CN111433363B - 非生物胁迫耐性提高的植物和提高植物非生物胁迫耐性的多聚核苷酸及方法 - Google Patents

非生物胁迫耐性提高的植物和提高植物非生物胁迫耐性的多聚核苷酸及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了分离的多核苷酸和多肽，和赋予植物耐旱性的重组DNA构建体，包含这些重组DNA构建体的组合物如植物或种子，以及利用这些重组DNA的构建体方法。这些重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的一个植物中有功能的启动子，其中所述多核苷酸编码耐旱性的多肽。

Description

非生物胁迫耐性提高的植物和提高植物非生物胁迫耐性的多 聚核苷酸及方法
技术领域
本发明涉及植物育种和遗传学领域，特别是，涉及用于提高植物耐诸如干旱和冷胁迫等非生物胁迫的重组DNA构建体。
背景技术
生物和非生物原因可以对植物产生胁迫，例如造成生物胁迫的原因包括病原菌感染、昆虫取食、一种植物对另一种植物的寄生，例如槲寄生；非生物胁迫包括诸如有效水分的过量或者不足、极限温度和诸如除草剂的合成化学药品。
非生物胁迫是造成世界范围内农作物减产的主要原因，造成主要农作物平均减产50％以上(Boyer,J.S.(1982)Science 218：443-448；Bray,E.A.等(2000)In Biochemistryand Molecular Biology of Plants,edited by Buchannan,B.B.等,Amer.Soc.PlantBiol.,pp.1158-1249)。植物固着于地面，必须调整以适应周围的环境条件，这就导致了植物发育中基因调控、形态形成和新陈代谢的巨大可塑性。植物的适应和防御策略包括激活编码重要蛋白的基因，这些蛋白可以使植物适应或防御不同胁迫条件。
干旱(有效水分不足)是一种主要的非生物胁迫，限制了世界范围内农作物的生产。在植物生长发育阶段，将植物暴露于水分限制环境下，将会激活植物各种不同生理和发育变化。遗传学研究表明植物的耐旱性是一个由多基因调控的数量性状，分子标记辅助育种能够提高农作物的耐旱性，转基因途径提高农作物的耐旱性已经取得了很大进展(Vinocur B.and Altman A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16:123-132；Lawlor DW.(2013)J.Exp.Bot.64：83-108)。
发明概述
本发明包括以下具体实施例：
在一个实施例中，本发明包括一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、10、13或16的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中增加所述多核苷酸的表达量能够提高植物的耐旱性。所述分离的多核苷酸包括SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16或17所示的核苷酸序列；所述多肽包括SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18所示的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明包括一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括一种分离的多核苷酸和与其可操作的连接至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16或17的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。
在另一个实施例中，本发明包括一种修饰的植物或种子，包含增加表达的至少一种编码多肽的多核苷酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％。
在某些实施例中，所述修饰的植物在其基因组中包含一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含一种多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16或17的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列，
在某些实施例中，所述修饰植物包含在基因组位点上的靶向遗传修饰，修饰的调控元件用于提高内源多聚核苷酸的表达量，其中所述多核苷酸所编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％；其中，所述目标基因修饰提高了编码多肽的水平和/或活性。
在某些实施例中，与对照植物相比，所述植物表现出较高的耐旱性(例如，提高了存活率、降低了叶片的卷曲度、提高结实率或提高籽粒产量)。在某些实施例中，在非生物胁迫条件下生长时，所述植物表现出谷物产量的提高。
在另一个实施例中，公开了提高植物耐旱性的方法，所述方法包括，与对照植物相比，提高植物中至少一个多核苷酸的表达，其中所述多聚核苷酸其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％；其中，与对照植物相比，所述获得植物表现出耐旱性的提高，所述的较高的耐旱性表现为，在干旱条件下，存活率的提高、叶片卷曲度的降低、结实率的提高、或籽粒产量的增加。
在某些实施例中，所述多核苷酸的表达量通过以下方式提高：(a)通过向植物中转入重组DNA构建体以提高编码多肽的多核苷酸的表达，其中所述重组DNA构建体包括编码多肽的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件，其中，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％；(b)增加内源多核苷酸的表达量，所述内源多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％。
在另一实施例中，公开了提高水稻植株籽粒产量的方法，其中，与对照植物相比，所述植物在正常和/或胁迫条件下表现出提高的籽粒产量，所述方法包括增加至少一个多核苷酸编码的多肽的表达，所述多肽编码的氨基酸序列和SEQ ID NO:3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％。
在另一个实施例中，公开了一种产生植物的方法，所述方法中，当与对照植物中多肽的活性或表达量相比，增加所述植物中多肽的表达或活性，所述多肽编码的氨基酸序列和SEQ ID NO:3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％。与所述对照植物相比，所述植物显示出至少一种表型，所述表现选自增加耐旱性、增加籽粒产量、增加非生物胁迫耐性或增加生物量，所述方法包括的步骤为在基因组区域(包括调控元件和基因区域)(i)导入一个DNA片段或删除一个DNA片段，或(ii)导入一个或多个核苷酸的变化，其中所述DNA片段或核苷酸的改变能够有效增加多肽的表达或活性；所述DNA片段或者核苷酸的改变可以通过锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶(TALEN)、成簇的规则间隔的短回文重复序列技术(CRISPR-Cas)、引导Cas核酸内切酶、归位核酸酶切酶或CRISPR-Cas核糖核蛋白复合体介导实现。
本发明包括任一公开的植物，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。
在另一个实施例中，公开了一种在水稻植株群体中鉴定一个或多个等位基因的方法，所述等位基因与籽粒产量的增加相关，所述方法包括的步骤为(a)检测水稻植株群体中一个或多个多态性，所述多态性位于(i)多肽编码的基因组区域，或(ii)调控所述多肽表达的调控区域，所述多肽包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18,或与SEQ IDNO：3、6、9、12、15或18序列一致性为90％以上的氨基酸序列；所述多肽编码基因组区域或所述调控多肽表达的调控区域的一个或多个多态性与籽粒产量相关；和(b)鉴定一个或多个等位基因，所述等位基因位于增加产量相关的一个或多个多态性中，所述增加产量相关的一个或多个等位基因可用于分子标记辅助选择增加籽粒产量的水稻植株。所述一个或多个多态性位于多核苷酸的编码区，所述调控区域是启动子。
序列表的详细描述
根据以下发明详述和序列表，可以更全面的理解本发明，以下发明详述和序列表形成本发明的一部分。
表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列的编号
Figure BDA0002475182070000031
序列描述以及关联的序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic AcidsRes.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本发明。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822中列出的规则。
详细描述
本发明中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本发明。
如本发明所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
如本发明所述：
“OsDN-DTP12”是耐旱性蛋白12(drought tolerance protein 12)，涉及水稻基因位点LOC_Os05g38930.1及其相关的等位基因变异体编码的能够赋予植物耐旱性表型水稻多肽。“DN-DTP12多肽”此处涉及OsDN-DTP12多肽和源于其他植物的同源物。
OsDN-DTP12多肽(SEQ ID NO：3)是水稻基因位点LOC_Os05g38930.1及其相关的等位基因变异体的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：2)或核酸序列(SEQ ID NO：1)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中(the internet at plant biology msu.edu/index.shtml)注释为“假定蛋白”。
“OsSSL13”是异胡豆苷合成酶类似-13(strictosidine synthase like 13)，涉及水稻基因位点LOC_Os03g15710.1及其相关的等位基因变异体编码的能够赋予植物耐旱性表型水稻多肽。“SSL13多肽”此处涉及OsSSL13多肽和源于其他植物的同源物。
OsSSL13多肽(SEQ ID NO：6)是水稻基因位点LOC_Os03g15710.1及其相关的等位基因变异体的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：5)或核酸序列(SEQ ID NO：4)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“异胡豆苷合成酶，推测，表达”，在NCBI(on the world web atncbi.nlm.nih.gov)注释为“异胡豆苷合成酶类似-13”，但是没有在先的功能介绍。
“截短的OsGDSL”涉及位点LOC_Os09g04624.1及其相关的等位基因变异体的水稻基因第一外显子编码的能够赋予植物耐旱性表型水稻多肽。
截短的OsGDSL多肽(SEQ ID NO：9)是水稻基因位点LOC_Os09g04624.1及其相关的等位基因变异体的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：8)或核酸序列(SEQ ID NO：7)编码的氨基酸序列。该全长多肽在TIGR中注释为“GDSL-类似脂肪酶/酰基水解酶，推测，表达”。
“OsDN-DTP9”是耐旱性蛋白9(drought tolerance protein 9)，涉及水稻基因位点LOC_Os02g08040.1及其相关的等位基因变异体编码的能够赋予植物耐旱性表型水稻多肽。“DN-DTP9多肽”此处涉及OsDN-DTP9多肽和源于其他植物的同源物。
OsDN-DTP9多肽(SEQ ID NO：12)是水稻基因位点LOC_Os02g08040.1及其相关的等位基因变异体的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：11)或核酸序列(SEQ ID NO：10)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“表达蛋白”。
“OsWD40-42”涉及水稻基因位点LOC_Os02g20430.1及其相关的等位基因变异体编码的能够赋予植物耐旱性表型水稻多肽。“WD40-42多肽”此处涉及OsWD40-42多肽和源于其他植物的同源物。
OsWD40-42多肽(SEQ ID NO：15)是水稻基因位点LOC_Os02g20430.1及其相关的等位基因变异体的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：14)或核酸序列(SEQ ID NO：13)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“WD结构域，含有G-β重复结构域蛋白，表达”。
“OsABCB12”是ABC转运子B类型蛋白12(ABC transporter B type protein 12)，涉及水稻基因位点LOC_Os03g08380.1及其相关的等位基因变异体编码的能够赋予植物耐旱性表型水稻多肽。“ABCB12多肽”此处涉及OsABCB12多肽和源于其他植物的同源物。
OsABCB12多肽(SEQ ID NO：18)是水稻基因位点LOC_Os03g08380.1及其相关的等位基因变异体的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：17)或核酸序列(SEQ ID NO：16)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“ABC转运子，ATP-结合蛋白，推测，表达的”。
本发明中的单子叶植物包括禾本科的植物；双子叶植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本发明所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。
对照植物或对照植物细胞包括，例如：(a)相同基因型并用于基因改变产生受测植物或细胞的野生型植物或细胞；(b)相同基因型作为起始材料但是转入空载体(如带有标记基因的并对目标的性状没有影响的载体)的植物或植物细胞；(c)转基因植物或植物细胞性状分离，获得的非转基因的子代植物或植物细胞；(d)没有暴露于可以诱导基因表达的条件或刺激下的，与转基因植物或植物细胞基因组相同的植物或植物细胞；(e)特定的目标基因不表达情况下的，转基因植物或者植物细胞本身。对照可以包括多种代表上述一种或多种类型的个体，例如，(c)中性状分离后非转基因的材料的混合通常认为是bulk null。
本发明中，ZH11-TC和DP0158指对照植物。ZH11-TC表示通过组织培养中花11获得的水稻植株，DP0158表示转化空载体DP0158获得水稻植株。
“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。
“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
“干旱”指植物可用水分的减少，特别是较长时间的缺水或者在植物重要的生长阶段发生，会造成植物损伤，或阻止植物的生长(限制植物的生长，降低籽粒的产量)。
“耐旱性”指干旱胁迫下植物能够存活并且没有实质性的生理或物理改变的能力，和/或一段时间干旱后复水能够恢复的能力。
多肽的“耐旱能力”表示与参照或对照植物相比，过表达该多肽可以提高转基因植物的耐旱性能。
植物“增强的耐旱性”是与参照或对照植物相比测定的，反映了植物在干旱胁迫下存活的能力，并且与参照或对照相比，具有较小的生理或物理损伤，或者干旱胁迫后复水时，恢复较快的能力。
“环境条件”指植物生长的环境，诸如可用的水分、可用的营养物质或昆虫或病害的存在。
“百草枯”(1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)是一类叶片喷施的非选择性的吡啶除草剂，能够引起光氧化胁迫，并进一步造成植物的损害或者阻止植物的正常生长。
“百草枯耐性”是植物的一种性状，反映了百草枯溶液处理后，与参照或对照植物相比，植物的存活或生长良好的能力。
植物“增加的百草枯耐性”是相对于参照或对照植物测定的，反映了植物在百草枯溶液处理后，与参照或对照植物相比，能够存活并具有较小的生理或物理伤害的能力。通常，针对较低浓度的百草枯溶液的耐性用作诸如干旱胁迫的非生物胁迫耐性的一种指标。
“氧化胁迫”反映了活性氧分子的生成和生物系统清除活性氧中间体或修复损伤的能力之间的不平衡。扰乱细胞正常的氧化还原状态会导致产生过氧化氢和自由基的毒性效应，过氧化氢和自由基能够损害包括蛋白、脂质和DNA在内的细胞组成部件。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
“全长互补序列”是指给定核苷酸序列的互补序列，互补序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸数，并且100％的互补。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。
“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即带有前肽和原肽的蛋白质。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。
“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上是游离的，或者以其他方式从通常与自然环境中的物质相伴或者相互作用的组份中分离出来的。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
术语“入门克隆”和“入门载体”本发明可互换使用。
“调控序列”、“调控元件”和“调控区域”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。
“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。
本发明所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。
“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。
“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。
“基因”是一段可表达功能分子的核苷酸片段，所述功能分子，包括但不限于，特定蛋白，所述基因包括位于编码序列上游的调控序列(5’非编码序列)和下游序列(3’非编码序列)。“天然基因”是拥有自身调控序列的自然存在的基因。
本文中使用的“基因组位点”通常是指在植物染色体上发现基因(比如编码本文中所述多肽的多核苷酸)的位置。
“突变基因”是通过人工干预后的产生的基因。由此产生的“突变基因”的序列与非突变基因的序列相比，至少有一个核苷酸增加，删除或替换。“突变植物”是指含有突变基因的植物。
“靶向突变”是通过改变原基因中靶序列而产生的原基因突变。可以使用本领域内已知或本文公开的任何方法引起目标突变。本发明中“靶向突变”是指通过双链断裂诱发剂诱导靶序列DNA双链断裂，改变内源基因的特定序列，从而导致内源基因突变
“遗传修饰”指通过蓄意人为活动而导入植物的基因组核苷酸序列的改变。
“核定位信号”是指靶向核蛋白的信号多肽(Raikhel，(1992)Plant Phys.100：1627-1632)。
“CRISPR-相关基因”是指编码成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)-相关系统(Cas)的多肽组合物的核苷酸序列，所述基因通常耦合存在，与CRISPR位点侧翼片段相关或相邻。术语“Cas基因”和“CRISPR-相关基因”在本发明中可互换使用。例如包括但不限于，Cas3和Cas9,它们分别为CRISPR类型I和CRISPR类型II系统编码的内切酶。
“Cas内切酶”是指一个由Cas基因编码的Cas蛋白，所述Cas蛋白能导致DNA靶序列双链断裂。Cas核酸内切酶在多核苷酸的引导下识别并选择性的将特定靶位点的双链断裂引入细胞基因组中(U.S.2015/0082478)。
“向导RNA(gRNA)”是指一个由可改变的DNA元件编码的crRNA(CRISPR RNA)：tracrRNA融合的杂合RNA分子，gRNA通常包括一个拷贝的与基因组特定位点的前间区序列互补的间隔序列，和一个用于CRISPR复合体的相关Cas内切酶结合的结合域。
“向导多核苷酸”是指一个可与Cas内切酶形成复合体、且使Cas内切酶识别和选择DNA剪切靶位点的多核苷酸序列。所述向导多核苷酸由一个单分子或一个双分子组成。向导多核苷酸可以由一个单分子或一个双分子组成。向导多核苷酸的序列可以是一个RNA序列、一个DNA序列或者是二者的结合，比如一个RNA-DNA结合序列。所述向导多核苷酸也可任意地包含至少一个核苷酸、磷酸二酯键或修饰链接。例如：锁定核酸(LNA)、5-甲基dC、2,6-二氨基嘌呤、2'-氟-A、2'-氟-U、2'-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的链接、与聚乙二醇分子的链接，与间隔18(六乙二醇链)分子的链接，或5'到3'共价链接导致循环。当然并不仅限于上述核苷酸。仅包含核糖核酸的向导多核苷酸也被称为“向导RNA”。
术语“向导多核苷酸/Cas内切酶体系”是指含有一个Cas内切酶和一个前导多核苷酸的复合体，可导致DNA靶序列的双链断裂。如果正确的前间区序列邻近基序(PAM)大致定位于靶序列的3'末端后，一旦向导RNA识别靶序列，Cas内切酶才能解开基因组靶位点附近的DNA双链序列，并对DNA双链进行剪切
“基因组靶位点”是指定位于宿主基因组的用于定点突变和/或双链断裂的一个前间区和一个前间区序列邻近基序(PAM)。
“前间区”是指一段靶向突变和/或双链断裂的短的DNA序列(12-40个核苷酸)，所述前间区是基于crRNA或sgRNA的间隔序列的碱基互补配对，以CRISPR体系内切酶而导致酶促断裂。
“前间区序列邻近基序(PAM)”包括一段3-8个核苷酸序列，紧邻基因组靶位点前间区序列。
术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在本文中可互换使用，包括与双链DNA靶位点的一条链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一核苷酸序列结构域(VT结构域)和靶序之间的互补百分比可以是至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，可变靶结构域的长度可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向结构域可以由DNA序列、核糖核酸序列、修饰的DNA序列、修饰的核糖核酸序列或其任意组合组成。
向导多核苷酸的术语“Cas核酸内切酶识别结构域”或“CER结构域”在本文中可互换使用，包括与Cas核酸内切酶多肽相互作用的核苷酸序列(例如指导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可以由DNA序列、核糖核酸序列、修饰的DNA序列、修饰的核糖核酸序列(参见例如本文所述的修饰)或其任意组合组成。
链接cr核苷酸和单导多核苷酸的tracr核苷酸的核苷酸序列可以由RNA序列、DNA序列或RNA-DNA合成的序列组成。在一个实施方案中，连接单引导多核苷酸的核苷酸和tracrNucleotide的核苷酸序列可以是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸。在另一个实施方案中，连接单引导多核苷酸的核苷酸和tracrNucleotide的核苷酸序列可以包含四环序列，例如但不限于GAAA四环序列。
CRISPR位点(成簇规律间隔短回文重复，也称为SPIDRs-间隔散布定向重复)组成最近描述的DNA位点家族。CRISPR位点由短的、高度保守的DNA重复序列(一般24-40个核苷酸，重复1-140次，因此也称为CRISPR-重复单元)组成，所述DNA重复序列部分是回文重复。所述重复序列(通常存在物种特异性)被固定长度(一般20-58个核苷酸，依赖于CRISPR位点)的可变序列间隔(WO2007/025097公开于2017年3月1日)。
核酸内切酶是可切断多核苷酸链的磷酸二酯键的酶类，包括在特定位点切割DNA而不破坏碱基的限制性核酸内切酶。所述限制性核酸内内切酶包括类型I、类型II、类型III和类型IV核酸内切酶及其亚类型。在类型I和类型III系统中，单复合体具有甲基化酶和限制活性。核酸内切酶也包括归巢核酸内切酶(meganucleases或HEases)，其类似于限制性核酸内切酶，能结合和剪切特定识别位点，然而归巢核酸内切酶识别位点通常更长，约18个核苷酸或更长(专利申请WO-PCT PCT/US12/30061，提交日期2012年3月22日)。根据保守序列基序，归巢核酸内切酶可分为四个家族，分别为LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H和His-Cys盒子家族。这些基序参与到金属离子和磷酸二酯键的水解过程的协调。归巢核酸内切酶的显著点在于其长识别位点和在其DNA底物中容忍一些序列多态性。
TAL效应因子核酸酶是一种新的序列特异性核酸酶，能导致植物或其他生物基因组特定靶序列双链断裂。TAL效应因子核酸酶通过将一个天然或人工合成的转录激活样(TAL)效应因子或其功能区，融合到核酸内切酶的催化结构域而产生的，诸如Foki内切酶。所述独特的、模块化的TAL效应因子DNA结合域允许设计具有潜在给定DNA识别特异性的蛋白(Miller et al.(2011)Nature Biotechnology 29：143-148)。锌指核酸酶(ZFNs)是一种人工合成的双链断裂诱发剂，含有一个锌指DNA结合结构域和一个双链断裂诱导剂结构域。锌指结构域赋予识别位点特异性，其一般包括2、3或4个锌指结构，例如，有一个C2H2结构，然而其他锌指结构也是已知并是可改造的。锌指结构域是可设计的多肽，能特异结合选定的多核苷酸识别序列。ZFNs由一个设计的DNA结合锌指结构域和与其链接的一个非特异性内切核酸酶结构域构成，例如，源于诸如FokI的类型l的核酸内切酶的核酸酶结构域。其它功能可融入锌指结合域，包括转录激活结构域，转录阻遏结构域和甲基化酶。在一些例子中，剪切活性需要核酸酶的二聚作用。每一个锌指可识别靶DNA的3个碱基对。例如，一个含有3个锌指结构域能识别9个连续的核苷酸序列，两组含3个锌指结构域经二聚化作用后，则能识别18个核苷酸序列。
“靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶位置”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”和“基因组靶位置”在本发明中可互换使用，具体指植物细胞基因组中的一段多核苷酸序列(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)，且在植物细胞基因组中能被Cas内切酶诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源位点，也可以是非自然发生在基因组中的植物异源位点，或靶位点可以是与自然存在的基因组位点异源的位点。本发明中“内源靶序列”和“天然靶序列”可以互换使用，具体指植物基因组内源或天然基因组的靶序列，且是植物基因组靶序列的内源或天然位点。
“变异靶位点”、“变异靶序列”、“修饰靶位点”、“修饰靶序列”在本发明中可互换使用，具体指本发明公开的靶序列，其与未改变的靶序列相比，包括至少有一处变异。所述变异包括，例如：(i)至少一个核苷酸替换，(i i)至少一个核苷酸删除，(iii)至少一个核苷酸插入，或(iv)上述(i)-(iii)的任意组合。
“序列一致性百分比(％)”是经过序列比对和引入缺口后，待测序列(query)相对于参考序列(subject)的氨基酸残基或核苷酸的一致性百分比，如果必须，所述序列一致性百分比是达到最大比例的序列一致性，且不考虑属于序列一致性的氨基酸保守型替换。例如，利用诸如BLAST,BLAST-2的公开电脑软件确定序列一致性比例的比对是本领域技术人员熟知的。决定序列比对的合适参数，包括与待测全序列比对达到最大化匹配的算法。本发明中两个序列的“序列一致性百分数”是指序列匹配一致性的数量的函数(例如，待测序列的序列一致性计算包括，将两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数目，获得匹配位置数，然后将匹配的位置数除以比对窗口中位置总数再乘以100)。
现在转向实施方案：
实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、赋予耐旱性的重组DNA构建体、包含重组DNA构建体的诸如植物或种子的组合物、以及利用这些重组DNA构建体的方法。
分离的多核苷酸和多肽：
本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：
一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQID NO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列，其中核酸序列(i)与全长互补序列具有相同数目的核苷酸，并且100％的互补。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明的任一重组DNA构建体，提高所述编码的多肽的表达量提高植物的耐旱性和/或百草枯耐性。提高所述编码的多肽的表达量提高植物在正常条件下的籽粒产量。
一种分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。所述多肽优选为耐旱性多肽，提高所述多肽的表达量增加植物的耐旱性和/或百草枯耐性。提高所述编码的多肽的表达量提高植物在正常条件下的籽粒产量。
一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(ii)一种核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、10、13或16相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(iii)核酸序列(i)或(ii)的全长互补序列。前述任一分离的多核苷酸可用于构建本发明任一重组DNA构建体。所述分离的多核苷酸优选为编码耐旱性的多肽，提高所述多肽的表达量提高植物的耐旱性和/或百草枯耐性。提高所述编码的多肽的表达量提高植物在正常条件下的籽粒产量。
应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。例如，丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。
重组DNA构建体：
一方面，本发明包括重组DNA构建体。
在一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
在另一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如植物中有功能的启动子)，其中，所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11、14或17相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(ii)一种核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、10、13或16相比，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(iii)核酸序列(i)或(ii)的全长互补序列。
在一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码一个耐旱性的多肽，所述多肽优选为具有耐旱性和/或百草枯耐性，并可来自，例如水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycinetabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
调控元件：
本发明的重组DNA构建体包含至少一个调控元件。
调控元件可以是启动子、增强子、5′UTR或3′UTR。
多个启动子可用于本发明的重组DNA构建体，启动子根据期望的结果选择，可包括宿主生物体中表达的组成型、组织特异型、诱导型、或其他启动子。
一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子称为“组成型启动子”。
当组成型启动子驱动候选基因表达时能够评估候选基因的效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留提高植物耐旱性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell2：163-171)；泛素启动子(Christensen)等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。
在选择启动子用于本发明方法时，期望使用组织特异性启动子或发育调节启动子。
组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，其调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并通常限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。
对于在发育种子组织中表达的多聚核苷酸，特定的启动子包括种子优选的启动子，尤其是早期籽粒/胚胎启动子和晚期籽粒/胚乳启动子，授粉后籽粒的发育大致可以分为三个基本阶段，籽粒生长的停滞期起始于授粉后0天到10-12天，在此期间，籽粒不再明显的生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)。线性籽粒灌浆期起始于授粉后的10-12天并延续到授粉后的40天左右，在此籽粒发育期间，籽粒达到最终的质量，并产生多种储藏物质如淀粉、蛋白质和油等；成熟期起始于授粉后大约40天到收获，在这一过程中，籽粒开始休眠，变干并为萌芽前的种子休眠做准备。本发明中的“早期籽粒/胚胎启动子”指主要在种子发育的停滞期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期间)驱动基因表达的启动子；“后期籽粒/胚乳启动子”主要驱动基因在授粉后12天到成熟过程中的种子中基因表达；表达窗口可能会有一些重叠，将根据使用的ABA偶联的序列和期望的表型选择启动子。
早期籽粒/胚胎启动子包括，Cim1，其在授粉后第5天活跃在特定组织中(WO 00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子end1，其在授粉后7-10天表达，和end2，其在授粉后9-14天在整个籽粒中表达，在授粉后10天在胚乳和果皮中表达(WO00/12733)，此处以全文引用方式并入本文。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利号6,403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利号7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子ADF4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。
本发明中调控核酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异启动子，包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等(1995)Plant Mol.Biol.27：513-528)和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)和类似的启动子。
用于本发明特定实施例的启动子包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织偏爱启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子还包括根偏爱启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CRlBIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GINo.1063664)。
本发明的重组DNA构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在特定实施方案中，重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。
内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.CellBiol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。
增强子或增强子元件是指顺式作用的转录调控元件，即顺式元件。它赋予可操作性连接的多核苷酸序列的整体表达模式，但通常不足以单独驱动转录。分离的增强子元件可与启动子融合以产生嵌合启动子的顺式元件，这赋予了基因表达的整体调节。增强子在本领域中已知并且包括SV40增强子区域、CaMV 35S增强子元素等。一些增强子也被认为可以改变正常的调控元件表达模式，例如，使调控元件在没有增强子时持续性地表达，同一调控元件只在一个特定组织或几个特定组织中表达。复制CaMV35S启动子的上游区域已经被证明可以增加大约10倍的表达(Kay，R.等人，(1987)Science 236:1299-1302)。
组合物：
在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新导入的重组DNA构建体的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性的植物(例如水分限制条件下改良农艺特征)，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子或水稻种子。
植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如水稻、玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、黍、甘蔗或柳枝稷。
重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。
实施方案包括但不限于以下实施方案：
1.一种转基因植物或在基因组中包含重组DNA构建体的基因编辑植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种异源调控元件，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，并且其中，与对照植物相比，所述植物表现出更强的耐旱性和/或百草枯耐性，且所述植物进一步表现出至少一个改变的农艺性状。
2.一种转基因植物，或在其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物，如水稻、玉米或大豆植物，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接至少一个调控元件，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，与对照植物相比，所述植物表现出更强的耐旱性和/或百草枯耐性，且所述植物进一步表现出至少一个改变的农艺性状。
3.一种基因组编辑植物或在其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物，例如水稻、玉米或大豆植物，所述重组DNA构建体的多核苷酸包含有靶向遗传修饰的基因组位点，该修饰的基因编码，多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，与对照植物相比，所述植物表现出更强的耐旱性或百草枯耐性，且所述植物表现出至少一个农艺性状的变化。
4.实施方案1-3所述的植物的任何子代植物，实施方案1-3所述的植物的任何种子，实施方案1-3所述的植物的任何子代植物的种子，和源于实施方案1-3的植物和其子代植物的细胞。
前述实施方案1-4或其它实施方案中，所述耐旱性多肽可来自水稻(Oryzasativa)、野生稻(Oryza australiensis)、短舌野生稻(Oryza barthii)、非洲型稻(Oryzaglaberrima)、阔叶稻(Oryza latifolia)、长雄野生稻(Oryza longistaminata)、南方野生稻(Oryza meridionalis)、药用野生稻(Oryza officinalis)、斑点野生稻(Oryzapunctata)、普通野生稻(Oryza rufipogon)(红稻)、印度野生稻(Oryza nivara)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycinetabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
前述实施方案1、2或4其它实施方案中，重组DNA构建体包含至少一个植物中有功能的启动子作为调控元件。
前述实施方案1-4或其它实施方案中，至少一种农艺性状的变化可以是增加也可以是减少。
前述1-4实施方案或其它实施方案中，与对照植物相比，所述植物在水分限制条件下表现出至少一个农艺性状的变化。
前述实施方案1-4或其它实施方案中，与对照植物相比，所述植物在氧化胁迫即百草枯胁迫下表现出至少一个农艺性状的变化。
下面的例子描述一些代表性的方法或技术用于模拟干旱条件和/或评估耐旱性；模拟氧化条件。
本领域的技术人员也可以测试模拟或者自然发生的干旱条件下的植物保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的产量)的能力评估耐旱性，例如，干旱条件下产生与非干旱条件下相比实质相当的产量；与对照或参照植物相比，干旱条件下产量减少较少。
参数包括与对照细胞或对照植物相比的恢复度、存活率、百草枯抗性率、基因表达水平、水分利用效率、编码蛋白的水平或活性和其他参数。
本领域技术人员很容易找到适当的对照或参照植物，当采用本发明描述的组合物或方法评估或测定转基因植物一个农艺性状或表型时。例如，但不限于下述举例：
1.转化植物的子代，所述转化植物对于重组DNA构建体来说是半合子的，所述子代分离成包含或不包含该DNA构建体的植株：包含该重组DNA构建体的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体的子代是对照或参照植物)。
2.重组DNA构建体基因渗入至近交系中，例如在水稻和玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。
3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。
4.包含重组DNA构建体的植物：该植株可以相对于这样的对照植物进行评价或测量，该对照植物不包含重组DNA构建体，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体的植株相比较，该核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。
方法：
方法包括但不限于：提高植物耐旱性的方法，评估植物耐旱性的方法，提高植物百草枯耐受性的方法，改变植物农艺性状的方法，确定植物农艺性状变化的方法，和生产种子的方法。
方法包括但不限于：
转化细胞方法包括将本发明公开的任意一个或多个分离的多核苷酸转化细胞，其中，在特定的实施方案中，所述细胞是真核细胞，如酵母、昆虫或植物细胞；或原核细胞如细菌细胞。
产生转基因植物的方法包括转化将本发明公开的任意分离的核苷酸或重组DNA构建体转化植物细胞和由转化的植物细胞再生转基因植物，其中本方法获得转基因植物和转基因种子可用于本发明的其他方法。
从细胞或细胞培养物中分离本发明的多肽的方法，其中，所述细胞包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含本发明的一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，所述宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。
改变本发明多肽在宿主细胞中表达水平的方法包括：(a)将本发明重组DNA构建体转化宿主细胞；和(b)使转化宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长，其中重组DNA构建体的表达导致转化宿主细胞中本发明多肽含量的变化。
提高植物耐旱性的方法包括：提高植物中编码多肽的至少一个多核苷酸的表达，其中所述多核苷酸包括：一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18的序列一致性至少为90％。
提高植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种调控元件(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18进行比较时，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与对照植物进行比较时表现出提高的耐旱性和/或百草枯耐性；和(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，与对照植物相比，表现出提高的耐旱性和/或百草枯耐性。
提高植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括(a)在基因组位点处向可再生植物细胞引入靶向基因修饰，该基因修饰编码包含至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列的多肽，或与序列ID NO:3、6、9、12、15或18的100％一致；和(b)产生植物，其中编码多肽的水平和/或活性在植物中增加。
评估植物耐旱性和/或百草枯耐性的方法，包括(a)获得转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件(如，植物中有功能的启动子)其中，所述多核苷酸编码一个多肽，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(b)获得源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；和(c)与对照植物相比，评估子代植物的耐旱性和/或百草枯耐性。
确定植物一种农艺性状变化的方法，包括(a)获得转基因植物，所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接至少一个调控元件(如，植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码一个多肽，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12、15或18相比，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；(b)获得源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物的基因组中包含重组DNA构建体；和(c)水分限制条件下，确定与对照植物相比，所述子代植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。
生产种子的方法包括前述的任一方法，进一步还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体。
可以通过任何适当的技术将本发明的重组DNA构建体导入植物中，所述技术包括但不限于直接DNA吸收、化学药品处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、基因枪轰击或农杆菌的转化。植物转化和再生的技术在国际专利公开号WO 2009/006276中描述，其全部内容并入作为参考。
另外，也有修饰或改变宿主内源基因组DNA的方法，包括改变宿主天然DNA序列或包括调控元件、编码或非编码序列等前体转基因序列。这些方法也可以用于将核酸序列靶向到基因组中改造目标识别序列。例如本文中转基因修饰的细胞或植物使用传统的基因工程核酸酶如产生修饰植物基因组的归位核酸内切酶产生(例如WO 2009/114321；Gao等(2010)Plant Journal 1：176-187)。其他的位点定向工程是通过使用锌指结构域识别偶联的限制性内切酶的限制性特点修饰内源基因(例如Urnov等(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46；Shukla等(2009)Nature 459(7245)：437-41)。转录激活样(TAL)效应因子-DNA修饰酶(transcription activator-like effector-DNA modifying enzyme，TALE或TALEN)可用于基因工程修饰植物基因组，参见例如US20110145940,Cermak等(2011)Nucleic AcidsRes.39(12)和Boch等(2009)，Science 326(5959)：1509-12。植物基因组定点修饰也可以使用细菌II型CRISPR(成簇的规律的间隔的短回文的重复序列，clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR关联蛋白，CRISPR-associated)系统，参考例如Belhaj等(2013)，Plant Methods 9:39.CRISPR/Cas系统可以允许可定制的小的非编码RNA引导的基因组DNA靶向切割。
本领域的技术人员熟悉将编码期望多肽的外源基因转化植物和培育再生植物的方法。再生植物可以自花授粉产生纯合子转基因植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交。本领域的技术人员熟知培育本文披露的含有期望多肽的转基因植物的方法。
转基因植物中性状的重叠
转基因植物可包含本发明公开的一个或多个耐旱性多核苷酸与一个或多个另外的多核苷酸的堆叠，从而导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物可通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一者或两者来获得。这些方法包括但不限于培育各自包含靶多核苷酸的单独品系，用后续基因转化包含本发明公开的基因的转基因植物，以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本发明所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的多种性状(例如，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。如本发明所用的性状是指衍自特定序列或序列群组的表型。
实施例
实施例1.耐旱基因的克隆和载体的构建
根据水稻激活标签突变体库初步的筛选结果设计引物，克隆了水稻耐旱基因OsDN-DTP12、OsSSL13、截短的OsGDSL、OsDN-DTP9、OsWD40-42和OsABCB12。引物序列和扩增片段的长度如表2所示。
以中花11号水稻叶、茎和根混合的cDNA库为模板克隆OsSSL13的cDNA；以ZH11水稻叶、茎和根混合的基因组DNA库为模板克隆OsDN-DTP12、截短的OsGDSL、OsDN-DTP9、OsWD40-42和OsABCB12的gDNA。
表2.克隆水稻耐旱性基因的引物
Figure BDA0002475182070000161
PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳分离后采用柱式试剂盒回收，并与TA克隆载体连接。通过测序确定PCR产物的核酸序列和在构建体中的方向，然后将基因克隆到植物双元载体DP0158(pCAMBIA1300-DsRed)中。
DP0797载体中克隆的核苷酸序列和OsDN-DTP12的编码序列如SEQ ID NO：1和2所示，OsDN-DTP12的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；DP0800载体中克隆的核苷酸序列和OsSSL13的编码序列如SEQ ID NO：4和5所示，OsSSL13的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；DP0802载体中克隆的核苷酸序列和截短的OsGDSL的编码序列如SEQ ID NO：7和8所示，截短的OsGDSL的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；DP0949载体中克隆的核苷酸序列和OsDN-DTP9的编码序列如SEQ ID NO：10和11所示，OsDN-DTP9的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；DP0950载体中克隆的核苷酸序列和OsWD40-42的编码序列如SEQ ID NO：13和14所示，OsWD40-42的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；和DP1169载体中克隆的核苷酸序列和OsABCB12的编码序列如SEQ ID NO：16和17所示，OsABCB12的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
实施例2.转化获得转基因水稻
过表达载体和空载体(DP0158)采用林拥军和张启发((2005)Plant Cell Rep.23：540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻。中花11号水稻为中国农业科学院作物研究所培育的品种，第一批种子由北京未名凯拓农业生物公司提供。转化实验室获得的T0代转基因幼苗移栽至田间水田中获得T1种子，T1和T2代种子储藏在4℃冷库中。过表达载体含有标记基因，T1和T2代种子在绿色荧光灯下发红色荧光的为转基因种子，并用于下列性状验证试验。
实施例3.基因表达分析
采用标准的RT-PCR程序和实时RT-PCR分析转基因水稻植株中基因的表达水平。EF1α基因用作内参显示转基因水稻和对照植物的扩增和上样量类似。以EF1αmRNA水平为参照确定基因表达量。
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsDN-DTP12基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsDN-DTP12基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在6-2256倍之间。ZH11-TC为组织培养获得的ZH11，DP0158代表转空载体DP0158的ZH11。OsDN-DTP12基因实时RT-PCR分析的引物如下：
DP0797-F1：5’-CGAGGACCTTGAGCAACC-3’(SEQ ID NO：31)
DP0797-R1：5’-GCCATACTCTCCCCATCAATTC-3'(SEQ ID NO：32)
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsSSL13基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsSSL13基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在23-426倍之间。OsSSL13基因在几乎所有测试的转基因株系中过量表达，实时RT-PCR的引物如下：
DP0800-F2：5’-CTACTTCAAGCTGCCCCTG-3'(SEQ ID NO：33)
DP0800-R2：5’-CTCCCTCACCTCGCTCAC-3'(SEQ ID NO：34)
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中截短的OsGDSL基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中截短的OsGDSL基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在9-9477倍之间。截短的OsGDSL基因在所有测试的转基因株系中过量表达。
DP0802-F1：5'-ATTTCCCGCCTTATGGTCG-3'(SEQ ID NO：35)
DP0802-R1：5'-GATCAATGGTGTAGGTGGAGTC-3'(SEQ ID NO：36)
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsDN-DTP9基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsDN-DTP9基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在83-13144倍之间。OsDN-DTP9基因在所测试的转基因株系中的表达量高于ZH11-TC幼苗。
DP0949-F1：5’-TGAAGGGATGAGGATAGGGAC-3'(SEQ ID NO：37)
DP0949-R1：5’-CTCACATTTCCCCTCTCCG-3'(SEQ ID NO：38)
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsWD40-42基因的相对表达水平,ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsWD40-42基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在197-927倍之间。
DP0950-F1：5’-GACATTTCAAACATTCCGTGGG-3'(SEQ ID NO：39)
DP0950-R1：5’-AATGCTGGAGTTGATGGAGAC-3'(SEQ ID NO：40)
实时PCR分析测定了不同转基因水稻株系叶片中OsABCB12基因的相对表达水平,DP0158叶片中基因的表达水平设置为1.00，其它转基因株系中OsABCB12基因表达水平与对照ZH11-TC相比,浮动范围在39-2365倍之间。OsABCB12基因在几乎所有测试的转基因株系中过量表达，而DP0158植株中的OsABCB12基因表达量较低。
DP1169-F1：5'-GGGTGCAGTTGTCAGGTG-3'(SEQ ID NO：41)
DP1169-R1：5'-GTATCCTCGCCTGCTTCAC-3'(SEQ ID NO：42)
实施例4.成熟转基因水稻植株的田间干旱试验
开花期干旱胁迫是农业生产中严重的问题。转基因水稻在田间干旱条件下进行验证。田间干旱试验中，每个基因载体选择12个转基因株系。T2代种子首先消毒，萌发的种子种植在田间苗床上，三叶期时，将水稻幼苗移栽到田间试验地，设置四个重复，每个重复每转基因株系10棵苗，并将四个重复种植在同一地块。同一地块中，邻近转基因株系种植的ZH11-TC和DP0158用作统计分析中的对照。
水稻苗期正常管理，并使用相应的杀虫剂和化肥，穗分化期停止浇水，因此开花期时产生干旱胁迫，干旱时间长短取决于温度和湿度等天气条件。干旱期间，使用TDR30(Spectrum Technologies，Inc.)在每块地的10个位点每四天测定土壤相对含水量。
试验过程中，观察并记录植株表型，植株的表型主要包括抽穗期、卷叶程度、敏旱性和抗旱性，尤其关注中午时植株的卷叶程度。种植季结束时，每个株系在每行中间挑选约6株具有代表性的植株收获，并称量每株水稻籽粒的重量，利用混合线性模型(mixedlinear model)对籽粒重量进行统计分析。P＜0.1时，认为转基因株系为阳性株系，基因具有提高耐旱性功能。
田间干旱试验结果：
1)OsDN-DTP12(DP0797)转基因水稻的田间DRT验证结果
第一次田间试验中，使用12个OsDN-DTP12转基因水稻株系在海南省进行验证，ZH11-TC和DP0158用作对照。主茎穗处于幼穗分化Ⅱ-Ⅳ期，分蘖穗处于幼穗分化Ⅰ期停止浇水。幼穗抽穗过程中，土壤体积含水量从40％降到10％。断水后19天，主茎穗处于幼穗分化Ⅷ,分蘖穗处于幼穗分化Ⅴ-Ⅵ期，一些水稻植株展现出诸如卷叶的表型；断水后35天，50％的幼穗抽出。5个OsDN-DTP12转基因水稻株系DP0797.02、DP0797.03、DP0797.04、DP0797.06和DP0797.14在成熟期表现出较好的结实率。
籽粒产量分析表明，载体水平上，OsDN-DTP12转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照且显著高于DP0158对照；转基因株系水平上，3个OsDN-DTP12转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC，6个转基因株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照(表3)。这些结果表明OsDN-DTP12转基因水稻耐受干旱胁迫，过量表达OsDN-DTP12基因提高耐旱性，并提高花期干旱胁迫后植物单株籽粒产量。
表3.OsDN-DTP12转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000181
Figure BDA0002475182070000191
第二次试验在海南田间进行，同样的12个OsDN-DTP12转基因株系进行了测试。当主茎穗处于幼穗分化Ⅲ-Ⅳ期，分蘖穗处于幼穗分化Ⅰ-Ⅱ期时，停止灌水。断水后52天，主茎穗处于乳熟期，水稻植株开始出现干旱胁迫表型。抽穗和成熟过程中，土壤体积含水量从18％降至6％。4个OsDN-DTP12转基因株系DP0797.02、DP0797.03、DP0797.04和DP0797.06在成熟期表现出了较好的结实率。
籽粒产量分析表明，载体水平上，OsDN-DTP12转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平，4个OsDN-DTP12转基因株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照(表4)。这些结果表明OsDN-DTP12转基因水稻获得了耐旱性，并提高了单株籽粒产量。
表4.OsDN-DTP12转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000192
2)OsSSL13(DP0800)转基因水稻的田间DRT验证结果
第一次田间试验中，使用12个OsSSL13转基因水稻株系在海南省进行验证，ZH11-TC和DP0158用作对照。主茎穗处于幼穗分化Ⅱ-Ⅳ期，分蘖穗处于幼穗分化Ⅰ期停止浇水，抽穗期期间，土壤体积含水量从40％下降到10％。断水后19天，主茎穗处于幼穗分化Ⅷ期,分蘖穗处于幼穗分化Ⅴ-Ⅵ期，且水稻植株展现出诸如卷叶的表型；断水后35天，50％的幼穗抽出。成熟期时，2个OsSSL13转基因水稻株系DP0800.07和DP0800.10表现出较好的结实率。
籽粒产量分析表明，载体水平上，OsSSL13转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，7个OsSSL13转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，9个株系的单株产量显著高于DP0158对照(表5)。这些结果表明OsSSL13转基因水稻耐受干旱条件，过量表达OsSSL13基因提高了苗期耐旱性并提高了开花期干旱胁迫后单株籽粒产量。
表5.OsSSL13转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000201
第二次试验在海南田间进行，同样的12个OsSSL13转基因株系进行了测试。主茎穗处于幼穗分化Ⅴ-Ⅵ期，分蘖穗处于幼穗分化Ⅱ-Ⅲ期停止浇水。断水后49天，主茎穗处于乳熟期,水稻植株开始出现干旱胁迫表型；抽穗期和成熟期期间，土壤体积含水量从21％下降到7％。1个OsSSL13转基因水稻株系DP0800.10表现出较好的结实表型。
籽粒产量分析表明，载体水平上，OsSSL13转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照并显著高于DP0158对照；转基因株系水平上，3个OsSSL13转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，6个株系的单株产量显著高于DP0158对照(表6)。这些结果进一步表明OsSSL13转基因水稻获得了耐旱性，并提高了单株籽粒产量。
表6.OsSSL13转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000202
Figure BDA0002475182070000211
3)截短的OsGDSL(DP0802)基因转化水稻的田间DRT验证结果
第一次田间试验中，使用12个截短的OsGDSL基因转化水稻株系在海南省进行验证。主茎穗处于幼穗分化Ⅱ期停止浇水，直至种子成熟产生较重的干旱胁迫，抽穗期期间，土壤体积含水量从36％下降到10％。断水后26天，主茎穗抽出,分蘖穗处于幼穗分化Ⅵ-Ⅶ期，一些水稻植株出现诸如卷叶的表型。种植季结束时，5个截短的OsGDSL基因转化水稻株系DP0802.03、DP0802.07、DP0802.11、DP0802.14和DP0802.15表现出较好的结实率。
单株籽粒产量如表7所示，载体水平上，截短的OsGDSL基因转化水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照，并显著高于DP0158对照；转基因株系水平上，6个截短的OsGDSL基因转化水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，9个株系的单株产量显著高于DP0158对照。这些结果表明截短的OsGDSL基因转化水稻植株在干旱胁迫后的单株籽粒产量高于对照。
表7.截短的OsGDSL基因转化水稻在田间干旱条件下的产量分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000212
第二次田间试验在海南省进行，对12个截短的OsGDSL基因转化水稻株系进行验证。主茎穗处于幼穗分化Ⅴ-Ⅵ期，分蘖穗处于幼穗分化Ⅱ-Ⅲ期，停止浇水，抽穗期和成熟期期间，土壤体积含水量从21％下降到7％。断水后27天，50％的幼穗抽出；断水后52天，主茎穗处于乳熟期,水稻植株出现诸如卷叶的表型。
如表8所示，载体水平上，截短的OsGDSL基因转化水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，6个截短的OsGDSL基因转化水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，7个株系的单株产量显著高于DP0158对照。这些结果进一步表明，截短的OsGDSL基因转化水稻植株耐受干旱胁迫，过量表达截短的OsGDSL基因提高了花期和抽穗期干旱胁迫后的单株籽粒产量。
表8.截短的OsGDSL基因转化水稻在田间干旱条件下的产量分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000221
4)OsDN-DTP9(DP0949)转基因水稻的田间DRT验证结果
第一次田间试验中，使用12个OsDN-DTP9转基因水稻株系在宁夏省进行验证，临近种植的ZH11-TC和DP0158水稻植株用作对照。主茎穗处于幼穗分化Ⅰ期停止浇水，水稻抽穗期前，土壤体积含水量从45％下降到10％，后来的降雨导致了干旱胁迫过程中土壤体积含水量在25％到10％之间变动。断水后16天，主茎穗处于幼穗分化Ⅳ-Ⅴ期,分蘖穗处于幼穗分化Ⅲ-Ⅳ期，水稻植株开始出现卷叶表型。6个转基因株系DP0949.01、DP0949.02、DP0949.06、DP0949.14、DP0949.15和DP0949.17比对照的卷叶程度低且叶色更绿；成熟期时，转基因水稻株系DP0949.17表现出较好的结实表型。
种植季结束时，每个转基因株系选择每行中间具有代表性的6株进行收获，并测量单株籽粒产量。载体水平上，OsDN-DTP9转基因水稻的单株籽粒产量高于DP0158对照；转基因株系水平上，1个OsDN-DTP9转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，5个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照(表9)。这些结果表明OsDN-DTP9转基因水稻耐受干旱胁迫，过量表达OsDN-DTP9基因提高水稻苗期耐旱性，并可能提高花期干旱胁迫后单株籽粒产量。
表9.OsDN-DTP9转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000231
第二次试验在海南省进行，对同样的12个OsDN-DTP9转基因水稻株系进行验证。主茎穗处于幼穗分化Ⅲ-Ⅳ期，分蘖穗处于幼穗分化Ⅰ-Ⅱ期时，停止浇水，水稻抽穗期和成熟期期间，土壤体积含水量从24％下降到8％。断水后27天，50％的幼穗抽出；断水后49天，主茎穗处于乳熟期,水稻植株开始出现卷叶表型。成熟期时，多个转基因水稻株系表现出较好的结实表型。
如表10所示，载体水平上，OsDN-DTP9转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照，并显著高于DP0158对照；转基因株系水平上，3个OsDN-DTP9转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，9个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照。这些结果进一步表明OsDN-DTP9转基因水稻耐受干旱胁迫，过量表达OsDN-DTP9基因提高了花期和抽穗期干旱胁迫后单株籽粒产量。
表10.OsDN-DTP9转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000232
Figure BDA0002475182070000241
5)OsWD40-42(DP0950)转基因水稻的田间DRT验证结果
第一次田间试验中，使用12个OsWD40-42转基因水稻株系在宁夏省进行验证。主茎穗处于幼穗分化Ⅰ期停止浇水，抽穗期之前，土壤体积含水量从45％下降到10％。后来的降雨导致了干旱胁迫过程中土壤体积含水量在25％到10％之间变动。断水后16天，主茎穗处于幼穗分化Ⅳ-Ⅴ期,分蘖穗处于幼穗分化Ⅲ-Ⅳ期，水稻植株开始出现卷叶表型。几乎所有的OsWD40-42转基因水稻株系在成熟期表现出较好的结实率。
如表11所示，载体水平上，OsWD40-42转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照，并显著高于DP0158对照；转基因株系水平上，6个OsWD40-42转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明OsWD40-42转基因水稻耐受干旱胁迫，过量表达OsWD40-42基因提高了花期干旱胁迫后单株籽粒产量。
表11.OsWD40-42转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000242
Figure BDA0002475182070000251
第二次试验在海南省进行，对同样的12个OsWD40-42转基因水稻株系进行验证。主茎穗处于幼穗分化Ⅲ-Ⅳ期，分蘖穗处于幼穗分化Ⅰ-Ⅱ期，停止浇水，抽穗期和成熟期过程中，土壤体积含水量从24％下降到8％。断水后27天，50％的幼穗抽出。断水49天后，主茎穗处于乳熟期,水稻植株开始出现卷叶表型。4个OsWD40-42转基因水稻株系DP0950.01、DP0950.03、DP0950.05和DP0950.10在成熟期表现出较好的结实率。
载体水平上，OsWD40-42转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照，并显著高于DP0158对照；转基因株系水平上，3个OsWD40-42转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，5个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照(表12)。这些结果进一步表明OsWD40-42过表达转基因水稻耐受干旱胁迫，过量表达OsWD40-42基因提高了耐旱性，并进一步提高单株籽粒产量。
表12.OsWD40-42转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000252
6)OsABCB12(DP1169)转基因水稻的田间DRT验证结果
第一次田间试验中，使用12个OsABCB12转基因水稻株系在海南省进行验证，种植的ZH11-TC和DP0158水稻植株用作对照。主茎穗处于幼穗分化Ⅱ-Ⅲ期停止浇水，抽穗期和成熟期期间，土壤体积含水量从35％下降到8％。断水后26天，主茎穗抽出,分蘖穗处于幼穗分化Ⅵ-Ⅶ期，水稻植株开始出现诸如卷叶的表型。断水后39天，50％的幼穗抽出。3个OsABCB12转基因水稻株系DP1169.02、DP1169.09和DP1169.12在成熟期表现出较好的结实率。
籽粒产量分析表明，载体水平上，OsABCB12转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，10个OsABCB12转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，11个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照(表13)。这些结果表明OsABCB12转基因水稻耐受干旱胁迫，过量表达OsABCB12基因提高了苗期耐旱性，并增加了花期干旱胁迫后单株籽粒产量。
表13.OsABCB12转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000261
第二次试验中，对同样的12个OsABCB12转基因水稻株系在海南省再次进行验证。主茎穗处于幼穗分化Ⅴ-Ⅵ期，分蘖穗处于幼穗分化Ⅱ-Ⅲ期停止浇水。断水后27天，50％的幼穗抽出，水稻植株开始出现诸如卷叶的表型。断水后49天，主茎穗处于乳熟期，水稻植株开始出现干旱胁迫表型。抽穗期期间，土壤体积含水量从21％下降到7％。
籽粒产量分析表明，载体水平上，OsABCB12转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，7个OsABCB12转基因水稻株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，10个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照(表14)。这些结果进一步表明OsABCB12转基因水稻获得耐旱性，并增加了单株籽粒产量。
表14.OsABCB12转基因水稻在田间干旱条件下的产量分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000262
Figure BDA0002475182070000271
实施例5.转基因水稻植株的实验室百草枯试验
百草枯(1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)是一类叶片喷施的非选择性的吡啶除草剂，是世界范围内广泛应用一种除草剂，能够控制大量作物如玉米、水稻、大豆等中生长的杂草。在植物细胞中，百草枯主要靶向叶绿体，百草枯通过接受光系统I的电子，然后与氧气发生化学反应生成过氧化物和过氧化氢，而过氧化物和过氧化氢可以导致产生光氧化胁迫。干旱胁迫通常导致植物中产生活性氧(ROS)，有时，植物的耐旱性与增强的抗活性氧能力相关。百草枯是强有力的氧化胁迫诱导剂，能够大大的增加活性氧(ROS)的产生，同时抑制抗氧化系统活性所需的的还原物和化合物的再生。非生物胁迫增加了ROS的产生，而植物响应耐性到死亡的范围取决于胁迫力度和与其相关的ROS水平。相对较低水平的百草枯能够模拟胁迫相关的ROS产生，并用作植物胁迫生物学中胁迫耐性的标记(Hasaneen M.N.A.(2012)Herbicide-Properties,Synthesis and Control of Weeds book)。因此，进一步采用百草枯验证耐旱性的转基因水稻。
百草枯试验方法：
每个载体的水稻选择10个转基因株系用于百草枯试验，组培中花11(ZH11-TC)和转空载体对照DP0158用作对照。T2代种子参照常规方法消毒和萌发。百草枯试验在温度28-30℃，湿度30％的生长室中进行。萌发的种子放置在底部有孔的离心管中，采用水稻水培方法，培养5天，至一叶一心期；然后选择高度大约3.5～4cm的一致的幼苗用于百草枯试验。本实验采用随机区组设计，在同一个筛选水槽内设置5个区组；区组内包含所有测试的10个转基因株系、ZH11-TC和DP0158；区组的行列为16*12，每一行为一份测试材料，故每个转基因株系在区组内各12株，对照ZH11-TC和DP0158在区组内各3行；区组内的所有转基因株系和对照均随机排布。幼苗用终浓度为0.8μM的百草枯溶液进行处理7天，光周期为10h黑暗/14h光照，每两天更换一次溶液，在处理和更换溶液后，保证幼苗首先进入光周期的黑暗时期。处理7天后，计算绿色的幼苗。绿色没有损伤的幼苗为百草枯耐性幼苗；叶片、茎部变白褪色的幼苗为非百草枯耐性的幼苗。
耐性率是百草枯试验的一个指标，指保持绿色并显示百草枯耐性表型的幼苗数除以总幼苗数的百分数。
试验数据在载体水平(所有的转基因幼苗与对照幼苗相比)和转基因株系水平(不同的转基因株系与对照相比)进行分析，采用的统计模型为“Y～seg+line(seg)+rep+error”，随机效应为“rep”，统计方法是“
Figure BDA0002475182070000272
PROC GLIMMIX”。
百草枯试验结果：
1)OsDN-DTP12(DP0797)转基因水稻的百草枯验证结果
第一次试验中，百草枯溶液处理7天后，600株OsDN-DTP12转基因幼苗中，345株(58％)保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，91株(51％)具有百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，92株(51％)显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的OsDN-DTP12转基因幼苗的耐性率高于ZH11-TC和DP0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明7个OsDN-DTP12转基因株系的百草枯耐性率高于ZH11-TC对照和DP0158对照，2个株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照(表15)。这些结果表明，与ZH11-TC和DP0158两个对照相比，OsDN-DTP12转基因水稻在载体水平和转基因株系水平均提高了幼苗的百草枯耐性，OsDN-DTP12在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。
表15.OsDN-DTP12转基因水稻的百草枯耐性分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000281
第二次试验中，对同样的10个OsDN-DTP12转基因株系进行测试，百草枯溶液处理7天后，600株OsDN-DTP12转基因幼苗中，427株(71％)保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，108株(60％)具有百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，96株(53％)显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的OsDN-DTP12转基因幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明3个OsDN-DTP12转基因株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC对照，6个株系显著高于DP0158两个对照(表16)。这些结果进一步表明，OsDN-DTP12在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。
表16.OsDN-DTP12转基因水稻的百草枯耐性分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000282
Figure BDA0002475182070000291
2)OsSSL13(DP0800)转基因水稻的百草枯验证结果
第一次试验中，百草枯溶液处理7天后，600株OsSSL13转基因幼苗中，499株(83％)保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，108株(60％)具有百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，114株(63％)显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的OsSSL13转基因幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明9个OsSSL13转基因株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC对照和DP0158对照(表17)。这些结果表明，与ZH11-TC和DP0158两个对照相比，OsSSL13转基因水稻在载体水平和转基因株系水平均提高了幼苗的百草枯耐性，OsSSL13在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。
表17.OsSSL13转基因水稻的百草枯耐性分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000292
第二次试验中，对同样的10个OsSSL13转基因株系进行测试，百草枯溶液处理7天后，600株OsSSL13转基因幼苗中，468株(78％)保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，112株(62％)具有百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，100株(56％)显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的OsSSL13转基因幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明6个OsSSL13转基因株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC对照，9个株系的百草枯耐性率显著高于DP0158两个对照(表18)。这些结果进一步表明，OsSSL13在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。
表18.OsSSL13转基因水稻的百草枯耐性分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000301
3)截短的OsGDSL(DP0802)基因转化水稻的百草枯验证结果
第一次试验中，百草枯溶液处理7天后，600株截短的OsGDSL基因转化幼苗中，476株(79％)保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，120株(67％)具有百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，108株(60％)显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的截短的OsGDSL基因转化幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明6个截短的OsGDSL基因转化株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC对照，和7个株系的百草枯耐性率显著高于DP0158对照(表19)。这些结果表明，与ZH11-TC和DP0158两个对照相比，截短的OsGDSL基因转化水稻在载体水平和转基因株系水平均提高了幼苗的百草枯耐性，截短的OsGDSL基因在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。
表19.截短的OsGDSL基因转化水稻的百草枯耐性分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000302
Figure BDA0002475182070000311
第二次试验中，对同样的10个截短的OsGDSL基因转化株系进行测试，百草枯溶液处理7天后，600株截短的OsGDSL基因转化幼苗中，496株(83％)保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，122株(68％)具有百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，130株(72％)显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的截短的OsGDSL基因转化幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明7个截短的OsGDSL基因转化株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC对照，和2个株系的百草枯耐性率显著高于DP0158对照(表20)。这些结果进一步表明，截短的OsGDSL基因在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。
表20.截短的OsGDSL转基因水稻的百草枯耐性分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000312
4)OsDN-DTP9(DP0949)转基因水稻的百草枯验证结果
第一次试验中，百草枯溶液处理7天后，600株OsDN-DTP9转基因幼苗中，499株(83％)保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，112株(62％)具有百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，136株(76％)显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的OsDN-DTP9转基因幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明9个OsDN-DTP9转基因株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC对照，和2个株系的百草枯耐性率显著高于DP0158对照(表21)。这些结果表明，与ZH11-TC和DP0158两个对照相比，OsDN-DTP9转基因水稻在载体水平和转基因株系水平均提高了幼苗的百草枯耐性，OsDN-DTP9在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。
表21.OsDN-DTP9转基因水稻的百草枯耐性分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000321
第二次试验中，对同样的10个OsDN-DTP9转基因株系进行测试，百草枯溶液处理7天后，588株OsDN-DTP9转基因幼苗中，474株(81％)保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，111株(62％)具有百草枯耐性表型；192株DP0158幼苗中，132株(69％)显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的OsDN-DTP9转基因幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。
进一步在转基因株系水平的分析表明7个OsDN-DTP9转基因株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC对照，4个株系的百草枯耐性率显著高于DP0158两个对照(表22)。这些结果进一步表明，与ZH11-TC和DP0158两个对照相比，OsDN-DTP9转基因水稻在载体水平和转基因株系水平均提高了幼苗的百草枯耐性，OsDN-DTP9在提高转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力中起作用。
表22.OsDN-DTP9转基因水稻的百草枯耐性分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000322
Figure BDA0002475182070000331
5)OsWD40-42(DP0950)转基因水稻的百草枯验证结果
第一次试验中，0.8μM百草枯溶液处理7天后，600株OsWD40-42转基因幼苗中，460株(77％)保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，119株(66％)具有百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，134株(74％)显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的OsWD40-42转基因幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC对照并高于DP0158对照。
转基因株系水平的分析如表23所示，5个OsWD40-42转基因株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC对照。这些结果表明，过量表达OsWD40-42基因提高了转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力。
表23.OsWD40-42转基因水稻的百草枯耐性分析(第一次试验)
Figure BDA0002475182070000332
第二次试验中，0.8μM百草枯溶液处理7天后，600株OsWD40-42转基因幼苗中，436株(73％)保持绿色并显示出百草枯耐性表型；而180株ZH11-TC幼苗中，105株(58％)具有百草枯耐性表型；180株DP0158幼苗中，107株(59％)显示百草枯耐性表型。载体水平上，所测试的OsWD40-42转基因幼苗的耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。
转基因株系水平的分析如表24所示，4个OsWD40-42转基因株系的百草枯耐性率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明，过量表达OsWD40-42基因提高了转基因植物百草枯耐性或抗氧化能力，OsWD40-42在提高转基因植物的百草枯耐性或抗氧化能力上发挥作用。
表24.OsWD40-42转基因水稻的百草枯耐性分析(第二次试验)
Figure BDA0002475182070000341
实施例6.成熟的转基因水稻植株在水分充足条件下的谷物产量
将耐旱基因转化的水稻和ZH11-TC以及DP0158品种种植在水田中，在水分充足的条件下测量籽粒产量。从每个基因构建体中选择5个转基因株系。先对T2种子进行消毒，然后将发芽的种子种植在苗床上。在三叶期，将幼苗转移到试验田种植，每个转基因株系分4个重复，每个重复种植40株，这4个重复种在同一个田块。ZH11-TC和DP0158的幼苗作为统计分析中的对照，靠近转基因株系种植在同一田块内。
水稻植株在田间种植过程中进行正常的喷洒农药和施用肥料的管理。在试验中，及时观测植株的表型并进行记录。在生长后期，每个株系中选择每行中间具有代表性的植株进行收获，测量并记录每一株的籽粒产量。采用混合线性模型对籽粒产量进行统计分析。
在水分充足条件下种植的OsABCB12(DP1169)转基因水稻植株
试验选用了5个OsABCB12转基因水稻株系。这5个株系的植株和对照植株间没有明显不同的表型。如表25所示，OsABCB12转基因水稻的单株籽粒产量在载体水平上显著高于对照ZH11-TC和DP0158。而且，有3个株系的单株籽粒产量在株系水平上明显高于对照ZH11-TC和DP0158。试验结果表明，在水分充足的条件下，OsABCB12基因的过量表达能够提高植株的单株籽粒产量。
表25.OsABCB12转基因水稻在水分充足条件下籽粒产量的分析
Figure BDA0002475182070000342
Figure BDA0002475182070000351
实施例7.水稻耐旱基因转化玉米并评估玉米的抗旱性
将水稻耐旱性基因或者玉米、拟南芥或其它物种中的相应的同源基因转化玉米植株，以组成型的启动子如玉米泛素启动子(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)或诸如胁迫响应启动子或组织偏爱启动子的其它启动子驱动玉米转化载体中基因的表达，采用微粒轰击法(国际专利公布WO 2009/006276)将构建的重组DNA载体转化玉米，也可以以采用农杆菌介导法(Zhao等，Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)和Zhao等，Mol.Breed.8：323-333(2001)和美国专利号5,981,840，1999年11月9日公布)转化玉米。农杆菌介导转化的过程包括细菌的接种、共培养、静止、筛选和植株的再生。
再生植株的子代如T1代植株可以种在土壤中进行干旱胁迫，采用图像分析，测量胁迫前和干旱胁迫过程中多个时期点植株面积、体积、生长速率和叶片颜色。与对照相比，明显延迟胁迫期间植株的萎蔫，叶面积的减小，黄色素积累的减少，和/或促进生长速率的增加被认为基因提高玉米的耐旱性能。
序列表
<110> 未名生物农业集团有限公司
先锋海外公司
<120> 非生物胁迫耐性提高的植物和提高植物非生物胁迫耐性的多聚核苷酸及方法
<130> RTS22593G
<150> 201711062556.3
<151> 2017-11-02
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 387
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
gatagtaatt aagagaccat ggtggagtgc caccaccagt acaccaacag catgaaggag 60
aagaggccgc caccgaggag aggtcagctc aagcggcaga tcgcgaggac cttgagcaac 120
ctcatggtgc cgggcggcgg caagcagatc gcagcaggtt cagaggaggg ccaggctgca 180
gcaaaagctc atggatgctt caggcttaga tgatgaattg atggggagag tatggctgat 240
tcaggttcag gcttagatga tgttagttgt taatctattt tgtactatag tcgttagttt 300
ttgctttcag aacctctctt tgatatccta tataatgctg tgtttgcaat cttgggttcc 360
caacgtatat aggagtagtg cgcacag 387
<210> 2
<211> 201
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
atggtggagt gccaccacca gtacaccaac agcatgaagg agaagaggcc gccaccgagg 60
agaggtcagc tcaagcggca gatcgcgagg accttgagca acctcatggt gccgggcggc 120
ggcaagcaga tcgcagcaga acctctcttt gatatcctat ataatgctgt gtttgcaatc 180
ttgggttccc aacgtatata g 201
<210> 3
<211> 66
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 3
Met Val Glu Cys His His Gln Tyr Thr Asn Ser Met Lys Glu Lys Arg
1 5 10 15
Pro Pro Pro Arg Arg Gly Gln Leu Lys Arg Gln Ile Ala Arg Thr Leu
20 25 30
Ser Asn Leu Met Val Pro Gly Gly Gly Lys Gln Ile Ala Ala Glu Pro
35 40 45
Leu Phe Asp Ile Leu Tyr Asn Ala Val Phe Ala Ile Leu Gly Ser Gln
50 55 60
Arg Ile
65
<210> 4
<211> 1417
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 4
ctctgcgtgc aaattccgtc ttccctcgct cctgatctcc atggaagaga agaagcagca 60
gcagcagcgt ccacagagag ggcgcgatgg catcctgcag tatccgcacc ttttcttcgc 120
ggcgctggcg ctggccctgc tcctcaccga cccgttccac ctcggcccgc tcgccggggt 180
ggactaccgg ccggtgaggc acgagctggc gccgtaccgc gaggtgatgg cgcggtggcc 240
gcgggacaac ggcagccggc tcaggcacgg caggctggag ttcgtcggag aggtgttcgg 300
gccggagtcc atcgagttcg accgccacgg ccgcggcccc tacgccggcc tcgccgacgg 360
ccgcgtcgtg cggtggatgg gggaggacgc cgggtgggag acgttcgccg tcatgagccc 420
tgactggtcg gagaaagttt gtgccaatgg ggtggagtcg acgacgaaga agcagcacga 480
gatggagcga cggtgcggcc ggcctctcgg gctgaggttt cacggcgaga ccggcgagct 540
ctacgtcgcc gacgcgtact acgggctcat gtccgtcggt ccgaacggcg gggtggcgac 600
ctctctcgcg agagaagtcg gcgggagccc ggtcaacttc gcgaacgacc tcgacatcca 660
ccgcaacggc tccgtgttct tcaccgacac gagcacgaga tacaacagaa aggatcatct 720
gaacgttctg ctagaaggtg aaggcacagg gaggctgctc agatatgacc cagaaaccaa 780
agctgcccat gtcgtgctga gcgggctggt cttcccgaat ggcgtgcaga tttctgacga 840
ccagcagttc ctcctcttct ccgaaacaac aaactgcagg ataatgcggt actggctgga 900
agggccaaga gccgggcagg tggaggtgtt cgccgacctg ccggggttcc cggacaacgt 960
gcgactgagc agcggcggcg gcggcggacg gttctgggtg gcgatcgact gctgcaggac 1020
ggcggcgcag gaggtgttcg ccaagcggcc gtggctgcga acgctctact tcaagctgcc 1080
cctgacgatg cggacgctgg ggaagatggt cagcatgcgg atgcacaccc tcgtcgcgct 1140
cctcgacggc gaaggggacg tcgtcgaggt gctcgaggac cggggcggcg aggtgatgcg 1200
gctggtgagc gaggtgaggg aggtggggcg caagctgtgg atcggcaccg tggctcataa 1260
ccacatcgcc acgatccctt acccgttgga agagcagagt agcagcaacg tgcttggtga 1320
ttgatacttt gataggctgg ttttagcagc aacaaaggtg tactagttga tgtattgttt 1380
gtgtttgccg ggccatcata gaaagtgcct ggtgatc 1417
<210> 5
<211> 1284
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 5
atggaagaga agaagcagca gcagcagcgt ccacagagag ggcgcgatgg catcctgcag 60
tatccgcacc ttttcttcgc ggcgctggcg ctggccctgc tcctcaccga cccgttccac 120
ctcggcccgc tcgccggggt ggactaccgg ccggtgaggc acgagctggc gccgtaccgc 180
gaggtgatgg cgcggtggcc gcgggacaac ggcagccggc tcaggcacgg caggctggag 240
ttcgtcggag aggtgttcgg gccggagtcc atcgagttcg accgccacgg ccgcggcccc 300
tacgccggcc tcgccgacgg ccgcgtcgtg cggtggatgg gggaggacgc cgggtgggag 360
acgttcgccg tcatgagccc tgactggtcg gagaaagttt gtgccaatgg ggtggagtcg 420
acgacgaaga agcagcacga gatggagcga cggtgcggcc ggcctctcgg gctgaggttt 480
cacggcgaga ccggcgagct ctacgtcgcc gacgcgtact acgggctcat gtccgtcggt 540
ccgaacggcg gggtggcgac ctctctcgcg agagaagtcg gcgggagccc ggtcaacttc 600
gcgaacgacc tcgacatcca ccgcaacggc tccgtgttct tcaccgacac gagcacgaga 660
tacaacagaa aggatcatct gaacgttctg ctagaaggtg aaggcacagg gaggctgctc 720
agatatgacc cagaaaccaa agctgcccat gtcgtgctga gcgggctggt cttcccgaat 780
ggcgtgcaga tttctgacga ccagcagttc ctcctcttct ccgaaacaac aaactgcagg 840
ataatgcggt actggctgga agggccaaga gccgggcagg tggaggtgtt cgccgacctg 900
ccggggttcc cggacaacgt gcgactgagc agcggcggcg gcggcggacg gttctgggtg 960
gcgatcgact gctgcaggac ggcggcgcag gaggtgttcg ccaagcggcc gtggctgcga 1020
acgctctact tcaagctgcc cctgacgatg cggacgctgg ggaagatggt cagcatgcgg 1080
atgcacaccc tcgtcgcgct cctcgacggc gaaggggacg tcgtcgaggt gctcgaggac 1140
cggggcggcg aggtgatgcg gctggtgagc gaggtgaggg aggtggggcg caagctgtgg 1200
atcggcaccg tggctcataa ccacatcgcc acgatccctt acccgttgga agagcagagt 1260
agcagcaacg tgcttggtga ttga 1284
<210> 6
<211> 427
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 6
Met Glu Glu Lys Lys Gln Gln Gln Gln Arg Pro Gln Arg Gly Arg Asp
1 5 10 15
Gly Ile Leu Gln Tyr Pro His Leu Phe Phe Ala Ala Leu Ala Leu Ala
20 25 30
Leu Leu Leu Thr Asp Pro Phe His Leu Gly Pro Leu Ala Gly Val Asp
35 40 45
Tyr Arg Pro Val Arg His Glu Leu Ala Pro Tyr Arg Glu Val Met Ala
50 55 60
Arg Trp Pro Arg Asp Asn Gly Ser Arg Leu Arg His Gly Arg Leu Glu
65 70 75 80
Phe Val Gly Glu Val Phe Gly Pro Glu Ser Ile Glu Phe Asp Arg His
85 90 95
Gly Arg Gly Pro Tyr Ala Gly Leu Ala Asp Gly Arg Val Val Arg Trp
100 105 110
Met Gly Glu Asp Ala Gly Trp Glu Thr Phe Ala Val Met Ser Pro Asp
115 120 125
Trp Ser Glu Lys Val Cys Ala Asn Gly Val Glu Ser Thr Thr Lys Lys
130 135 140
Gln His Glu Met Glu Arg Arg Cys Gly Arg Pro Leu Gly Leu Arg Phe
145 150 155 160
His Gly Glu Thr Gly Glu Leu Tyr Val Ala Asp Ala Tyr Tyr Gly Leu
165 170 175
Met Ser Val Gly Pro Asn Gly Gly Val Ala Thr Ser Leu Ala Arg Glu
180 185 190
Val Gly Gly Ser Pro Val Asn Phe Ala Asn Asp Leu Asp Ile His Arg
195 200 205
Asn Gly Ser Val Phe Phe Thr Asp Thr Ser Thr Arg Tyr Asn Arg Lys
210 215 220
Asp His Leu Asn Val Leu Leu Glu Gly Glu Gly Thr Gly Arg Leu Leu
225 230 235 240
Arg Tyr Asp Pro Glu Thr Lys Ala Ala His Val Val Leu Ser Gly Leu
245 250 255
Val Phe Pro Asn Gly Val Gln Ile Ser Asp Asp Gln Gln Phe Leu Leu
260 265 270
Phe Ser Glu Thr Thr Asn Cys Arg Ile Met Arg Tyr Trp Leu Glu Gly
275 280 285
Pro Arg Ala Gly Gln Val Glu Val Phe Ala Asp Leu Pro Gly Phe Pro
290 295 300
Asp Asn Val Arg Leu Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Arg Phe Trp Val
305 310 315 320
Ala Ile Asp Cys Cys Arg Thr Ala Ala Gln Glu Val Phe Ala Lys Arg
325 330 335
Pro Trp Leu Arg Thr Leu Tyr Phe Lys Leu Pro Leu Thr Met Arg Thr
340 345 350
Leu Gly Lys Met Val Ser Met Arg Met His Thr Leu Val Ala Leu Leu
355 360 365
Asp Gly Glu Gly Asp Val Val Glu Val Leu Glu Asp Arg Gly Gly Glu
370 375 380
Val Met Arg Leu Val Ser Glu Val Arg Glu Val Gly Arg Lys Leu Trp
385 390 395 400
Ile Gly Thr Val Ala His Asn His Ile Ala Thr Ile Pro Tyr Pro Leu
405 410 415
Glu Glu Gln Ser Ser Ser Asn Val Leu Gly Asp
420 425
<210> 7
<211> 534
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 7
aatgcaaatc agtgacaaca actaactaag atgacctcac agcaattagg ctactgctgg 60
gtcctcctaa ttgccttgct atcgtgcagc gcagccactg ccagcgaggt cccggcgatc 120
atcgtgttcg gggactcgac ggtcgacgcc ggcaacaaca actacatcct caccgtcgcc 180
aagggcaatt tcccgcctta tggtcgcgac ttcgacggcg gcgtcgccac cggccgcttc 240
tccaatggcc gccttgtcac cgacttcgtg tcggaggcgc tggggctgcc gtcctctgtg 300
ccggcctatc tcgactccac ctacaccatt gatcagcttg ctactggtgt cagctttgct 360
tcaggcggca ccgggctcga tagtctcact gccagagttg tagtaagtta actcatctcc 420
caatatataa ccttgcactt gtcttttttt taaggaaagc ggcaagagta ttgccgaata 480
tattagagga aaagaaaatt acggtttaca tgttggtgat tatacgatca aagc 534
<210> 8
<211> 381
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 8
atgacctcac agcaattagg ctactgctgg gtcctcctaa ttgccttgct atcgtgcagc 60
gcagccactg ccagcgaggt cccggcgatc atcgtgttcg gggactcgac ggtcgacgcc 120
ggcaacaaca actacatcct caccgtcgcc aagggcaatt tcccgcctta tggtcgcgac 180
ttcgacggcg gcgtcgccac cggccgcttc tccaatggcc gccttgtcac cgacttcgtg 240
tcggaggcgc tggggctgcc gtcctctgtg ccggcctatc tcgactccac ctacaccatt 300
gatcagcttg ctactggtgt cagctttgct tcaggcggca ccgggctcga tagtctcact 360
gccagagttg tagtaagtta a 381
<210> 9
<211> 126
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 9
Met Thr Ser Gln Gln Leu Gly Tyr Cys Trp Val Leu Leu Ile Ala Leu
1 5 10 15
Leu Ser Cys Ser Ala Ala Thr Ala Ser Glu Val Pro Ala Ile Ile Val
20 25 30
Phe Gly Asp Ser Thr Val Asp Ala Gly Asn Asn Asn Tyr Ile Leu Thr
35 40 45
Val Ala Lys Gly Asn Phe Pro Pro Tyr Gly Arg Asp Phe Asp Gly Gly
50 55 60
Val Ala Thr Gly Arg Phe Ser Asn Gly Arg Leu Val Thr Asp Phe Val
65 70 75 80
Ser Glu Ala Leu Gly Leu Pro Ser Ser Val Pro Ala Tyr Leu Asp Ser
85 90 95
Thr Tyr Thr Ile Asp Gln Leu Ala Thr Gly Val Ser Phe Ala Ser Gly
100 105 110
Gly Thr Gly Leu Asp Ser Leu Thr Ala Arg Val Val Val Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 238
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 10
cggatagaca atggcgtata aatcgcaatg gatggacgtg gacgtgcagg gccgtgctcg 60
ccggccgtgt gaagggatga ggatagggac gcgcggtcgc atggctggga tggctgcctg 120
cgacaaggcc ggcggagagg ggaaatgtga ggaggcgatg agaggagagc gaggcggcgg 180
cggaggggga gactggagaa gagaaggggg agcagttcag gggtagggtt ttgtggtg 238
<210> 11
<211> 216
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 11
atggcgtata aatcgcaatg gatggacgtg gacgtgcagg gccgtgctcg ccggccgtgt 60
gaagggatga ggatagggac gcgcggtcgc atggctggga tggctgcctg cgacaaggcc 120
ggcggagagg ggaaatgtga ggaggcgatg agaggagagc gaggcggcgg cggaggggga 180
gactggagaa gagaaggggg agcagttcag gggtag 216
<210> 12
<211> 71
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 12
Met Ala Tyr Lys Ser Gln Trp Met Asp Val Asp Val Gln Gly Arg Ala
1 5 10 15
Arg Arg Pro Cys Glu Gly Met Arg Ile Gly Thr Arg Gly Arg Met Ala
20 25 30
Gly Met Ala Ala Cys Asp Lys Ala Gly Gly Glu Gly Lys Cys Glu Glu
35 40 45
Ala Met Arg Gly Glu Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Trp Arg Arg
50 55 60
Glu Gly Gly Ala Val Gln Gly
65 70
<210> 13
<211> 2685
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 13
gaatccttct ccatctccgg tcagcatagc tcccgctcgg ccgcgccgct catccctcac 60
tggcacaccg caccgtttct atcgcccgct gtcaccgctg agaagaggga cacaactgtc 120
gtgcgcggcc gagtggatgt ggtgtgaggc ggtgaggcgg agggaacgcg gggagcttgg 180
ggcacggcgc ttcgagaccg ccgcccgggc gcgccgcacc gcctcactcg cactctccaa 240
ccgcaaggag ttcaccaccc cgcacaacgg cgccgtcaac tctctccagg tacaccccct 300
tctcactccc tcactcccct tctccttctc tcaccttagt ggtttagatc aatttgattt 360
gtacaccctg tagatggaat cttgcgtatt tggtgtgcaa ttcctgagtc gctcccgctg 420
gtgttttgta atttgacaat atggtcaggt tgatttgata gagcggcggt acctgctctc 480
gggcgcatcg gatggatcag ccgctatatt tgatgtgcag aatgcgatcg aatacgaagc 540
tgggttcatt gccaagcata ggagcattct ccttgtggac aagcagcatg aaaatggcca 600
caagttcgcg gtatctatgg ccgtatggta tcctgtggac actgggctgt ttgtgacagc 660
ttcttttgat cagtatgtca aagtgtggga tactaattcg actcaagtat gctttcatct 720
gctttgtcga ttgctaattt ttcttttgtc ttgcctcctt tgtggtggca atggtgtgat 780
cctgatgttc tgattttttg cctggttttc ttttctaggt cgtaatggat tttaagatgc 840
ctggaaaagt gtacagtgca gcaatgtccc caattgcaac aacacatatg ctgatcgcta 900
ctggaagtgc agatgttcag gtccgtttat gtgatattgc ttctggagcc tttacccaca 960
cgttgtctgg tcatcgtggt tagttgctta cttctagtgt agtgatgaaa atatgcttgc 1020
tttgtttgta tggttaccac cttatccttg gtatctgaca tgtcagatgg tatcatgtct 1080
ttggagtggt ctacttcaag tgagtggatt ttgatgagcg gtggttgtga tggagcaata 1140
cgattttggg acataagacg agctggatgc tttcttgttc ttgatcaatc acggtctcaa 1200
ctaggaaggc ggcctccttt tcttgagggc acctcagata aggtatggtc accattatcc 1260
atcacttaca tttgttttca aaatatttgg ttgcaacgct aaagctggac ttccactttt 1320
attttctgca aaagcttcaa aaatgttgca gctttaagta aaacattatg gttgtaatgc 1380
tacagatcaa tactgtcagc cttcaagtaa aagctgattt ctgcggctat taatttatag 1440
gtttgtctca catattagtg tcagtatata ggtgctatgg atcagtttag tgctccaatt 1500
cttacaatat aaggtctgca tacattgttt cttgttgatt gttgtgccct agaaatgacg 1560
cgcaaactca ttgatctagt tgtgcaaatg atcaatgtat tcatttttaa ttttgactag 1620
gatcctttga actctttaca accttcatct tcttcaaaga tttactctgc acagcagagg 1680
acaggcaaga gtaagaaaca gtcacacaaa ttgcacaaaa gtcaaatccc tggacatgga 1740
catatccaac agagattgca ccctggtttg tcttctagtc aaaatcgtgc aacggcgcat 1800
tatggtgctg ttacgggatt aagaacaact acagatggga tgtaccttct tagctcaggt 1860
tgattgaatt taattgctat ttctatgagc attcgattgc tattgcttga aaggaattat 1920
tgcctatggc tatcttcttg ttatgcctgt atgcagtatg cattaatgat tgttatcctc 1980
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tggtcaattt tgaagctatg cgattacaga ctagcaaacc actacaatta gctgtcactg 2100
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<213> Oryza sativa
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Arg Arg Phe Glu Thr Ala Ala Arg Ala Arg Arg Thr Ala Ser Leu Ala
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Leu Ser Asn Arg Lys Glu Phe Thr Thr Pro His Asn Gly Ala Val Asn
35 40 45
Ser Leu Gln Val Asp Leu Ile Glu Arg Arg Tyr Leu Leu Ser Gly Ala
50 55 60
Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ile Phe Asp Val Gln Asn Ala Ile Glu Tyr
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100 105 110
Pro Val Asp Thr Gly Leu Phe Val Thr Ala Ser Phe Asp Gln Tyr Val
115 120 125
Lys Val Trp Asp Thr Asn Ser Thr Gln Val Val Met Asp Phe Lys Met
130 135 140
Pro Gly Lys Val Tyr Ser Ala Ala Met Ser Pro Ile Ala Thr Thr His
145 150 155 160
Met Leu Ile Ala Thr Gly Ser Ala Asp Val Gln Trp Ser Thr Ser Ser
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Glu Trp Ile Leu Met Ser Gly Gly Cys Asp Gly Ala Ile Arg Phe Trp
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195 200 205
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Arg Gln Ile Leu Val Trp Ser Pro Ser Thr Pro Ala Phe Thr Glu Met
340 345 350
Glu Asp Asp Gly Lys Arg Gln Met Asp Phe Val Val Asp Glu Asp Asn
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Trp Ser Asp
370
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<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 16
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<210> 17
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<213> Oryza sativa
<400> 17
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20 25 30
Met Gly Ser Ala Gly Arg Arg Gly Pro Ala Leu Phe Arg Arg Thr Ala
35 40 45
Arg Glu Tyr Tyr Val Ser Arg Arg Ser Ala Arg Pro Arg Tyr Arg Asp
50 55 60
Val Ser Ser Ser Ala His Arg Pro Val Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Arg Arg Leu Glu Leu Gln Ser Val Val Thr Asp Ala Ser Arg
85 90 95
Ala Ile Val Val Val Pro Asn Thr Ser Phe Ala Ser Asn Asp Asp Ser
100 105 110
Val Val Val Ala Asp Ser Ala Val Tyr Ser Ala Pro Gly His Asp Ala
115 120 125
Gly Arg Gly Gly Arg Ala Met Val Arg Tyr Ser Asp Thr Asn Ala Ala
130 135 140
Ala Ala Ala Ser Arg Glu Val Ser Phe Ser Arg Asp Asn His Asp Gln
145 150 155 160
Leu Tyr Val Ser Ala Ala Arg Arg Asp Pro Pro Ser Phe Gly Tyr Asp
165 170 175
Ile Ser Val Ala Ser Phe Ser Gly Gln Ser Arg Tyr Glu Asp Ala Val
180 185 190
Gly Asp Tyr Asp Asp Asp Asp Asp Glu Ile Asp Val Arg Val Gly Lys
195 200 205
Pro Val Gly Val Ala Gly Leu Phe Lys Tyr Ser Thr Ala Met Asp Ile
210 215 220
Val Leu Leu Val Leu Gly Cys Val Gly Ala Met Ile Asn Gly Gly Ser
225 230 235 240
Leu Pro Trp Tyr Ser Tyr Leu Phe Gly Asn Phe Val Asn Lys Ile Val
245 250 255
Asn Val Asp Lys Thr Gln Met Met Lys Asp Val Lys Gln Ile Ser Val
260 265 270
Tyr Met Ala Phe Leu Ala Ala Val Val Val Val Gly Ala Tyr Leu Glu
275 280 285
Ile Thr Cys Trp Arg Ile Ile Gly Glu Arg Ser Ala Leu Arg Met Arg
290 295 300
Arg Glu Tyr Leu Lys Ala Val Leu Arg Gln Glu Ile Gly Phe Phe Asp
305 310 315 320
Thr Glu Val Ser Thr Gly Glu Val Met His Ser Ile Ser Gly Asp Val
325 330 335
Ala Gln Ile Gln Glu Val Met Gly Glu Lys Ile Pro Gly Phe Val His
340 345 350
His Val Phe Thr Phe Val Phe Gly Tyr Val Val Gly Phe Ala Lys Ser
355 360 365
Trp Arg Ile Ala Leu Ala Val Phe Ala Val Thr Pro Ala Met Met Ala
370 375 380
Cys Gly Met Ala Tyr Lys Ala Ile Tyr Gly Gly Leu Thr Ala Lys Glu
385 390 395 400
Glu Ala Ser Tyr Gln Arg Ala Gly Asp Val Ala Gln Gln Ala Ile Ser
405 410 415
Ser Ile Arg Thr Val Met Ser Phe Val Met Glu Glu Arg Leu Ala Gly
420 425 430
Glu Tyr Ala Glu Trp Leu Asp Lys Ala Ala Pro Ile Gly Val Lys Met
435 440 445
Gly Phe Ala Lys Gly Ala Gly Met Gly Val Ile Tyr Leu Val Thr Tyr
450 455 460
Ser Gln Trp Ala Leu Ala Leu Trp Tyr Gly Ser Arg Leu Val Ala Asn
465 470 475 480
Gly Glu Ile Lys Gly Gly Asp Ala Ile Ala Cys Phe Phe Gly Val Met
485 490 495
Val Gly Gly Arg His Ala His Gln Pro Pro Arg Thr Ala Ser Cys Cys
500 505 510
Arg Gln Trp Arg Arg Ser Pro Glu Phe Arg Gly Trp Gly Leu Ala Leu
515 520 525
Thr Leu Ser Tyr Met Ala Gln Phe Ala Gln Gly Thr Val Ala Ala Gly
530 535 540
Arg Val Phe Glu Val Ile Asp Arg Val Pro Glu Ile Asp Ala Tyr Gly
545 550 555 560
Ala Gly Gly Arg Ala Leu Pro Ala Val Lys Gly Arg Met Glu Phe Lys
565 570 575
Asp Val Glu Phe Ala Tyr Pro Ser Arg Pro Asp Ala Met Val Leu Tyr
580 585 590
Asn Leu Asn Leu Val Ile Pro Ala Ala Lys Thr Leu Ala Leu Val Gly
595 600 605
Val Ser Gly Gly Gly Lys Ser Thr Met Phe Ala Leu Ile Glu Arg Phe
610 615 620
Tyr Asp Pro Thr Arg Gly Glu Arg Glu Trp Pro Leu Thr Arg Thr Gln
625 630 635 640
Ser Thr Thr Met Ala Arg Ser Ser Val Ile Asp Asp Glu Ala Phe Ala
645 650 655
Ser Val Gly Cys Ala Gly Ser Ile Thr Leu Asp Gly His Asp Leu Ala
660 665 670
Ser Leu Asn Leu Arg Trp Leu Arg Ser Gln Ile Gly Leu Val Gly Gln
675 680 685
Glu Pro Val Leu Phe Ser Thr Ser Ile Ile Glu Asn Val Met Met Gly
690 695 700
Lys Glu Asn Ala Thr Arg His Asp Ala Ile Ser Ala Cys Ala Met Ala
705 710 715 720
Asn Val His Thr Phe Val Leu Ala Leu Pro Asp Gly Tyr Asp Thr Gln
725 730 735
Val Gly Asp Arg Gly Ala Gln Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile
740 745 750
Ala Leu Ala Arg Ala Ile Ile Arg Asp Pro Arg Ile Leu Leu Leu Asp
755 760 765
Glu Pro Thr Ser Ala Leu Asp Thr Gln Ser Glu Ala Val Val Gln Gln
770 775 780
Ser Ile Asp Arg Leu Ala Ala Gly Arg Thr Val Val Val Ile Ala His
785 790 795 800
Arg Leu Ala Thr Val Arg Asn Ala Asp Thr Ile Ala Val Leu Asp Arg
805 810 815
Gly Ala Val Val Glu Ser Gly Arg His Ala Asp Leu Met Ala Arg Arg
820 825 830
Gly Pro Tyr Ser Ala Leu Val Ser Leu Ala Ser Asp Ser Gly Gly Ala
835 840 845
Arg Pro Asp Leu Ala Gly Ala Ala Ala Ala Tyr Thr Ser Phe Thr Asp
850 855 860
Glu Ser Gly Tyr Asp Val Ser Val Ser Lys Ser Arg Tyr Gly Phe Gln
865 870 875 880
Thr Ile Arg Glu Glu Glu Glu Lys Lys Asp Ser Gln Asp Ala Lys Val
885 890 895
Arg Val Ser Glu Ile Trp Arg Leu Gln Arg Arg Glu Gly Pro Leu Leu
900 905 910
Ile Leu Gly Phe Leu Met Gly Ile His Ala Gly Ala Val Phe Ser Val
915 920 925
Phe Pro Leu Leu Leu Gly Gln Ala Val Glu Val Tyr Phe Asp Ala Asp
930 935 940
Thr Ala Arg Met Lys Arg Gln Val Glu Tyr Leu Ala Met Ala Val Val
945 950 955 960
Gly Leu Gly Val Ala Cys Ile Leu Thr Met Thr Gly Gln Gln Gly Leu
965 970 975
Cys Gly Trp Ala Gly Ala Arg Leu Thr Met Arg Val Arg Asp Arg Leu
980 985 990
Phe Arg Ala Ile Met Arg Gln Glu Pro Ala Trp Phe Asp Glu Glu Asp
995 1000 1005
Asn Ala Met Gly Val Leu Val Thr Arg Leu Ala Arg Asp Ala Val
1010 1015 1020
Ala Phe Arg Ser Met Phe Gly Asp Arg Tyr Ala Val Leu Leu Met
1025 1030 1035
Ala Val Gly Ser Ala Gly Val Gly Leu Gly Ile Cys Phe Gly Leu
1040 1045 1050
Asp Trp Arg Leu Thr Leu Val Ala Thr Ala Cys Thr Pro Leu Thr
1055 1060 1065
Leu Gly Ala Ser Tyr Leu Asn Leu Leu Ile Asn Val Gly Ala Arg
1070 1075 1080
Ser Asp Asp Gly Ala Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Ile Ala Ala Gly
1085 1090 1095
Ala Val Ser Asn Val Arg Thr Val Ala Ala Leu Cys Ala Gln Gly
1100 1105 1110
Ser Val Val Gly Thr Phe Asn Arg Ala Leu Asp Gly Pro Ala Ala
1115 1120 1125
Lys Ala Ser Arg Arg Ser Gln Leu Met Gly Val Ile Leu Gly Leu
1130 1135 1140
Ser Gln Gly Ala Met Tyr Gly Ala Tyr Thr Ala Thr Leu Cys Ala
1145 1150 1155
Gly Ala His Phe Ile Asn Asn Gly Val Ser Thr Phe Gly Asp Val
1160 1165 1170
Ser Lys Ile Phe Leu Ile Leu Val Leu Ser Ser Phe Ser Val Gly
1175 1180 1185
Gln Leu Ala Gly Leu Ala Pro Asp Thr Ser Gly Ala Pro Ala Ala
1190 1195 1200
Ile Ala Gly Ile Leu Thr Ile Leu Lys Arg Arg Pro Ala Ile Thr
1205 1210 1215
Gly Asp Ser Thr Lys Arg Arg Ile Thr Ile Lys Asp Gly Lys Pro
1220 1225 1230
Ile Asp Val Glu Leu Arg Lys Val Thr Phe Ala Tyr Pro Ser Arg
1235 1240 1245
Pro Glu Val Thr Val Leu Ser Gly Phe Ser Leu Arg Val Lys Ala
1250 1255 1260
Gly Thr Thr Val Ala Val Val Gly Ala Ser Gly Ser Gly Lys Ser
1265 1270 1275
Thr Val Val Trp Leu Val Gln Arg Phe Tyr Asp Pro Gly Asp Gly
1280 1285 1290
Lys Val Val Val Gly Gly Val Asp Ala Arg Glu Leu Asp Leu Lys
1295 1300 1305
Trp Leu Arg Gly Glu Cys Ala Met Val Gly Gln Glu Pro Ala Leu
1310 1315 1320
Phe Ser Gly Ser Ile Arg Asp Asn Ile Gly Phe Gly Asn Pro Lys
1325 1330 1335
Ala Ser Trp Ala Glu Ile Glu Glu Ala Ala Lys Glu Ala Asn Ile
1340 1345 1350
His Lys Phe Ile Ser Ala Leu Pro Gln Gly Tyr Glu Thr Gln Val
1355 1360 1365
Gly Glu Ser Gly Val Gln Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile
1370 1375 1380
Ala Ile Ala Arg Ala Ile Val Lys Gln Ala Arg Ile Leu Leu Leu
1385 1390 1395
Asp Glu Ala Ser Ser Ala Leu Asp Leu Glu Ser Glu Arg His Val
1400 1405 1410
Gln Glu Ala Leu Arg Arg Ala Ser Arg Arg Ala Thr Ala Ile Thr
1415 1420 1425
Val Ala His Arg Leu Ser Thr Val Arg Asp Ala Asp Arg Ile Ala
1430 1435 1440
Val Val Ser Ala Gly Arg Val Val Glu Phe Gly Gly His Asp Ala
1445 1450 1455
Leu Leu Ala Gly His Gly Asp Gly Leu Tyr Ala Ala Met Val Lys
1460 1465 1470
Ala Glu Thr Glu Ala Gln Ala Phe Lys
1475 1480
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for cloning gDNA of OsDN-DTP12 gene
<400> 19
gatagtaatt aagagaccat ggtg 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for cloning gDNA of OsDN-DTP12 gene
<400> 20
ctgtgcgcac tactcctata tacg 24
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for cloning cDNA of OsSSL13 gene
<400> 21
ctctgcgtgc aaattccgtc ttc 23
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for cloning cDNA of OsSSL13 gene
<400> 22
gatcaccagg cactttctat gatgg 25
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for cloning gDNA of truncated OsGDSL gene
<400> 23
aatgcaaatc agtgacaaca actaactaag 30
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for cloning gDNA of truncated OsGDSL gene
<400> 24
gctttgatcg tataatcacc aacatg 26
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for cloning gDNA of OsDN-DTP9 gene
<400> 25
ctgctgaggc ggatagacaa tggcgtataa atcg 34
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for cloning gDNA of OsDN-DTP9 gene
<400> 26
ccgctgaggc accacaaaac cctacccctg aac 33
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for cloning gDNA of OsWD40-42 gene
<400> 27
ctgctgaggg aatccttctc catctccggt cagc 34
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for cloning gDNA of OsWD40-42 gene
<400> 28
ccgctgaggg cataattctc agtcgctcca gttatcc 37
<210> 29
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for cloning gDNA of OsABCB12 gene
<400> 29
ctgctgaggg acatgtcgtg gcagagctca gtg 33
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for cloning gDNA of OsABCB12 gene
<400> 30
ccgctgaggg tgttataatt gcaaatcccc cagc 34
<210> 31
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of OsDN-DTP12 gene
<400> 31
cgaggacctt gagcaacc 18
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of OsDN-DTP12 gene
<400> 32
gccatactct ccccatcaat tc 22
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of OsSSL13 gene
<400> 33
ctacttcaag ctgcccctg 19
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of OsSSL13 gene
<400> 34
ctccctcacc tcgctcac 18
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of truncated OsGDSL gene
<400> 35
atttcccgcc ttatggtcg 19
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of truncated OsGDSL gene
<400> 36
gatcaatggt gtaggtggag tc 22
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of OsDN-DTP9 gene
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tgaagggatg aggataggga c 21
<210> 38
<211> 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of OsDN-DTP9 gene
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ctcacatttc ccctctccg 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of OsWD40-42 gene
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<213> Artificial Sequence
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<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of OsWD40-42 gene
<400> 40
aatgctggag ttgatggaga c 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of OsABCB12 gene
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gggtgcagtt gtcaggtg 18
<210> 42
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of OsABCB12 gene
<400> 42
gtatcctcgc ctgcttcac 19

Claims (6)

1.一种提高植物耐旱性的方法，所述方法包括，与对照植物相比，提高植物中至少一个多核苷酸的表达，其中所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
2.如权利要求1所述的方法，所述多核苷酸的表达通过以下方式提高：
(a)通过向植物中转入重组DNA构建体以提高多核苷酸的表达，其中所述重组DNA构建体包括编码多肽的多核苷酸，和与其可操作连接的至少一个异源调控元件，其中，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3；或
(b)增加内源多核苷酸的表达量，所述内源多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQID NO:3。
3.一种提高水稻植株产量的方法，该方法包括增加至少一个编码一个氨基酸序列为SEQ ID NO：3的多肽的多核苷酸的表达。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多核苷酸的表达通过以下方式提高：
(a)通过向植物中转入重组DNA构建体以提高多核苷酸的表达，其中所述重组DNA构建体包括编码多肽的多核苷酸，和与其可操作连接的至少一个异源调控元件，其中，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3；或
(b)增加内源多核苷酸的表达量，所述内源多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQID NO:3。
5.一种制造植物的方法，其中与来自对照植物的相应多肽的表达或活性相比，氨基酸序列为SEQ ID NO：3的多肽的表达或活性增加，其中，与对照植物相比，该植物至少表现出一种从以下组中选择的表型：增加耐旱性、增加粮食产量、增加非生物胁迫耐受性和增加生物量，其中，所述方法包括以下步骤：(i)引入DNA片段或删除DNA片段，或(ii)在包含编码所述多肽及其调节元件的内源性基因的基因组区域中引入一个或多个核苷酸改变，其中所述改变对增加内源性多肽的表达或活性有效。
6.如权利要求5所述的方法，所述改变可以通过锌指核酸酶、转录激活子样效应核酸酶、CRISPR-Cas、引导Cas核酸内切酶、归位核酸内切酶或CRISPR-Cas核糖核蛋白复合体介导实现。
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