CN108220307A - 一种gdp-甘露糖转运蛋白酶及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种GDP‑甘露糖转运蛋白酶及其编码基因和应用。本发明从铁皮石斛中克隆得到了GDP‑甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1，全长1745bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；第203位到1342位碱基编码GDP‑甘露糖转运蛋白酶DoGMT1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明GDP‑甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1为核苷酸糖转运蛋白家族成员，在甘露聚糖合成过程中起重要作用。通过基因工程技术过表达DoGMT1基因，能够促进甘露糖和多糖的合成，并通过增强清除自由基的能力来提高植物耐盐性，在培育高糖、耐盐植物方面具有良好的应用前景。

Description

一种GDP-甘露糖转运蛋白酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属基因工程技术领域，更具体地说，本发明涉及一种GDP-甘露糖转运蛋白酶及其编码基因和应用。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是《神农本草经》、《中华人民共和国药典》中收录的名贵中药材之一，以茎入药，茎中富含具有生物活性的多糖。《中华人民共和国药典(2015年版)》规定铁皮石斛多糖含量不得少于25.0％，通常作为铁皮石斛质量的评价依据。近代药理研究表明，铁皮石斛多糖具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫等功效。因此也是最具有开发潜力的中药材之一，受到国内外学者的高度重视。

植物化学分析表明，铁皮石斛中的多糖为2-O-乙酰葡萄甘露聚糖(Hua Y F,ZhangM,Fu C X,et al.Structural characterization of a 2-O-acetylglueomannan fromDendrobium officinale stem.Carbohydrate Research,2004,339:2219-2224)或2,3-O-乙酰化葡萄甘露聚糖(Xing X H,Cui S W,Nie S P,et al.Study on Dendrobiumofficinale,O-acetyl-glucomannanPart I Extraction,purification,andpartial structural characterization.Bioactive Carbohydrates and DietaryFibre,2014,4:74-83)，均属于甘露聚糖，主要由β-D-1,4-甘露糖残基和β-D-1,4-葡萄糖残基组成(Wei W,Feng L,Bao W R,et al.Structure characterization andimmunomodulating effects of polysaccharides isolated from Dendrobiumofficinale.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2016,64(4):881-889)。

目前，植物甘露聚糖的生物合成途径在拟南芥(Goubet F,Barton C J,MortimerJ C,et al.Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLAglycosyltransferases,and influences the progression of embryogenesis.ThePlant Journal,2009,60:527-538)、葫芦巴(Wang Y,Mortimer J C,Davis J,etal.Identification of an additional protein involved in mannanbiosynthesis.The Plant Journal,2013,73:105-117)、瓜尔豆(Dhugga K S,Barreiro R,Whitten B,et al.Guar seed beta-mannan synthase is a member of the cellulosesynthase super gene family.Science,2004,303:363-366)等高等植物中均有报道，为铁皮石斛甘露聚糖生物合成的调控研究提供了参考。研究发现，甘露聚糖合成酶(Mannansynthase)以活化的甘露糖(GDP-甘露糖)为底物负责植物甘露聚糖的合成(Temple H,Saez-Aguayo S,Reyes F C,et al.The inside and outside:topological issues inplant cell wall biosynthesis and the roles of nucleotide sugartransporters.Glycobiology,2016,26:913-925)。然而，GDP-甘露糖是在细胞质上产生的，GDP-甘露糖必须依赖GDP-甘露糖转运蛋白(GDP-mannose transporter,GMT)从细胞质转运到甘露聚糖合成场所高尔基体上(Bar-peled M,O'Neill M A.Plant nucleotide sugarformation,interconversion,and salvage by sugar recycling.Annual Review ofPlant Biology,2011,62(1):127-155)。因此，GDP-甘露糖转运蛋白在植物甘露聚糖的过程中起着非常重要的作用。

迄今有关植物GDP-甘露糖转运蛋白的报道鲜少(Baldwin T C,Handford M G,Yuseff M I,et al.Identification and characterization of GONST1,a Golgi-localized GDP-mannose transporter in Arabidopsis.The Plant Cell,2001,13:2283-2295)，甘露聚糖合成与调控的分子机理还不明确。挖掘铁皮石斛GDP-甘露糖转运蛋白酶基因有利于阐明其多糖合成的调控机制，也为植物甘露聚糖合成调控机制研究提供理论支撑。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种可用于提高植物甘露糖、甘露聚糖含量和提高植物耐盐的GDP-甘露糖转运蛋白酶DoGMT1及其编码基因DoGMT1。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种GDP-甘露糖转运蛋白酶DoGMT1，其是通过上述GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1的第203位到1342位碱基编码得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种含有所述的GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1的表达载体。

本发明上述载体为一种可用于农杆菌转化植物的双元载体，其构建方法是通过Nco I酶切后连接到植物表达载体pCAMBIA1302上，命名为pCABIA1302-DoGMT1。

本发明GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1可用于提高植物多糖、甘露糖含量、增强活性氧自由基清除能力和提高植物耐盐性。例如，用于培育高糖、耐盐的植物品种。

具体方式可以是：将GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1在植物中表达，得到高糖、耐盐的植物。

优选的，所述的GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1是通过pCAMBIA1302植物表达载体导入植物细胞、组织或器官的。

优选的，所述的植物为模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明克隆得到的属于铁皮石斛糖基转移酶家族的GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1，其参与甘露糖、多糖的合成以及增强活性氧自由基清除能力的逆境应答过程。通过转基因及功能鉴定证实超量表达DoGMT1提高拟南芥中的甘露糖和多糖含量，同时DoGMT1能增强拟南芥对活性氧自由基的清除能力，进而提高植物的耐盐性。铁皮石斛DoGMT1在培育高糖和耐盐植物尤其是铁皮石斛新品种方面具有非常重要的理论及应用价值。

附图说明

图1为铁皮石斛DoGMT1基因片段的扩增。

图2为应用巢式PCR扩增铁皮石斛DoGMT1基因的3′端。

图3为应用Touch-down PCR扩增铁皮石斛DoGMT1基因的5′端。

图4为铁皮石斛DoGMT1开放阅读框的扩增。

图5为铁皮石斛DoGMT1与已报道GDP-甘露糖转运蛋白的系统进化关系分析。氨基酸序列比对采用ClustalX2，系统进化树构建采用MEGA5(邻接法，设置1000个重复)。所采用的氨基酸序列如下：ScVRG4(NP_011290)、AtGONST1(At2g13650)、AtGONST2(At1g07290)、AtGONST3(At1g76340)、AtGONST4(At5g19980)、VvGONSTA(XP_010649370)和VvGONSTB(XP_019075086)。

图6为铁皮石斛DoGMT1在不同器官中的表达模式。不同器官包括营养生长阶段(根、茎、叶，种子萌发后10个月)和生殖生长阶段(根、茎、叶，组培苗移栽后10个月)。

图7为不同生长阶段的铁皮石斛。组培苗不同生长阶段包括原球茎阶段、丛生芽阶段和小苗阶段，即S1、S2、S3。

图8为不同生长阶段铁皮石斛多糖、甘露糖含量及DoGMT1在不同生长阶段的表达模式。组培苗不同生长阶段包括原球茎阶段、丛生芽阶段和小苗阶段，即S1、S2、S3。

图9为所用的植物双元表达载体pCABIA1302。NCBI登陆号为AF234298。

图10为铁皮石斛DoGMT1超量表达载体构建的示意图。

图11为DoGMT1转基因拟南芥株系的表型。野生型拟南芥(WT)，35S:DoGMT1转基因株系line 1和line 2。

图12为DoGMT1转基因拟南芥株系的半定量PCR检测。野生型拟南芥(WT)，35S:DoGMT1转基因株系line 1和line 2。DoActin的NCBI登陆号为JX294908。

图13为DoGMT1转基因拟南芥株系多糖的含量。野生型拟南芥(WT)，35S:DoGMT1转基因株系line 1和line 2。AIR：(多糖提取的)醇不溶物。DW：干重，每组数据的bar表示±标准误差(n≥3)。统计分析为各处理与对照的比较，采用单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。

图14为DoGMT1转基因拟南芥株系多糖中单糖的含量。AIR：(多糖提取的)醇不溶物。DW：干重，每组数据的bar表示±标准误差(n≥3)。统计分析为各处理与对照的比较，采用单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。

图15为盐胁迫胁迫处理下DoGMT1转基因拟南芥株系响应过氧化物的影响。将7d大小的拟南芥小苗移栽在1/2MS培养基中，设置盐胁迫处理为150mM的NaCl添加到1/2MS培养基中，用二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)检测过氧化物酶的活性部位。

图16为盐胁迫胁迫处理对DoGMT1转基因拟南芥株系清除活性氧能力的影响。每组数据的bar表示±标准误差(n≥3)。统计分析为各处理与对照的比较，采用单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。

图17为DoGMT1转基因拟南芥株系过氧化氢酶活性的变化。每组数据的bar表示±标准误差(n≥3)。统计分析为各处理与对照的比较，采用单因素方差分析，p<0.05差异有统计学意义。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

下列实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产厂商的使用说明。

实施例中所用铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)栽种于中国科学院华南植物园铁皮石斛种植大棚(N23°10′，E113°21′；中国广州)；野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)源自哥伦比亚生态型(Columbia，col-0)；SMARTer^TM RACE cDNAAmplification Kit购自Clontech公司(货号：634923)；HD Cloning Kit购自Takara公司(货号：639648)；pMD18-T Vector购自Takara公司(货号：D101A)；SYBR PremixEx Taq^TM Kit购自Takara公司(货号：DRR420A)；购自Takara公司(货号：RR52A)；LB、MS培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。

实施例1铁皮石斛DoGMT1基因的分离克隆

(1)铁皮石斛总RNA的提取及cDNA第一条链的合成

取刚采收的铁皮石斛茎0.1g，切割成1-2mm片段，在液氮下研磨成粉。采用柱式植物RNAout2.0试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司，货号：90404-50)提取铁皮石斛总RNA。采用NanoDrop^TM 2000c超微量分光光度计(Thermo Scientific公司，美国威斯康星州)和1.0％琼脂糖凝胶电泳仪(Biorad公司，美国加利福尼亚州)测定总RNA的含量和纯度。吸取2μg已纯化的总RNA，根据反转录酶M-MLV试剂盒(Promega公司，货号：M1701)的使用说明书，进行cDNA第一条链的合成，将反应产物稀释到所需浓度，-80℃冰箱保存。

(2)铁皮石斛DoGMT1基因片段的扩增

根据课题组已发表的铁皮石斛转录组数据库(Zhang J,He C,Wu K,etal.Transcriptome analysis of Dendrobium officinale and its application to theidentification of genes associated with polysaccharide synthesis.Frontiers inPlant Science,2016,7:5.)，查找GDP-甘露糖转运蛋白基因部分序列，通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库BLAST比对，找到铁皮石斛DoGMT1保守片段。根据铁皮石斛DoGMT1保守片段，运用Primer Premier5.0软件(Premier Biosoft公司,美国加利福尼亚州)设计相应引物GMTF和GMTR，利用TaKaRa LA(Takara公司，货号：RR52A)进行铁皮石斛DoGMT1目的片段PCR的扩增。所使用引物GMTF和GMTR序列如SEQ ID NO:3～4所示。

PCR反应体系(20μl)：反转录模板1.0μl，10xBuffer 2.0μl，dNTP Mix(10mM)1.0μl，GMTF 1.0μl，GMTR 1.0μl，LA Taq酶0.5μl，ddH₂O(高压灭菌)13.5μl。PCR反应程序：94℃变性3min，随后进行30个循环反应(94℃30s,55℃30s,72℃1min)，72℃延伸10min。PCR产物采用1.0％琼脂糖凝胶电泳仪(Biorad，美国加利福尼亚州)检测，并使用环保型琼脂糖凝胶回收试剂盒(广州东盛生物科技有限公司，货号：N1081)回收目的片段，16℃过夜连接到pMD18-T Vector(Takara公司，货号：D101A)，连接产物采用热激法转化至大肠杆菌DH 5α(Takara公司，货号：D9057)，涂布于含有100μg·ml^-1氨苄抗生素(Ampicillin)的LB平板上，37℃过夜。挑取单菌落为模板，GMTF和GMTR为引物进行菌落PCR验证，送至北京六合华大基因科技有限公司进行菌液测序。获得铁皮石斛GDP-甘露糖转运蛋白基因DoGMT1的部分核心片段560bp(图1)。

(3)铁皮石斛DoGMT1基因3'和5'序列的扩增

利用该560bp的核心片段，根据SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(Clontech公司，货号：634923&634924)，设计扩增3'端UTR序列的引物GMT3F和GMT3R，以及扩增5'端UTR序列的引物GMT5F和GMT5R，引物GMT3F、GMT3R、GMT5F、GMT5R的序列如SEQ IDNO:5～8所示。

3'端UTR序列PCR扩增方法：采用SMARTer^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒，根据试剂盒所提供的反应体系，采用巢式PCR扩增，PCR反应程序为94℃变性3min,随后30个循环反应(94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)，72℃延伸10min。经过二轮PCR，再经切胶回收，转化大肠杆菌DH5α，送至北京六合华大基因科技有限公司进行菌液测序，获得DoGMT1的3′端UTR为685bp(图2)。

5'端UTR序列PCR扩增方法：采用SMARTer^TMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒，根据试剂盒所提供的反应体系，采用Touch-down PCR扩增，PCR反应程序为94℃变性3min，接着2个循环反应(98℃30s；65℃，30s；72℃，1min)，保持变性、延伸条件不变，每一轮退火温度降低1℃，即紧接着2个循环反应(98℃30s；64℃，30s；72℃，1min)，以此类推，最后20个循环反应(98℃30s；55℃，30s；72℃，1min)，72℃延伸10min。经过二轮PCR，再经切胶回收，转化大肠杆菌DH5α，送至北京六合华大基因科技有限公司进行菌液测序，获得DoGMT的5′端UTR为388bp(图3)。

(4)铁皮石斛DoGMT1基因全长的获得

根据已获得的3'端UTR序列，5'端UTR序列，以及DoGMT1的核心片段进行拼接获得基因全长的cDNA序列(图4)，其序列如SEQ ID NO.1所示，该序列长度为1745bp。此序列的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)命名为DoGMT1基因，利用NCBI的ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找得到，即SEQ ID NO.1的自5'端第203位至第1342位碱基，共1140bp，编码379个氨基酸，蛋白质分子量约为41.96kD，包含31个酸性氨基酸，19个碱性氨基酸，理论等电点为5.04，脂溶性系数为119.08。该蛋白包含α-螺旋42.22％，β-折叠28.23％，β-转角7.65％和无规则卷曲21.90％，N端、C端以α-螺旋为主。NCBI保守域分析发现，DoGMT1的氨基酸序列中存在磷酸丙糖转运家族蛋白(Triose-phosphate Transporter family)，位于61-332位点。进一步遗传进化分析显示(图5)，铁皮石斛DoGMT1蛋白与已报道的拟南芥GDP-甘露糖转运蛋白AtGONST3亲缘关系最近，两者氨基酸序列相似性达到72.5％。此外，铁皮石斛DoGMT1蛋白与已报道的GDP-甘露糖转运蛋白均存在4个保守的Motifs，它们分别是：

Motif 1(VMTLSGLLGLAISFTSMWFLHQTGATTYSLVGSLNKJPLSVAGJVLFDVP)；

Motif 2(VMDTAKQVTKSGNLNEWSMVLLNNLLSLP)；

Motif 3(FTSSFSLKYINVDTFTVFKNVTPIIVAVGETLFFNKPHPSR)；

Motif 5(AYCISSSLMIIINKFVLSSYNFNAGJTLM)。

实施例2铁皮石斛DoGMT1基因表达模式分析

采收铁皮石斛幼年生长阶段和成年生长阶段的根、茎、叶，参照实施例1-(1)方法进行RNA提取及其逆转录反应。荧光定量PCR反应根据DoGMT1基因的保守区域设计特异引物RTGMTF和RTGMTR，采用SYBR Premix Ex Taq^TM Kit购自Takara公司(货号：DRR420A)进行PCR扩增。反应程序为95℃变性2min，随后进行40个循环反应(95℃15s，60℃1min)。内参基因为铁皮石斛的DoActin基因，NCBI登陆号为JX294908。反应在ABI 7500型实时荧光定量PCR(美国应用生物系统公司，美国加利福尼亚州)运行后得到数据，运用2^-ΔΔCt方法计算，获得各个样品之间相对表达量的数据。所用引物RTGMTF、RTGMTR、DoActinF、DoActinR序列如SEQ IDNO:9～12所示。

从图6中可以看出，DoGMT1基因在铁皮石斛各器官中均有表达，幼年生长阶段，DoGMT1表达水平较低，成年生长阶段，表达水平较高。幼年生长阶段DoGMT1基因在茎杆的表达量最高，成年生长阶段DoGMT1基因也在茎杆的表达量最高，在根中的表达量次之，在叶片的表达量最低。上述结果表明，DoGMT1是铁皮石斛茎杆特异表达的基因。

进一步分析DoGMT1在不同生长阶段的表达模式，结果发现，DoGMT1在铁皮石斛3个生长阶段(S1、S2和S3，依次为组培瓶中的原球茎、丛生芽和小苗，图7)表达丰度差异明显，随着生长时间的增加，呈现逐渐上升的趋势，最大值为S3，最小值为S1(图8)。此外，DoGMT1在铁皮石斛不同生长阶段的表达量与其茎杆中多糖含量(皮尔森相关系数R²＝0.85，p<0.05)和甘露糖含量(皮尔森相关系数R²＝0.94，p<0.05)呈现明显的正相关，结果表明DoGMT1与铁皮石斛多糖合成，尤其是甘露糖合成紧密相关。

实施例3转半乳糖基转移酶基因DoGMT1拟南芥的获得和鉴定

(1)铁皮石斛半乳糖基转移酶基因DoGMT1超表达载体的构建

根据pCAMBIA1302载体上的序列和半乳糖基转移酶基因DoGMT1全长，设计一对引物OEGMTF和OEGMTR，序列如SEQ ID NO:13～14所示。

以铁皮石斛的cDNA为模板，高保真扩增获得半乳糖基转移酶基因DoGMT1全长。扩增产物经纯化后，回收目的片段，用Nco I酶切表达载体pCAMBIA1302(图9)。采用Takara公司的HD Cloning Kit试剂盒构建植物表达载体，具体操作方法详见操作说明书。pCAMBIA1302载体含有CaMV 35S启动子，将半乳糖基转移酶基因DoGMT1(如SEQ ID NO.1的第203位到1342位碱基所示)保留ATG，去掉终止密码子，连接在启动子后面，构建成半乳糖基转移酶基因DoGMT1超表达载体，将此植物重组表达载体命名为pCAMBIA1302-DoGMT1(图10)。

(2)重组质粒pCAMBIA1302-DoGMT1转化到农杆菌EHA105

采用热激法将构建取重组质粒pCAMBIA1302-DoGMT1转化到农杆菌EHA105中，具体方法为：1μl重组质粒表达载体pCAMBIA1302-DoGMT1与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，冰上放置30min。然后液氮速冻1min后，迅速转到37℃保温5min。加入800μl不含抗生素的LB培养基，在28℃摇床上，100rpm转速中培养2-4h。将培养物涂布到25ml LB平板(培养基中含50mg·ml^-1卡那霉素)。将平板倒置放在28℃的培养箱中培养，直至菌落长出(约2天)。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，菌落鉴定的PCR引物为OEGMTF和OEGMTR。选取转入了超表达载体pCAMBIA1302-DoGMT1的农杆菌EHA105克隆作为阳性克隆。

(3)花序浸染法转化拟南芥

①活化后的含有pCAMBIA1302-DoGMT1载体的农杆菌，挑取单菌落于100ml LB液体培养基中(含50mg·ml^-1卡那霉素)，28℃、180rpm振荡培养过夜(约16h)，至OD₆₀₀＝0.8～1.0。

②室温5000rpm离心10min收集菌液。

③用100mL渗透培养基(1/2MS+0.5g·l^-1MES+5％蔗糖，pH 5.7)重悬农杆菌，并加入20μl表面活性剂Silwet L-77。

④用大约4-5周，开始抽苔至10cm左右时(即刚开花，形成1～2个角果时)的拟南芥进行花序侵染转化。将所有的花序浸泡在农杆菌重悬液中浸泡1min，斜置晾干。

⑤黑暗共培养2天后，在光照条件下培养。直至种子成熟，收集T₀代种子。待种子成熟后进行下一步的培养筛选工作或保存在-20℃冰箱中。

(4)转基因植株的培养及筛选

①从-20℃冰箱中取出保存的拟南芥转基因种子，在室温下放置一段时间，取适量的种子于1.5ml离心管中，现配的1％NaClO消毒10min。室温稍离心，弃上清，无菌水漂洗6次后播种在含潮霉素B(25μg·ml^-1)1/2MS培养基用中。

②4℃黑暗同步化至少2天后，移至培养室，在22℃±2℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。

③约2周左右，转化成功的植株长出主根，叶片鲜绿并长出真叶，而没有转化成功的植株基本不长根或者根较短，无法长出真叶。将转化成功的植株转栽到培养盆中，基质为泥炭土：蛭石(1:2)，在22℃±2℃，16h光照/8h黑暗培养室中培养。

④在幼苗期，保持蛭石始终处于湿润状态，待其拟南芥长至6～8片叶时，则等到蛭石的表面干燥才浇水，以防止生长霉菌。

⑤待种子成熟，收集T₁代种子。T₁代种子再进行筛选培养，直至获得转基因纯合子。

(5)转基因植株的分子鉴定

取pCAMBIA1302-DoGMT1拟南芥转基因纯合子的叶片0.1g，用RNAout 2.0提取总RNA，具体操作参考说明书。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取1μg的总RNA做起始逆转录反应，所采用的逆转录酶为M-MLV，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以DoGMT1的ORF为模板，以拟南芥UBQ10为内参，设计半定量PCR引物SQGMTF、SQGMTR、UBQ10F、UBQ10R，序列如SEQ ID NO:15～18所示。

半定量PCR扩增按照常规的PCR扩增，PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，60℃1min，30个循环；72℃10min。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。共筛选获得3个纯合株系(图11)，这三个株系都可以正常转录DoGMT1，而野生型拟南芥没有检测到DoGMT1(图12)。

实施例4转基因株系的多糖和甘露糖含量测定

(1)转基因株系的多糖含量测定

①取两个月大小的转基因和野生型拟南芥地上部分，洗净，于烘箱内105℃杀青2小时，后80℃烘烤过夜(约5h)。用手提式高速万能粉碎机DFT-50粉碎样品。

②精确称取0.5g粉末于索氏提取瓶中，加入80％乙醇，小心混匀，80℃回流2小时，过滤，弃滤液，得到醇不溶物质(Alcohol-insoluble residue,AIR)。100℃回流2～3h，过滤，弃滤渣。滤液放置至室温，定容100ml，温和摇匀，此为多糖提取液。完成多糖提取后，尽快完成多糖含量测定。

③精确取0.2ml至10ml具塞的反应管中，补入1.8ml的蒸馏水至2ml，每个样品3个重复。另外，在另一反应管中加入2ml的蒸溜水，以此作为空白对照。

④往所有反应管中，加入现配的5％的苯酚1ml，涡旋混匀。加入5ml的浓硫酸，涡旋混匀。盖上塞子，沸水浴20min，充分反应。反应结束后，取出反应管，在凉水中放置5min。待冷却至室温，紫外分光光度计488nm处测定吸收值。

⑤根据制定的标准曲线，换算得到醇不溶多糖的百分含量。由结果可以得出，在拟南芥中超表达DoGMT1后，转基因拟南芥的总多糖含量显著增加(图13)。

(2)转基因植株的甘露糖含量测定

①与实施例3-(5)所述方法一致，得到拟南芥转基因植株的醇不溶多糖。

②精密吸取上述多糖溶液1ml，置顶空瓶中，加2.0mol·l^-1的TFA溶液5ml，封口，充分混匀120℃水解2h。待溶液放冷，调节pH至中性，此为多糖水解液，备用。

③分别吸取单糖对照品溶液和多糖水解溶液各0.4ml，加0.5mol·l^-1的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液与0.3mol·l^-1的氢氧化钠溶液各400μl，混匀，70℃水浴反应110min。再加0.3mol·l^-1的盐酸溶液500μl，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次2ml，弃去三氯甲烷液。12000rpm离心5min，取上清液20μl注入高效液相色谱仪，检测单糖含量。

④采用岛津SHIMADZU高效液相色谱仪，ZORBAX SB-Aq C₁₈色谱柱(柱规格：4.6mm×250mm，5μm)，柱温30℃，流动相0.02mol·l^-1醋酸铵(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0-30min，B20％)，流速1.0ml·min^-1，进样量20μl，检测波长250nm。在此条件下，葡萄糖和甘露糖衍生物均达到基线分离，理论塔板数按葡萄糖衍生物峰计算应不低于10000。

⑤根据外标法制定的单糖标准曲线，计算醇不溶多糖中半乳糖的含量。由结果可以得出，在拟南芥中超表达DoGMT1后，转基因拟南芥的甘露糖含量显著增加(图14)。

实施例5转基因株系增强清除活性氧能力和抗盐性的鉴定

转基因植株对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性

①从-20℃冰箱中取出保存的拟南芥野生型(col-0)种子和DoGMT1转基因种子(2个株系，line 1、line 2)，在室温下放置一段时间，取适量的种子于1.5ml离心管中，现配的1％NaClO消毒10min。室温稍离心，弃上清，无菌水漂洗6次。

②4℃黑暗同步化至少2天后，移至培养室，在22℃±2℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。7d后进行盐胁迫处理实验。

③盐胁迫处理为：以培养在不含NaCl的1/2MS培养基上的小苗为对照，将7d大小的转基因植株和野生型植株小心移栽在含150mmol·l^-1NaCl的1/2MS培养基中，各10株，重复3次。

④5d后观察植株的生长情况，并检测转基因株系清除活性氧的能力(图15)。结果表明，野生型小苗的叶片和根在盐胁迫处理下，受到不同的损伤，而超量表达DoGMT1的植株，损伤程度明显减轻(图16)。此外，超量表达DoGMT1后有助于提高植株过氧化氢酶的活性(图17)。因此，超量表达GDP-甘露糖转运蛋白基因DoGMT1后能够显著增强拟南芥清除活性氧的能力，提高其抵御高盐胁迫能力。

根据上述说明书的揭示和指导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

序列表

<110> 中国科学院华南植物园

<120> 一种GDP-甘露糖转运蛋白酶及其编码基因和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1745

<212> DNA

<213> DoGMT1(GDP-甘露糖转运蛋白酶基因)

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agtacatggg gacgcatcgc ttattcggct ccttcttcgt 60

ggctgttcga cttcgctcct tcgacgactt taccttctgt cggatcggaa gttacgacat 120

tttgatcgga agcaacaacg ggagctcgct ggctgtgaag atcagagagc tgaggacacg 180

atagaggccg aagcggcaat caatgatgtc tgatgacaat gggatcacta aaagcagcaa 240

tcatacaaat tcagctgcca actcttcatc atcagcatca aagaatgaca tatcttggag 300

tgaaactctt gcaaatatac tgcaccatgc atcaatatat ggaatagcag ctggctactg 360

tatctctgcc tcccttctat caataatcaa caaatgggct ctcatgaagt tcccctaccc 420

tggtgccttg acagccttac agtatctcac cagtacactt ggagtcctaa tttgtggtta 480

tctaaagctc ctagattatg acagacttga tctcataaca atgtggaaat tcttacctgc 540

tgccctgatt ttctatctct cactctttac caacagcgag ctccttctcc acgccaatgt 600

cgacacgttc atagtgtttc gatctgtcgt ccccatgttt gtagcagtag gagaaacact 660

cttcttaatg cagccatggc cttctctctc aacctggctt tcacttgcca ccatctttgc 720

tggaagtctg atatatgtcc ttactgacta tcaattcaac ttgacagctt acagttgggc 780

cgttgcttac gtcgtaagta tgtcgattga ttttgtttac atcaagcatg tagtgatgac 840

aattggtctg aacacttggg gcctggtgct ctacaacaat ctggaggccc tcttactgtt 900

tcccgttgag ctgcttgtta tgggagagct gaagaagata aggcatgata ttgtggatga 960

atcggactgg cattccttca gtgtggtctt gccagtgggg ctctcttgtt tgtttggttt 1020

ggccatttct ttctttgggt tctcttgccg aagggccatc tctgctacag gttttacagt 1080

gcttggtata gttaacaagc ttctgactgt aatcataaat ttggtgattt gggacaaaca 1140

ttcaacactg attggaacca ttgggctgct tatttgcatg tttggtggag tcctctacca 1200

gcaatccaca tcaaagctga aggcagtgtc ggttcagacc gagtcggcgg tcgaggatga 1260

agaacagcag atgcttctag agatgaagct tgaagttgag gtgaatgaaa accagggcat 1320

tgttgcagaa gagaccactt aaggatttta agattctttt gatgacctaa gtttaaggag 1380

gataagtgag attggctatc ttggaaaact gatggaattg aagacctgtg tgggtatgct 1440

taacaatctg agccaagcag ataatatgca gaaggaaatt ggttatactt tgtgcagggc 1500

aggctctcat tgaagaaaat gcttttgatc aggtgatgtc ttatgataga agtattttta 1560

tgaaaaatta gtctgtgcag acgccgaact ccttctgaat atcaatcaga atacgttaca 1620

tcacttcttt atttcgtact gcggttcggt actgctaatg tggctgcacc taattcacct 1680

ctggaacctc ttaattcaat tttgtttatg attgaagcgt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740

aaaaa 1745

<210> 2

<211> 379

<212> PRT

<213> DoGMT1(GDP-甘露糖转运蛋白酶)

<400> 2

Met Met Ser Ala Ala Ala Gly Ile Thr Leu Ser Ser Ala His Thr Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ala Ile Ser Thr

20 25 30

Ser Gly Thr Leu Ala Ala Ile Leu His His Ala Ser Ile Thr Gly Ile

35 40 45

Ala Ala Gly Thr Cys Ile Ser Ala Ser Leu Leu Ser Ile Ile Ala Leu

50 55 60

Thr Ala Leu Met Leu Pro Pro Thr Pro Gly Ala Leu Thr Ala Leu Gly

65 70 75 80

Thr Leu Thr Ser Thr Leu Gly Val Leu Ile Cys Gly Thr Leu Leu Leu

85 90 95

Leu Ala Thr Ala Ala Leu Ala Leu Ile Thr Met Thr Leu Pro Leu Pro

100 105 110

Ala Ala Leu Ile Pro Thr Leu Ser Leu Pro Thr Ala Ser Gly Leu Leu

115 120 125

Leu His Ala Ala Val Ala Thr Pro Ile Val Pro Ala Ser Val Val Pro

130 135 140

Met Pro Val Ala Val Gly Gly Thr Leu Pro Leu Met Gly Pro Thr Pro

145 150 155 160

Ser Leu Ser Thr Thr Leu Ser Leu Ala Thr Ile Pro Ala Gly Ser Leu

165 170 175

Ile Thr Val Leu Thr Ala Thr Gly Pro Ala Leu Thr Ala Thr Ser Thr

180 185 190

Ala Val Ala Thr Val Val Ser Met Ser Ile Ala Pro Val Thr Ile Leu

195 200 205

His Val Val Met Thr Ile Gly Leu Ala Thr Thr Gly Leu Val Leu Thr

210 215 220

Ala Ala Leu Gly Ala Leu Leu Leu Pro Pro Val Gly Leu Leu Val Met

225 230 235 240

Gly Gly Leu Leu Leu Ile Ala His Ala Ile Val Ala Gly Ser Ala Thr

245 250 255

His Ser Pro Ser Val Val Leu Pro Val Gly Leu Ser Cys Leu Pro Gly

260 265 270

Leu Ala Ile Ser Pro Pro Gly Pro Ser Cys Ala Ala Ala Ile Ser Ala

275 280 285

Thr Gly Pro Thr Val Leu Gly Ile Val Ala Leu Leu Leu Thr Val Ile

290 295 300

Ile Ala Leu Val Ile Thr Ala Leu His Ser Thr Leu Ile Gly Thr Ile

305 310 315 320

Gly Leu Leu Ile Cys Met Pro Gly Gly Val Leu Thr Gly Gly Ser Thr

325 330 335

Ser Leu Leu Leu Ala Val Ser Val Gly Thr Gly Ser Ala Val Gly Ala

340 345 350

Gly Gly Gly Gly Met Leu Leu Gly Met Leu Leu Gly Val Gly Val Ala

355 360 365

Gly Ala Gly Gly Ile Val Ala Gly Gly Thr Thr

370 375

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> GMTF(Artificial Sequence)

<400> 3

tggagtccta atttgtggtt atcta 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> GMTR(Artificial Sequence)

<400> 4

gagaacccaa agaaagaaat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> GMT3F(Artificial Sequence)

<400> 5

attttgttta catcaagcat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> GMT3R(Artificial Sequence)

<400> 6

tctgctacag gttttacagt 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> GMT5F(Artificial Sequence)

<400> 7

caattgtcat cactacatgc ttga 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> GMT5R(Artificial Sequence)

<400> 8

gattattgat agaagggagg caga 24

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> RTGMTF(Artificial Sequence)

<400> 10

cctggtgctc tacaacaatc t 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> RTGMTR(Artificial Sequence)

<400> 11

ccagtccgat tcatccacaa ta 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> DoActinF(Artificial Sequence)

<400> 11

tcccaaggca aacagagaaa 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> DoActinR(Artificial Sequence)

<400> 12

ggccactagc atatagggaa ag 22

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> OEGMTF(Artificial Sequence)

<400> 13

ggactcttga ccatggcaat gatgtctgat gacaat 36

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> OEGMTR(Artificial Sequence)

<400> 14

gtcagatcta ccatggtagt ggtctcttct gcaacaa 37

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> SQGMTF(Artificial Sequence)

<400> 15

atgatgtctg atgacaat 18

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> SQGMTR(Artificial Sequence)

<400> 16

agtggtctct tctgcaacaa 20

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> UBQ10F(Artificial Sequence)

<400> 17

gatctttgcc ggaaaacaat tggaggatgg t 31

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> UBQ10R(Artificial Sequence)

<400> 18

cgacttgtca ttagaaagaa agagataaca gg 32

Claims (7)

1.一种GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种GDP-甘露糖转运蛋白酶DoGMT1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种植物表达载体，其特征在于，含有权利要求1所述的GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1。

4.权利要求3所述的植物表达载体的构建方法，其特征在于，将GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1连接到pCABIA1302载体的Nco I克隆位点获得。

5.权利要求1所述的GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1在调节多糖和甘露糖合成中的应用。

6.权利要求1所述的GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1在提高植物抗逆境胁迫中的应用。

7.根据权利要求5、6所述的GDP-甘露糖转运蛋白酶基因DoGMT1的应用，其特征在于，所述的植物为模式植物拟南芥。