物花药开裂比例的转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、小麦、新疆偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明以杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)为试验材料，得到茉莉酸调控途径中调控花药开裂的相关蛋白TaOPR及其编码基因TaOPR，并将基因TaOPR导入小麦光温敏雄性不育系BS366，能够显著提高花药开裂率及结实率，从而通过基因工程方法验证其功能。该基因与植物育性相关，能提高植物花药开裂率从而提高结实率，对于提高粮食产量及二系杂交小麦理论的发展具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1茉莉酸代谢途径育中调控花药开裂的相关蛋白TaOPR编码基因的cDNA克隆凝胶图，以杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)为模板，PCR扩增TaOPR的cDNA片段，1，2，杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)的TaOPR基因片段；M，DL2000 marker(100，250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)。

图2RT-PCR半定量分析凝胶图，A，B为凝胶图，C，D为凝胶图的IOD值分析。以小麦光温敏雄性不育系BS366及常规品种京冬8活体花药在0d、1d、2d、3d、4d、5d五个处理时间点的cDNA作为模板，用JA途径相关基因半定量特异引物进行PCR，在处理的5天中MeJA处理后的表达量比空白对照要高，受到MeJA的正向调控。

图3为转基因小麦的获得，A通过基因枪法获得转基因的小麦愈伤，B，筛选、分化后获得的再生植株生根培养；C，转基因小麦植株的PCR检测有带的为阳性植株。

图4为TaOPR基因引起的花药开裂情况，A1，京冬8正常植株的花药开裂情况，A2，京冬8转基因植株的花药开裂情况；B1，BS366正常植株的花药开裂情况，B2，BS366转基因植株的花药开裂情况。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1：小麦茉莉酸代谢途径中调控花药开裂相关基因TaOPR的cDNA克隆与半定量分析

取杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)的花药，用Trizol法提取花药的总RNA。应用5’RACE试剂盒(5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA EndsKit)(GIBCOBRL，CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(3’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL，CAT.NO.18373-019)获得TaOPR基因，其序列全长为845kb。

用Trizol法提取杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)花药的总RNA，用superscript II(购自invitrogen公司)反转录酶反转录获得到cDNA。根据TaOPR基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-CACAATTGGCTTCTCGCCGC-3’

P2：5’-CCCATCTCAGATCGCTAACTCG-3’

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1.0-2.0kb左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(购自Promega公司)连接，参照Cohen等的方法(Proc NatlAcad Sci，69：2110)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaOPR基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.3，即SEQ ID No.2的自5’末端第20至1300位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。含序列SEQ ID No.3的cDNA克隆结果如图1所示。

TaOPR基因的序列在Genabnk上进行比对，BLAST分析表明，其编码的蛋白与水稻中的OsOPR7的进化距离最近，这表明TaOPR8与OsOPR7亲缘关系最近。OsOPR7被证实与AtOPR3功能相近，而后者的基因功能与拟南芥花药开裂有关，由此我们推测TaOPR8作为小麦OPR基因家族成员之一很有可能与AtOPR3和OsOPR7基因功能相近，在小麦花药开裂中扮演重要角色。

以小麦光温敏雄性不育系BS366及常规品种京冬8为实验材料，在小麦药隔后期开始，用0.5mmol/L的茉莉酸甲酯(MeJA)对小麦进行喷洒处理，以喷前时取样记作0d，以后每一天喷洒一次，以活体花药在0d、1d、2d、3d、4d、5d五个处理时间点的cDNA作为模板(其中常规品种京冬8作为对照组)，用JA途径相关基因半定量特异引物进行PCR，每个基因半定量PCR结果均由软件分析得到其IOD值，并利用SPSS进行方差分析，最后在Excel中做出柱状图(图2C，D)，在处理的5天中MeJA处理后的表达量比空白对照要高，受到MeJA的正向调控。总的表达量上看，京冬8中MeJA处理后的总表达量与空白对照相比没有显著变化。

实施例2：TaOPR单子叶植物转基因表达载体的构建

1、重组表达载体的构建

pAHC-TaOPR单子叶植物重组表达载体的构建：以杂交小麦品种京麦7号(京审麦2009003)的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有BamHI和SacI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后BamHI和SacI双酶切PCR产物，回收，将酶切产物正向插入载体pAHC25的CaMV 29A启动子之后的BamHI和SacI酶切位点之间，得到重组载体pAHC-TaOPR。

引物序列如下：

OPR[BamHI]：5′-CGGGATCCACGAGGGCAGTGC-3′

OPR[SacI]：5′-CGAGCTCTACGACTCGTCCTC-3′

2、转基因小麦的获得与鉴定

1)将上述得到的重组质粒pAHC-TaOPR通过基因枪法介导小麦光温敏不育系BS366及京冬8幼胚的转基因，从而获得到转基因小麦的愈伤，并在生根培养基上进行生根培养(图3)，最终获得转基因小麦植株。

2)PCR检测转基因小麦植株，提取转基因小麦T0代植株基因组DNA；每株小麦提取三管，即做三个平行实验；利用TaOPR基因全长的引物对转pAHC-TaOPR基因的植株进行PCR检测，同时以克隆的目的基因作为阳性对照，未转基因的小麦基因组DNA为阴性对照，结果如图3C。

3)对转基因小麦的花药与对照进行比较(图4)，发现转基因植株的花药开裂程度较对照组有较大提升，通过对花药开裂率的统计(表2)，也发现转基因小麦的花药开裂率有明显提升，从而说明该基因对花药的开裂及提高小麦育性都起到了十分重要的作用。

表2 BS366和京冬8处理后花药开裂率及结实率基本统计

注：表中0代表空白处理；M代表MeJA处理。

Claims (7)

1.一种调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种调控植物花药开裂相关基因TaOPR，其特征在于，编码权利要求1所述的调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR。

3.根据权利要求2所述的调控植物花药开裂相关基因TaOPR，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

4.包含权利要求2或3所述调控植物花药开裂相关基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体为将权利要求2所述调控植物花药开裂相关基因TaOPR构建到pAHC25载体CaMV 29A启动子之后的BamHI和SacI酶切位点之间而获得的载体pAHC-TaOPR。

6.权利要求1所述调控植物花药开裂相关蛋白TaOPR在调控植物育性方面的应用。

7.一种调控植物花药开裂的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求2或3所述调控植物花药开裂相关基因TaOPR导入植物中并表达的步骤。

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