CN108285899A - 一种半乳糖基转移酶及其编码基因和应用 - Google Patents

一种半乳糖基转移酶及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种半乳糖基转移酶及其编码基因和应用。本发明从铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)中克隆得到了半乳糖基转移酶基因DoGALT，全长2120bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；第125位到1849位碱基编码半乳糖基转移酶DoGALT，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明半乳糖基转移酶基因DoGALT为糖基转移酶家族成员，在含半乳糖基的多糖合成过程中起重要作用。通过基因工程技术过表达DoGALT基因，能够促进半乳糖和多糖的合成，并提高植物对盐和干旱的抗性，在培育高糖、耐盐、耐旱植物方面具有良好的应用前景。

Description

一种半乳糖基转移酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明属基因工程技术领域，更具体地说，本发明涉及一种半乳糖基转移酶及其编码基因和应用。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是《神农本草经》、《中华人民共和国药典》中收录的名贵中药材之一，以茎入药，茎中富含具有生物活性的多糖。《中华人民共和国药典(2015年版)》规定铁皮石斛多糖含量不得少于25.0％，通常作为铁皮石斛质量的评价依据。近代药理研究表明，铁皮石斛多糖具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫等功效。因此也是最具有开发潜力的中药材之一，受到国内外学者的高度重视。
植物化学分析表明，铁皮石斛多糖主要为水溶性多糖，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖等单糖组成(Ng T B,Liu J,Wong J H,et al.Review of research onDendrobium,a prized folk medicine.Applied Microbiology and Biotechnology,2012,93:1795-1803)。目前，铁皮石斛多糖被鉴定为甘露聚糖(Hua Y F,Zhang M,Fu C X,et al.Structural characterization of a2-O-acetylglueomannan from Dendrobiumofficinale stem.Carbohydrate Research,2004,339:2219-2224；Xing X H,Cui S W,NieS P,et al.Study on Dendrobium officinale,O-acetyl-glucomannanPartI Extraction,purification,and partial structural characterization.BioactiveCarbohydrates and Dietary Fibre,2014,4:74-83)，与此同时，多名学者研究发现，其支链上存在半乳糖(Meng L Z,Lv G P,Hu D J,et al.Effects of polysaccharides fromdifferent species of Dendrobium on macrophage function.Molecules,2013,18:5779-5791；Zhang J Y,Guo Y,Si J P,et al.A polysaccharide of Dendrobiumofficinale ameliorates H2O2-induced apoptosis in H9c2cardiomyocytes via PI3K/AKT and MAPK pathways.International Journal of Biological Macromolecules,2017,104:1-10)。
目前，植物甘露聚糖的生物合成途径在拟南芥(Goubet F,Barton C J,MortimerJ C,et al.Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLAglycosyltransferases,and influences the progression of embryogenesis.ThePlant Journal,2009,60:527-538)、葫芦巴(Wang Y,Mortimer J C,Davis J,etal.Identification of an additional protein involved in mannanbiosynthesis.The Plant Journal,2013,73:105-117)、瓜尔豆(Dhugga K S,Barreiro R,Whitten B,et al.Guar seed beta-mannan synthase is a member of the cellulosesynthase super gene family.Science,2004,303:363-366)等高等植物中均有报道，为铁皮石斛甘露聚糖生物合成的调控研究提供了参考。此外，已报道的甘露聚糖大多数存在细胞壁中，而且是不可溶的，少数可溶的却没有生物活性。铁皮石斛甘露聚糖兼具水溶性和生物活性，研究铁皮石斛甘露聚糖的生物合成具有很重要的学术价值。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种可用于提高植物半乳糖、多糖含量和提高植物耐盐和抗旱的半乳糖基转移酶及其编码基因。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种半乳糖基转移酶基因DoGALT，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种半乳糖基转移酶DoGALT，其是通过上述半乳糖基转移酶基因DoGALT的第125位到1849位碱基编码得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种含有所述的半乳糖基转移酶基因DoGALT的表达载体。
本发明上述载体为一种可用于农杆菌转化植物的双元载体，其构建方法是通过Nco I酶切后连接到植物表达载体pCAMBIA1302上，命名为pCABIA1302-DoGALT。
本发明半乳糖基转移酶基因DoGALT可用于提高植物多糖、半乳糖含量和抗逆境胁迫。例如，用于培育高糖、耐盐和抗旱植物品种。
具体方式可以是：将半乳糖基转移酶基因DoGALT导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使半乳糖基转移酶基因DoGALT在植物中表达，得到高糖、耐盐和抗旱的植物。
优选的，所述的半乳糖基转移酶基因DoGALT是通过pCAMBIA1302植物表达载体导入植物细胞、组织或器官的。
优选的，所述的植物为模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明克隆得到的属于铁皮石斛糖基转移酶家族的半乳糖基转移酶基因DoGALT，其参与半乳糖、多糖的合成以及高盐、干旱胁迫灯的逆境应答过程。通过转基因及功能鉴定证实超量表达DoGALT提高拟南芥中的半乳糖和多糖含量，同时DoGALT能提高拟南芥对高盐和干旱的抗性。铁皮石斛DoGALT在培育高糖、耐盐和耐旱植物尤其是铁皮石斛新品种方面具有非常重要的理论及应用价值。
附图说明
图1为铁皮石斛DoGALT基因片段的扩增。
图2为应用巢式PCR扩增铁皮石斛DoGALT基因的3′端。
图3为应用Touch-down PCR扩增铁皮石斛DoGALT基因的5′端。
图4为铁皮石斛DoGALT开放阅读框的扩增。
图5为铁皮石斛DoGALT在不同器官中的表达模式。不同器官包括营养生长阶段(根、茎、叶，种子萌发后10个月)和生殖生长阶段(根、茎、叶、花，组培苗移栽后14个月)。
图6为铁皮石斛DoGALT在不同生长时期的表达模式。不同生长时期包括组培苗移栽后6、11、14、17个月，即S1、S2、S3、S4。
图7为所用的植物双元表达载体pCABIA1302。NCBI登陆号为AF234298。
图8为铁皮石斛DoGALT超量表达载体构建的示意图。
图9为DoGALT转基因拟南芥株系的表型。野生型拟南芥(WT)，35S:DoGALT转基因株系line 1、line 2和line 3。
图10为DoGALT转基因拟南芥株系的半定量PCR检测。野生型拟南芥(WT)，35S:DoGALT转基因株系line 1、line 2和line 3。DoActin的NCBI登陆号为JX294908。
图11为DoGALT转基因拟南芥株系多糖的含量。野生型拟南芥(WT)，35S:DoGALT转基因株系line 1、line 2和line 3。AIR：(多糖提取的)醇不溶物。DW：干重，每组数据的bar表示±标准误差(n≥3)。统计分析为各处理与对照的比较，采用单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。
图12为DoGALT转基因拟南芥株系多糖中单糖的含量。AIR：(多糖提取的)醇不溶物。DW：干重，每组数据的bar表示±标准误差(n≥3)。统计分析为各处理与对照的比较，采用单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。
图13为盐胁迫和干旱胁迫处理下DoGALT转基因拟南芥的表型。将7d大小的拟南芥小苗移栽在1/2MS培养基中，生长5天后，统计根长和鲜重，其中盐胁迫、干旱胁迫处理分别为150mM的NaCl、200mM的Mannitol添加到1/2MS培养基中。
图14为盐胁迫和干旱胁迫对DoGALT转基因拟南芥株系根长的影响。每组数据的bar表示±标准误差(n≥3)。统计分析为各处理与对照的比较，采用单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。
图15为盐胁迫和干旱胁迫对DoGALT转基因拟南芥株系鲜重的影响。每组数据的bar表示±标准误差(n≥3)。统计分析为各处理与对照的比较，采用单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。
实施例中所用铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)栽种于中国科学院华南植物园铁皮石斛种植大棚(N23°10′，E113°21′；中国广州)；野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)源自哥伦比亚生态型(Columbia，col-0)；SMARTerTM RACE cDNAAmplification Kit购自Clontech公司(货号：634923)；HD Cloning Kit购自Takara公司(货号：639648)；pMD18-T Vector购自Takara公司(货号：D101A)；SYBR PremixEx TaqTM Kit购自Takara公司(货号：DRR420A)；TaKaRa LA购自Takara公司(货号：RR52A)；LB、MS培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。
实施例1铁皮石斛DoGALT基因的分离克隆
(1)铁皮石斛总RNA的提取及cDNA第一条链的合成
取刚采收的铁皮石斛茎条(Dendrobium officinale，栽种于中国科学院华南植物园铁皮石斛种植大棚，N23°10′，E113°21′，中国广州)0.1g，切割成1-2mm片段，在液氮下研磨成粉。采用柱式植物RNAout2.0试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司，货号：90404-50)提取铁皮石斛总RNA。采用NanoDropTM 2000c超微量分光光度计(Thermo Scientific公司，美国威斯康星州)和1.0％琼脂糖凝胶电泳仪(Biorad公司，美国加利福尼亚州)测定总RNA的含量和纯度。吸取2μg已纯化的总RNA，根据反转录酶M-MLV试剂盒(Promega公司，货号：M1701)的使用说明书，进行cDNA第一条链的合成，将反应产物稀释到所需浓度，-80℃冰箱保存。
(2)铁皮石斛DoGALT基因片段的扩增
根据课题组已发表的铁皮石斛转录组数据库(Zhang J,He C,Wu K,etal.Transcriptome analysis of Dendrobium officinale and its application to theidentification of genes associated with polysaccharide synthesis.Frontiers inPlant Science,2016,7:5.)，查找半乳甘露聚糖半乳糖基转移酶部分序列，通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库BLAST比对，找到铁皮石斛DoGALT保守片段。根据铁皮石斛DoGALT保守片段，运用PrimerPremier 5.0软件(Premier Biosoft公司,美国加利福尼亚州)设计相应引物F和R，利用TaKaRa LA (Takara公司，货号：RR52A)进行铁皮石斛DoGALT目的片段PCR的扩增。所使用扩增引物如SEQ ID NO:3～4所示。
PCR反应体系(20μl)：反转录模板1.0μl，10xBuffer 2.0μl，dNTP Mix(10mM)1.0μl，GALTF 1.0μl，GALTR 1.0μl，LA Taq酶0.5μl，ddH2O(高压灭菌)13.5μl。PCR反应程序：94℃变性3min，随后进行30个循环反应(94℃30s,55℃30s,72℃1min)，72℃延伸10min。PCR产物采用1.0％琼脂糖凝胶电泳仪(Biorad，美国加利福尼亚州)检测，并使用环保型琼脂糖凝胶回收试剂盒(广州东盛生物科技有限公司，货号：N1081)回收目的片段，16℃过夜连接到pMD18-T Vector(Takara公司，货号：D101A)，连接产物采用热激法转化至大肠杆菌DH 5α(Takara公司，货号：D9057)，涂布于含有100μg·ml-1氨苄抗生素(Ampicillin)的LB平板上，37℃过夜。挑取单菌落为模板，GALTF和GALTR为引物进行菌落PCR验证，送至北京六合华大基因科技有限公司进行菌液测序。获得铁皮石斛半乳甘露聚糖半乳糖基转移酶基因DoGALT的部分核心片段782bp(图1)。
(3)铁皮石斛DoGALT基因3'和5'序列的扩增
利用该782bp的核心片段，根据SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech公司，货号：634923&634924)，设计扩增3'端UTR序列的引物GalT3F和GalT3R，以及扩增5'端UTR序列的引物GALT5F和GALT5R，引物序列如SEQ ID NO:5～8所示。
3'端UTR序列PCR扩增方法：采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒，根据试剂盒所提供的反应体系，采用巢式PCR扩增，PCR反应程序为94℃变性3min,随后30个循环反应(94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)，72℃延伸10min。经过二轮PCR，再经切胶回收，转化大肠杆菌DH5α，送至北京六合华大基因科技有限公司进行菌液测序，获得DoGALT的3′端UTR为441bp(图2)。
5'端UTR序列PCR扩增方法：采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒，根据试剂盒所提供的反应体系，采用Touch-down PCR扩增，PCR反应程序为94℃变性3min，接着2个循环反应(98℃30s；65℃，30s；72℃，1min)，保持变性、延伸条件不变，每一轮退火温度降低1℃，即紧接着2个循环反应(98℃30s；64℃，30s；72℃，1min)，以此类推，最后20个循环反应(98℃30s；55℃，30s；72℃，1min)，72℃延伸10min。经过二轮PCR，再经切胶回收，转化大肠杆菌DH5α，送至北京六合华大基因科技有限公司进行菌液测序，获得DoGALT的5′端UTR为1009bp(图3)。
(4)铁皮石斛DoGALT基因全长的获得
根据已获得的3'端UTR序列，5'端UTR序列，以及DoGALT的核心片段进行拼接获得基因全长的cDNA序列(图4)，其序列如SEQ ID NO.1所示，该序列长度为2120bp。此序列的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)命名为DoGALT基因，利用NCBI的ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找得到，即SEQ ID NO.1的自5'端第125位至第1849位碱基，共1724bp，编码574个氨基酸，蛋白质分子量约为63.6kD，包含62个酸性氨基酸，59个碱性氨基酸，理论等电点为6.44，脂溶性系数为88.69。该蛋白包含α-螺旋28.22％，β-折叠26.13％，β-转角12.37％和无规则卷曲33.28％，N端、C端以α-螺旋为主。NCBI保守域分析，该蛋白包含半乳糖苷结合凝集素(Galactoside-binding lectin)，位于128-296位点，并且在340-535位点处存在半乳糖基转移酶(Galactosyltransferase)。DoGALT蛋白在126-299位点存在Galectin(半乳凝素)信号肽。PredictProtein在线预测表明该蛋白位于高尔基体膜上，且存在1个跨膜区域。进一步遗传进化分析显示，铁皮石斛DoGALT蛋白与水稻等单子叶植物聚类在同一阵营，且与海枣、油棕亲缘关系最近。
实施例2铁皮石斛DoGALT基因表达模式分析
采收铁皮石斛幼苗生长时期和开花时期的根、茎、叶、花，参照实施例1-(1)方法进行RNA提取及其逆转录反应。荧光定量PCR反应根据DoGALT基因的保守区域设计特异引物RTGALTF和RTGALTR，采用SYBR Premix Ex TaqTM Kit购自Takara公司(货号：DRR420A)进行PCR扩增。反应程序为95℃变性2min，随后进行40个循环反应(95℃15s，60℃1min)。内参基因为铁皮石斛的DoActin基因，NCBI登陆号为JX294908。反应在ABI 7500型实时荧光定量PCR(美国应用生物系统公司，美国加利福尼亚州)运行后得到数据，运用2-ΔΔCt方法计算，获得各个样品之间相对表达量的数据。所用引物RTGALTF、RTGALTR、DoActinF、DoActinR分别如SEQ ID NO:9～12所示。
从图5中可以看出，DoGALT基因在铁皮石斛各器官中均有表达，营养生长阶段，DoGALT表达水平较低，生殖生长阶段，表达水平较高。营养生长期DoGALT基因在茎杆的表达量最高，生殖生长期DoGALT基因在花中的表达量最高，在茎杆、根中的表达量次之，在叶片的表达量最低。
进一步分析DoGALT在不同生长时期的表达模式(图6)，结果发现，DoGALT在铁皮石斛4个生长阶段(S1、S2、S3和S4，依次为组培苗移栽后6、11、14、17个月)表达丰度差异明显，呈现先上升后下降的趋势，最大值为S3，最小值为S1。上述结果表明，铁皮石斛DoGALT与其生长发育紧密相关，有意思的是S4的表达量是其它时期的4.73～7.98倍，而且S4是铁皮石斛的盛花期，推测DoGALT可能还与铁皮石斛开花有关系。
实施例3转半乳糖基转移酶基因DoGALT拟南芥的获得和鉴定
(1)铁皮石斛半乳糖基转移酶基因DoGALT超表达载体的构建
根据pCAMBIA1302载体上的序列和半乳糖基转移酶基因DoGALT全长，设计一对引物OEGALTF和OEGALTR，具体序列如SEQ ID NO:13～14所示。
以铁皮石斛的cDNA为模板，高保真扩增获得半乳糖基转移酶基因DoGALT全长。扩增产物经纯化后，回收目的片段，用Nco I酶切表达载体pCAMBIA1302(图7)。采用Takara公司的HD Cloning Kit试剂盒构建植物表达载体，具体操作方法详见操作说明书。pCAMBIA1302载体含有CaMV 35S启动子，将半乳糖基转移酶基因DoGALT(如SEQ ID NO.1的第125位到1849位碱基所示)保留ATG，去掉终止密码子，连接在启动子后面，构建成半乳糖基转移酶基因DoGALT超表达载体，将此植物重组表达载体命名为pCAMBIA1302-DoGALT(图8)。
(2)重组质粒pCAMBIA1302-DoGALT转化到农杆菌EHA105
采用热激法将构建取重组质粒pCAMBIA1302-DoGALT转化到农杆菌EHA105中，具体方法为：1μl重组质粒表达载体pCAMBIA1302-DoGALT与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，冰上放置30min。然后液氮速冻1min后，迅速转到37℃保温5min。加入800μl不含抗生素的LB培养基，在28℃摇床上，100rpm转速中培养2-4h。将培养物涂布到25ml LB平板(培养基中含50mg·ml-1卡那霉素)。将平板倒置放在28℃的培养箱中培养，直至菌落长出(约2天)。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落鉴定的PCR引物为OEGALTF和OEGALTR。选取转入了超表达载体pCAMBIA1302-DoGALT的农杆菌EHA105克隆作为阳性克隆。
(3)花序浸染法转化拟南芥
①活化后的含有pCAMBIA1302-DoGALT载体的农杆菌，挑取单菌落于100ml LB液体培养基中(含50mg·ml-1卡那霉素)，28℃、180rpm振荡培养过夜(约16h)，至OD600＝0.8～1.0。
②室温5000rpm离心10min收集菌液。
③用100mL渗透培养基(1/2MS+0.5g·l-1MES+5％蔗糖，pH 5.7)重悬农杆菌，并加入20μl表面活性剂Silwet L-77。
④用大约4-5周，开始抽苔至10cm左右时(即刚开花，形成1～2个角果时)的拟南芥进行花序侵染转化。将所有的花序浸泡在农杆菌重悬液中浸泡1min，斜置晾干。
⑤黑暗共培养2天后，在光照条件下培养。直至种子成熟，收集T0代种子。待种子成熟后进行下一步的培养筛选工作或保存在-20℃冰箱中。
(4)转基因植株的培养及筛选
①从-20℃冰箱中取出保存的拟南芥转基因种子，在室温下放置一段时间，取适量的种子于1.5ml离心管中，现配的1％NaClO消毒10min。室温稍离心，弃上清，无菌水漂洗6次后播种在含潮霉素B(25μg·ml-1)1/2MS培养基用中。
②4℃黑暗同步化至少2天后，移至培养室，在22℃±2℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。
③约2周左右，转化成功的植株长出主根，叶片鲜绿并长出真叶，而没有转化成功的植株基本不长根或者根较短，无法长出真叶。将转化成功的植株转栽到培养盆中，基质为泥炭土：蛭石(1:2)，在22℃±2℃，16h光照/8h黑暗培养室中培养。
④在幼苗期，保持蛭石始终处于湿润状态，待其拟南芥长至6～8片叶时，则等到蛭石的表面干燥才浇水，以防止生长霉菌。
⑤待种子成熟，收集T1代种子。T1代种子再进行筛选培养，直至获得转基因纯合子。
(5)转基因植株的分子鉴定
取pCAMBIA1302-DoGALT拟南芥转基因纯合子的叶片0.1g，用RNAout 2.0提取总RNA，具体操作参考说明书。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取1μg的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为M-MLV，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以DoGALT的ORF为模板，以拟南芥UBQ10为内参，设计半定量PCR引物SQGALTF、SQGALTR、UBQ10F、UBQ10R，具体序列如SEQ ID NO:15～18所示。
半定量PCR扩增按照常规的PCR扩增，PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，60℃1min，30个循环；72℃10min。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。共筛选获得3个纯合株系(图9)，这三个株系都可以正常转录DoGALT，而野生型拟南芥没有检测到DoGALT(图10)。
实施例4转基因株系的多糖和半乳糖含量测定
(1)转基因株系的多糖含量测定
①取两个月大小的转基因和野生型拟南芥地上部分，洗净，于烘箱内105℃杀青2小时，后80℃烘烤过夜(约5h)。用手提式高速万能粉碎机DFT-50粉碎样品。
②精确称取0.5000g粉末于索氏提取瓶中，加入80％乙醇，小心混匀，80℃回流2小时，过滤，弃滤液，得到醇不溶物质(Alcohol-insoluble residue,AIR)。100℃回流2～3h，过滤，弃滤渣。滤液放置至室温，定容100ml，温和摇匀，此为多糖提取液。完成多糖提取后，尽快完成多糖含量测定。
③精确取0.2ml至10ml具塞的反应管中，补入1.8ml的蒸馏水至2ml，每个样品3个重复。另外，在另一反应管中加入2ml的蒸溜水，以此作为空白对照。
④往所有反应管中，加入现配的5％的苯酚1ml，涡旋混匀。加入5ml的浓硫酸，涡旋混匀。盖上塞子，沸水浴20min，充分反应。反应结束后，取出反应管，在凉水中放置5min。待冷却至室温，紫外分光光度计488nm处测定吸收值。
⑤根据制定的标准曲线，换算得到醇不溶多糖的百分含量。由结果可以得出，在拟南芥中超表达DoGALT后，转基因拟南芥的总多糖含量显著增加(图11)。
(2)转基因植株的半乳糖含量测定
①与实施例3-(5)所述方法一致，得到拟南芥转基因植株的醇不溶多糖。
②精密吸取上述多糖溶液1ml，置顶空瓶中，加2.0mol·l-1的TFA溶液5ml，封口，充分混匀120℃水解2h。待溶液放冷，调节pH至中性，此为多糖水解液，备用。
③分别吸取单糖混合对照品溶液和多糖水解溶液各0.4ml，加0.5mol·l-1的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液与0.3mol·l-1的氢氧化钠溶液各400μl，混匀，70℃水浴反应110min。再加0.3mol·l-1的盐酸溶液500μl，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次2ml，弃去三氯甲烷液。12000rpm离心5min，取上清液20μl注入高效液相色谱仪，检测单糖含量。
④采用岛津SHIMADZU高效液相色谱仪，ZORBAX SB-Aq C18色谱柱(柱规格：4.6mm×250mm，5μm)，柱温30℃，流动相0.02mol·l-1醋酸铵(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0-30min，B20％)，流速1.0ml·min-1，进样量20μl，检测波长250nm。在此条件下，葡萄糖和甘露糖衍生物均达到基线分离，理论塔板数按葡萄糖衍生物峰计算应不低于10000。
⑤根据外标法制定的单糖标准曲线，计算醇不溶多糖中半乳糖的含量。由结果可以得出，在拟南芥中超表达DoGALT后，转基因拟南芥的半乳糖含量显著增加(图12)。
实施例5转基因株系的抗盐抗旱性鉴定
转基因植株对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性
①从-20℃冰箱中取出保存的拟南芥野生型(col-0)种子和DoGALT转基因种子(3个株系，line 1～3)，在室温下放置一段时间，取适量的种子于1.5ml离心管中，现配的1％NaClO消毒10min。室温稍离心，弃上清，无菌水漂洗6次。
②4℃黑暗同步化至少2天后，移至培养室，在22℃±2℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。7d后进行盐胁迫处理实验。
③盐胁迫处理为：以培养在不含NaCl的1/2MS培养基上的小苗为对照，将7d大小的转基因植株和野生型植株小心移栽在含150mmol·l-1NaCl的1/2MS培养基中，各10株，重复3次。
④干旱胁迫处理为：以培养在不含Mannitol的1/2MS培养基上的小苗为对照，将7d大小的转基因植株和野生型植株小心移栽在含200mmol·l-1Mannitol的1/2MS培养基中，各10株，重复3次。
⑤5d后观察植株的生长情况，并统计根长和鲜重(图13)。结果表明，在不含NaCl或者Mannitol的培养基中生长的小苗，无论是野生型还是转基因株系，根长相差不大，且生长一致。在含NaCl或者Mannitol的培养基上的小苗，野生型小苗的根的生长受到明显的抑制，出现明显的逆境胁迫表型，而盐处处和干旱处理对转基因株系的影响较小，转基因株系小苗对盐的敏感性降低(图14、图15)。因此，超量表达半乳糖基转移酶基因DoGALT后能够显著提高拟南芥抵御高盐和干旱的胁迫能力。
根据上述说明书的揭示和指导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
序列表
<110> 中国科学院华南植物园
<120> 一种半乳糖基转移酶及其编码基因和应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2120
<212> DNA
<213> 半乳糖基转移酶基因(DoGALT)
<400> 1
aagcagtggt atcaacgcag agtacatggc aagcagtggt atcaacgcag atcccatttc 60
ccttttggcg acaatgcttc ttacttgcat gctttcgaag ccctggttat aatcctttcc 120
gacgatgaag cggtggtccg gcggcatcct catcctctcc ctggccgtct tcctcctcct 180
ccgttactct ttttcaccca actctgctac cccccgccgt atctcaactc gtaaacgcta 240
ctcctctcca cccctttccg gtctcacccc cctcatttcc tccgccgaag ataccgttcc 300
taatcccact cccacgctcg cttggcccta tctcctttcc ctcctttctc gcgccgactc 360
ccttcccaca gccgccgccg cagcccgcga ggccaccgct gtctggagca acctcgcggc 420
cgacatccaa ccaaaacccg ccaacgcatc tgtgacctct tgtcctttct ccgccatcgc 480
tgtaagcgga agcaatggca cgttcctcac aattccttgc ggcctcaccg aaaactcagc 540
catcaatgtg gttgccatac cctccggccc cttctatatt gatctcgtcg gaagcggagc 600
tccgccgcat gtcgtgcttc ggtacaacgt cagcctcggc gattcatcga ccattgctga 660
gagctcatgg acacctgaac ttggttggat cgactggcag tggtgcccgg agcctgatgg 720
taacctgaaa gttgatgagc ttgttcgctg caatgtgcat tctggtgaga gtatccttga 780
ggataggctg aacggcagtg ttgttgatgg aaagaaaagg agttctcaca tgagcatcaa 840
cttccccttc actgaaggtc aagcattcac cagcactttg tgggcaggac ttgatggttt 900
ccacatgacg gtgaatgggc gacatgagac ctcattcatg tataaggaga gtcttgaccc 960
gtggtcagtg agtggagtaa aggttgaggg agctttagag gtgttgtcct gttttgcaaa 1020
tggcttaccc ttctttgaag atcttgcgtt ggttggtgac gtggagaagc tcaaggctcc 1080
taagattgca aagcgcaggg cgttcatgct tgttggggtg ttctcatcaa gtaacaattt 1140
tgctcggcgg caggcaataa ggaaatcctg gatgcagtat gaagcagtta ggtctggaga 1200
cgttgctgtg cgtttcctca tcggacttca caagagcaag caagtcaatt tagaattatg 1260
gaaagaatgg caggcctatg gagatatcca gttgatgcca tttgttgact actacggcct 1320
tatcactctg aaaactgtag ctatctgcgt tcttgggacg aaactacttc ccgccaaata 1380
catcatgaaa actgacgatg atgcttttgt gagaattgat gaggtcatat ctgctcttaa 1440
gaaaaatgat cccaatggcc tattgtatgg tctcatctca tttgaatcat ctccccacag 1500
ggataaggat agcaagtggt acattagtga ggcggaatgg tctaatgatt cctatcctcc 1560
ttgggctcat ggtcctggat acataatctc aagagacatt gccaaatttg ttgtgaaggg 1620
tcatgaaggt ggcaaactca aacttttcaa gcttgaagat gttgcgatgg gaatttggat 1680
tcaagagttc aaggagaacg gtggaaaggt gaattatgtg aatgatgaac ggttctacaa 1740
tgctggctgt gaatccgact atgtcctcgc tcattatcag gggccaagga agctattatg 1800
cctatgggat aagctacaaa gagaacatga ggcaatctgc tgtgaatagt aaacaacttt 1860
caaactgtaa aagatcaaat ctcaggtttt cgagggagag aagctgggaa tataagcctg 1920
tctcgttgga caggctttta gctctcaaac gagattctga tgaagatcaa caggtatggt 1980
gagtatctga tttttttgta tgatttgatg tttttgacat acaaattcac ttacgaaaat 2040
taagaatttg gaaagccaag ctgcagcatt aatcggaaga gaagccgatt gaggttttgt 2100
ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa 2120
<210> 2
<211> 574
<212> PRT
<213> 半乳糖基转移酶(DoGALT)
<400> 2
Met Leu Ala Thr Ser Gly Gly Ile Leu Ile Leu Ser Leu Ala Val Pro
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Thr Ser Pro Ser Pro Ala Ser Ala Thr Pro Ala Ala
20 25 30
Ile Ser Thr Ala Leu Ala Thr Ser Ser Pro Pro Leu Ser Gly Leu Thr
35 40 45
Pro Leu Ile Ser Ser Ala Gly Ala Thr Val Pro Ala Pro Thr Pro Thr
50 55 60
Leu Ala Thr Pro Thr Leu Leu Ser Leu Leu Ser Ala Ala Ala Ser Leu
65 70 75 80
Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Ser Ala
85 90 95
Leu Ala Ala Ala Ile Gly Pro Leu Pro Ala Ala Ala Ser Val Thr Ser
100 105 110
Cys Pro Pro Ser Ala Ile Ala Val Ser Gly Ser Ala Gly Thr Pro Leu
115 120 125
Thr Ile Pro Cys Gly Leu Thr Gly Ala Ser Ala Ile Ala Val Val Ala
130 135 140
Ile Pro Ser Gly Pro Pro Thr Ile Ala Leu Val Gly Ser Gly Ala Pro
145 150 155 160
Pro His Val Val Leu Ala Thr Ala Val Ser Leu Gly Ala Ser Ser Thr
165 170 175
Ile Ala Gly Ser Ser Thr Thr Pro Gly Leu Gly Thr Ile Ala Thr Gly
180 185 190
Thr Cys Pro Gly Pro Ala Gly Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ala
195 200 205
Cys Ala Val His Ser Gly Gly Ser Ile Leu Gly Ala Ala Leu Ala Gly
210 215 220
Ser Val Val Ala Gly Leu Leu Ala Ser Ser His Met Ser Ile Ala Pro
225 230 235 240
Pro Pro Thr Gly Gly Gly Ala Pro Thr Ser Thr Leu Thr Ala Gly Leu
245 250 255
Ala Gly Pro His Met Thr Val Ala Gly Ala His Gly Thr Ser Pro Met
260 265 270
Thr Leu Gly Ser Leu Ala Pro Thr Ser Val Ser Gly Val Leu Val Gly
275 280 285
Gly Ala Leu Gly Val Leu Ser Cys Pro Ala Ala Gly Leu Pro Pro Pro
290 295 300
Gly Ala Leu Ala Leu Val Gly Ala Val Gly Leu Leu Leu Ala Pro Leu
305 310 315 320
Ile Ala Leu Ala Ala Ala Pro Met Leu Val Gly Val Pro Ser Ser Ser
325 330 335
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ser Thr Met Gly Thr
340 345 350
Gly Ala Val Ala Ser Gly Ala Val Ala Val Ala Pro Leu Ile Gly Leu
355 360 365
His Leu Ser Leu Gly Val Ala Leu Gly Leu Thr Leu Gly Thr Gly Ala
370 375 380
Thr Gly Ala Ile Gly Leu Met Pro Pro Val Ala Thr Thr Gly Leu Ile
385 390 395 400
Thr Leu Leu Thr Val Ala Ile Cys Val Leu Gly Thr Leu Leu Leu Pro
405 410 415
Ala Leu Thr Ile Met Leu Thr Ala Ala Ala Ala Pro Val Ala Ile Ala
420 425 430
Gly Val Ile Ser Ala Leu Leu Leu Ala Ala Pro Ala Gly Leu Leu Thr
435 440 445
Gly Leu Ile Ser Pro Gly Ser Ser Pro His Ala Ala Leu Ala Ser Leu
450 455 460
Thr Thr Ile Ser Gly Ala Gly Thr Ser Ala Ala Ser Thr Pro Pro Thr
465 470 475 480
Ala His Gly Pro Gly Thr Ile Ile Ser Ala Ala Ile Ala Leu Pro Val
485 490 495
Val Leu Gly His Gly Gly Gly Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ala
500 505 510
Val Ala Met Gly Ile Thr Ile Gly Gly Pro Leu Gly Ala Gly Gly Leu
515 520 525
Val Ala Thr Val Ala Ala Gly Ala Pro Thr Ala Ala Gly Cys Gly Ser
530 535 540
Ala Thr Val Leu Ala His Thr Gly Gly Pro Ala Leu Leu Leu Cys Leu
545 550 555 560
Thr Ala Leu Leu Gly Ala Gly His Gly Ala Ile Cys Cys Gly
565 570
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 扩增引物F(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaatggca cgttcctcac a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 扩增引物R(Artificial Sequence)
<400> 4
tgccattctt tccataattc ta 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> GALT3F(Artificial Sequence)
<400> 5
gcctattgta tggtctcatc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> GALT3R(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcaagagtt caaggagaac 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> GALT5F(Artificial Sequence)
<400> 7
ggacaacacc tctaaagctc cctca 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> GALT5R(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcatgtgga aaccatcaag tcctg 25
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> RTGALTF(Artificial Sequence)
<400> 9
gtggtcagtg agtggagtaa ag 22
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> RTGALTR(Artificial Sequence)
<400> 10
tcaccaacca acgcaaga 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> DoActinF(Artificial Sequence)
<400> 11
tcccaaggca aacagagaaa 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> DoActinR(Artificial Sequence)
<400> 12
ggccactagc atatagggaa ag 22
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> OEGALTF(Artificial Sequence)
<400> 13
ggactcttga ccatggcgat gaagcggtgg tccggcg 37
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> OEGALTR(Artificial Sequence)
<400> 14
gtcagatcta ccatggtttc acagcagatt gcctcat 37
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> SQGALTF(Artificial Sequence)
<400> 15
gcattcacca gcactttgtg 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> SQGALTR(Artificial Sequence)
<400> 16
cacctctaaa gctccctcaa c 21
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> UBQ10F(Artificial Sequence)
<400> 17
gatctttgcc ggaaaacaat tggaggatgg t 31
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> UBQ10R(Artificial Sequence)
<400> 18
cgacttgtca ttagaaagaa agagataaca gg 32

Claims (7)

1.一种半乳糖基转移酶基因DoGALT，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种半乳糖基转移酶DoGALT，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种植物表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的半乳糖基转移酶基因DoGALT。
4.权利要求3所述的植物表达载体的构建方法，其特征在于，将半乳糖基转移酶基因DoGALT连接到pCABIA1302载体的Nco I克隆位点获得。
5.权利要求1所述的半乳糖基转移酶基因DoGALT在调节植物多糖和半乳糖合成中的应用。
6.权利要求1所述的半乳糖基转移酶基因DoGALT在提高植物抗逆境胁迫中的应用。
7.根据权利要求5、6所述的半乳糖基转移酶基因DoGALT的应用，其特征在于，所述的植物为模式植物拟南芥。
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