CN111303260A - 一种植物抗逆性相关蛋白OsC3HC4及编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物抗逆性相关蛋白OsC3HC4及编码基因与应用。本发明提供一种蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由序列SEQ ID NO 2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，将所述蛋白的编码基因导入植物细胞，可以得到抗逆性增强的转基因植株。本发明的蛋白及其编码基因对培育抗逆性植物品种具有重要的应用价值，从而提高农作物产量具有重要意义；本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

一种植物抗逆性相关蛋白OsC3HC4及编码基因与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物抗逆性相关蛋白OsC3HC4及其编码基因与应用。
背景技术
水稻（Oryza sativa L.）是世界主要粮食作物之一，地球上近一半人口都以稻米为食，种植水稻需要消耗大量的淡水资源。世界上存在大面积的盐渍化的土地。据统计，全世界共有8亿 hm2盐碱地，在灌溉地区还有占耕地面积33%的次生盐渍化土地，土壤的盐溃化严重影响现代农业的发展。就我国而言，在全国18亿亩耕地中有近十分之一的次生盐溃化土地，另外还有2000万hm2盐碱荒地。一般来说，盐浓度在0.2%-0.5%会影响作物的生长，但是盐碱地的盐分大都在0.6%-10%。大面积的盐渍化土地的存在严重影响了粮食生产，成为限制农业生产的主要因素。随着世界人口的剧增及可耕地面积的逐年下降，粮食生产安全受到了严重威胁，对于人均耕地面积相对较小的中国更是日益严重的问题。
水资源短缺是当前制约全球农业生产发展的一个严峻的生态问题。干旱是长期以来影响全世界粮食安全的主要限制因素，随着全球气温升高，干旱和半干旱土地面积正在逐年增加。中国干旱半干旱耕地面积约占总耕地面积的51%，每年有将近2.5×106 hm2耕地不同程度上受到干旱的影响。目前，随着全球气候的变暖和生态平衡的破坏，水资源短缺的现象显得更为严重。作物正常生长发育和高产都必须有充足的水分提供保障。因此，干旱是影响作物产量的最重要的非生物胁迫因素之一，尤其是传统水稻的生产将面临严峻的挑战。
环境直接影响作物的生长发育，如干旱、高盐、低温和高温等都会不同程度的造成植物细胞缺水。为了适应胁迫环境，植物在长期的进化中，通过一系列的生理生化变化来响应环境的水分胁迫，从而逐渐建立起了适应和抗性机制。当植物遭受水分胁迫时，会快速感知和主动适应环境的变化，通过胞间和胞内逆境信息的传递和转导，做出积极的应答反应。首先，外界信号被植物细胞膜上的信号受体（可能包括离子通道蛋白、组氨酸激酶、G蛋白偶联受体等）捕捉；随后，产生能在细胞内传递的第二信使（Ca2+、活性氧ROS、肌醇-1,4,5-三磷酸IP3、二酰基甘油DAG、ABA等）；其次，第二信使介导下游的蛋白质磷酸化串联物（如CDPK、SOS/PKS、MAPK、SnRK2等）的磷酸化反应，启动蛋白磷酸化通路；这些蛋白质磷酸化级联物激活下游一系列的转录因子（如EREBP/AP2、bZIP、NAC、Zinc finger等）；最后，这些转录因子特异性地激活一批与胁迫应答的靶基因，产生一些使细胞免受胁迫伤害的物质（如胚胎晚期丰富蛋白LEA、渗透调节蛋白、抗冻蛋白、通道蛋白等），从而增强植物对胁迫的耐受能力。
在长期的进化过程中，植物发展出了一系列的耐盐抗旱机制。随着分子生物学的迅速发展，植物耐盐抗旱生理生化机制日益明确，使得克隆与植物耐盐抗旱相关基因成为可能。加强植物耐盐抗旱生理的研究，探明植物在逆境下的生命活动规律并加以人为调控，利用基因工程技术提高植物抗逆性，培育具有抵抗不良环境性状的优良品种，以提高作物的产量和品质，对于获得农业高产稳产具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供蛋白OsC3HC4及编码基因在提高植物抗逆性中的应用，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明所提供的蛋白，名称为OsC3HC4，来源于水稻（Oryza sativa），如下的（a）或（b）蛋白质：
（a）由序列表中序列SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列SEQ ID NO2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由（a）衍生的蛋白质。
所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因为如下（1）-（3）中任一所述的基因：
（1）序列表中序列SEQ ID NO 1中690个碱基核苷酸所示的DNA分子；
（2）在严格条件下与（1）所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；
（3）与（1）或（2）的基因至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或者至少具有99%同源性且编码植物抗逆性相关蛋白的DNA分子。
以上（2）中所述严格条件可为用6×SSC，0.5% SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1% SDS和1×SSC，0.1% SDS各洗膜一次。
序列表中的序列SEQ ID NO 1由690个碱基组成，编码氨基酸序列是序列表中序列SEQ ID NO 2所示的蛋白。
含有所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体是在载体pCBGUS的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；
所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：
（1）将pCAMBIA1301载体经过Hind III和EcoR I双酶切，回收载体大片段；
（2）将pBI121载体经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的片段；
（3）将步骤（1）中回收的载体大片段与步骤（2）中回收的包含gusA基因的片段连接，得到重组载体pCBGUS。
所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。
扩增所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对为如下所示：
OsC3HC4-GC-F：5’-ATGTCGCTGCCTTCCAAGGCCGA-3’
OsC3HC4-GC-R：5’-TCACGCACAGCCGACGCTGTCGTCT-3’
上述蛋白、上述基因或上述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高植物抗逆性中的应用也属于本发明的保护范围。
一种培育转基因植物的方法，将编码上述蛋白OsC3HC4的编码基因导入目的植物，获得转基因植物。
优选地，所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。
优选地，所述目的植物组织为叶片。
进一步地，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物为水稻。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所提供的OsC3HC4基因所编码的蛋白可以提高植物的抗逆性且在提高植物抗逆性上具有重要的应用价值，为提高植物抗逆性的研究提供重要的依据；从试验结果来看，转基因植物表现出很好的生长状态，转基因材料的苗长和鲜重分别比野生型WT材料提高了115～119%和146～165%；在甘露醇胁迫下，转基因材料的苗长和鲜重分别比野生型WT材料提高了97～105%和139～156%;转基因植株的存活率显著高于野生型植株，较野生型植株相比分别提高了687～756%和557～643%，表达出很强的耐盐性和抗旱性，因此本发明的蛋白及其编码基因对培育抗逆性植物品种具有重要的应用价值，从而提高农作物产量具有重要意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1 本发明OsC3HC4基因在水稻品种淮稻5号中的逆境胁迫表达分析。
图2 本发明OsC3HC4基因植物表达载体简图。
图3 本发明OsC3HC4基因转基因水稻植株的PCR检测结果图。
图4 本发明OsC3HC4基因在过表达水稻株系和野生型水稻植株中的表达。
图5 本发明OsC3HC4基因转基因水稻植株在200 mM NaCl、200 mM甘露醇的MS培养基上的生长和生根情况，WT为野生型水稻植株，OE2、OE3和OE5为转基因水稻植株。
图6 本发明OsC3HC4基因转基因水稻植株的耐盐性和抗旱性盆栽鉴定，WT为野生型水稻植株OE2、OE3和OE5为转基因水稻植株。
图7 本发明OsC3HC4基因转基因水稻植株抗逆生理生化指标测定，WT为野生型水稻植株，OE2、OE3和OE5为转基因水稻植株。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：
水稻（Oryza sativa）品种淮稻5号和中花11号，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。克隆载体PMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。
本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》【Molecular Cloning. 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989】。
下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【Sambook J, Frets EF,Mannsdes T et al. In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989】。
1/2霍格兰营养液记载于如下文献中【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong,Lifeng Fu, Rihe Peng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoidsaccumulation and abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana.Molecular Genetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】。
实施例1 水稻抗逆性相关的蛋白及其编码基因的获得
1. 实验材料
参照Jan等（2013）【Asad Jan, Kyonoshin Maruyama, Daisuke Todaka, SatoshiKidokoro, Mitsuru Abo, Etsuro Yoshimura, Kazuo Shinozaki, Kazuo Nakashima andKazuko Yamaguchi-Shinozaki. OsTZF1, a CCCH-Tandem Zinc Finger Protein,Confers Delayed Senescence and Stress Tolerance in Rice by Regulating Stress-Related Genes. Plant Physiology, 2013, 161:1202-1216】的方法，将水稻品种‘淮稻5号’植物叶片材料取下，液氮速冻，-80℃保存。
2. 叶片总RNA提取和纯化
取淮稻5号幼苗展开叶片约2.0 g，在液氮中研磨成粉状，加入10 mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒（Applygen Technologies Inc，Beijing）提取甘薯块根总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit （QIAGEN，GmbH，Germany）从总RNA中纯化mRNA。最后，取1 μL于1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2 μL稀释至500 μL，用紫外分光光度计检测其质量（OD260）和纯度（OD260/OD280），提取的淮稻5号幼苗叶片总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于水稻OsC3HC4蛋白cDNA全长的克隆。
3. OsC3HC4蛋白cDNA的全长克隆
以OsC3HC4基因cDNA序列设计引物进行OsC3HC4蛋白cDNA的全长克隆。
引物序列如下：
OsC3HC4-GC-F：5’-ATGTCGCTGCCTTCCAAGGCCGA-3’
OsC3HC4-GC-R：5’-TCACGCACAGCCGACGCTGTCGTCT-3’
以淮稻5号幼苗展开叶片总RNA经Oligo（dT）反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增，PCR条件为95℃ 1 min，随后95℃ 20 s，53℃ 20 s和72℃ 1 min，进行36个循环，最后72℃延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得690 bp长度的扩增片段。
综合上述步骤的结果，获得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQID NO 1所示。序列表中序列SEQ ID NO 1由690个碱基组成，自5’端第1位-第690位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列SEQ ID NO 2由229个氨基酸残基组成。将该基因命名为OsC3HC4，将其编码的蛋白命名为OsC3HC4。
实施例2 OsC3HC4基因的逆境胁迫表达分析
1. 逆境胁迫处理
将淮稻5号的饱满种子用1%次氯酸钠表面消毒20 min，蒸馏水冲洗6遍，然后用蒸馏水浸泡24-36 h，置于湿纱布上，32 ℃催芽大约2 d。将发芽一致的种子播于粘有纱布的泡沫塑料孔板上，进行液体培养，正常生长4 w后，开始以下胁迫处理。
甘露醇处理：将水稻幼苗从营养液中转移到含有200 mM甘露醇的溶液中，分别在0、3、6、12、24、48 h 取水稻的根和叶；
PEG处理：处理方法同甘露醇，PEG6000溶液的浓度是20%，分别在0、3、6、12、24、48 h 取水稻的根和叶；
NaCl处理：处理方法同甘露醇，NaCl 溶液的浓度是200 mM，分别在0、3、6、12、24、48 h取水稻的根和叶；
ABA处理：处理方法同甘露醇，ABA 溶液的浓度是100 μM，分别在0、3、6、12、24、48 h 取水稻的根和叶；
对照处理：直接取未经任何处理的幼苗根和叶作为对照（0 h）。
所有样品取样后立即经液氮冷冻，-80℃保存。
逆境胁迫qRT-PCR分析
分别提取上述步骤中的各处理根和叶总RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR分析，鉴定OsC3HC4基因在水稻不同胁迫处理后的表达特征。OsActin基因为内参：OsActin-F：5’-TTATGGTTGGGATGGGACA-3’和OsActin-R：5’-AGCACGGCTTGAATAGCG-3’；OsC3HC4引物序列为：OsC3HC4-F：5’-CATGTGCGACTCCTACTCTCC-3’和OsC3HC4-R：5’-GTCGACGGGGGAAGAACAAG-3’。
结果如图2所示，OsC3HC4基因能被甘露醇、PEG6000、NaCl和ABA诱导表达，表明OsC3HC4基因与植物耐盐性和抗旱性相关。
实施例3 OsC3HC4基因过表达载体的构建
将实施例1中测序鉴定正确的含有序列表SEQ ID NO 1所示核苷酸的DNA片段用BamH I和Sac I进行双酶切，用1%琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T4 DNA连接酶将回收的OsC3HC4基因片段与含有双35S启动子pYPx245质粒连接，酶切鉴定和序列分析测定获得了含有水稻OsC3HC4基因的重组质粒AH128。该表达载体还包含gusA 报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，载体如图2所示。
实施例4 OsC3HC4基因转化水稻
将实施例3构建的水稻OsC3HC4基因的植物表达载体pCAMBIA1301-OsC3HC4转化水稻，具体方法如下：
1. 农杆菌的准备
（1）将pCAMBIA1301-OsC3HC4用电击法转化根癌农杆菌EHA105菌株（Biovector Co.,LTD），得到含有pCAMBIA1301-OsC3HC4的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。
（2）挑取农杆菌单菌接种于5 mL LB 液体培养基（利福平 50 μg/mL，氯霉素100 μg/mL）中，28 ℃，250 rpm培养20 h。
（3）取1 mL菌液转接入20-30 mL LB液体培养基（利福平 50 μg/mL，氯霉素100 μg/mL）中，28 ℃，250 rpm培养约12 h，测OD 600 ≈ 1.5。
（4）8000 rpm，4 ℃，10 min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5% 蔗糖，0.05% Silwet L-77）并稀释至OD 600 ≈ 0.8。
水稻成熟胚愈伤的获取
（1）将成熟的水稻品种中花11号种子去掉颖壳，用70%酒精消毒1-2 min；
（2）然后用20%的次氯酸钠浸泡30-40 min，用无菌蒸馏水冲洗4遍，将种子转移到灭过菌的滤纸上吸干表面水分，然后接种在NB诱导培养基上；
（3）暗培养7-10 d后，当盾片膨大，胚乳变软时，去掉胚和芽，把剥下的胚性愈伤转移到NB继代培养基上，大约3 w继代一次，继代2-3次后就可以作为受体进行转化。
农秆菌介导转化水稻愈伤组织
（1）选取良好的胚性愈伤组织放于上述侵染液中，浸泡30 min；
（2）将愈伤组织取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，然后置于NB共培养培养基上培养至刚有菌落出现（大约2-3 d）；
（3）用无菌水振荡清洗3-4 次，直至上清液完全清洁为止，用500 mg/L头孢霉素溶液振荡清洗40 min；
（4）取出愈伤组织，放入只带滤纸的无菌培养皿中0.4 m/s风干4 h，转入NB筛选培养基筛选两轮（每轮3-4 w）；
（5）将抗性愈伤进行预分化2-3 w，然后转移到分化培养基中光照培养2-3 w；
（6）待幼芽长至约1 cm时转入壮苗培养基培养30 d左右；
（7）揭去封口膜炼苗培养1 w左右，然后移栽到土中。
实施例5 OsC3HC4基因转基因水稻植株分子检测
1. 转基因水稻植株PCR检测
（1）试验方法
用CTAB法提取T2水稻转基因植株和野生型植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR 检测，所使用的hpt II基因引物为：Primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA -3’和Primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2 mL Eppendorf 离心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP（10 mol/L）1 μL、引物（10 μmol/L）均为1 μL、模板DNA（50 ng/uL） 2 μL、 TaqDNA聚合酶 0.25 μL，加ddH2O至总体积20 μL。反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性30s，55℃复性30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环。
（2）试验结果
电泳检测扩增结果见图3【图3中，泳道M：Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照（重组质粒pCAMBIA1301-OsC3HC4）；泳道NT：野生型水稻植株；泳道OE1-OE7：为转化pCAMBIA1301-OsC3HC4的水稻转基因植株】。从图中可见，转化pCAMBIA1301-OsC3HC4的水稻拟转基因植株和阳性对照扩增出591 bp的目标条带，表明OsC3HC4基因已经整合到水稻的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型水稻植株没有扩增出591 bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。
转基因水稻植株qRT-PCR检测
（1）试验方法
提取阳性转OsC3HC4水稻株系RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR分析，以未转化的烟草野生型为对照。OsActin基因为内参：OsActin-F：5’-TTATGGTTGGGATGGGACA-3’和OsActin-R：5’-AGCACGGCTTGAATAGCG-3’；OsC3HC4引物序列为：OsC3HC4-F：5’-CATGTGCGACTCCTACTCTCC-3’和OsC3HC4-R：5’-GTCGACGGGGGAAGAACAAG-3’。
（2）试验结果
结果如图4所示，WT为野生型烟草植株，OE1-OE7均为阳性转OsC3HC4水稻植株，表明OsC3HC4在转基因水稻植株中有不同程度的表达。
实施例6 OsC3HC4基因转基因水稻植株抗逆性鉴定
1. 转基因水稻植株抗逆性离体鉴定
（1）试验方法
将转基因水稻材料和野生型材料的种子消毒，种子播种在MS固体平板上，种子发芽2-3d后，选取发芽状态一致的种子，分别播种在MS、MS+NaCl（200 mM）和MS+甘露醇（200 mM）的不同中指管培养基上，苗生长7-10 d之后，不同处理的苗长势开始出现差异，进行照相和生长势统计，包括苗长和鲜重数据。
（2）试验结果
结果显示，在盐胁迫、甘露醇处理条件下，结果见图5，转基因材料和野生型WT材料均因为盐胁迫、甘露醇胁迫条件的存在，植株变小；但是转基因材料和野生型WT相比，生长状态相对较好，生长势数据统计显示，在盐胁迫下，转基因材料的苗长和鲜重分别比野生型WT材料提高了115～119%和146～165%；在甘露醇胁迫下，转基因材料的苗长和鲜重分别比野生型WT材料提高了97～105%和139～156%；表明过表达OsC3HC4基因显著提高转基因水稻植株的耐盐性和抗旱性。
转基因水稻植株抗逆性盆栽鉴定
（1）试验方法
为了验证转基因水稻材料的耐盐性和抗旱性，将纯合的T2转基因水稻和野生型水稻种子表面消毒，用纯净水催芽，接种在MS培养基上，生长大约3-4 d。挑选长势一致的幼苗，种植在以营养土：蛭石=1:2的营养土中，注意每天浇水，等到植株长到4 w后开始进行盐、干旱胁迫处理。用含有200 mM NaCl的1/2霍格兰营养液每个2 d灌溉1次，每次200 mL，处理4 w，观察其表型，进行照相并调查其存活率；干旱处理6 w后，观察其表型，进行照相并调查其存活率。以下涉及存活率提高的计算方式是：（转基因植株存活率-野生型植株存活率）*100%/野生型植株存活率。
（2）试验结果
结果显示，在盐胁迫处理条件4 w或干旱胁迫处理6 w后，结果见图5，转基因植株的生长状态显著优于野生型植株，转基因植株的存活率显著高于野生型植株，较野生型植株相比分别提高了687～756%和557～643%；表明过表达OsC3HC4基因显著提高转基因水稻植株的耐盐性和抗旱性。
实施例7 OsC3HC4基因转基因水稻植株抗逆生理生化指标的测定
1. 脯氨酸含量测定
（1）试验方法
植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、盐等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测水稻植株的脯氨酸含量。水稻植株为空白对照中处理2 w的水稻植株、盐胁迫2 w的水稻植株、干旱胁迫4 w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
水稻植株脯氨酸含量测定实验结果见图7中A（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE3植株和OE5植株的脯氨酸含量显著高于野生型水稻植株。
22含量测定
（1）试验方法
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H2O2的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测水稻植株的H2O2含量。水稻植株为空白对照中处理2 w的水稻植株、盐胁迫2 w的水稻植株、干旱胁迫4 w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
水稻植株H2O2含量测定实验结果见图7中B（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE3植株和OE5植株的H2O2含量显著低于野生型水稻植株。
含量测定
（1）试验方法
植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测水稻植株的MDA含量。水稻植株为空白对照中处理2 w的水稻植株、盐胁迫2 w的水稻植株、干旱胁迫4 w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
水稻植株MDA含量测定实验结果见图7中C（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE3植株和OE5植株的MDA含量显著低于野生型水稻植株。
活性测定
（1）试验方法
超氧化物歧化酶（SOD）活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测水稻植株的SOD活性。水稻植株为空白对照中处理2 w的水稻植株、盐胁迫2 w的水稻植株、干旱胁迫4 w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
水稻植株SOD活性测定实验结果见图7中D（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE3植株和OE5植株的SOD活性显著高于野生型水稻植株。
活性测定
（1）试验方法
过氧化物酶（POD）活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。POD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao. AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测水稻植株的POD活性。水稻植株为空白对照中处理2 w的水稻植株、盐胁迫2 w的水稻植株、干旱胁迫4 w的水稻植株。实验需重复三次，结果取平均值。
（2）试验结果
水稻植株POD活性测定实验结果见图7中E（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因水稻OE2植株、OE3植株和OE5植株的POD活性显著高于野生型水稻植株。
生理生化指标的测定结果表明，经过表达OsC3HC4基因显著提高转基因水稻植株的耐盐性和抗旱性。
附：本发明所涉及到的核苷酸序列表：
<110> 淮阴工学院
<120> 蛋白OsC3HC4及编码基因在提高植物抗逆性中的应用
<210> SEQ ID NO 1
<211> 690
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa）
atgtcgctgc cttccaaggc cgagctgctc ggccgcgtcc tcatccgctc cctcctcctt 60
ctcctccccg cgctgtcgcc tgacggatcg caccacctgc tccgcatccc ggctaccgac 120
ctcgacgccg cgatcctgct cctcgccatg tgcgactcct actctccccc ggccgcggcg 180
tcgtcttcct ccccttcttg ttcttccccc gtcgactggc acgcgctgct cgtcgacgac 240
gcggtgggct ccgcgctctc catctccggc ctcggcgcca cgccgtgggc gtcgctcgcc 300
ccctacgtcg acgcggccgc caagtgccgc cgcttcgctg acgtcgtgtc gcaggaacgc 360
gtggcggtcg gcggcgggaa ggacggcgag tggcgcggcg gggcgtcgta cgccgccgta 420
ctggcgatgc cccccgcggc cggggacggc gcgccgtgcg cgatctgcag ggaggagatg 480
gtgcgtcgcg gcggcggggg cgtgtgcgcg ctgcgcccgt gcggtcaccg gttccattgg 540
cactgcgcgc tccggtggct ggcgcggcgg aacacctgcc cttgctgccg cgcggagctg 600
cccgcggagg acgcgcgcgc cgagacccgg cggctgtggc gggcggtgga gaggatggca 660
gccggagacg acagcgtcgg ctgtgcgtga 690
<210> SEQ ID NO 2
<211> 229
<212> PRT
<213> 水稻（Oryza sativa）
Met Ser Leu Pro Ser Lys Ala Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Ile Arg
1 5 10 15
Ser Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ala Leu Ser Pro Asp Gly Ser His His
20 25 30
Leu Leu Arg Ile Pro Ala Thr Asp Leu Asp Ala Ala Ile Leu Leu Leu
35 40 45
Ala Met Cys Asp Ser Tyr Ser Pro Pro Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser
50 55 60
Pro Ser Cys Ser Ser Pro Val Asp Trp His Ala Leu Leu Val Asp Asp
65 70 75 80
Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ile Ser Gly Leu Gly Ala Thr Pro Trp
85 90 95
Ala Ser Leu Ala Pro Tyr Val Asp Ala Ala Ala Lys Cys Arg Arg Phe
100 105 110
Ala Asp Val Val Ser Gln Glu Arg Val Ala Val Gly Gly Gly Lys Asp
115 120 125
Gly Glu Trp Arg Gly Gly Ala Ser Tyr Ala Ala Val Leu Ala Met Pro
130 135 140
Pro Ala Ala Gly Asp Gly Ala Pro Cys Ala Ile Cys Arg Glu Glu Met
145 150 155 160
Val Arg Arg Gly Gly Gly Gly Val Cys Ala Leu Arg Pro Cys Gly His
165 170 175
Arg Phe His Trp His Cys Ala Leu Arg Trp Leu Ala Arg Arg Asn Thr
180 185 190
Cys Pro Cys Cys Arg Ala Glu Leu Pro Ala Glu Asp Ala Arg Ala Glu
195 200 205
Thr Arg Arg Leu Trp Arg Ala Val Glu Arg Met Ala Ala Gly Asp Asp
210 215 220
Ser Val Gly Cys Ala
225
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种蛋白OsC3HC4，其特征在于，是如下（a）或（b）蛋白质：
（a）由序列表中序列SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列表中序列SEQ ID NO2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由（a）衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下（1）-（3）中任一所述的基因：
（1）.序列表中序列SEQ ID NO 1中690个碱基核苷酸所示的DNA分子；
（2）.与（1）所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；
（3）.与（1）或（2）限定的DNA序列至少具有70%以上同源性且编码植物抗逆性相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为将权利要求1所述蛋白质的编码基因插入表达载体中，得到表达权利要求1所述蛋白质的重组表述载体。
6. 扩增权利要求2或3所述基因全长或其任意片段的引物对，所述引物对为如下所示：
OsC3HC4-GC-F：5’-ATGTCGCTGCCTTCCAAGGCCGA-3’
OsC3HC4-GC-R：5’-TCACGCACAGCCGACGCTGTCGTCT-3’。
7.权利要求1所述蛋白质、权利要求2或3所述编码基因或权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调节植物抗逆性中的应用；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
8.一种培育转基因植物的方法，包括如下（a1）和（a2）的步骤：
（a1）向目的植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；
（a2）从步骤（a1）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗逆性提高的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤（a1）中，所述编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入所述目的植物的。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
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