CN112041448B

CN112041448B - 氮素限制条件下农艺性状改变的植物和非生物胁迫耐性基因相关的构建体和方法

Info

Publication number: CN112041448B
Application number: CN201980028845.2A
Authority: CN
Inventors: 高阳; 吕贵华; 毛冠凡; 王昌贵; 王国奎; 王建涛
Original assignee: Sinobioway Bio Agriculture Group Co Ltd; Pioneer Overseas Corp
Current assignee: Sinobioway Bio Agriculture Group Co Ltd; Pioneer Overseas Corp
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2039-04-26
Also published as: CN110408625A; CN112041448A; US11479785B2; WO2019206256A1; US20210040496A1

Abstract

本发明公开了分离的多聚核苷酸和多肽，以及赋予植物增加的氮素利用效率的重组DNA构建体；包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作的连接植物中有功能的启动子的多聚核苷酸，其中所述多核苷酸编码非生物胁迫耐受性多肽。

Description

氮素限制条件下农艺性状改变的植物和非生物胁迫耐性基因相关的构建体和方法

技术领域

本发明涉及植物育种和遗传学，特别是，涉及用于提高植物氮素利用效率和/或低氮耐性的重组DNA构建体。

背景技术

生物和非生物原因可以对植物产生胁迫，例如造成生物胁迫的原因包括病原菌感染、昆虫取食、一种植物对另一种植物的寄生，例如槲寄生；非生物胁迫包括诸如有效水分的过量或者不足、有效氮素的过量或不足、极限温度和诸如除草剂的合成化学药品。

非生物胁迫是引起世界范围内作物减产的主要因素，主要农作物平均减产超过50％(Boyer,J.S.(1982)，Science 218:443-448；Bray、E.A.等(2000)In Biochemistryand Molecular Biology of Plants,edited by Buchannan,B.B.等,Amer.Soc.PlantBiol.,pp.1158-1249)。植物固着于地面，必须调整以适应周围的环境条件，这就导致了植物发育中基因调控、形态建成和新陈代谢的巨大可塑性。植物的适应和防御策略包括激活编码重要蛋白的基因，这些蛋白可以使植物适应或防御不同胁迫条件。

氮素的吸收在植物生长发育的过程中发挥着重要的作用(Gallais等(2004)，J.Exp.Bot.55(396)：295-306)，植物吸收环境中的无机氮合成氨基酸，因此施用氮肥成为提高栽培作物(如玉米、水稻和大豆)产量强有力的方法。在植物最佳生长发育阶段，植物可利用氮素的缺失可以认为是一种非生物胁迫。现在，为了避免硝酸盐对环境的污染，同时保持足够的利润率，需要减少氮肥的施用量。

因此，需要研发新的能够提高氮素利用效率的合成物和方法。本文将提供这种合成物和方法。

发明概述

本发明包括以下具体实施方案：

提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、10或13的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQID NO：2、5、8、11或14的一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中与不增加所述多核苷酸表达的对照植物相比，增加所述多核苷酸在植物中的表达能够提高植物的氮胁迫耐性或提高NUE。在某些实施例中，所述核苷酸序列包括SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。在某些实施例中，所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15；

本公开内容还提供了一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包括一种分离的多核苷酸和与其可操作的连接至少一个调控序列，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13或14的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。在某些实施例中，所述至少一个调控序列是植物中有功能的启动子。

本公开内容还提供了一种修饰的植物或种子，在所述修饰的植物或种子中，包含编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽的至少一种多核苷酸，与对照植物或种子相比，所述多核苷酸的表达是增加的，其中，所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、13或14的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；其中，与对照植物相比，所述植物显示增加的氮胁迫耐性和/或增加的产量。

在某些实施例中，修饰的植物或种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含一种多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件，其中所述多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13或14的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；或者(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列；与对照植物相比，所述植物显示出增加的氮素利用效率(NUE)。

还提供了一种提高植物氮素胁迫耐性或NUE的方法，其包括，与对照植物相比，提高植物中编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17、DN-LTP9多肽的至少一个多核苷酸的表达，其中，所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、4、7、10或13的一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：2、5、8、11或14的一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％。

在某些实施例中，所述多核苷酸的表达量通过下述的一个步骤增加：(a)通过引入重组DNA构建体增加植物中编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17、DN-LTP9多肽的多核苷酸的表达量，其中所述重组DNA构建体包含编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17、DN-LTP9多肽的一种多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQI ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为90％；(b)引入一个基因修饰增加内源多核苷酸的表达量和/或活性，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15的一致性至少为95％。

序列表

以下序列表作为本申请的一部分，通过详细描述和序列表的能够更好的理解本公开的内容。

表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列的编号

此处的序列描述和序列表遵守37 C.F.R.§1.821-1.825中列出的专利申请的核苷酸和/或氨基酸序列管理规则，序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本发明。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822中列出的规则。

详细描述

本发明中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本发明。

如本发明所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

如本发明所述：

术语“OsDN-LTP8”是低氮耐性蛋白8(Low nitrogen Tolerance Protein 8)，指水稻基因位点LOC_Os09g26530.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽或其相关的等位变异体。“DN-LTP8多肽”此处指OsDN-LTP8多肽和其它植物中的同源物。

OsDN-LTP8多肽(SEQ ID NO：3)是水稻基因位点LOC_Os09g26530.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：2)或核苷酸序列(SEQ ID NO：1)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR(rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中注释为“表达蛋白”，在NCBI(ncbi.nlm.nih.gov/)中注释为“未知蛋白”。

术语“OsCYP76M5”是细胞色素P450 76M5(cytochrome P450 76M5)，指水稻基因位点LOC_Os08g43440.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽或其相关等位变异体。“CYP76M5多肽”此处指OsCYP76M5多肽和其它植物的同源物。

OsCYP76M5多肽(SEQ ID NO：6)是水稻基因位点LOC_Os08g43440.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：5)或核苷酸序列(SEQ ID NO：4)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“细胞色素P450，表达的”，在NCBI中注释为“细胞色素P450 76M5类似”。

术语“OsFBX25”指水稻基因位点LOC_Os01g55210.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽或其相关等位变异体。“FBX25多肽”此处指OsFBX25多肽和其它植物中的同源物。

OsFBX25多肽(SEQ ID NO：9)是水稻基因位点LOC_Os01g55210.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：8)或核苷酸序列(SEQ ID NO：7)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“含有OsFBX25-F-盒结构域的蛋白，表达的。

术语“OsGH17”是糖基水解酶家族17(glycosyl hydrolases family 17)，指水稻基因位点LOC_Os03g22530.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽或其相关等位变异体。“GH17多肽”此处指OsGH17多肽和其它植物的同源物。

OsGH17多肽(SEQ ID NO：12)是水稻基因位点LOC_Os03g22530.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：11)或核苷酸序列(SEQ ID NO：10)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“糖基水解酶家族17，推测，表达”，在NCBI中为“β-葡聚糖-2类”。

术语“OsDN-LTP9”是低氮耐性蛋白9(Low nitrogen Tolerance Protein 9)，指水稻基因位点LOC_Os04g57804.1编码的，赋予植物低氮耐性表型的水稻多肽或其相关等位变异体。“DN-LTP9多肽”此处指OsDN-LTP9多肽和其它植物的同源物。

OsDN-LTP9多肽(SEQ ID NO：15)是水稻基因位点LOC_Os04g57804.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：14)或核苷酸序列(SEQ ID NO：13)编码的氨基酸序列。该多肽在TIGR中注释为“表达蛋白，表达”。

本发明中的单子叶植物包括禾本科的植物；双子叶植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。

“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“修饰的植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸或修饰的基因或启动子的植物。例如异源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。T0植物直接源于转化和再生过程，T0植物的子代为T1代(第一个子代)，T2代(第二个子代)等。

针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本发明所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。受测植物或植物细胞可以来源于变异的植物或细胞，并包含这种这种变异。通常，所述对照植物是野生型植物或细胞，即与基因变异产生受测植物或细胞的起始材料有着相同表型的基因型。

“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。在一些实施例中，这些特征可以是肉眼可见的，比如种子、植株的大小等；可用生物化学技术测定的指标，如种子或叶片中蛋白、淀粉或油份的含量等；可观察的代谢或生理过程，如测定对水分胁迫、特定盐、糖或氮浓度的耐性；可检测的基因表达水平；或可观察渗透胁迫的耐性或产量等农艺性状。

“农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。

可测量的生物量的增加，例如与对照植物相比，增加的植物高度、植物总叶面积、植物鲜重、植物干重或植物种子产量等。

增加植株生物量或大小的能力具有多种重要商业应用，作物栽培品种可用于产生较高植物营养组织部分，用于食品、饲料、纤维和/或生物燃料。

人们对叶片大小的增加特别有兴趣。增加的叶片的生物量可用于增加植物源药或工业产品的生产。

增加的分蘖数可以增加产量，增加植物叶片面积可提高植物总的光合作用，增加的光合合成能力可以增加特定植物组织的产量，并使植物在低光强或高光强下生长，所述特定植物组织包括叶片、根、果实或种子。

其它组织如根的生物量的改变有利于提高植物在严酷条件下生长的能力，所述严酷条件包括营养贫瘠、水分缺失，因为大量的根系可以更好地吸收水分和营养。

“氮素限制条件”指可利用总氮量(例如，硝酸盐、氨或其它可知氮源)不足以维持植物的最佳生长发育的条件，本领域的技术人员应当知道维持植物最佳生长发育的可利用总氮量的条件，本领域的技术人员应当知道什么组成了足够的可利用总氮量，什么组成了土壤、介质和施入的肥料为植物提供氮素。氮素限制条件取决于多种因素，包括但不限于特定的植物和环境条件。

植物“增加的氮胁迫耐性”是与参照或对照相比后衡量的，反映了植物在氮限制条件下存活和/或生长更好的能力；与参照或对照植物相比，氮胁迫耐性的植物增加的数量可以是任何数量。例如，和生长在低氮条件下的对照植物相比，拥有“增加的氮素胁迫耐性”的植物在相同条件下会有更高的籽粒产量。

“NUE”是氮素利用效率，具体指植物在低肥料或高肥料水平下利用氮素的能力。它反映了植物吸收、同化和/或其它氮素利用的能力。

土壤植物分析发展(SPAD)值是SPAD-502plus叶绿素仪(KONICA MINOLTA生产)测定的SPAD读数。SPAD值是叶片叶绿素相对含量，是植物健康的一个重要指标。许多研究表明，叶片氮素含量与SPAD值成正相关性(Swain D.K.和Sandip S.J.(2010)Journal ofAgronomy9(2)：38-44)，叶片SPAD值可用于作物中氮素状况的分析指标(Cai H.-G.et al.(2010)Acta metallurgica sinica 16(4)：866-873)。

“氯酸盐”指含有氯酸根阴离子的化合物，是一种氯酸盐化合物。它是一种硝酸盐类似物，植物通过硝酸盐同一个转运系统吸收，通过硝酸盐还原酶将氯酸盐还原成亚氯酸盐，亚氯酸盐是有毒的，能够导致植物损伤、枯萎或死亡。本发明中将氯酸钾用于试验。“氯酸盐敏感性”是一种植物性状，反映了氯酸盐溶液处理后，与参照或对照植物相比，植物吸收、转运或还原氯酸盐后造成的损伤甚至死亡情况。通常，氯酸盐的敏感性可用作NUE的指标，植物对氯酸盐越敏感，氮素利用效率越高。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上是游离的，或者以其他方式从通常与自然环境中的物质相伴或者相互作用的组份中分离出来的。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。

“调控序列”、“调控元件”和“调控区域”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。

“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。

“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。

本发明所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。

“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。

“基因”是一段可表达功能分子的核苷酸片段，所述功能分子，包括但不限于，特定蛋白，所述基因包括位于编码序列上游的调控序列(5’非编码序列)和下游序列(3’非编码序列)。“天然基因”是拥有自身调控序列的自然存在的基因。

“突变基因”是通过人工干预后的产生的基因。由此产生的“突变基因”的序列与非突变基因的序列相比，至少有一个核苷酸增加，删除或替换。“突变植物”是指含有突变基因的植物。

应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明中“靶向突变”是指通过双链断裂诱发剂诱导靶序列DNA双链断裂，改变内源基因的特定序列，从而导致内源基因突变。

“遗传修饰”指通过蓄意人为活动而导入植物的基因组核苷酸序列的改变。

“CRISPR-相关基因”是指编码成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)-相关系统(Cas)的多肽组合物的核苷酸序列，所述基因通常耦合存在，与CRISPR位点侧翼片段相关或相邻。术语“Cas基因”和“CRISPR-相关基因”在本发明中可互换使用。例如包括但不限于，Cas3和Cas9,它们分别为CRISPR类型I和CRISPR类型II系统编码的内切酶。

“Cas内切酶”是指一个由Cas基因编码的Cas蛋白，所述Cas蛋白能导致DNA靶序列双链断裂。向导多核苷酸引导Cas内切酶识别，并有选择性导致细胞基因组特定位点的双链断裂。

“向导RNA(gRNA)”是指一个由可改变的DNA元件编码的crRNA(CRISPR RNA)：tracrRNA融合的杂合RNA分子，gRNA通常包括一个拷贝的与基因组特定位点的前间区序列互补的间隔序列，和一个用于CRISPR复合体的相关Cas内切酶结合的结合域。

“向导多核苷酸”是指一个可与Cas内切酶形成复合体、且使Cas内切酶识别和选择DNA剪切靶位点的多核苷酸序列。所述向导多核苷酸由一个单分子或一个双分子组成。

术语“向导多核苷酸/Cas内切酶体系”是指含有一个Cas内切酶和一个前导多核苷酸的复合体，可导致DNA靶序列的双链断裂。如果正确的前间区序列邻近基序(PAM)大致定位于靶序列的3'末端后，一旦向导RNA识别靶序列，Cas内切酶才能解开基因组靶位点附近的DNA双链序列，并对DNA双链进行剪切。

“基因组靶位点”是指定位于宿主基因组的用于定点突变和/或双链断裂的一个前间区和一个前间区序列邻近基序(PAM)。

“前间区”是指一段靶向突变和/或双链断裂的短的DNA序列(12-40个核苷酸)，所述前间区是基于crRNA或sgRNA的间隔序列的碱基互补配对，以CRISPR体系内切酶而导致酶促断裂。

“前间区序列邻近基序(PAM)”包括一段3-8个核苷酸序列，紧邻基因组靶位点前间区序列。

CRISPR位点(成簇规律间隔短回文重复，也称为SPIDRs-间隔散布定向重复)组成最近描述的DNA位点家族。CRISPR位点由短的、高度保守的DNA重复序列(一般24-40个核苷酸，重复1-140次，因此也称为CRISPR-重复单元)组成，所述DNA重复序列部分是回文重复。所述重复序列(通常存在物种特异性)被固定长度(一般20-58个核苷酸，依赖于CRISPR位点)的可变序列间隔(WO2007/025097公开于2007年3月1日)。

核酸内切酶是可切断多核苷酸链的磷酸二酯键的酶类，包括在特定位点切割DNA而不破坏碱基的限制性核酸内切酶。所述限制性核酸内内切酶包括类型I、类型II、类型III和类型IV核酸内切酶及其亚类型。在类型I和类型III系统中，单复合体具有甲基化酶和限制活性。核酸内切酶也包括归巢核酸内切酶(meganucleases或HEases)，其类似于限制性核酸内切酶，能结合和剪切特定识别位点，然而归巢核酸内切酶识别位点通常更长，约18个核苷酸或更长(专利申请WO-PCT PCT/US12/30061，提交日期2012年3月22日)。根据保守序列基序，归巢核酸内切酶可分为四个家族，分别为LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H和His-Cys盒子家族。这些基序参与到金属离子和磷酸二酯键的水解过程的协调。归巢核酸内切酶的显著点在于其长识别位点和在其DNA底物中容忍一些序列多态性。

TAL效应因子核酸酶是一种新的序列特异性核酸酶，能导致植物或其他生物基因组特定靶序列双链断裂。TAL效应因子核酸酶通过将一个天然或人工合成的转录激活样(TAL)效应因子或其功能区，融合到核酸内切酶的催化结构域而产生的，诸如Foki内切酶。所述独特的、模块化的TAL效应因子DNA结合域允许设计具有潜在给定DNA识别特异性的蛋白(Miller et al.(2011)Nature Biotechnology 29：143-148)。锌指核酸酶(ZFNs)是一种人工合成的双链断裂诱发剂，含有一个锌指DNA结合结构域和一个双链断裂诱导剂结构域。锌指结构域赋予识别位点特异性，其一般包括2、3或4个锌指结构，例如，有一个C2H2结构，然而其他锌指结构也是已知并是可改造的。锌指结构域是可设计的多肽，能特异结合选定的多核苷酸识别序列。ZFNs由一个设计的DNA结合锌指结构域和与其链接的一个非特异性内切核酸酶结构域构成，例如，源于诸如FokI的类型l的核酸内切酶的核酸酶结构域。其它功能可融入锌指结合域，包括转录激活结构域，转录阻遏结构域和甲基化酶。在一些例子中，剪切活性需要核酸酶的二聚作用。每一个锌指可识别靶DNA的3个碱基对。例如，一个含有3个锌指结构域能识别9个连续的核苷酸序列，两组含3个锌指结构域经二聚化作用后，则能识别18个核苷酸序列。

“靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶位置”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”和“基因组靶位置”在本发明中可互换使用，具体指植物细胞基因组中的一段多核苷酸序列(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)，且在植物细胞基因组中能被Cas内切酶诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源位点，也可以是非自然发生在基因组中的植物异源位点，或靶位点可以是与自然存在的基因组位点异源的位点。本发明中“内源靶序列”和“天然靶序列”可以互换使用，具体指植物基因组内源或天然基因组的靶序列，且是植物基因组靶序列的内源或天然位点。

“变异靶位点”、“变异靶序列”、“修饰靶位点”、“修饰靶序列”在本发明中可互换使用，具体指本发明公开的靶序列，其与未改变的靶序列相比，包括至少有一处变异。所述变异包括，例如：(i)至少一个核苷酸替换，(ii)至少一个核苷酸删除，(iii)至少一个核苷酸插入，或(iv)上述(i)-(iii)的任意组合。

“序列一致性百分比(％)”是经过序列比对和引入缺口后，待测序列(query)相对于参考序列(subject)的氨基酸残基或核苷酸的一致性百分比，如果必须，所述序列一致性百分比是达到最大比例的序列一致性，且不考虑属于序列一致性的氨基酸保守型替换。例如，利用诸如BLAST,BLAST-2的公开电脑软件确定序列一致性比例的比对是本领域技术人员熟知的。决定序列比对的合适参数，包括与待测全序列比对达到最大化匹配的算法。本发明中两个序列的“序列一致性百分数”是指序列匹配一致性的数量的函数(例如，待测序列的序列一致性计算包括，将两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数目，获得匹配位置数，然后将匹配的位置数除以比对窗口中位置总数再乘以100)。

现在转向实施方案：

实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、赋予提高的氮素利用效率的重组DNA构建体、包含重组DNA构建体的诸如植物或种子的组合物、以及利用这些重组DNA构建体的方法。

分离的多核苷酸和多肽：

本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：

一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQID NO：3、6、9、12或15相比，具有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。在某些实施例中，提高所述多肽的表达量优选的能够提高植物低氮耐性/NUE活性。

一种分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15相比，具有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性。

一种分离的多核苷酸，包括(i)一种核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13或14相比，具有至少70％(例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。在某些实施例中，提高所述多肽的表达量能够提高植物低氮耐性活性。

应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。例如，丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。

重组DNA构建体：

一方面，本发明包括重组DNA构建体。

在一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，其编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15相比，具有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。

在另一个实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列(如植物中有功能的启动子)，其中，所述多核苷酸包括(i)一种核酸序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO：1、2、4、5、7、8、10、11、13或14相比，具有至少70％(例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。

在另外的实施方案中，一个重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列(如植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码DN-LTP8、CYP76M5、FBX25、GH17或DN-LTP9多肽。

调控序列：

本发明的重组DNA构建体包含至少一个调控序列。

在某些实施例中，调控序列可以是启动子或增强子。

多个启动子可用于本发明的重组DNA构建体，启动子根据期望的结果选择，可包括宿主生物体中表达的组成型、组织特异型、诱导型、或其他启动子。

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell2：163-171)；泛素启动子(Christensen)等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。

组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，其调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并通常限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。

可用于本发明的种子或胚特异性启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg，(1989)Plant Cell 1：1079-1093)，patatin(土豆块茎)(Rocha-Sosa，M.,等,(1989)EMBO J.8:23-29)，convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等，(1991)Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等，(1990)Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等，(1988)Plant.Mol.Biol.11：683-695)，玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等，(1988)EMBO J.7：1249-1255)，菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)，植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等，(1987)EMBO J.6：3571-3577)，B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等，(1988)EMBOJ.7：297-302)，谷蛋白(稻胚乳)，大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等，(1988)Plant Mol.Biol.10：359-366)，麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V.等，(1987)EMBO J.6：3559-3564)，和sporamin(甘薯块根)(Hattori T.,等,(1990)Plant Mol.Biol.14:595-604)等的启动子。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等，(1989)Bio/Technology 7：L929-932)，表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等，(1989)PlantSci.63：47-57)，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等，(1987)EMBOJ6：3559-3564)。

诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序列。诱导启动子或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。

用于本发明的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等，(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)；2)大麦启动子B22E；B22E是发育中玉米籽粒中的柄所特异表达的启动子(“Primary Structure of a Novel Barley Gene DifferentiallyExpressed inImmature Aleurone Layers”(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)Klemsdal等，(1991)Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16)；和3)玉米启动子Zag2(“Identification and molecularcharacterization of ZAG1，the maize homolog ofthe Arabidopsis floralhomeotic gene AGAMOUS”，Schmidt，R.J.等，(1993)Plant Cell5(7)：729-737；“Structural characterization，chromosomal localizationandphylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-boxgenes frommaize”，Theissen等，(1995)Gene 156(2)：155-166；NCBI GenBank登录号X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml是发育玉米籽粒的籽仁特异的启动子。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。

对于在发育种子组织中表达的多聚核苷酸，特定的启动子包括种子优选的启动子，尤其是早期籽粒/胚胎启动子和晚期籽粒/胚乳启动子，授粉后籽粒的发育大致可以分为三个基本阶段，籽粒生长的停滞期起始于授粉后0天到10-12天，在此期间，籽粒不再明显的生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)。线性籽粒灌浆期起始于授粉后的10-12天并延续到授粉后的40天左右，在此籽粒发育期间，籽粒达到最终的质量，并产生多种储藏物质如淀粉、蛋白质和油等；成熟期起始于授粉后大约40天到收获，在这一过程中，籽粒开始休眠，变干并为萌芽前的种子休眠做准备。本发明中的“早期籽粒/胚胎启动子”指主要在种子发育的停滞期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期间)驱动基因表达的启动子；“后期籽粒/胚乳启动子”主要驱动基因在授粉后12天到成熟过程中的种子中基因表达；表达窗口可能会有一些重叠，将根据使用的ABA偶联的序列和期望的表型选择启动子。

早期籽粒/胚胎启动子包括，Cim1，其在授粉后第5天活跃在特定组织中(WO 00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子end1，其在授粉后7-10天表达，和end2，其在授粉后9-14天在整个籽粒中表达，在授粉后10天在胚乳和果皮中表达(WO00/12733)，此处以全文引用方式并入本文。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利号6,403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利号7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子ADF4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。

本发明中调控核酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异启动子，包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等(1995)Plant Mol.Biol.27：513-528)和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)和类似的启动子。

启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。

用于本发明特定实施例的启动子还包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织偏爱启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子还包括根偏爱启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CRlBIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GINo.1063664)。

本发明的重组DNA构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在特定实施方案中，重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。

内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.CellBiol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。

组合物：

本发明提供了其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体的植物。还提供了一种包含有靶向基因修饰的植物，所述靶向基因修饰能够提高编码前述任一多肽的多核苷酸的水平和/或活性。在某些实施例中，所述靶向基因修饰是插入的外源启动子，该外源启动子可操作地连接前述的多核苷酸。

组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体或靶向基因修饰。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。

植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如水稻、玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、黍、甘蔗或柳枝稷。

实施方案包括但不限于以下实施方案：

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种异源调控序列，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：3、6、9、12或15进行比较时具有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性，并且，与对照植物相比，所述植物进一步表现出至少一个改变的农艺性状。

2.在基因组中包含靶向基因修饰的植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，所述靶向基因修饰在一个基因组位点上包含一个多肽，所述多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：3、6、9、12或15进行比较时具有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性。其中所述引入的基因修饰提高了该多肽的表达和/或活性，且与对照植物相比，所述植物表现出增加的氮素胁迫耐性。

3.实施方案1-2所述的植物的任何子代植物，实施方案1-2所述的植物的任何种子，实施方案1-2所述的植物的任何子代植物的种子，和源于实施方案1-2的植物和其子代植物的细胞。

本领域的技术人员熟悉模拟限制或者不限制氮素条件的方案，用于评价在模拟的或天然发生的限制或不限制氮素条件下测试植物。例如可以通过一段时间内给植物提供比正常需要较少的氮素或不提供氮素来模拟低氮素条件，并通过寻找农艺性状的差别(例如生理和/或物理状的变化)评价这些植物，所述农艺性状包括但不限于活力、生长、大小或根的长度，尤其是叶色或叶面积的大小。评价这些植物的其它技术包括测定叶绿素荧光、光合速率、根生长或气体交换速率。

本领域的技术人员也可以测试模拟或者自然发生的低氮或高氮条件下的植物保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的产量)的能力评估氮胁迫耐性，例如，低氮或高氮条件下产生与正常条件下相比实质相当的产量；与对照或参照植物相比，低氮或高氮条件下产量减少较少。

田间和温室条件下，可通过叶绿素仪测量低氮或高氮条件下的SPAD值。SPAD值能反映植株健康状态，并通过预测叶绿素含量反映植株氮素含量。与对照或参照植物相比，具有较高的低氮耐受性的植株的SPAD值更高。

参数是相对于对照细胞或对照植物呈现的，例如基因表达水平、编码蛋白的水平或活性、SPAD值、分蘖数、籽粒产量等参数。采用文中描述的组合物或方法测量或评估本文实施例中的转基因植物的农艺性状或表型时，本领域技术人员能够快捷的识别出合适的对照或参照植物。例如，通过非限制性图解的方式。

方法：

提供了一个增强植物氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15进行比较时，具有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，表现出增强的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。所述方法还可包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体，并且与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。

还提供了一个增强植物氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性的方法，包括(a)将靶向基因修饰导入到可再生的植物细胞中，所述靶向基因修饰在其基因组位点包含一个多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15进行比较时，具有至少80％(例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性,其中所述基因修饰提高了编码多肽的多核苷酸的水平和/或活性；和(b)由步骤(a)的再生植物细胞再生一个转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组内包含有靶向基因修饰。在与不含有所述重组DNA构建体的对照植物相比较时，所述转基因植物表现出增加的氮素胁迫耐性和/或氯酸盐敏感性。所述方法进一步包括(c)获得一个来自于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含有所述靶向基因修饰，且在与不含有该靶向基因修饰的对照植物相比较时，所述转基因植物表现出增加的氮素胁迫耐性和/或氯酸盐敏感性。

还提供了评价植物氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接的至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：3、6、9、12或15进行比较时，具有至少80％(比如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性；(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，评价转基因植物的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。所述方法还包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(e)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，评价所述转基因植物的子代植物的氮胁迫耐受性和/或氯酸盐敏感性。

还提供了一种确定植物农艺性状变化的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作地连接的至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，其中所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3、6、9、12或15进行比较时，具有至少80％(81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；和(c)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，在氮素限制条件下，确定转基因植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。所述方法可能还包括(d)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体；(e)与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，在氮素限制条件下，确定所述子代植物是否表现出至少一个农艺性状的变化。

在前述任一的方法或本发明其它实施方案披露的任意方法中，所述确定转基因植物农艺性状的改变的步骤，如果适用，还可包括在各种环境条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，确定转基因植物是否表现出至少一个农艺性状的改变。

在前述任一的方法或本发明其它实施方案披露的任意方法中，所述确定子代植物农艺性状的改变的步骤，如果适用，还可包括在各种环境条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，确定子代植物是否表现出至少一个农艺性状的改变。

在前述任一的方法或本发明其它实施方案披露的任意方法中，所述引入步骤中所述再生植物细胞可包括愈伤细胞、胚胎愈伤细胞、配子细胞、分生细胞、或不成熟的胚胎细胞。可再生植物细胞可源于自交玉米植株。

在前述任一方法或本发明披露的其它实施方案中的任一方法中，所述再生步骤可包括：(i)在含有胚促激素培养基上培养所述转化的植物细胞直至长出愈伤组织；(ii)将步骤(i)所述的转化植物细胞转移至含有组织促激素的第一培养基上；和(iii)将步骤(ii)所述转化植物细胞接种到第二培养基上，使其茎伸长、根发育或两者均发育。

在前述任一方法或本发明的其它实施方案的方法中，在氮素胁迫条件条件下，与不包含重组DNA构建体的对照植物相比，所述植物表现为至少一个农艺性状的改变。

在前述任一方法或者本发明其它实施方案的任一方法中，存在将重组DNA构建体导入可再生植物的供选方案，所述重组DNA构建体包含一个多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控序列，例如可以将一个调控序列(如一个或多个增强子、任选的转座子元件的一部分)导入可再生植物细胞，接着筛选带有调控序列和与其可操作连接的编码本发明多肽的内源基因的转基因事件。

可以通过任何适当的技术将本发明的重组DNA构建体导入植物中，所述技术包括但不限于直接DNA吸收、化学药品处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、基因枪轰击或农杆菌的转化。植物转化和再生的技术在国际专利公开号WO2009/006276中描述，其全部内容并入作为参考。

本领域的技术人员熟悉将编码所关注多肽的外源基因转化植物和培育再生植物的方法。再生植物可以自花授粉产生纯合转基因植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交。本领域的技术人员熟知培育本文披露的含有期望多肽的转基因植物的方法。

另外，也有修饰或改变宿主内源基因组DNA的方法，包括改变宿主天然DNA序列或包括调控元件、编码或非编码序列等前体转基因序列。这些方法也可以用于将核酸序列靶向到基因组中改造目标识别序列。例如本文中转基因修饰的细胞或植物使用传统的基因工程核酸酶如产生修饰植物基因组的归位核酸内切酶产生(例如WO 2009/114321；Gao等(2010)Plant Journal 1：176-187)。其它的位点定向工程是通过使用锌指结构域识别偶联的限制性内切酶的限制性特点修饰内源基因(例如Urnov等(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46；Shukla等(2009)Nature 459(7245)：437-41)。转录激活样(TAL)效应因子-DNA修饰酶(transcription activator-like effector-DNA modifying enzyme，TALE或TALEN)可用于基因工程修饰植物基因组，参见例如US20110145940,Cermak等(2011)Nucleic AcidsRes.39(12)和Boch等(2009)，Science 326(5959)：1509-12。植物基因组定点修饰也可以使用细菌II型CRISPR(成簇的规律的间隔的短回文的重复序列，clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR关联蛋白，CRISPR-associated)系统，参考例如Belhaj等(2013)，Plant Methods 9:39.CRISPR/Cas系统可以允许可定制的小的非编码RNA引导的基因组DNA靶向切割。

转基因植物中性状的重叠

转基因植物可包含本发明公开的一个或多个耐旱性多核苷酸与一个或多个另外的多核苷酸的堆叠，从而导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物可通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一者或两者来获得。这些方法包括但不限于培育各自包含靶多核苷酸的单独品系，用后续基因转化包含本发明公开的基因的转基因植物，以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本发明所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的多种性状(例如，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。如本发明所用的性状是指衍自特定序列或序列群组的表型。可使用包含多个基因的单个转化载体或单独地携带于多个载体上的基因进行基因的共转化。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则靶多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化方案将性状与靶多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)，可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制靶多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如，WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853，上述专利均以引用的方式并入本文。

实施例

本文的具体实施进一步在下列实例中示明。在这些实例中，除非特别说明，采用摄氏/公制。在这些实例中，仅用举例说明具体的实施过程。通过上述讨论和具体事例，本领域的专业人员可以查明本发明的基本特征，经过各种改变和修改将本发明应用于各种用途和条件，并不偏离本发明主体和范围。因此，除了本专利表述和讨论的各种修改外，本领域内的专业人员所做的不偏离本发明主题的修改也将落入本专利的权力要求范围内。

实施例1.非生物胁迫耐性基因的克隆和载体的构建

基于水稻激活标签突变体库的初步筛选和表2所示的基因ID的序列信息，设计引物，克隆水稻OsDN-LTP8、OsCYP76M5、OsFBX25、OsGH17和OsDN-LTP9基因。扩增引物和期望扩增的片段长度如表3所示。

通过PCR的方法，以中花11水稻植株的叶、茎和根组织的混合cDNA为模板克隆OsDN-LTP9基因的cDNA；以中花11水稻植株的基因组DNA为模板克隆OsDN-LTP8、OsCYP76M5、OsFBX25和OsGH17基因的gDNA。

表2.水稻基因名称、基因ID(TIGR)和构建体ID

基因名称	基因LOC ID	构建体ID
			OsDN-LTP8	LOC_Os09g26530	DP0749
OsCYP76M5	LOC_Os08g43440	DP0788
			OsFBX25	LOC_Os01g55210	DP0963
OsGH17	LOC_Os03g22530	DP0979
			OsDN-LTP9	LOC_Os04g57804	DP1154

表3.克隆水稻非生物胁迫耐性基因的引物

PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳分离后采用柱式试剂盒回收，并与TA克隆载体连接。通过测序确定PCR产物的核酸序列和在构建体中的方向，然后将这些基因克隆到植物双元载体DP0158(pCAMBIA1300-DsRed)中。

所产生的过表达构建体见表2。DP0749构建体中克隆的核苷酸序列和OsDN-LTP8基因的编码序列为SEQ ID NO：1和2所示，OsDN-LTP8的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；DP0788构建体中克隆的核苷酸序列和OsCYP76M5基因的编码序列为SEQ ID NO：4和5所示，OsCYP76M5的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；DP0963构建体中克隆的核苷酸序列和OsFBX25基因的编码序列为SEQ ID NO：7和8所示，OsFBX25的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；DP0979构建体中克隆的核苷酸序列和OsGH17基因的编码序列为SEQ ID NO：10和11所示，OsGH17的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；DP1154构建体中克隆的核苷酸序列和OsDN-LTP9基因的编码序列为SEQ ID NO：13和14所示，OsDN-LTP9的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。

实施例2.转化获得转基因水稻株系

在本研究中，所有过表达构建体和空载体(DP0158)采用林拥军和张启发((2005)Plant Cell Rep.23:540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻(Oryzasativa L.)。中花11号水稻是中国农业科学院作物研究所培育的，我们从北京未名凯拓农业生物技术公司获得第一批种子。载体通过农杆菌被转入水稻胚诱导的愈伤组织。转化实验室获得的T0代转基因幼苗移栽至田间水田中获得T1种子，T1和T2代种子储藏在4℃冷库中，过表达载体含有标记基因，在绿色荧光灯下表现为红色的T1和T2代种子为转基因种子，用于后续性状筛选试验。

实施例3.基因表达分析

采用标准的实时RT-PCR程序分析转基因水稻植株中基因的表达水平。EF-1α基因用作内参显示转基因水稻和对照植物的扩增和上样量类似。EF-1αmRNA水平用于规范基因表达量。

采用实时PCR分析测定不同转基因水稻株系叶片中OsDN-LTP8基因的相对表达量水平，ZH11-TC水稻中的表达量水平设置为1.00，与ZH11-TC相比，转基因株系中OsDN-LTP8基因表达水平增加了15-915倍，ZH11-TC为组织培养的ZH11水稻。OsDN-LTP8基因的实时RT-PCR引物如下：

DP0749-F1：5'-ACCAGTGAAGAGAAAGGCG-3'(SEQ ID NO：26)

DP0749-R1：5'-CTTGACATTTGCGAACTGGC-3'(SEQ ID NO：27)

实时PCR分析测定不同转基因水稻株系叶片中OsFBX25基因的相对表达水平，ZH11-TC为对照，基准表达水平设置为1.00，不同转基因株系中OsFBX25基因的表达量在657-2128之间变动。OsFBX25在所有转基因株系中过量表达。

DP0963-F1：5'-AGTTGACGGTTGCCCAATAG-3'(SEQ ID NO：28)

DP0963-R1：5'-GTAGATGAAGATGGCCCGAG-3'(SEQ ID NO：29)

实时PCR分析测定不同转基因水稻株系叶片中OsGH17基因的相对表达水平，DP0158为对照，基准表达水平设置为1.00，不同转基因株系中OsGH17基因的表达量在3408-11266之间变动。DP0158是转化空载体的ZH11水稻植株，OsGH17在几乎所有转基因株系中过量表达。

DP0979-F1：5'-GAATCTGAGACAGGAACGACAG-3'(SEQ ID NO：30)

DP0979-R1：5'-ATCTCGGTGACTTTGCTCG-3'(SEQ ID NO：31)

实时PCR分析测定不同转基因水稻株系叶片中OsDN-LTP9基因的相对表达水平，ZH11-TC为对照，基准表达水平设置为1.00，不同转基因株系中OsDN-LTP9基因的表达量在253-1252之间变动。所有测试的OsDN-LTP9株系中基因的表达水平高于ZH11-TC幼苗。

DP1154-F1：5'-TTCATCTCCACTTCCCAACAC-3'(SEQ ID NO：32)

DP1154-R1：5'-CAGCAACCTGTGTCAAGAAAC-3'(SEQ ID NO：33)

实施例4.转基因水稻植株的温室NUE筛选

为了调查这些基因是否能增加水稻植株的低氮耐受性或氮素利用效率(NUE)，进行了转基因水稻植株的温室低氮试验。温室中设置比例为1:1的钠灯和金属卤化物灯作为光源，光照/黑暗时间为16h/8h，光源设置在苗床上部大约1.5m处，晴天时，高于苗床30cm处的光强度为10,000-20,000lx，阴天时为6,000-10,000lx；温室相对湿度为30％-90％，温度为20-35℃。

NUE试验方法：

T2代转基因种子和对照种子首先采用800ppm的多菌灵在32℃消毒8h，然后使用蒸馏水冲洗3～5次，然后32℃浸种16h，在35-37℃培养箱中萌发18h。发芽后的种子种植在装有蛭石的小盆中。本试验采用随机区组设计。每个筛选单元分为6个区块，其中包括1到2个对照(ZH11-TC和/或空载体)和9-12个转基因株系。每个转基因株系的12株幼苗种在6个盆中，并位于6个区块的不同位置。

培养7-10天后，用表4所示含有0.75mM的氮素(KNO₃)的改良的Hoagland营养液代替蒸馏水浇灌植株。为了提供有氧条件，每周一、三和五排出营养液，静置2-3小时后加入新的提供低氮条件的改良的Hoagland营养液。当在低氮溶液中培养35-40天后，测量分蘖(包括主茎和所有的分蘖)，使用SPAD仪(SPAD 502plus，KONICA MINOLTA公司制造)测定正数第二片叶三个不同位置的SPAD值，取其平均值作为SPAD值；并以百分之一的天平测量幼苗鲜重(从根和茎的连接处剪断)。将所有数据(分蘖数、SPAD值和鲜重)统计分析后选取P<0.05的植株为阳性植株。

表4.水稻培养的改良Hoagland营养液

NUE筛选结果

1)OsCYP76M5转基因水稻(DP0788)的验证结果

选择8个OsCYP76M5转基因株系进行验证，并以ZH11-TC幼苗为对照。如表5所示，5个株系的SPAD植显著高于ZH11-TC对照，3个株系的鲜重显著高于ZH11-TC对照，这些结果表明，OsCYP76M5转基因水稻植株可能提高低氮耐受性或提高NUE。

表5.温室低氮条件下OsCYP76M5转基因水稻植株的低氮试验

2)OsFBX25转基因水稻(DP0963)的验证结果

选择10个OsFBX25转基因水稻株系进行测试，ZH11-TC和DP0158幼苗用作对照。当幼苗生长到3-叶期时，采用含有0.75mM的硝酸钾的Hoagland营养液培养水稻植株40天，OsFBX25转基因水稻的平均分蘖数和鲜重大于ZH11-TC和DP0158对照。如表6所示，2个转基因株系的分蘖数显著高于ZH11-TC对照，4个转基因株系的SPAD值和鲜重显著高于ZH11-TC对照；如表7所示，3个转基因株系的分蘖数，4个转基因株系的鲜重显著高于DP0158对照。这些结果表明OsFBX25转基因水稻植株提高了低氮耐性或增加NUE。

表6.温室低氮条件下OsFBX25转基因水稻植株的低氮试验(ZH11-TC用作对照)

表7.温室低氮条件下OsFBX25转基因水稻植株的低氮试验(DP0158用作对照)

3)OsGH17转基因水稻(DP0979)的验证结果

10个OsGH17转基因株系进行了测试，ZH11-TC幼苗用作对照，并采用随机区组设计。当水稻植株生长到3-叶期时，采用含有0.75mM的硝酸钾的Hoagland营养液培养水稻植株，低氮胁迫28天后，测定分蘖数、SPAD值和鲜重。OsGH17转基因水稻的平均SPAD值和鲜重高于ZH11-TC对照，8个转基因株系的SPAD值和鲜重显著高于ZH11-TC对照(表8)。这些结果表明OsGH17转基因水稻获得了增加的低氮耐性或增加的NUE，过量表达OsGH17在增加NUE中起作用。

表8.温室低氮条件下OsGH17转基因水稻植株的低氮试验(ZH11-TC为对照)

实施例5.转基因水稻植株的实验室氯酸盐筛选

硝酸盐是高等植物无机氮利用的主要来源。氯酸盐是硝酸盐类似物，植物通过氮素的吸收、转运系统吸收和转运氯酸盐，并通过硝酸还原酶(NR)还原为有毒化合物(亚硝酸盐)。为了进一步证明转基因水稻植物的氮素利用效率，用氯酸盐溶液处理水稻幼苗，对氯酸盐敏感的幼苗被认为具有增加的氮素利用效率或低氮耐受性。

实验室氯酸盐试验方法：

每个构建体选择大约10个株系进行氯酸盐试验。ZH11-TC和空载体(DP0158)转基因植株为对照。

如实施例4所描述对T2代转基因种子和对照种子的进行消毒和并使其萌发，本试验在温度为28-30℃、相对湿度约30％的培养室中进行。种子萌发后置于底部有孔的管中，30℃水培6天至一叶一心期。选取高度为5.5cm的一致性幼苗用于氯酸盐筛选。本试验选用随机区组设计。每个容器分为5个区域，每个区域中随机将每个转基因株系放1行(每列12株)，ZH11-TC和DP0158幼苗放3行(3x12棵植株)。幼苗置于0.4mM的氯酸盐溶液中培养3-5天，光照/黑暗时间为10h/14h。处理幼苗首先进入黑暗时期进行氯酸盐吸收，并在第三天更换氯酸盐溶液。处理3-5天后，幼苗转入1/10Hoagland营养液(表6)中恢复培养4天。整株叶片枯萎和叶片全部失绿的幼苗被视为敏感幼苗。仅叶片或茎部坏死的幼苗，或叶片褪色的幼苗视为非敏感幼苗。

本筛选以敏感率为参数，所述敏感率为敏感植株数除以总植株数的百分比。

构建体水平(所有转基因植物与对照相比)和转基因株系水平(不同转基因株系分别与对照相比)的数据分析均采用“Y～seg+line(seg)+rep+error”统计模型，随机效应为“rep”，统计方法为“SAS Proc Glimmix”。

氯酸盐试验结果：

1)OsDN-LTP8转基因水稻(DP0749)的验证结果

第一次试验中，对OsDN-LTP8转基因水稻用0.8mM的氯酸盐溶液进行处理5天后置于1/10的Hoagland营养液中恢复培养4天，480株OsDN-LTP8转基因幼苗中235株死亡(49％)，而300株ZH11-TC幼苗死亡60株(20％)，180株DP0158幼苗死亡52株(29％)。OsDN-LTP8转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果显示，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsDN-LTP8转基因幼苗在载体水平显示增强的氯酸盐敏感性。表9为转基因株系水平的分析，6个株系的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。

表9.OsDN-LTP8转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第一次试验)

在第二次试验中，测试同样的8个转基因株系，氯酸盐处理后，480株OsDN-LTP8转基因幼苗中251株死亡(52％)，而300株ZH11-TC幼苗死亡88株(29％)，180株DP0158幼苗死亡62株(34％)。OsDN-LTP8转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。转基因株系水平的进一步分析证明所有8个转基因株系的敏感率显著高于ZH11-TC幼苗，4个转基因株系的敏感率显著高于DP0158幼苗(表10)。这些结果表明，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsDN-LTP8转基因水稻植株在载体水平和转基因株系水平增加幼苗的氯酸盐敏感性。OsDN-LTP8转基因水稻被认为具有较好的氮素利用效率或低氮耐性，增加OsDN-LTP8基因表达量可增加转基因植株的氯酸盐敏感性，并提高转基因植物的氮素利用效率或耐低氮性。

表10.OsDN-LTP8转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验)

2)OsFBX25转基因水稻(DP0963)的验证结果

第一次试验中，600株OsFBX25转基因幼苗中260株死亡(43％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡75株(42％)，180株DP0158幼苗死亡59株(33％)。OsFBX25转基因幼苗的敏感率显著高于DP0158对照。这些结果表明，OsFBX25转基因幼苗在在载体水平显示增强的氯酸盐敏感性。

转基因株系水平进一步的分析表明10个转基因株系中的6个株系的敏感率高于ZH11-TC和DP0158对照，且5个转基因株系的敏感率显著高于DP0158幼苗(表11)。这些结果表明OsFBX25转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性，OsFBX25提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。

表11.OsFBX25转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感试验(第一次试验)

第二次试验中，600株OsFBX25转基因幼苗中500株死亡(83％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡72株(40％)，180株DP0158幼苗死亡114株(63％)。OsFBX25转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。转基因株系水平的分析表明10个转基因株系中的9个株系的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158幼苗(表12)。这些结果进一步表明，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsFBX25转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性，OsFBX25提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。综上所述，这些结果表明OsFBX25表达量的增加提高了转基因植物的氯酸盐敏感性并提高转基因植物的氮素利用效率或低氮耐性。

表12.OsFBX25转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验)

3)OsGH17转基因水稻(DP0979)的验证结果

第一次试验中，氯酸盐处理后，600株OsGH17转基因幼苗中400株死亡(67％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡117株(65％)，180株DP0158幼苗死亡78株(43％)。OsGH17转基因幼苗的敏感率显著高于DP0158对照，表明，OsGH17转基因幼苗提高了氯酸盐敏感性。转基因株系水平进一步的分析表明10个转基因株系中的8个株系的敏感率高于DP0158对照(表13)。这些结果表明，与DP0158幼苗相比，OsGH17转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性，增加OsGH17的表达提高了转基因植物的氯酸盐敏感性。

表13.OsGH17转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第一次试验)

第二次试验中，氯酸盐处理后，600株OsGH17转基因幼苗中305株死亡(51％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡75株(42％)，180株DP0158幼苗死亡68株(38％)。OsGH17转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。转基因株系水平的分析表明8个转基因株系的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158幼苗(表14)。这些结果表明，OsGH17转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性。综上所述，上述结果表明，增加OsGH17的表达提高了转基因植物的氯酸盐敏感性并提高转基因植物的氮素利用效率或低氮耐性。

表14.OsGH17转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性分析(第二次试验)

4)OsDN-LTP9转基因水稻(DP01154)的验证结果

第一次试验中，氯酸盐处理后，600株OsDN-LTP9转基因幼苗中196株死亡(33％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡49株(27％)，180株DP0158幼苗死亡41株(23％)。OsDN-LTP9转基因幼苗的敏感率显著高于DP0158对照并高于ZH11-TC对照，表明，OsDN-LTP9转基因幼苗提高了氯酸盐敏感性。转基因株系水平进一步的分析表明10个转基因株系中的6个株系的敏感率高于ZH11-TC和DP0158对照(表15)。这些结果表明，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsDN-LTP9转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性。

表15.OsDN-LTP9转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感试验(第一次试验)

第二次试验中，氯酸盐处理后，600株OsDN-LTP9转基因幼苗中380株死亡(63％)，而180株ZH11-TC幼苗死亡64株(36％)，180株DP0158幼苗死亡87株(48％)。OsDN-LTP9转基因幼苗的敏感率显著高于ZH11-TC和DP0158对照。这些结果表明OsDN-LTP9转基因幼苗提高了氯酸盐敏感率。转基因株系水平的分析表明9个转基因株系的敏感率显著高于ZH11-TC对照和5个株系的氯酸盐敏感率显著高于DP0158对照(表16)。这些结果表明，与ZH11-TC和DP0158幼苗相比，OsDN-LTP9转基因水稻植株在载体和转基因株系水平提高了苗期的氯酸盐敏感性。这些结果表明，增加OsDN-LTP9的表达提高了转基因植物的氯酸盐敏感性并提高转基因植物的氮素利用效率或低氮耐性。

表16.OsDN-LTP9转基因水稻幼苗的氯酸盐敏感性试验(第二次试验)

实施例6.转基因水稻的田间低氮筛选

田间耐低氮试验在北京进行。设置两个氮素水平：N-0(不含氮的化肥)和N-1(每亩正常施用180kg氮)。种子萌发和幼苗培养如实施例4所述。萌发种子种植于田间苗床中，三叶期将幼苗移栽入试验田中，重复4次，每个转基因株系每个重复种植10株，4个重复种于同一个田块中。同一田块中临近转基因株系的ZH11-TC和DP0158植株作为对照，并用于统计分析。

水稻植株正常管理，并使用相应的杀虫剂，N-0处理施用磷肥和钾肥，N-1处理正常化肥。

株高为抽穗后20天的水稻茎基部到穗顶端的长度，或茎基部到最高叶的长度。每行中间的六株水稻植株的株高被测量，其算数平均值视为转基因水稻的株高。

生长季节结束时，从每个转基因株系中间收获六株代表植株。利用ASReml软件的混合线性模型统计分析株高和粒重数据。基于分析选择阳性转基因株系(P≤0.1)。

1)OsDN-LTP8转基因水稻(DP0749)的田间NUE验证结果

如表17所示，低氮条件下，载体水平上OsDN-LTP8转基因水稻的单株籽粒重量为31.07g，高于ZH11-TC对照的单株籽粒产量，并显著高于DP0158对照的单株籽粒产量。转基因株系水平上，所有12个株系的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照，6个株系的单株产量显著高于DP0158对照。

如表18所示，低氮条件下，载体水平上OsDN-LTP8转基因水稻比ZH11-TC和DP0158幼苗高；转基因株系水平上，4个OsDN-LTP8转基因株系显著高于ZH11-TC对照，7个株系显著高于DP0158对照。这些结果表明OsDN-LTP8转基因水稻提高了低氮耐性。

表17.OsDN-LTP8转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析(第一次试验)

表18.OsDN-LTP8转基因水稻在田间低氮条件下的植株高度分析(第一次试验)

选择5个OsDN-LTP8转基因水稻株系，在低氮条件(N-0)、正常氮条件(N-1)和高氮条件(N-2)下进行测试，并设置4个重复，每个重复中每个转基因株系种植50株水稻植株。N-0地块中，整个生育期不施用氮肥；N-1地块中，根据土壤氮素含量，施加一定量的氮肥；N-2地块中，施加N-1地块中1.5倍的氮肥。

如表19、20和21所示，在低氮条件、正常氮条件和高氮条件下，OsDN-LTP8转基因水稻的单株籽粒产量分别高于ZH11-TC植株。这些结果表明OsDN-LTP8转基因水稻植株显示增加的低氮耐性和/或NUE。OsDN-LTP8基因能够被用于提高低氮耐性和/或NUE。

表19.OsDN-LTP8转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析(第二次试验)

表20.OsDN-LTP8转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析

表21.OsDN-LTP8转基因水稻在田间高氮条件下的籽粒产量分析

2)OsCYP76M5转基因水稻(DP0788)的田间NUE验证结果

12个OsCYP76M5转基因水稻株系(DP0788)、ZH11-TC和DP0158水稻种植在田间，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表22所示，载体水平上，OsCYP76M5转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，2个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，1个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照。

表22.OsCYP76M5转基因水稻在田间的籽粒产量分析

3)OsFBX25转基因水稻(DP0963)的田间NUE验证结果

12个OsFBX25转基因水稻株系、ZH11-TC和DP0158水稻种植在田间，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表23所示，载体水平上，OsFBX25转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，9个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，5个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照。

表23.OsFBX25转基因水稻在田间正常氮素条件下的籽粒产量分析(第一次试验)

OsFBX25转基因水稻株系再次进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻用作对照，整个生育期没有施加氮肥，但并没有在测试田间产生低氮胁迫。如表24所示，载体水平上，OsFBX25转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，1个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，8个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照。

表24.OsFBX25转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析(第二次试验)

选择5个OsFBX25转基因水稻株系，在低氮条件(N-0)、正常氮条件(N-1)和高氮条件(N-2)下进行测试，并设置4个重复，每个重复中每个转基因株系种植50株水稻植株。N-0地块中，整个生育期不施用氮肥；N-1地块中，根据土壤氮素含量，施加一定量的氮肥；N-2地块中，施加N-1地块中1.5倍的氮肥。

如表25,26,27所示，在低氮条件、正常氮条件和高氮条件下，OsFBX25转基因水稻的单株籽粒产量分别高于ZH11-TC植株。这些结果表明OsFBX25转基因水稻植株显示增加的低氮耐性和/或NUE。OsFBX25基因能够被用于提高低氮耐性和/或NUE。

表25.OsFBX25转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析

表26.OsFBX25转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析

表27.OsFBX25转基因水稻在田间高氮条件下的籽粒产量分析

4)OsGH17转基因水稻(DP0979)的田间NUE验证结果

12个OsGH17转基因株系、ZH11-TC和DP0158水稻种植在田间，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表28所示，载体水平上，OsGH17转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照，并高于DP0158对照；转基因株系水平上，11个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照。

表28.OsGH17转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析(第一次试验)

OsGH17转基因株系再次进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻用作对照，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表29所示，载体水平上，OsGH17转基因水稻的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC和DP0158对照；转基因株系水平上，所有12个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照。

表29.OsGH17转基因水稻在田间正产氮条件下的籽粒产量分析(第二次试验)

5)OsDN-LTP9转基因水稻(DP1154)的田间NUE验证结果

12个OsDN-LTP9转基因株系、ZH11-TC和DP0158水稻种植在田间，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表30所示，载体水平上，OsDN-LTP9转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照和P0158对照；转基因株系水平上，6个株系的单株籽粒产量显著高于DP0158对照。

表30.OsDN-LTP9转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析(第一次试验)

OsDN-LTP9转基因水稻株系再次进行验证，ZH11-TC和DP0158水稻用作对照，整个生育期没有施加氮肥，但根据测定的田间土壤氮素含量，测试中没有产生低氮胁迫。如表31所示，载体水平上，OsDN-LTP9转基因水稻的单株籽粒产量高于ZH11-TC对照和DP0158对照；转基因株系水平上，4个株系的单株籽粒产量显著高于ZH11-TC对照。

表31.OsDN-LTP9转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析(第二次试验)

选择5个OsDN-LTP9转基因水稻株系，在低氮条件(N-0)、正常氮条件(N-1)和高氮条件(N-2)下进行测试，并设置4个重复，每个重复中每个转基因株系种植50株水稻植株。N-0地块中，整个生育期不施用氮肥；N-1地块中，根据土壤氮素含量，施加一定量的氮肥；N-2地块中，施加N-1地块中1.5倍的氮肥。

如表32,33,34所示，在低氮条件、正常氮条件和高氮条件下，OsDN-LTP9转基因水稻的单株籽粒产量分别高于ZH11-TC植株。这些结果表明OsDN-LTP9转基因水稻植株显示增加的低氮耐性和/或NUE。OsDN-LTP9基因能够被用于提高低氮耐性和/或NUE。

表32.OsDN-LTP9转基因水稻在田间低氮条件下的籽粒产量分析

表33.OsDN-LTP9转基因水稻在田间正常氮条件下的籽粒产量分析

表34.OsDN-LTP9转基因水稻在田间高氮条件下的籽粒产量分析

实施例7.在玉米中转化和评价水稻低氮耐受性基因

在玉米植株中可以通过编码本文中所述多肽的多核苷酸之一，或玉米、拟南芥或其它物种的相应同源物进行转化。在玉米转化载体中组成型启动子控制基因的表达水平，所述组成型启动子可为玉米泛素启动子(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632and Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)或诸如胁迫应答类启动子或组织特异性启动子等其它启动子。重组DNA构建体能通过粒子轰击法(国际专利WO2009/006276)被转入玉米细胞中。或者，重组DNA构建体也可通过农杆菌介导转化法转入玉米植株中(Zhao等(2006)Meth.Mol.Biol.318：315-323；Zhao等(2001)Mol.Breed.8：323-333；美国专利No.5,981,840公开于1999年11月9日)。

再生植株子代，如T1代植株，进行土壤中的低氮胁迫。在氮素胁迫之前和期间，利用图像分析软件多次测量植物面积、体积、生长率和颜色。在氮素胁迫期间，与对照相比其叶面积减少显著延迟，黄色积累减少，和/或生长率增加将被认为该基因在玉米中有增强的氮素利用效率。

实施例8.水稻低氮耐受性基因在拟南芥中的实验室NUE筛选

为了确认水稻耐低氮基因是否能提高双子叶植株的氮素胁迫耐受力或其它性状，通过农杆菌介导转化程序的花粉浸渍法将水稻耐低氮基因过表达载体转入拟南芥(哥伦比亚型)，并鉴定转基因植株(Clough,S.T.和Bent,A.F.(1998)The Plant Journal 16,735-743；Zhang,X.等(2006)Nature Protocols 1：641-646)。

再生植物的子代，比如T1植株，可以受到低氮胁迫。在低氮胁迫前后，利用图像分析技术，能够多次测定植株面积、体积、生长速率和颜色。在低氮胁迫下，相对于对照，显著延缓叶片面积缩减、减少黄色堆积和/或提高生长速率，会被认为是拟南芥中基因增强NUE功能的证据。

序列表

<110> 未名生物农业集团有限公司

先锋海外公司

<120> 氮素限制条件下农艺性状改变的植物和非生物胁迫耐性基因相关的构建体和方法

<130> RTS22593J

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2128

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

cattggctaa tttgtaattg gtgctttgca aataatgtca gcggtaagtt atcatttatg 60

tagactccaa aaatgttttg tggggcttat tgctttggaa aatgttctat aaattgtgtt 120

gctgttctag acttagtagt attttatgaa atgtttatgt tgtatggtat agtttgtgct 180

ttttttagtg tgtggcatta catagcactt tataatatag attgctttat aaaaaattga 240

ataaacaaaa aaaatcaaaa tacaagttaa cttgaaaatc tgtaggtgag aagttatgat 300

gatgcttttt taaggcaact gcatcaaagt gtagctcctt caattgtgca actggcagtt 360

ttcaatgcaa aaagtaccca aataccatgc catcttggta ctggattggt attatgtgtg 420

acacccaatt atattggggt aatcacatct atcagttgtg atccgaaaga tggtttcaga 480

gtcgttgcga gatttggtga tcaagaagat ttggagacag aagttgtcag aacaagttca 540

ttactttctg cgttggttgt gcgaggatgt aatgttcagg ccataccttg cattcctaca 600

tcgtttcatg aaggcgactt accagaggca gatgttgttt tttgtattgg atgttttagc 660

attgtgaaag agcagataat gactgcggga ataatcaggt atccatctat tcttgatgac 720

aattcatgga tatttttgtt ttgtactgtt acttttgttg catttcattc cccttgtatt 780

atattttgtt ttagtttatg tttaaagtgc ttataagatt tgacggaaga taattgagag 840

gaaaatgcag gccactgaac tttcaaattg caaatttagg ccttcaaact tggttaatgt 900

accatcatag gttcaaaggt gaacatactc cttagggaat agatgtggca tgctaacatg 960

gagtgaactt ggtatgtggg agcacgtgaa cttgccatgg attagaatat atgcatggaa 1020

cctcctaaaa tcgatatgct ctttactctt gttccacttt actcatgctg taatccccaa 1080

attatgtcgt ctcccgttca caacaccatt ggtctataat cgacgaaatg gtaggacaag 1140

ctagccattt tcaattgcaa tgagttggct tctcctggca tgccattgat tcctggtcat 1200

cgatgagatg aatgatcagc aggttgtttg gtgattatgt tatgagcaat tgggattgat 1260

agtgaacacc aagttgattt tgcatatatt tccatccacg tcaatctcaa ttctcacatt 1320

ctcccacatg ccacaccagc tgcttgcttg ttgacatgca tcataagctc ttagacattt 1380

gatgataaat taaataagtt tgctggctta aatttgcagt ttgaaagttt agagatctgg 1440

acaacacttt atggaatgtt ggtattttat tcttaattat ttattcttta agtatgtcct 1500

tcttaataac agttatttaa tgcatgccag tgtatgcgaa tttgaaaagg aactgagagg 1560

agaacaacag gttagcacat ttgtgcatac ctgtccgatt ggggatgggt tgatgggagc 1620

acctatatgt agtcgattcg gaaaagtttt tggaatgaat gttgctcgga cagcactgtg 1680

ttcatcaatt aattttgccc tgaacaatag tcaattaaag gttgaattgg caaaactatt 1740

acagaatgaa gattatgagg tactaccttt tgtacaaaac ctaaagcccg agtaatagct 1800

tttgctgttt taggtcgtaa aaggctcaga aatttacaga tttttaactt catgataata 1860

ttttatagat gtcagctctt attgagaagt acgattctga aaaaacgagt gcatcgaaga 1920

agagaaaggg aaggggtgtt agcagttcgc aaatgtcaag gtcaccagtg aagagaaagg 1980

cgggtggcag ttcttcgtca agaagggaga ggggtgttgc cagttcgcaa atgtcaagtt 2040

taccagcgaa gagaaaggcg ggtggcagtt cttcgtcaag agcgatataa aagaggtgtg 2100

tgccacagtt ttctattgtt caccatag 2128

<210> 2

<211> 873

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atgtcagcgg tgagaagtta tgatgatgct tttttaaggc aactgcatca aagtgtagct 60

ccttcaattg tgcaactggc agttttcaat gcaaaaagta cccaaatacc atgccatctt 120

ggtactggat tggtattatg tgtgacaccc aattatattg gggtaatcac atctatcagt 180

tgtgatccga aagatggttt cagagtcgtt gcgagatttg gtgatcaaga agatttggag 240

acagaagttg tcagaacaag ttcattactt tctgcgttgg ttgtgcgagg atgtaatgtt 300

caggccatac cttgcattcc tacatcgttt catgaaggcg acttaccaga ggcagatgtt 360

gttttttgta ttggatgttt tagcattgtg aaagagcaga taatgactgc gggaataatc 420

agtgtatgcg aatttgaaaa ggaactgaga ggagaacaac aggttagcac atttgtgcat 480

acctgtccga ttggggatgg gttgatggga gcacctatat gtagtcgatt cggaaaagtt 540

tttggaatga atgttgctcg gacagcactg tgttcatcaa ttaattttgc cctgaacaat 600

agtcaattaa aggttgaatt ggcaaaacta ttacagaatg aagattatga gatgtcagct 660

cttattgaga agtacgattc tgaaaaaacg agtgcatcga agaagagaaa gggaaggggt 720

gttagcagtt cgcaaatgtc aaggtcacca gtgaagagaa aggcgggtgg cagttcttcg 780

tcaagaaggg agaggggtgt tgccagttcg caaatgtcaa gtttaccagc gaagagaaag 840

gcgggtggca gttcttcgtc aagagcgata taa 873

<210> 3

<211> 290

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 3

Met Ser Ala Val Arg Ser Tyr Asp Asp Ala Phe Leu Arg Gln Leu His

1 5 10 15

Gln Ser Val Ala Pro Ser Ile Val Gln Leu Ala Val Phe Asn Ala Lys

20 25 30

Ser Thr Gln Ile Pro Cys His Leu Gly Thr Gly Leu Val Leu Cys Val

35 40 45

Thr Pro Asn Tyr Ile Gly Val Ile Thr Ser Ile Ser Cys Asp Pro Lys

50 55 60

Asp Gly Phe Arg Val Val Ala Arg Phe Gly Asp Gln Glu Asp Leu Glu

65 70 75 80

Thr Glu Val Val Arg Thr Ser Ser Leu Leu Ser Ala Leu Val Val Arg

85 90 95

Gly Cys Asn Val Gln Ala Ile Pro Cys Ile Pro Thr Ser Phe His Glu

100 105 110

Gly Asp Leu Pro Glu Ala Asp Val Val Phe Cys Ile Gly Cys Phe Ser

115 120 125

Ile Val Lys Glu Gln Ile Met Thr Ala Gly Ile Ile Ser Val Cys Glu

130 135 140

Phe Glu Lys Glu Leu Arg Gly Glu Gln Gln Val Ser Thr Phe Val His

145 150 155 160

Thr Cys Pro Ile Gly Asp Gly Leu Met Gly Ala Pro Ile Cys Ser Arg

165 170 175

Phe Gly Lys Val Phe Gly Met Asn Val Ala Arg Thr Ala Leu Cys Ser

180 185 190

Ser Ile Asn Phe Ala Leu Asn Asn Ser Gln Leu Lys Val Glu Leu Ala

195 200 205

Lys Leu Leu Gln Asn Glu Asp Tyr Glu Met Ser Ala Leu Ile Glu Lys

210 215 220

Tyr Asp Ser Glu Lys Thr Ser Ala Ser Lys Lys Arg Lys Gly Arg Gly

225 230 235 240

Val Ser Ser Ser Gln Met Ser Arg Ser Pro Val Lys Arg Lys Ala Gly

245 250 255

Gly Ser Ser Ser Ser Arg Arg Glu Arg Gly Val Ala Ser Ser Gln Met

260 265 270

Ser Ser Leu Pro Ala Lys Arg Lys Ala Gly Gly Ser Ser Ser Ser Arg

275 280 285

Ala Ile

290

<210> 4

<211> 1728

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 4

gattagctcc attttccacc taagagtgca ttaatatctc gattgcttgg cagtcatgga 60

ggtgacatcc accccagcga tgctgctcta cgccgccctg ttcgcggcgg cgctgctgta 120

cctcgccgtc gcggtccggc gcggccgcgg cgccggcctg ccgccgggtc cgacggggct 180

gccgctcgtc ggcagcttgc tgtccctcga cccggagctg cacacctact tcgccggcct 240

cgccgccagg tacggcccca tcttctctat ccgcctcggc tccaagctcg gcgtcgtcgt 300

cacctcgccg gcgctggcgc gggaggtgct gcgcgaccac gacctcgtct tctccaaccg 360

cgacacgccc gacgccgcgt gctccatctc ctacggcggc gggcagaaca tcgtgtggaa 420

cccggtcggc cccacgtggc gcctcctccg ccgcatctgc gtccacgaga tgatcggccc 480

cgccggcctc gacagcctcc acggcctccg ccgccgggag ttcatggcca cgctccacca 540

cctgcgcgcg cggtccggcg agcccgtcaa cgtcggcgcg cagatgttcc tcaccgtgat 600

gaacgtggtg accggcgcgc tgtggggcgg caacgtcggc agcgagagcg agcggacgac 660

ggtggggaag gagttccggg agctcgtcgc cgacatcacc gagttgctcg gcgcgcccaa 720

cgtgtccgac ttcttcccgg cgctggcgcc gctcgacatc cagggcatcc gcaacaagtc 780

cgacctgctc aaggaccgct tcgacgacat cttcgccagg atcatccaga agaggaccga 840

gtccgaccat gccgccgccg ccggcgagac ggcgtcggac ttcctcgagt acatgctcaa 900

gctggagaag gaaggcggcg acgggaagac cgccttcacc atgaccaacg tcaaggccct 960

gctcatggta agtgctcact gctcagtcac tgcactgccg gcgtcggaga cgacgacacc 1020

accattcatg gctgtgtgat ttggctgcag gacatggtga tcggggggac ggagacgacg 1080

tcgaacaccg tggaatgggg catggcggag atgctccaga acagggggac gctgcgcaag 1140

gtgcgggagg agctcgacgc ggtggtgggg cgcgacggcg tggtggagga gagccacctc 1200

ccgaagctgc actacctgaa tctggtggtc aaggagacgc tccggctgca cccggcgctg 1260

ccgctgatgg tgccgcactg ccccggcgag gacgccacgg tgggcggcca ccgcgtcccg 1320

gcgggcgccc gggtgttcgt caacgtgtgg gcgatccaga gggacccggc ggtgtggaag 1380

gacccggaac acttcatccc ggagaggttc ttgccggcgg acggcggcgg agggcggagg 1440

ctggacttca ccgggagcga gcaggagtac atgccgttcg ggtccgggag gaggatctgc 1500

gccggcgtcg ccatggcgga gcggatggtg gcctactcgc tggcgatgct ggtgcaggcg 1560

ttcgactggg agctgccggc cggcgagcgg ctggacctcg ccgagcggtt cggcatcgtg 1620

atgaagaagg ccacgccgct ggtcgccgtg cccacgccga ggctctccaa ccctcagctc 1680

tactccgcct agataccaaa ggttttaaat ctcgggctat aattgtag 1728

<210> 5

<211> 1554

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 5

atggaggtga catccacccc agcgatgctg ctctacgccg ccctgttcgc ggcggcgctg 60

ctgtacctcg ccgtcgcggt ccggcgcggc cgcggcgccg gcctgccgcc gggtccgacg 120

gggctgccgc tcgtcggcag cttgctgtcc ctcgacccgg agctgcacac ctacttcgcc 180

ggcctcgccg ccaggtacgg ccccatcttc tctatccgcc tcggctccaa gctcggcgtc 240

gtcgtcacct cgccggcgct ggcgcgggag gtgctgcgcg accacgacct cgtcttctcc 300

aaccgcgaca cgcccgacgc cgcgtgctcc atctcctacg gcggcgggca gaacatcgtg 360

tggaacccgg tcggccccac gtggcgcctc ctccgccgca tctgcgtcca cgagatgatc 420

ggccccgccg gcctcgacag cctccacggc ctccgccgcc gggagttcat ggccacgctc 480

caccacctgc gcgcgcggtc cggcgagccc gtcaacgtcg gcgcgcagat gttcctcacc 540

gtgatgaacg tggtgaccgg cgcgctgtgg ggcggcaacg tcggcagcga gagcgagcgg 600

acgacggtgg ggaaggagtt ccgggagctc gtcgccgaca tcaccgagtt gctcggcgcg 660

cccaacgtgt ccgacttctt cccggcgctg gcgccgctcg acatccaggg catccgcaac 720

aagtccgacc tgctcaagga ccgcttcgac gacatcttcg ccaggatcat ccagaagagg 780

accgagtccg accatgccgc cgccgccggc gagacggcgt cggacttcct cgagtacatg 840

ctcaagctgg agaaggaagg cggcgacggg aagaccgcct tcaccatgac caacgtcaag 900

gccctgctca tggacatggt gatcgggggg acggagacga cgtcgaacac cgtggaatgg 960

ggcatggcgg agatgctcca gaacaggggg acgctgcgca aggtgcggga ggagctcgac 1020

gcggtggtgg ggcgcgacgg cgtggtggag gagagccacc tcccgaagct gcactacctg 1080

aatctggtgg tcaaggagac gctccggctg cacccggcgc tgccgctgat ggtgccgcac 1140

tgccccggcg aggacgccac ggtgggcggc caccgcgtcc cggcgggcgc ccgggtgttc 1200

gtcaacgtgt gggcgatcca gagggacccg gcggtgtgga aggacccgga acacttcatc 1260

ccggagaggt tcttgccggc ggacggcggc ggagggcgga ggctggactt caccgggagc 1320

gagcaggagt acatgccgtt cgggtccggg aggaggatct gcgccggcgt cgccatggcg 1380

gagcggatgg tggcctactc gctggcgatg ctggtgcagg cgttcgactg ggagctgccg 1440

gccggcgagc ggctggacct cgccgagcgg ttcggcatcg tgatgaagaa ggccacgccg 1500

ctggtcgccg tgcccacgcc gaggctctcc aaccctcagc tctactccgc ctag 1554

<210> 6

<211> 517

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 6

Met Glu Val Thr Ser Thr Pro Ala Met Leu Leu Tyr Ala Ala Leu Phe

1 5 10 15

Ala Ala Ala Leu Leu Tyr Leu Ala Val Ala Val Arg Arg Gly Arg Gly

20 25 30

Ala Gly Leu Pro Pro Gly Pro Thr Gly Leu Pro Leu Val Gly Ser Leu

35 40 45

Leu Ser Leu Asp Pro Glu Leu His Thr Tyr Phe Ala Gly Leu Ala Ala

50 55 60

Arg Tyr Gly Pro Ile Phe Ser Ile Arg Leu Gly Ser Lys Leu Gly Val

65 70 75 80

Val Val Thr Ser Pro Ala Leu Ala Arg Glu Val Leu Arg Asp His Asp

85 90 95

Leu Val Phe Ser Asn Arg Asp Thr Pro Asp Ala Ala Cys Ser Ile Ser

100 105 110

Tyr Gly Gly Gly Gln Asn Ile Val Trp Asn Pro Val Gly Pro Thr Trp

115 120 125

Arg Leu Leu Arg Arg Ile Cys Val His Glu Met Ile Gly Pro Ala Gly

130 135 140

Leu Asp Ser Leu His Gly Leu Arg Arg Arg Glu Phe Met Ala Thr Leu

145 150 155 160

His His Leu Arg Ala Arg Ser Gly Glu Pro Val Asn Val Gly Ala Gln

165 170 175

Met Phe Leu Thr Val Met Asn Val Val Thr Gly Ala Leu Trp Gly Gly

180 185 190

Asn Val Gly Ser Glu Ser Glu Arg Thr Thr Val Gly Lys Glu Phe Arg

195 200 205

Glu Leu Val Ala Asp Ile Thr Glu Leu Leu Gly Ala Pro Asn Val Ser

210 215 220

Asp Phe Phe Pro Ala Leu Ala Pro Leu Asp Ile Gln Gly Ile Arg Asn

225 230 235 240

Lys Ser Asp Leu Leu Lys Asp Arg Phe Asp Asp Ile Phe Ala Arg Ile

245 250 255

Ile Gln Lys Arg Thr Glu Ser Asp His Ala Ala Ala Ala Gly Glu Thr

260 265 270

Ala Ser Asp Phe Leu Glu Tyr Met Leu Lys Leu Glu Lys Glu Gly Gly

275 280 285

Asp Gly Lys Thr Ala Phe Thr Met Thr Asn Val Lys Ala Leu Leu Met

290 295 300

Asp Met Val Ile Gly Gly Thr Glu Thr Thr Ser Asn Thr Val Glu Trp

305 310 315 320

Gly Met Ala Glu Met Leu Gln Asn Arg Gly Thr Leu Arg Lys Val Arg

325 330 335

Glu Glu Leu Asp Ala Val Val Gly Arg Asp Gly Val Val Glu Glu Ser

340 345 350

His Leu Pro Lys Leu His Tyr Leu Asn Leu Val Val Lys Glu Thr Leu

355 360 365

Arg Leu His Pro Ala Leu Pro Leu Met Val Pro His Cys Pro Gly Glu

370 375 380

Asp Ala Thr Val Gly Gly His Arg Val Pro Ala Gly Ala Arg Val Phe

385 390 395 400

Val Asn Val Trp Ala Ile Gln Arg Asp Pro Ala Val Trp Lys Asp Pro

405 410 415

Glu His Phe Ile Pro Glu Arg Phe Leu Pro Ala Asp Gly Gly Gly Gly

420 425 430

Arg Arg Leu Asp Phe Thr Gly Ser Glu Gln Glu Tyr Met Pro Phe Gly

435 440 445

Ser Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Val Ala Met Ala Glu Arg Met Val

450 455 460

Ala Tyr Ser Leu Ala Met Leu Val Gln Ala Phe Asp Trp Glu Leu Pro

465 470 475 480

Ala Gly Glu Arg Leu Asp Leu Ala Glu Arg Phe Gly Ile Val Met Lys

485 490 495

Lys Ala Thr Pro Leu Val Ala Val Pro Thr Pro Arg Leu Ser Asn Pro

500 505 510

Gln Leu Tyr Ser Ala

515

<210> 7

<211> 636

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 7

cccgtgtgct acctgtaccc atgggccgcg caatggcggc cgagttccgg cggcgcgggg 60

acgacccaga tgatgtgtat gggaccgtgg cacgcgtgct ctcctacatc cactacaccc 120

tccccagccc gcccgtctcc gctaccacac gcctctgcgc acttaccccg cacgacgtcg 180

tcgaccgcat cagcaccctc cctgacgagc tcctcagcaa ggtcgtctcc cacctccccg 240

tcaaggatgt cgcgcgcact accgctggag cccggtatgg tgctctatgc cgctcgcggc 300

ggatgagctc cccaccacgc cggactgccg ccgggtcccc tccgatccac cgcccactcc 360

gtcgcaggcc cgctccatgg cctgcatggc cggtcccgcc ttcctcactg acctccggac 420

cagttgacgg ttgcccaata gcctggtgct ctctgccgga accacctcat cacctcctcg 480

ggccatcttc atctacctcc tacgccctgt cccggtgcaa gcagaagcgg cggcaccgcg 540

gctgtggcat cggacgactt cgacatcaac cttgacagcc tcatgcgaga gctcgcccac 600

cgccgccccc actctgctcg gctggctcct ctctcc 636

<210> 8

<211> 543

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 8

atggcggccg agttccggcg gcgcggggac gacccagatg atgtgtatgg gaccgtggca 60

cgcgtgctct cctacatcca ctacaccctc cccagcccgc ccgtctccgc taccacacgc 120

ctctgcgcac ttaccccgca cgacgtcgtc gaccgcatca gcaccctccc tgacgagctc 180

ctcagcaagg tcgtctccca cctccccgtc aaggatgtcg cgcgcactac cgctggagcc 240

cggtatggtg ctctatgccg ctcgcggcgg atgagctccc caccacgccg gactgccgcc 300

gggtcccctc cgatccaccg cccactccgt cgcaggcccg ctccatggcc tgcatggccg 360

gtcccgcctt cctcactgac ctccggacca gttgacggtt gcccaatagc ctggtgctct 420

ctgccggaac cacctcatca cctcctcggg ccatcttcat ctacctccta cgccctgtcc 480

cggtgcaagc agaagcggcg gcaccgcggc tgtggcatcg gacgacttcg acatcaacct 540

tga 543

<210> 9

<211> 180

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 9

Met Ala Ala Glu Phe Arg Arg Arg Gly Asp Asp Pro Asp Asp Val Tyr

1 5 10 15

Gly Thr Val Ala Arg Val Leu Ser Tyr Ile His Tyr Thr Leu Pro Ser

20 25 30

Pro Pro Val Ser Ala Thr Thr Arg Leu Cys Ala Leu Thr Pro His Asp

35 40 45

Val Val Asp Arg Ile Ser Thr Leu Pro Asp Glu Leu Leu Ser Lys Val

50 55 60

Val Ser His Leu Pro Val Lys Asp Val Ala Arg Thr Thr Ala Gly Ala

65 70 75 80

Arg Tyr Gly Ala Leu Cys Arg Ser Arg Arg Met Ser Ser Pro Pro Arg

85 90 95

Arg Thr Ala Ala Gly Ser Pro Pro Ile His Arg Pro Leu Arg Arg Arg

100 105 110

Pro Ala Pro Trp Pro Ala Trp Pro Val Pro Pro Ser Ser Leu Thr Ser

115 120 125

Gly Pro Val Asp Gly Cys Pro Ile Ala Trp Cys Ser Leu Pro Glu Pro

130 135 140

Pro His His Leu Leu Gly Pro Ser Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Leu Ser

145 150 155 160

Arg Cys Lys Gln Lys Arg Arg His Arg Gly Cys Gly Ile Gly Arg Leu

165 170 175

Arg His Gln Pro

180

<210> 10

<211> 559

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 10

ccgttcggac agtgaggaga aagccatgcc caccttcccc ttccccacgg cgcagatgaa 60

tgccgaagaa gagatggaat ctgagacagg aacgacagcg gttggagtgt gctggggcat 120

gagcggcgac aacctgccgc cggcgagcaa agtcaccgag atgctccgag agaacggctt 180

caccgtcgtc cgcctctaca cgccggacag cgccgctctc gtggcgctcg gcagcacagg 240

catctgcgtc gtcgtcggtg cgcccaacta cgacctcccc gccctggcgc acggcaggac 300

agccgccacg gccgcctgga tccgcgagaa catccaggcc tacccgacgg tgttattccg 360

gttcgtcgtc gtgggcaacg aggtctccag cgccgacatg cagctcctcg tcccggccat 420

ggagacgtcc acgccgcgct cgcggcggct ggtttgggac acatcaaggt gacgacgtcg 480

tccgcctgcg ccagcctgcc gccatgcagc tgctcccccg cgcagctgtt cccccgctgg 540

agcccgtgaa gaagagagg 559

<210> 11

<211> 447

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 11

atgcccacct tccccttccc cacggcgcag atgaatgccg aagaagagat ggaatctgag 60

acaggaacga cagcggttgg agtgtgctgg ggcatgagcg gcgacaacct gccgccggcg 120

agcaaagtca ccgagatgct ccgagagaac ggcttcaccg tcgtccgcct ctacacgccg 180

gacagcgccg ctctcgtggc gctcggcagc acaggcatct gcgtcgtcgt cggtgcgccc 240

aactacgacc tccccgccct ggcgcacggc aggacagccg ccacggccgc ctggatccgc 300

gagaacatcc aggcctaccc gacggtgtta ttccggttcg tcgtcgtggg caacgaggtc 360

tccagcgccg acatgcagct cctcgtcccg gccatggaga cgtccacgcc gcgctcgcgg 420

cggctggttt gggacacatc aaggtga 447

<210> 12

<211> 148

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 12

Met Pro Thr Phe Pro Phe Pro Thr Ala Gln Met Asn Ala Glu Glu Glu

1 5 10 15

Met Glu Ser Glu Thr Gly Thr Thr Ala Val Gly Val Cys Trp Gly Met

20 25 30

Ser Gly Asp Asn Leu Pro Pro Ala Ser Lys Val Thr Glu Met Leu Arg

35 40 45

Glu Asn Gly Phe Thr Val Val Arg Leu Tyr Thr Pro Asp Ser Ala Ala

50 55 60

Leu Val Ala Leu Gly Ser Thr Gly Ile Cys Val Val Val Gly Ala Pro

65 70 75 80

Asn Tyr Asp Leu Pro Ala Leu Ala His Gly Arg Thr Ala Ala Thr Ala

85 90 95

Ala Trp Ile Arg Glu Asn Ile Gln Ala Tyr Pro Thr Val Leu Phe Arg

100 105 110

Phe Val Val Val Gly Asn Glu Val Ser Ser Ala Asp Met Gln Leu Leu

115 120 125

Val Pro Ala Met Glu Thr Ser Thr Pro Arg Ser Arg Arg Leu Val Trp

130 135 140

Asp Thr Ser Arg

145

<210> 13

<211> 559

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 13

ccgttcggac agtgaggaga aagccatgcc caccttcccc ttccccacgg cgcagatgaa 60

tgccgaagaa gagatggaat ctgagacagg aacgacagcg gttggagtgt gctggggcat 120

gagcggcgac aacctgccgc cggcgagcaa agtcaccgag atgctccgag agaacggctt 180

caccgtcgtc cgcctctaca cgccggacag cgccgctctc gtggcgctcg gcagcacagg 240

catctgcgtc gtcgtcggtg cgcccaacta cgacctcccc gccctggcgc acggcaggac 300

agccgccacg gccgcctgga tccgcgagaa catccaggcc tacccgacgg tgttattccg 360

gttcgtcgtc gtgggcaacg aggtctccag cgccgacatg cagctcctcg tcccggccat 420

ggagacgtcc acgccgcgct cgcggcggct ggtttgggac acatcaaggt gacgacgtcg 480

tccgcctgcg ccagcctgcc gccatgcagc tgctcccccg cgcagctgtt cccccgctgg 540

agcccgtgaa gaagagagg 559

<210> 14

<211> 447

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 14

atgcccacct tccccttccc cacggcgcag atgaatgccg aagaagagat ggaatctgag 60

acaggaacga cagcggttgg agtgtgctgg ggcatgagcg gcgacaacct gccgccggcg 120

agcaaagtca ccgagatgct ccgagagaac ggcttcaccg tcgtccgcct ctacacgccg 180

gacagcgccg ctctcgtggc gctcggcagc acaggcatct gcgtcgtcgt cggtgcgccc 240

aactacgacc tccccgccct ggcgcacggc aggacagccg ccacggccgc ctggatccgc 300

gagaacatcc aggcctaccc gacggtgtta ttccggttcg tcgtcgtggg caacgaggtc 360

tccagcgccg acatgcagct cctcgtcccg gccatggaga cgtccacgcc gcgctcgcgg 420

cggctggttt gggacacatc aaggtga 447

<210> 15

<211> 78

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 15

Met Pro Trp Arg Pro Gly Arg Gly Glu Ser Ile Ala Tyr Pro Phe Ser

1 5 10 15

Val Gly Glu Trp Ala Pro Arg Glu His Ser Ser Pro Leu Pro Asn Thr

20 25 30

Arg Ile Leu Ala Ile Ala Asn Leu Trp Leu Ser Pro Glu Thr Leu Ser

35 40 45

Arg Asp Pro Ser Ala Gly Ile Ile Ala Ala Ile Cys Gly Tyr Leu Leu

50 55 60

Asp Ile Cys Phe Leu Thr Gln Val Ala Gly Cys Tyr Cys Ser

65 70 75

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for cloning gDNA of OsDN-LTP8

<400> 16

cattggctaa tttgtaattg g 21

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for cloning gDNA of OsDN-LTP8

<400> 17

ctatggtgaa caatagaaaa ctgtg 25

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for cloning gDNA of OsCYP76M5

<400> 18

gattagctcc attttccacc taagag 26

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for cloning gDNA of OsCYP76M5

<400> 19

ctacaattat agcccgagat ttaaaacc 28

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for cloning gDNA of OsFBX25

<400> 20

ctgctgaggc ccgtgtgcta cctgtaccca tg 32

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for cloning gDNA of OsFBX25

<400> 21

ccgctgaggg gagagaggag ccagccgagc 30

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for cloning gDNA of OsGH17

<400> 22

ctgctgaggc cgttcggaca gtgaggagaa agc 33

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for cloning gDNA of OsGH17

<400> 23

ccgctgaggc ctctcttctt cacgggctcc agc 33

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for cloning cDNA of OsDN-LTP9

<400> 24

ctgctgaggg gtctctcttg cactcgtgag c 31

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for cloning cDNA of OsDN-LTP9

<400> 25

ccgctgaggc aaaatcaaga acagtagcag ccag 34

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of OsDN-LTP8 gene

<400> 26

accagtgaag agaaaggcg 19

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of OsDN-LTP8 gene

<400> 27

cttgacattt gcgaactggc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of OsFBX25 gene

<400> 28

agttgacggt tgcccaatag 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of OsFBX25 gene

<400> 29

gtagatgaag atggcccgag 20

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of OsGH17 gene

<400> 30

gaatctgaga caggaacgac ag 22

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of OsGH17 gene

<400> 31

atctcggtga ctttgctcg 19

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of OsDN-LTP9 gene

<400> 32

ttcatctcca cttcccaaca c 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of OsDN-LTP9 gene

<400> 33

cagcaacctg tgtcaagaaa c 21

Claims

1.一种制备修饰的植物或种子的方法，包括与对照植物或种子相比，使修饰的植物或种子中的编码DN-LTP8多肽的多核苷酸的表达量增加，其中所述多核苷酸是(a)核苷酸序列为SEQ ID NO：1的多核苷酸；(b)核苷酸序列为SEQ ID NO：2的多核苷酸；或(c)编码多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3的多核苷酸；其中，与对照植物相比，所述植物显示出增加的氮素胁迫耐性或增加的产量。

2.根据权利要求1所述的方法，所述植物在其基因组中包含一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含(a)核苷酸序列为SEQ ID NO：1的多核苷酸；(b)核苷酸序列为SEQ IDNO：2的多核苷酸；(c)编码多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3的多核苷酸；或(d)核苷酸序列为(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的全长互补序列的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物在其基因组的基因位点上包含有一个编码多肽的靶向基因修饰，所述靶向基因修饰增加了氨基酸序列为SEQ ID NO:3的多肽的表达量和/或活性。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

5.一种提高植物氮胁迫耐性或NUE的方法，其包括：与对照植物相比，增加植物中编码DN-LTP8多肽的至少一个多核苷酸的表达，其中所述多核苷酸包括(a)核苷酸序列为SEQ IDNO：1的多核苷酸；(b)核苷酸序列为SEQ ID NO：2的多核苷酸；或(c)，编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3的多核苷酸。

6.根据权利要求5所述的方法，所述多核苷酸表达通过以下方法增加：

(a)向可再生植物细胞引入一个重组DNA构建体，所述构建体包含与编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3的多核苷酸序列可操作性连接的调控元件；和

(b)产生所述植物，其中所述植物在其基因组内含有所述重组DNA构建体。

7.权利要求5的方法，其中所述方法包括：(a)向一个可再生的植物细胞的基因组位点引入一个靶向基因修饰，所述基因组位点编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；和(b)再生所述植物，其中所述植物中的所述多肽的水平和/或活性是增加的。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶向基因修饰通过锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas、引导Cas核酸内切酶、归巢核酸内切酶或CRISPR-Cas核糖核蛋白复合体引入。

9.权利要求7所述的方法，其中所述靶向基因修饰存在于所述基因组位点的(a)编码区；(b)一个非编码区；(c)一个调控序列；(d)一个非翻译区；或(e)(a)-(d)任意的组合，所述基因组位点编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

10.权利要求6的方法，其中所述调控元件是一个异源启动子。