CN101899103A

CN101899103A - 一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaNAC及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN101899103A
Application number: CN 201010238553
Authority: CN
Inventors: 唐益苗; 赵昌平; 高世庆; 冶晓芳; 刘美英; 张朝
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2010-07-23
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2010-12-01

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaNAC及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强烟草抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

Description

一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaNAC及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaNAC及其编码基因和应用。

背景技术

干旱、盐碱等逆境胁迫是限制植物生长发育和作物产量的主要非生物胁迫因素。据统计，世界干旱、半干旱地区占全球陆地面积的三分之一，我国干旱、半干旱地区占全国陆地面积的二分之一；还有3.6×107hm²的盐碱地有待开垦利用。小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境我国对小麦造成的减产达700-800亿公斤，严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食生产的快速发展。因此，改良农作物的抗逆性，选育耐旱、农作物新品，已经成为作物品种改良的重要课题。

近年来，随着植物抗逆分子生物学研究的深入，初步揭示了植物对逆境胁迫信号应答、信号传导及基因表达调控等分子机理，为利用基因工程技术改良作物的抗逆性提供了科学依据。目前，通过基因工程技术已将许多抗旱、耐盐、耐低温相关的基因导入到植物中，提高植物的抗逆性已有相关研究报道。

植物转录因子的研究是功能基因组学研究的一个重要内容。近年来，相继从高等植物中分离出一系列调控干旱、高盐、低温、激素、病原反应及发育相关的转录因子。其中NAC转录因子是近年来发现的具有多种生物功能的植物特异转录因子，因此受到广泛的重视。

NAC受多种生物胁迫和非生物胁迫的诱导表达。目前，已经从多种植物中分离鉴定得到与抗逆相关的NAC转录因子。第一个NAC转录因子由Souer et al.在1996年从矮牵牛中克隆得到，随后在拟南芥、水稻、大豆、玉米、油菜、棉花、甘蔗等物种中相继发现，目前在拟南芥和水稻中分别存在106个和149个NAC成员。Aidaet al.在1997年首先报道了NAC结构域，发现矮牵牛NAM基因和拟南芥ATAF1/2和CUC2基因编码蛋白的N端均包含一段保守的氨基酸序列，取其首字母命名为NAC，NAC结构域的典型结构分为A，B，C，D，E五个亚结构域。研究表明，NAC转录因子在顶端分省组织和花器官发育、植物侧根发育、叶片凋亡、作物品质、次生壁形成和木质部形成等生长调节过程，特别是抵御多种生物和非生物胁迫方面发挥重要作用。

目前，已经从多种植物中分离鉴定得到与抗逆相关的NAC转录因子。Tran et al.在2004年采用酵母单杂技术从拟南芥中分离到3个NAC基因ANACO19，ANAC055，ANAC072，它们的表达受干旱、高盐和ABA的诱导，过量表达三个基因中的任何一个都可以增强植株的耐旱能力。水稻抗旱耐盐基因SNAC1，其主要在气孔的保卫细胞中被诱导表达，当植株受到干旱胁迫时，基因的表达促进气孔关闭，但是不影响光合速率，因而抗旱性大为提高。在生殖生长期遭遇严重干旱的情况下，过量表达SNAC1的转基因植株结实率较对照提高22-34％；ATAF1是最早发现的NAC转录因子之一，Lu et al.在2007年证实了ATAF1为干旱诱导型基因，它的表达受干旱胁迫和ABA处理的诱导，而在水处理下受到抑制，ATAF1基因作为负调控转录因子，通过下调抗逆相关基因的表达在胁迫反应中起作用。水稻OsNAC6的表达不但受到干旱，低温，高盐等非生物胁迫的诱导，还受机械损伤和稻瘟病的产诱导，过量表达该基因的水稻提高了对干旱，高盐及稻瘟病的耐受力，但是表现出生长阻滞和低产。Delessert et al.在2005年发现拟南芥转录因子ATAF2在叶片损伤部位高表达，并对损伤植物中的激素甲基茉莉酮酸和水杨酸诱导作出响应，超量表达ATAF2的转基因植株对土生镰刀霉菌敏感性增强，说明ATAF2作为病原相关蛋白的负调控子在防御反应中起作用。Selth et al.在2005年证实在复制增强子的作用下，番茄缩叶病毒诱导基因SINAC1在染毒细胞中特异表达，过量表达SINAC1导致TLCV病毒DNA大量积累，说明SINAC1在复制增强子增强的TLCV复制中起重要作用。

综上所述，NAC类转录因子在调节植物的逆境反应，提高植物的抗逆性中起着至关重要的作用。过量表达NAC转录因子基因提高了植物的抗逆能力，转基因植株发育不产生任何负面作用，这对抗逆育种和农业生产会产生巨大推动作用和经济效益。因此，利用抗逆相关的NAC类转录因子基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要理论和实践意义。利用抗旱小麦种质资源，挖掘、筛选出优良的抗旱、耐盐相关基因改良小麦的抗逆性，为培育小麦等粮食作物抗旱、耐盐新品种提供重要的抗逆基因资源，对盐渍化土地的治理与改良等方面均具有重要实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗旱、耐盐相关蛋白TaNAC。

本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱、耐盐相关蛋白TaNAC的编码基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的提供上述植物抗旱、耐盐相关蛋白TaNAC及其基因的应用。

本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白TaNAC，来源于小麦京冬17(Triticumaestivum L.)，为北京杂交小麦工程技术研究中心培育的冬小麦抗旱品种，具有强抗旱、耐寒性，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MEGLDVFQRY RLNPTDVDAV TYYLPRLIAG QLHGAEKFIH HVDIYSCEPK

DLAAKIAPVP 60

QAASSGDRFF TTRKSKNGSK TQSVRTAGGG TWTVNATTTV RHAGVEVGER

KNLSFRKKGK 120

STGWVMEEYK CLLPGAVVSD GVKVFCKIHL AQHPPDAARQ ESAAYKLQEP

QWEHAQKQPV 180

PRPEHGQKRP ASAAAADPHL PHPNKRMRGA IPVPAPATPS VLTHDEAARA

MYAPLACTNY 240

HVQDAQVPAV AVPAAIEGAS ASCESTTSNH SDVASSSHNK QGQAQAPAIS

SQSDVLESVK 300

HYSQQQMIVP EAGLSIARST SEEDVFEQLE PISNELDGEA DGFDIEELMR

MMEDDPIEIE 360

PVTGANTGVE TGQQEPLYLD TLDQGMLDEM LQSYCPYPMW RPEDQAMHNP

AFHDADKEKR 420

YDAASDLDAP SLQGQDHLFK PRLCFSDPFE AALMAEEALE KEKRDNLHAG

PLGEHNNFFS 480

SASVH 485

其中，

YRLNPTDVDAVTYYLPRLIAGQLHGAEKFIHHVDIYSCEPKDLAAKIAPVPQAASSGDRFFTTRKSKNGSKTQSVRTAGGGTWTVNATTTVRHAGVEVGERKNLSFRKKGKSTGWVMEEYKCL为NAC的保守域。

根据本发明的TaNAC基因编码上述蛋白，可具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，TaNAC开放阅读框(ORF)长度为1445bp。

SEQ ID NO.2：

atggaagggc tcgacgtctt ccagcgctac cgcttgaacc ctacagacgt ggacgccgtg 60

acttactacc tgccacgcct catcgccggc cagctgcatg gcgccgagaa attcatccac 120

cacgtcgaca tctacagctg cgagcccaag gatctcgccg ccaagattgc gcccgtgccg 180

caggccgcca gcagcggcga ccgcttcttc accacgcgca agagcaagaa cggaagcaaa 240

acccagagcg tgcgcaccgc cggcggcggc acctggaccg tcaatgctac cacgaccgtc 300

agacacgcgg gagtcgaggt tggcgagagg aagaacctgt cgttcaggaa gaagggcaag 360

tcgaccggct gggtcatgga ggagtacaaa tgcttgctgc caggggccgt cgtctctgac 420

ggggtgaagg tgttctgcaa gatccacttg gctcagcatc ctcctgacgc ggcccgccaa 480

gaatcggccg cgtacaagct tcaagaaccg caatgggagc acgcacagaa gcagccagtg 540

ccgcgaccag agcacggaca gaagaggcca gcgtcggctg ccgccgccga tcctcatctg 600

ccgcacccca acaagaggat gcgaggagca atccccgtcc cggcacctgc cacaccgtcg 660

gtcttgacgc atgatgaggc agccagagca atgtatgccc cgctggcttg taccaactac 720

catgttcagg atgcacaagt acctgctgtg gctgtaccag cggcaatcga aggtgcttca 780

gcatcatgcg agtccactac atccaaccac tccgacgttg cttcttcctc acataataag 840

cagggacaag ctcaagctcc tgcgatttcc tcccagtcag atgtgctgga gtctgtcaag 900

cattacagcc aacaacagat gattgttcct gaggctggct taagcattgc aaggagcaca 960

tctgaagagg atgtctttga gcaattggag cctatttcca acgagcttga tggggaggca 1020

gatggttttg atatcgaaga actaatgaga atgatggaag acgacccaat tgaaattgag 1080

ccggtcactg gagccaacac tggcgtggag acgggccaac aggaacctct gtacctggat 1140

accttggacc aaggcatgct ggatgaaatg ctgcagtcct attgccctta cccaatgtgg 1200

agaccagagg atcaggccat gcacaaccct gccttccatg atgctgacaa ggagaagagg 1260

tacgatgccg cgtcggatct tgacgctcca tcgcttcagg gacaggacca cttgttcaaa 1320

ccgcggctgt gcttctccga tccatttgaa gcagcgttga tggccgaaga ggcgctcgag 1380

aaggagaaga gggacaatct tcatgctgga ccgctaggag aacacaacaa cttcttctcg 1440

tctgcaagtg tccattaa 1458

本发明从小麦中克隆到一个基因TaNAC，该基因编码的蛋白序列结构非常特殊，其N端为保守性差的NAC结构域，C端序列与DREB家族转录因子相似性很高。TaNAC与水稻(ABA97598.1)已知的NAC转录因子一致性最高仅为32％，证明TaNAC是一种新的NAC转录因子。

具体说来，TaNAC与胁迫相关NAC转录因子的同源性低，但是其C端序列与DREB家族转录因子具有高度相似性，而DREB家族基因主要功能就是参与逆境胁迫应答，从结构和进化关系看来，TaNAC所具有的抵御干旱胁迫的功能可能不是由NAC家族的共有结构特征决定的。

另外，干旱和高盐胁迫处理表达实验表明TaNAC基因受干旱诱导强烈表达，对高盐处理敏感。同时，构建该基因的过量表达载体并通过农杆菌介导的叶盘转化法将TaNAC转入烟草，PEG胁迫处理实验表明转TaNAC基因烟草具有抗旱性，证明了TaNAC基因在烟草中成功表达，且提高了烟草的抗旱能力，可以作为烟草抗旱育种的优质候选基因。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗旱、耐盐植物的方法。

本发明所提供的培育抗旱耐盐植物的方法，是将上述任一种含有TaNAC基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。

所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对干旱或盐胁迫的耐逆性。

本发明以抗旱、耐盐性较强小麦京冬17(Triticum aestivumL.)为实验材料，得到了抗逆相关的NAC转录因子TaNAC蛋白及其编码基因，并将TaNAC基因导入烟草，显著提高了植物的抗旱、耐盐性。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强植物抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

附图说明

图1TaNAC基因在干旱、盐胁迫处理下的表达特征，A.为TaNAC基因在干旱胁迫处理下的表达特征；B为TaNAC基因在盐胁迫处理下的表达特征。

图2转TaNAC基因烟草耐旱性鉴定，A为转TaNAC基因烟草在2％PEG的MS培养基上培养两周的生长情况；B为转TaNAC基因烟草在2％PEG的MS培养基上培养一个月的生长情况。

图3A、图3B分别为TaNAC转基因烟草耐盐性鉴定，左边是对照，右边为pBI35S-TaNAC转基因烟草在含有200mM NaCl培养基上的生长情况；

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1、TaNAC基因的克隆及序列基序分析

1、将25℃光照培养2周左右的小麦京冬17植株进行干旱、高盐(200mM NaCl)胁迫处理，分别在0h、1h、2h、5h、10h、24h后取样，迅速置于液氮冷冻，-80℃保存备用。根据RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)完成植物叶片组织的总RNA提取，之后以提取的总RNA为模板，以AP序列为引物，用反转录酶(M-MLV)进行反转录，得到用于后续实验的cDNA模板。

通过水稻的NAC序列，利用tBLSATN，搜索小麦EST库，通过分析比较，获得该基因全长cDNA序列，通过danman设计一对引物：TaNAC-F1：5′-AGG ACC ACT

TGT TCAAAC CG-3′；TaNAC-R1：5′-CCA GCATGAAGATTG TCC CT-3′。

本发明得到一个NAC转录因子家族的基因TaNAC，TaNAC开放阅读框(ORF)长度1445bp，编码485个氨基酸，在NCBI上比对分析，推定的蛋白序列N端含有NAM保守域，与其他NAC转录因子(水稻(ABA97598.1))的最高一致性最高仅在32％，证明TaNAC为一种新的NAC转录因子。

2、序列基序分析

使用DNAMAN软件将测序成功的核苷酸序列翻译为蛋白序列，将该序列同几个NAC家族的序列提交到The MEME suite tool(http://meme.nbcr.net/meme4_4_0/cgi-bin/meme.cgi)，主要分析其N端序列，将TaNAC同DREB家族的几个序列(NCBI BLAST搜集)同样提交到该网站，主要分析其C端序列。提交蛋白序列在GeneBank登录号如下：Wheat TaNAC2(AY625683)，TaNAC4(HM027572)，TaNAC6(HM027573)，TaDREB4B(AAX13283)，TaDREB4A(AAX13282)；rice SNAC 1(DQ394702)，OsNAC4(AB028183)，ONAC300(AB 182278)；Leymus chinensis unnamed(ACH73204)；Aegilops columnaris DRF1(ACX94335)。

对TaNAC推定蛋白序列进行基序分析发现，TaNAC与NAC家族的其他转录因子相比，保守域序列的保守性较差，其亚结构域并非典型的A，B，C，D，E五个亚结构域，而只包含A，B，D三个亚结构域。在NCBI中BLAST比对显示，TaNAC与DREB家族的某些基因一致性较高，对TaNAC与部分DREB家族的蛋白序列基序分析表明，这些序列的C端至少共享4种以上基序。

实施例2、TaNAC基因在干旱、高盐逆境胁迫处理下的基因表达特征

将25℃光照培养2周左右的小麦京冬17植株进行干旱、高盐(200mM NaCl)胁迫处理，分别在0h、1h、2h、5h、10h、24h后取样，迅速置于液氮冷冻，-80℃保存备用。根据RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)完成植物叶片组织的总RNA提取。

选用小麦肌动蛋白(GeneBank登录号AB181991)作为本实验的内参基因，内参基因扩增引物actin-F：5′-CGG CTA CCA CAT CCAAGG AA-3′；actin-R：5′-GCTGGA ATT ACC GCG GCT-3′。从目的基因的非保守序列部分设计引物，控制扩增片段长度尽量接近内参基因长度，目的基因扩增引物序列，TaNAC-F1：5′-AGG ACCACTTGTTCAAAC CG-3′；TaNAC-R1：5′-CCAGCATGAAGATTGTCC CT-3′。进行实时定量RT-PCR，完成后利用Livak and Schmittgen(2001)报道的方法，计算相对表达量。

ΔΔCT＝(CT.Target-CT.Actin)Timex-(CT.Target-CT.Actin)Time0

其中，Time x表示任意时间点，Time 0表示经肌动蛋白校正后1倍量的目标基因表达。

实验结果表明TaNAC基因受干旱诱导强烈表达(如图1A所示)；TaNAC受NaCl诱导表达，在处理1小时后转录水平表达积累至峰值，而后慢慢恢复至原始水平(如图1B所示)。

实施例3、转TaNAC基因烟草耐旱、抗盐性鉴定

将TaNAC基因连接到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游，构建过量表达载体，并通过根癌农杆菌C58C1介导的烟草叶盘转化法转化到烟草W38株系中。待PCR检测为阳性的转基因烟草植株生长到一定高度后移栽至花盆，24℃，16小时光照培养，5个月左右收获种子，之后进行模拟干旱、耐盐胁迫处理，经消毒处理的种子播种到含2％PEG和200mM NaCl的MS培养基中，观察转基因苗和野生型对照的生长情况。

抗旱实验结果种子萌发后两周的生长情况如图2A，平板左半边是转基因株系，右半边为野生型对照，转基因烟草在培养基上生长良好，而野生型对照发芽率及植株高度均受到PEG抑制。图2B为种子萌发后一个月生长状况，平板的左半边是野生型对照，右半边是转基因苗，受PEG影响，两者叶片均出现一定程度的卷曲，转基因苗较对照苗植株高度更高，且根的长度更长。以上实验结果均说明过量表达TaNAC的转基因烟草提高了植株的抗旱功能。

耐盐实验结果幼苗两周的生长情况如图3A，转基因烟草转入含有200mM NaCl的培养基中进行盐胁迫理25天。结果显示：pBI35S-TaNAC转基因植株在盐胁迫条件下生长基本正常，能够生根，略有发黄。然而，左边对照(W38)不能生根，叶片黄化程度比转基因植株严重。说明转基因植株比对照耐盐能力强。

Claims

1.植物抗旱、耐盐相关蛋白TaNAC，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.植物抗旱、耐盐相关基因TaNAC，其特征在于，编码权利要求1所述的蛋白。

3.如权利要求2所述的植物抗旱、耐盐相关基因TaNAC，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2。

4.包含权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因TaNAC的重组载体

5.权利要求1所述植物抗旱、耐盐相关蛋白TaNAC的应用。

6.权利要求2所述植物抗旱、耐盐相关基因TaNAC的应用。

7.一种培育抗旱、耐盐植物的方法，所述方法包括将含有权利要求2所述TaNAC基因的重组表达载体导入植物细胞中、得到抗旱植物的步骤。