CN111662905B - 小麦产量杂种优势相关调控基因TalncRNA1809及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物领域，具体涉及小麦产量杂种优势相关基因TalncRNA1809和应用。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对改良提高产量、加速高产分子育种进程具有十分重要的理论和实际意义。

Description

小麦产量杂种优势相关调控基因TalncRNA1809及其应用

技术领域

本发明属于农业生物领域，具体涉及小麦产量杂种优势相关基因TalncRNA1809及其编码基因和应用。

背景技术

长链非编码RNA(Long noncoding RNAs，lncRNA)是一种非编码RNA，长度通常大于200个核苷酸，含有1个少于100个氨基酸开放阅读框(Open reading frame，ORF)且不具有蛋白质编码功能。长链非编码RNA是参与生物体中许多生长发育过程和胁迫响应关键调控元件。在拼接、聚腺苷酸化和保守序列等方面，它们与mRNA有相似之处。由RNA聚合酶II进化而来的两种植物特异性RNA聚合酶(RNA Pol IV和Pol V)触发lncRNA转录。上述聚合酶是通过基因沉默机制和表观遗传调控来调控基因表达的。lncRNA可以是聚腺苷酸化或非聚腺苷酸化的，与聚腺苷酸化的lncRNA相比，非聚腺苷酸化的lncRNA通常较短，且表达较低。lncRNA可以从基因组的任何位置转录。根据lncRNA与相近蛋白编码基因在基因组中的相对位置和方向，可以将lncRNA分为五类：正义长链非编码RNA；来源内含子的反义转录RNA；基因间的非编码RNA；基因内的非编码RNA；双向非编码RNA。

迄今为止，lncRNA在植物中的功能不只在拟南芥、水稻等模式植物中被发现，在玉米、小麦、谷子、棉花、白菜、黄瓜等植物中也均有报道。与蛋白编码基因相比较，lncRNA在植物中具有组织表达特异性，参与不同的生物学代谢途径，并通过多种机制行使功能，包括激活、聚集或转运蛋白产生表观遗传沉默和抑制，核小体定位修饰启动子活性和调控DNA和组蛋白进行甲基化产生表观遗传学修饰。

lncRNA主要的生物学功能有：参与多种重要调控过程，如X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等；以多种模式保护蛋白编码基因。许多lncRNA仅在特定的发育阶段出现或具有组织或细胞特异性，还有很多lncRNA具有保守的二级结构及剪切形式。植物lncRNA在基因表达调控、花粉发育、侧根发育、雄性不育、抗病性、非生物胁迫反应等方面发挥重要的生物学功能。

lncRNA主要从表观遗传学、转录调控及转录后调控三个层面实现对基因表达的调控。在表观遗传学中，lncRNA可通过招募特异的修饰复合体到相应位点发挥作用，使DNA甲基化状态发生改变，也可直接与DNA甲基转移酶作用，调控相应基因的表达。lncRNA本身也受到甲基化修饰的影响，lncRNA甲基化的改变会引起不同的表达模式，从而影响靶基因的表达。另外，lncRNA可促使组蛋白发生不同类型的修饰而影响靶基因的表达。在转录水平，lncRNA主要影响mRNA的生成，部分lncRNA位于编码基因上游启动子区，作为顺式作用元件干扰下游基因的转录，从而影响mRNA的生成。在转录后水平，lncRNA可影响pre-mRNA的剪接、核内运输及mRNA降解，还可通过与pre-mRNA形成双链复合物等形式调控基因的表达。

lncRNA在植物生长发育中发挥调控作用。拟南芥中发现FLOWERING LOCUS C(FLC)参与春化作用诱导开花；两个拟南芥核斑RNA结合蛋白(Arabidopsis nuclear speckleRNA-binding proteins，At NSRs)参与侧根发育调控。通过RNA干扰(RNAi)技术抑制lncRNA-COLDAIR的表达后，发现拟南芥植株开花时间延迟，表明lncRNA在花发育过程中对相关基因的转录和沉默起调控作用。DRIR是拟南芥干旱和盐胁迫响应的正向调节lncRNA，其可能通过调节一系列参与应激反应的基因表达来参与调控植物对非生物胁迫的反应。TPSI1(tomato phosphate starvation induced 1)基因家族是研究地较为清楚的胁迫响应lncRNA，在番茄中最早发现，在磷胁迫下TPSI1家族成员诱导表达，在拟南芥和水稻中也检测到其同源基因。玉米中花粉特异性表达的lncRNA(Zm401)能调节玉米花粉发育有关的3个关键基因的表达，最终造成雄性不育。LDMAR为与水稻光敏性雄性不育相关的lncRNA。白菜花粉发育和授粉受精过程中存在两个lncRNA(bra-eTM160-1和bra-eTM160-2)可以作为功能性eTM调控白菜miRNA160的活性，进一步影响其靶基因ARF家族成员的表达而参与花粉发育。蓖麻lncRNA与其邻近蛋白编码基因表现为强烈的共表达，暗示了lncRNA在调控胚和胚乳的发育中具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供小麦产量杂种优势相关基因TalncRNA1809及其编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述小麦产量杂种优势相关基因TalncRNA1809及其编码基因的应用。

本发明的再一目的在于提供提高植物产量的方法。

根据本发明具体实施方式的小麦产量杂种优势相关基因TalncRNA1809码基因

具有如SEQ ID NO.1所示cDNA序列：

CCATCGATGCCCAGGGCAGCGAGCTGGCTAGGTAGAGTCGAGACCGAGAGAAATGGAACA

TGGCATCATCTTTGTGATGCTCCTGGCCATGGCGGCCACCGTCGGAGCGCGGTCAGGAGC

CACGGCGCAGCCATCCTGCATCCCCACTGCAGATGGCGCCCCTCGCATGCACGCCGGAGC

AGTGCCCCCGTCGGTCGCCGCCAACTCGTCCCCGGCGCTTCATCGTCTGCATCGTCCTGC

CAGAGGACTGCCAACGCACCCAGCTCCGGCGGATCATGAACCGCGGTCACTCGCCCGGCC

GCTTCCTCGTCTGCCTCGTCCGGCCAGAGGACTACCGACAACACCAACTCCCGTGGATCA

TGAGCCGTGGTCACCACCGCCGCCCGCCATGCAAGGGTGATTAGTTTATGAAAGTGCAGC

CGTGCCTGTTTCTCAGTACGTTGCTGTTGATCACCTGGCAAAAAGAAAAGACCCAGTGTC

GTCGCTTTAATATTCTGTATCCTGTAGTGTAGTTCAGTCTAGTTCCAGTTTTTGTCAGCG

TGCAAGTTCTAGTCTACATTTTTTGCTTAAACATCACTGTAATAAGTTCTTTAGGCCTTA

CATCTAAATTCGCGTCTTCTCTTGGAATCTTTTTTCTTTGAACACCTCTTTGAATCTTT

本发明还提供含有上述TalncRNA1809基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌株。

根据本发明具体实施方式的植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用TalncRNA1809构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因。

根据本发明具体实施方式的提高植物产量的方法，包括在植物中过表达植物产量杂种优势相关基因TalncRNA1809的步骤。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体将TalncRNA1809基因导入植物细胞，可获得对产量优势增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明的有益效果：

本发明以产量杂种优势性较强的国审杂交小麦新品京麦179种为实验材料，得到了产量杂种优势相关的TalncRNA1809及其编码基因，并将其导入小麦，显著提高了植物的产量杂种优势。本发明的产量杂种优势相关lnRNA对改良增强小麦产量杂种优势，提高产量、加速高产分子育种进程具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1显示小麦产量杂种优势相关TalncRNA1809基因的cDNA克隆结果，其中，M：Trans2K Plus DNAmarker；1为TalncRNA1809基因的cDNA扩增产物；

图2显示TalncRNA1809基因在不同强、中、弱杂交组合中的表达模式分析结果，P1为不同不育系材料；P2为不同恢复系材料；F1为不同杂交种材料。

图3显示TalncRNA1809亚细胞定位分析，其中，35S::GFP为空载体，35S:TalncRNA1809-GFP为融合载体，Bright为明场通道，GFP为绿色荧光蛋白通道，Merged为GFP和Bright两个通道的叠加，(标尺长度＝10μm)；

图4显示TalncRNA1809转基因小麦分子检测及及产量分析，其中，M：Trans2KPlusDNAmarker；1为阳性对照；2-7为TalncRNA1809基因不同转基因株系；WT为野生型小麦Fieldier；Ubi::TalncRNA1809为过表达转基因小麦株系。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1 小麦产量杂种优势相关TalncRNA1809基因的cDNA克隆。

对生长15天左右的京麦179小麦幼苗用Trizol提取小麦总RNA。应用5’RACE试剂盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)，设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，获得TalncRNA1809基因的全长序列659bp。

引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-CCATCGATGCCCAGGGCAG-3’，

P2：5’-AAAGATTCAAAGAGGTGTTCAAAGA-3’。

对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，得到分子量约为700kb左右的条带，与预期结果相符。

用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-TEasy(Promega)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。

以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TalncRNA1809基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.1。将含序列SEQID No.1所示TalncRNA1809基因的重组载体命名为pTE-TalncRNA1809。

将TalncRNA1809基因的序列进行比对，在小麦中未发现同源基因，证明TalncRNA1809基因是一个新的基因。

进一步用引物P1和P2在小麦基因组中进行扩增，结果显示该基因的基因组序列大小与cDNA长度大小一致，不含有内含子序列。

实施例2 TalncRNA1809基因荧光定量差异表达分析

利用灌浆期的BS366不育系、恢复系14GF6613、14GF7029、14GF7789、14GF6245等及杂交种灌浆期籽粒取样，对TalncRNA1809基因在不同品系材料中的表达特性进行分析，研究其是否与产量之间存在关系，通过成熟期结实率统计分析筛选出了不同强、中、弱产量杂种优势类型材料进行荧光定量PCR分析。

如图2所示，荧光定量结果显示，该lnRNA在BS366不育系、恢复系14GF6613、14GF7029、14GF7789、14GF6245及杂交种中表达量差异显著，表现为超亲表达模式，结合产量考种数据发现这4个杂交组合为强优势杂交组合，产量水平显著高于其他杂交种。因此，TalncRNA1809基因在14GF6613等强优势组合产量杂种优势中发挥着重要调控作用。

实施例3 TalncRNA1809亚细胞定位分析

构建TalncRNA1809基因的GFP融合表达载体，并通过PEG渗透法转化小麦原生质体。通过激光共聚焦显微镜下观察GFP激发光、明场和叠加视野下TalncRNA1809在小麦原生质体细胞中的定位情况，验证TalncRNA1809亚细胞定位。

如图3所示，对照GFP在小麦原生质体中大量表达，绿色荧光信号在细胞质和细胞核中均有分布；与GFP对照相比，TalncRNA1809融合蛋白绿色荧光信号主要定位于细胞核和细胞膜上，证实TalncRNA1809作为非编码RNA主要在细胞核和细胞膜上发挥着重要转录调控作用。

实施例4 TalncRNA1809基因提高小麦的产量杂种优势

1)Ubi-TalncRNA1809重组表达载体的构建

以小麦的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和SpeI双酶切PCR产物回收，将酶切产物正向插入载体pBI221的玉米泛素启动子(Ubiquitin)之后SmaI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体pUbi::TalncRNA1809。

引物序列如下：

TalncRNA1809[SmaI]5’-TCCCCCGGGG CCATCGATGCCCAGGGCAG-3’，

TalncRNA1809[SpeI]5’-GGACTAGTAAAGATTCAAAGAGGTGTTCAAAGA-3’。

2)转基因小麦的获得

将上述构建的重组表达载体pUbi::TalncRNA1809分别用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，再用pUbi::TalncRNA1809的根癌农杆菌EHA105转化小麦，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行筛选，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。

P3(上游引物):5’-ATCCTGCATCCCCACTGCAGATGG-3’，

P4(下游引物):5’-CTGGAACTAG ACTGAACTAC ACT-3’。

对Ubi::TalncRNA1809转基因小麦进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得500bp左右条带，结果获得转Ubi::TalncRNA1809小麦10株，结果如图4中A所示。

同时将pBI221空载体导入小麦，方法同上，作为对照，获得5个株系的转空载体小麦(筛选获得的转基因小麦用T₂代表示)。

3)TalncRNA1809转基因小麦产量表型鉴定

将pUbi::TalncRNA1809重组表达载体转化农杆菌EHA105，再用含pUbi::TalncRNA1809的农杆菌EHA105转化小麦材料Fieldier，通过PCR分子检测得到阳性转基因植株，并进一步对T2代成熟期转基因小麦和对照产量统计分析，结果如表1、图4中B所示。

表1 TalncRNA1809转基因株系产量比较分析

发现过表达TalncRNA1809转基因小麦株系产量比对照Fieldier显著提高，增产幅度达到9.16-10.64％，转基因株系穗粒数均比对照Fieldier有所增加，粒重没有太大变化，从而证明了过表达TalncRNA1809基因能够提高转基因小麦的产量水平，在小麦穗粒数方面发挥着重要的调控作用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 小麦产量杂种优势相关调控基因TalncRNA1809及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 659

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivuml.)

<400> 1

ccatcgatgc ccagggcagc gagctggcta ggtagagtcg agaccgagag aaatggaaca 60

tggcatcatc tttgtgatgc tcctggccat ggcggccacc gtcggagcgc ggtcaggagc 120

cacggcgcag ccatcctgca tccccactgc agatggcgcc cctcgcatgc acgccggagc 180

agtgcccccg tcggtcgccg ccaactcgtc cccggcgctt catcgtctgc atcgtcctgc 240

cagaggactg ccaacgcacc cagctccggc ggatcatgaa ccgcggtcac tcgcccggcc 300

gcttcctcgt ctgcctcgtc cggccagagg actaccgaca acaccaactc ccgtggatca 360

tgagccgtgg tcaccaccgc cgcccgccat gcaagggtga ttagtttatg aaagtgcagc 420

cgtgcctgtt tctcagtacg ttgctgttga tcacctggca aaaagaaaag acccagtgtc 480

gtcgctttaa tattctgtat cctgtagtgt agttcagtct agttccagtt tttgtcagcg 540

tgcaagttct agtctacatt ttttgcttaa acatcactgt aataagttct ttaggcctta 600

catctaaatt cgcgtcttct cttggaatct tttttctttg aacacctctt tgaatcttt 659

Claims (5)

1.一种植物产量杂种优势相关基因TalncRNA1809，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.包含权利要求1所述的植物产量杂种优势相关基因TalncRNA1809的重组表达载体。

3.包含权利要求1所述的植物产量杂种优势相关基因TalncRNA1809的重组菌株。

4.权利要求1所述的植物产量杂种优势相关基因TalncRNA1809用于提高小麦产量的应用。

5.一种提高小麦产量的方法，其特征在于，所述方法包括在小麦中过表达权利要求1所述的植物产量杂种优势相关基因TalncRNA1809的步骤。

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