CN107663232A

CN107663232A - 植物抗逆相关蛋白OsIAA18及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN107663232A
Application number: CN201711024597.3A
Authority: CN
Inventors: 王飞兵; 陈新红; 叶玉秀; 周青; 任高磊; 李烽生; 王博文; 杨雨霖
Original assignee: Huaiyin Institute of Technology
Current assignee: Dongdai Jinan Intelligent Technology Co ltd
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2017-10-27
Publication date: 2018-02-06
Anticipated expiration: 2037-10-27
Also published as: CN107663232B

Abstract

本发明公开了一种水稻抗逆性相关蛋白OsIAA18及编码基因与应用。本发明提供一种蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由序列SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，将所述蛋白的编码基因导入植物细胞，可以得到耐盐性和抗旱性显著增强的转基因植株。本发明的蛋白及其编码基因对培育抗逆性增强植物品种具有重要的应用价值，从而提高农作物产量具有重要意义；本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

植物抗逆相关蛋白OsIAA18及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗逆性相关蛋白OsIAA18及其编码基因与应用，特别是来源于水稻的抗逆性相关蛋白OsIAA18及其编码基因与应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是世界主要粮食作物之一，种植水稻需要消耗大量的淡水资源。水资源短缺是当前制约全球农业生产发展的一个严峻的生态问题。干旱是长期以来影响全世界粮食安全的主要限制因素，随着全球气温升高，干旱和半干旱土地面积正在逐年增加。中国干旱半干旱耕地面积约占总耕地面积的51％，每年有将近2.5×106hm²耕地不同程度上受到干旱的影响目前，随着全球气候的变暖和生态平衡的破坏，水资源短缺的现象显得更为严重。作物正常生长发育和高产都必须有充足的水分提供保障，因此，干旱是影响作物产量的最重要的非生物胁迫因素之一，尤其是传统水稻的生产将面临严峻的挑战。

世界上存在大面积的盐渍化的土地。据统计，全世界共有8亿hm²盐碱地，在灌溉地区还有占耕地面积33％的次生盐渍化土地，土壤的盐溃化严重影响现代农业的发展。就我国而言，在全国18亿亩耕地中有近十分之一的次生盐溃化土地，另外还有2000万hm²盐碱荒地。一般来说，盐浓度在0.2％-0.5％会影响作物的生长，但是盐碱地的盐分大都在0.6％-10％。大面积的盐渍化土地的存在严重影响了粮食生产，成为限制农业生产的主要因素。

植物在长期的进化及适应过程中，逐步形成了一系列抵御外界不良环境变化的机制。例如，渗透物质的合成，脯氨酸、糖醇、甜菜碱等被认为是增强植物对逆境胁迫抗性的主要机制；保护酶和抗氧化物质的积累以清除逆境胁迫增加的活性氧的伤害；光合作用的调节；离子的选择性吸收/排斥、离子区隔化；激素调控；与胁迫相关的转录因子以及胁迫诱导蛋白表达等。生长素(IAA)在植物的生长发育过程中有重要作用，可以调控下游基因表达。Aux/IAA和ARF是两类重要的生长素响应转录因子，在植物发育、激素和胁迫响应过程中具有重要作用。在水稻中，有31个Aux/IAA蛋白基因(OsIAA)，大多数该类基因都受生长素诱导表达，同时也受其它激素诱导，以及对胁迫逆境有应答响应。

通过对植物抗性生理的研究，探究植物在逆境胁迫下的生理生化机制并加以人为调控，培育抗逆性显著提高、品质改良的优良作物品种，对农业生产具有重要的理论意义和应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明所提供的蛋白，名称为OsIAA18，来源于水稻，为如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。

所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因为如下(1)～(3)中任一所述的基因：

(1)序列表中如SEQ ID NO 1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

(3)与(1)或(2)的基因具有70％以上的同源性且编码所述蛋白的基因；优选为，与(1)或(2)的基因具有75％以上的同源性且编码所述蛋白的基因；进一步优选为具有80％以上的同源性；更进一步优选为具有85％以上的同源性；更进一步优选为具有90％以上的同源性；更进一步优选为具有95％以上的同源性；更进一步优选为具有96％以上的同源性；更进一步优选为具有97％以上的同源性；更进一步优选为具有98％以上的同源性；更进一步优选为具有99％以上的同源性。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列SEQ ID NO：1由909个碱基组成，其编码的氨基酸序列是序列表中序列SEQ ID NO：2所示的蛋白。

含有所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体是在载体pCBGUS的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；

所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA1301载体经过Hind III和EcoR I双酶切，回收载体大片段；

(2)将pBI121载体经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的片段连接，得到重组载体pCBGUS。

所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。

扩增所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对为如下所示：

OsIAA18-GC-F：5’-ATGGGGGAGGCGTCGG-3’

OsIAA18-GC-R：5’-TCAACACTCAGCAGCTGTTCT-3’

上述蛋白、上述基因或上述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。

一种培育转基因植物的方法，将编码上述蛋白OsIAA18的基因导入目的植物，即得。优选的，所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥和水稻。

本发明的有益效果：

本发明所提供的OsIAA18基因所编码的蛋白可以提高植物的抗逆性。本发明所提供的OsIAA18蛋白及其编码基因在提高植物抗逆性上具有重要的应用价值，为提高水稻抗逆性的研究提供重要的依据。本发明的蛋白及其编码基因对培育抗逆性植物品种具有重要的应用价值，从而提高农作物产量具有重要意义。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1本发明水稻OsIAA18基因植物表达载体简图。

图2本发明OsIAA18转基因拟南芥植株的PCR检测结果图。

图3本发明OsIAA18转基因水稻植株的PCR检测结果图。

图4本发明OsIAA18转基因拟南芥植株耐盐性和抗旱性盆栽鉴定，Col为野生型拟南芥植株，#2和#4为转基因拟南芥植株。

图5本发明OsIAA18转基因水稻植株耐盐性和抗旱性盆栽鉴定，WT为野生型水稻植株，OE2、OE4和OE5为转基因水稻植株。

图6本发明OsIAA18转基因水稻植株抗逆生理生化指标测定，WT为野生型水稻植株，OE2、OE4和OE5为转基因水稻植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

水稻(Gossypium hirsutum)品种‘淮稻5号’，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。

拟南芥(Arabidopsis thaliana)的种子经过2.5％(v/v)CaClO₂消毒后种植在黑土：蛭石：珍珠岩(1:1:1，v：v：v)的混合基质中，22℃，16h光照培养(16h光照，8h黑暗，冷光源)生长2w。

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。

本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》【Molecular Cloning.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989】。

下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【Sambook J,Frets EF,Mannsdes T et al.In:Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989】。

1/2霍格兰营养液记载于如下文献中【Feibing Wang,Weili Kong,Gary Wong,Lifeng Fu,Rihe Peng,Zhenjun Li,Quanhong Yao.AtMYB12regulates flavonoidsaccumulation and abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsisthaliana.Molecular Genetics and Genomics,2016,291:1545-1559】。

实施例1水稻抗逆性相关的蛋白OsIAA18及其编码基因的获得

1.实验材料

参照Jan等(2013)【Asad Jan,Kyonoshin Maruyama,Daisuke Todaka,SatoshiKidokoro,Mitsuru Abo,Etsuro Yoshimura,Kazuo Shinozaki,Kazuo Nakashima andKazuko Yamaguchi-Shinozaki.OsTZF1,a CCCH-Tandem Zinc Finger Protein,ConfersDelayed Senescence and Stress Tolerance in Rice by Regulating Stress-RelatedGenes.Plant Physiology,2013,161:1202-1216】的方法，将水稻品种‘淮稻5号’植物叶片材料取下，液氮速冻，-80℃保存。

2.叶片总RNA提取和纯化

取淮稻5号叶片约2.0g，在液氮中研磨成粉状，加入10mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒(Applygen Technologies Inc，Beijing)提取淮稻5号叶片总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；ExtractionReagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit(QIAGEN，GmbH，Germany)从总RNA中纯化mRNA。最后，取1μL于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD260)和纯度(OD260/OD280)，提取淮稻5号叶片总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于水稻OsIAA18蛋白cDNA全长的克隆。

3.OsIAA18蛋白cDNA的全长克隆

以NCBI(National Center for Biotechnology Information)上的OsIAA18的cDNA序列设计引物进行OsIAA18蛋白cDNA的全长克隆。

引物序列如下：

OsIAA18-GC-F：5’-ATGGGGGAGGCGTCGG-3’

OsIAA18-GC-R：5’-TCAACACTCAGCAGCTGTTCT-3’

以淮稻5号叶片总RNA经Oligo(dT)反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增，PCR条件为95℃1min，随后95℃20s，53℃20s和72℃1min，进行36个循环，最后72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1362bp长度的扩增片段。

综合上述步骤的结果，获得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQID NO 1所示。序列表中序列SEQ ID NO 1由909个碱基组成，自5’端第4位-第906位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列SEQ ID NO 2由302个氨基酸残基组成。将该基因命名为OsIAA18，将其编码的蛋白命名为OsIAA18。

实施例2 OsIAA18基因过表达载体的构建

将实施例1中测序鉴定正确的含有序列表SEQ ID NO 1所示核苷酸的DNA片段用BamH I和Sac I进行双酶切，用1％琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T₄DNA连接酶将回收的OsIAA18基因片段与含有双35S启动子重组载体pCBGUS连接，酶切鉴定和序列分析测定获得了含有水稻OsIAA18基因的重组植物表达载体pCAMBIA1301-OsIAA18。该表达载体还包含gusA报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，载体如图1所示。

实施例3 OsIAA18基因转化拟南芥

将实施例2构建的水稻OsIAA18基因的植物表达载体pCAMBIA1301-OsIAA18用蘸花法转化拟南芥，具体方法如下：

1.农杆菌的准备

(1)将pCAMBIA1301-OsIAA18用电击法转化根癌农杆菌LBA4404菌株(BiovectorCo.,LTD)，得到含有pCAMBIA1301-OsIAA18的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。

(2)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养20h。

(3)取1mL菌液转接入20-30mL LB液体培养基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培养约12h，测OD 600≈1.5。

(4)8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77，浓度单位为g/100ml)并稀释至OD 600≈0.8。

2.拟南芥蘸花法转化

(1)将拟南芥的花薹浸入上述侵染液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化完毕后，用保鲜袋罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置，22℃避光培养，24h后去掉保鲜袋直立培养。

(2)初次转化4d后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。

(3)生长约两个月后，收集种子，4℃冰箱储存待用。

经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。

实施例4 OsIAA18基因转化水稻

将实施例2构建的水稻OsIAA18基因的植物表达载体pCAMBIA1301-OsIAA18转化水稻，具体方法如下：

1.农杆菌的准备

(1)将pCAMBIA1301-OsIAA18用电击法转化根癌农杆菌EHA105菌株(BiovectorCo.,LTD)，得到含有pCAMBIA1301-OsIAA18的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。

(4)8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀释至OD 600≈0.8。

2.水稻成熟胚愈伤的获取

(1)将成熟的水稻品种中花11号种子去掉颖壳，用70％酒精消毒1-2min；

(2)然后用20％的次氯酸钠浸泡30-40min，用无菌蒸馏水冲洗4遍，将种子转移到灭过菌的滤纸上吸干表面水分，然后接种在NB诱导培养基上；

(3)暗培养7-10d后，当盾片膨大，胚乳变软时，去掉胚和芽，把剥下的胚性愈伤转移到NB继代培养基上，大约3w继代一次，继代2-3次后就可以作为受体进行转化。

3.农秆菌介导转化水稻愈伤组织

(1)选取良好的胚性愈伤组织放于上述侵染液中，浸泡30min；

(2)将愈伤组织取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，然后置于NB共培养培养基上培养至刚有菌落出现(大约2-3d)；

(3)用无菌水振荡清洗3-4次，直至上清液完全清洁为止，用500mg/L头孢霉素溶液振荡清洗40min；

(4)取出愈伤组织，放入只带滤纸的无菌培养皿中0.4m/s风干4h，转入NB筛选培养基筛选两轮(每轮3-4w)；

(5)将抗性愈伤进行预分化2-3w，然后转移到分化培养基中光照培养2-3w；

(6)待幼芽长至约1cm时转入壮苗培养基培养30d左右；

(7)揭去封口膜炼苗培养1w左右，然后移栽到土中。

上述过程中所涉及的NB诱导培养基、NB继代培养基、NB共培养培养基、NB筛选培养基、分化培养基、壮苗培养基均为本领域技术人员所公知的。

实施例5 OsIAA18基因转基因拟南芥植株PCR检测

1.转基因拟南芥种子的筛选

(1)称25-30mg种子放入1.5mL离心管；

(2)1mL 75％乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5s，去上清；

(3)加入1mL过滤后的漂白粉(2.5％，g/100ml)消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000rpm离心5s，去上清；

(4)无菌水洗涤3-4次；

(5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(潮霉素50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16h光照培养10天。

(6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T₁)培养至开花结实，收集T₁植株上所结T₂种子，进一步筛选得到T₃种子。

2.转基因拟南芥植株PCR检测

(1)试验方法

用CTAB法提取T₃拟南芥转基因植株和野生型植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的OsIAA18基因引物为：Primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和Primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2mL Eppendorf离心管中加入10×PCRbuffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均为1μL、模板DNA(50ng/uL)2μL、TaqDNA聚合酶0.25μL，加ddH₂O至总体积20μL。反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，共35个循环。

(2)试验结果

电泳检测扩增结果见图2【图2中，泳道M：Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照(重组质粒pCAMBIA1301-OsIAA18)；泳道Col：野生型拟南芥植株；泳道#2和泳道#4：转化pCAMBIA1301-OsIAA18的拟南芥转基因植株】。从图中可见，转化pCAMBIA1301-OsIAA18的烟草拟转基因植株和阳性对照扩增出1093bp的目标条带，表明OsIAA18基因已经整合到拟南芥的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；对照植株Col没有扩增出1093bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。

实施例6 OsIAA18基因转基因水稻植株PCR检测

(1)试验方法

用CTAB法提取T₂水稻转基因植株和野生型植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的OsIAA18基因引物为：Primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和Primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2mL Eppendorf离心管中加入10×PCRbuffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均为1μL、模板DNA(50ng/uL)2μL、TaqDNA聚合酶0.25μL，加ddH₂O至总体积20μL。反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，共35个循环。

(2)试验结果

电泳检测扩增结果见图3【图3中，泳道M：Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照(重组质粒pCAMBIA1301-OsIAA18)；泳道WT：野生型水稻植株；泳道OE1-OE7：为转化pCAMBIA1301-OsIAA18的水稻转基因植株】。从图中可见，转化pCAMBIA1301-OsIAA18的水稻拟转基因植株和阳性对照扩增出1093bp的目标条带，表明OsIAA18基因已经整合到水稻的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型水稻植株没有扩增出1093bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。

实施例7 OsIAA18基因转基因拟南芥植株耐盐性和抗旱性鉴定

(1)试验方法

将转基因拟南芥和野生型种子在1/2MS培养基上培养2w后，将植株移栽到盆中培养2w后，进行盐、干旱胁迫处理。用含有200mM NaCl的1/2霍格兰营养液每2d灌溉1次，每次200mL，处理4w，观察植株生长情况并统计存活率；干旱处理6w后，观察植株生长情况并统计存活率。

(2)试验结果

结果显示，通过耐盐性和抗旱性盆栽鉴定，结果见图4，盐处理4w或干旱处理6w后，转基因植株的生长状态显著优于野生型植株，转基因植株的存活率显著高于野生性植株。表明过表达OsIAA18基因显著提高转基因拟南芥植株的耐盐性和抗旱性。

实施例8 OsIAA18基因转基因水稻植株耐盐性和抗旱性鉴定

(1)试验方法

为了验证转基因水稻材料的耐盐性和抗旱性，将纯合的T₂转基因水稻和野生型水稻种子表面消毒，用纯净水催芽，接种在MS培养基上，生长大约3-4d。挑选长势一致的幼苗，种植在以营养土：蛭石＝1:2的营养土中，注意每天浇水，等到植株长到4片真叶时开始进行盐、干旱胁迫处理。用含有200mM NaCl的1/2霍格兰营养液每个2d灌溉1次，每次200mL，处理4w，观察其表型，进行照相并调查其存活率；干旱处理6w后，观察其表型，进行照相并调查其存活率。

(2)试验结果

结果显示，在盐胁迫处理条件4w或干旱胁迫处理6w后，结果见图5，转基因植株的生长状态显著优于野生型植株，转基因植株的存活率显著高于野生性植株。表明过表达OsIAA18基因显著提高转基因水稻植株的耐盐性和抗旱性。

实施例9 OsIAA18基因转基因水稻植株抗逆生理生化指标的测定

1.脯氨酸含量测定

(1)试验方法

植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、盐等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。

测定方法参考文献【Feibing Wang,Weili Kong,Gary Wong,Lifeng Fu,RihePeng,Zhenjun Li,Quanhong Yao.AtMYB12regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.MolecularGenetics and Genomics,2016,291:1545-1559】，检测水稻植株的脯氨酸含量。水稻植株为空白对照中处理2w的水稻植株、盐胁迫2w的水稻植株、干旱胁迫4w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。

(2)试验结果

实验结果见图6中A(Normal为空白对照，NaCl为盐胁迫，Drought为干旱胁迫)。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE4植株和OE5植株的脯氨酸含量显著高于野生型水稻植株。

2.SOD活性测定

(1)试验方法

超氧化物歧化酶(SOD)活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

测定方法参考文献【Feibing Wang,Weili Kong,Gary Wong,Lifeng Fu,RihePeng,Zhenjun Li,Quanhong Yao.AtMYB12regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.MolecularGenetics and Genomics,2016,291:1545-1559】，检测水稻植株的SOD活性。水稻植株为空白对照中处理2w的水稻植株、盐胁迫2w的水稻植株、干旱胁迫4w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。

(2)试验结果

实验结果见图6中B(Normal为空白对照，NaCl为盐胁迫，Drought为干旱胁迫)。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE4植株和OE5植株的SOD活性显著高于野生型水稻植株。

3.POD活性测定

(1)试验方法

过氧化物酶(POD)活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。POD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。

(2)试验结果

实验结果见图6中C(Normal为空白对照，NaCl为盐胁迫，Drought为干旱胁迫)。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE4植株和OE5植株的POD活性显著高于野生型水稻植株。

4.MDA含量测定

(1)试验方法

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

测定方法参考文献【Feibing Wang,Weili Kong,Gary Wong,Lifeng Fu,RihePeng,Zhenjun Li,Quanhong Yao.AtMYB12regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.MolecularGenetics and Genomics,2016,291:1545-1559】，检测水稻植株的MDA含量。水稻植株为空白对照中处理2w的水稻植株、盐胁迫2w的水稻植株、干旱胁迫4w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。

(2)试验结果

实验结果见图6中D(Normal为空白对照，NaCl为盐胁迫，Drought为干旱胁迫)。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE4植株和OE5植株的MDA含量显著低于野生型水稻植株。

5.H₂O₂含量测定

(1)试验方法

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H₂O₂发生累积。H₂O₂可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H₂O₂的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。

(2)试验结果

实验结果见图6中E(Normal为空白对照，NaCl为盐胁迫，Drought为干旱胁迫)。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE4植株和OE5植株的H₂O₂含量显著低于野生型水稻植株。

序列表

<110> 淮阴工学院

<120> 植物抗逆相关蛋白OsIAA18及其编码基因与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 909

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgggagaag catctgagtc tatgaagaag atcagtcgtg gcagacttgg tggcagctgg 60

atgggtgaac caagcgatca ccacagacat ggtgatgaac aggaagaaga agagaagacc 120

cttgaactca gccttggact gcctggagga ggatggagag ctgcctgtag agacaaagga 180

accaccacca agcactccat tgcagcagct gctgctgctg atgatgatga tggtgacaag 240

agttccatgc tgtctcttgg ctactccact ctcgtctctc actcccaagg caaggccaac 300

aagaacaagg gatctccaga ggaagaagag gcacatccac caccagctac tggcaacaac 360

gcacttgcat ccaacaacaa tggctgcttc cagactcgtt ctccaagtac tccagttgtt 420

ggttggccac ctgtcagaac cttcagaaga aacctggcta cttccagcaa agcctctctt 480

gaactccaga atggcaagaa ggctgccaaa gcagaagaga tcaagcgtgc tccattcatc 540

aagatcaaca tggatggtgt ccctattggc agaaagatcg atctgaatgc tttcgacagc 600

tacgagaagc tctctcttgc tgttgacaag ctgttcagag gacttcttgc agcacagaga 660

gatccactga ctgctggagc caaggactgt cagcaggaag atgttgccat ctctggactg 720

ctggatggaa ctggtgagta cactctggtc tatgaggact atgaaggtga caaggtcctt 780

gttggagatg ttccttgggg aatgtttgtc tcttccgtca agagactgag agtcctgaag 840

acctctgacc tgtcttcctc tctgatcacc tctggcagaa agagaactgc tgctgagtgc 900

gaattctaa 909

<210> 2

<211> 302

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Gly Glu Ala Ser Glu Ser Met Lys Lys Ile Ser Arg Gly Arg Leu

1 5 10 15

Gly Gly Ser Trp Met Gly Glu Pro Ser Asp His His Arg His Gly Asp

20 25 30

Glu Gln Glu Glu Glu Glu Lys Thr Leu Glu Leu Ser Leu Gly Leu Pro

35 40 45

Gly Gly Gly Trp Arg Ala Ala Cys Arg Asp Lys Gly Thr Thr Thr Lys

50 55 60

His Ser Ile Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Asp Asp Asp Gly Asp Lys

65 70 75 80

Ser Ser Met Leu Ser Leu Gly Tyr Ser Thr Leu Val Ser His Ser Gln

85 90 95

Gly Lys Ala Asn Lys Asn Lys Gly Ser Pro Glu Glu Glu Glu Ala His

100 105 110

Pro Pro Pro Ala Thr Gly Asn Asn Ala Leu Ala Ser Asn Asn Asn Gly

115 120 125

Cys Phe Gln Thr Arg Ser Pro Ser Thr Pro Val Val Gly Trp Pro Pro

130 135 140

Val Arg Thr Phe Arg Arg Asn Leu Ala Thr Ser Ser Lys Ala Ser Leu

145 150 155 160

Glu Leu Gln Asn Gly Lys Lys Ala Ala Lys Ala Glu Glu Ile Lys Arg

165 170 175

Ala Pro Phe Ile Lys Ile Asn Met Asp Gly Val Pro Ile Gly Arg Lys

180 185 190

Ile Asp Leu Asn Ala Phe Asp Ser Tyr Glu Lys Leu Ser Leu Ala Val

195 200 205

Asp Lys Leu Phe Arg Gly Leu Leu Ala Ala Gln Arg Asp Pro Leu Thr

210 215 220

Ala Gly Ala Lys Asp Cys Gln Gln Glu Asp Val Ala Ile Ser Gly Leu

225 230 235 240

Leu Asp Gly Thr Gly Glu Tyr Thr Leu Val Tyr Glu Asp Tyr Glu Gly

245 250 255

Asp Lys Val Leu Val Gly Asp Val Pro Trp Gly Met Phe Val Ser Ser

260 265 270

Val Lys Arg Leu Arg Val Leu Lys Thr Ser Asp Leu Ser Ser Ser Leu

275 280 285

Ile Thr Ser Gly Arg Lys Arg Thr Ala Ala Glu Cys Glu Phe

290 295 300

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggggagg cgtcgg 16

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaacactca gcagctgttc t 21

Claims

1.一种蛋白，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下(1)-(3)中任何一种的DNA分子；

(1)其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物抗逆性相关蛋白的DNA分子；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％同源性且编码植物抗逆性相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述基因插入表达载体中即得。

6.扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对。

7.根据权利要求6所述的引物对，其序列如下：

OsIAA18-GC-F：5’-ATGGGGGAGGCGTCGG-3’

OsIAA18-GC-R：5’-TCAACACTCAGCAGCTGTTCT-3’

8.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物抗逆性中的应用；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

9.一种培育转基因植物的方法，其特征在于：包括以下步骤：将编码权利要求1所述蛋白的基因导入目的植物，即得。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：编码权利要求1所述蛋白的基因是通过权利要求4或5所述的重组载体导入目的植物；所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。