JP2003047466A - 塩ストレス耐性を制御する新規イネ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 塩ストレス耐性を制御するタンパク質をコー
ドする遺伝子を提供すること。 【解決手段】 イネ由来の塩ストレス耐性を制御する植
物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、上記
ポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列、または該
アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠
失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を有し、かつ塩ストレス耐性
を制御する機能を有するポリヌクレオチドを含む、ポリ
ヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規遺伝子に関す
る。より詳細には、植物において塩ストレス耐性を制御
する機能を有するタンパク質をコードする新規遺伝子に
関する。

【０００２】

【従来の技術】植物は通常の生育環境下においても、常
にストレスを受けている。このようなストレスには、
塩、乾燥、高温、低温、強光、空気汚染などのさまざま
なものが含まれる。農業生産の観点から、塩ストレスが
注目されている。土壌および岩石が分解すると塩類が生
じる。塩類の生成は絶えず続いており、雨が降るとそれ
らは川または海に流され得る。雨量の少ない砂漠地帯で
は流出する塩類が少ないために、土壌水中の塩類の濃度
は極めて高くなる。植物は、水とともに塩類を根によっ
て浸透的に吸収して栄養分とするが、塩類濃度が高くな
ると吸水できなくなる。また、イオン固有の生理作用に
より成長阻害が起こる。植物の塩ストレスに対する応答
はまた、乾燥、高浸透圧、低温などの環境ストレスと重
複した応答を示すことが知られている。これらのストレ
スは、農業上極めて深刻な被害をもたらす。

【０００３】近年、化学肥料の大量使用や長期にわたる
連作により、土壌中での塩類の高濃度集積が見られるよ
うになり、特にハウス土壌では塩類集積の弊害が頻発し
ている。また、海岸付近地域での海水や海風による塩害
や、乾燥地帯や半乾燥地帯での過度の蒸散による土壌表
層の塩類集積などが生じており、農地の利用を制限して
いる。このような問題の解決方法としては、土壌を交換
することや潅水により除去することが一般的に行われて
いるが、多大の費用や労力を要する。また、潅水による
塩類除去は、周辺地域に大量の塩水を流入させることか
ら、環境汚染を引き起こすとして使用規制が行われよう
としている。

【０００４】したがって、このような塩ストレスに耐性
を有する植物を見い出すことは、非常に重要なことであ
る。

【０００５】これまでの国内外で行われてきた耐塩性植
物についての研究から、耐塩性植物を、非ストレス条件
から塩ストレス条件に移すと新たな遺伝子の発現が誘発
され、これらの遺伝子の産物が塩ストレス耐性に役立っ
ていることが知られている。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属植物
においては、塩ストレス耐性を有する種類の植物が存在
することが知られており、その遺伝子を単離したという
報告も存在する（Ｎｅｌｓｏｎら、（１９９２） Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏ
ｌ．１９，５７７−５８８，Ｙｕｎら（１９９６） Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１１１，１
２１９−１２２５）。他に、塩ストレスに対する応答に
関連のあるＮｉｃｏｔｉａｎａ属植物遺伝子としては、
特開平１１−１８７８７７号、特開平１１−１８７８７
８号、特開平１１−１８７８７９号、特開平１１−１８
７８８０号に記載の塩ストレス耐性種であるＮｉｃｏｔ
ｉａｎａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ由来の遺伝子が挙げら
れる。特開平１１−１８７８７７号には、塩ストレスに
より誘導される新規な遺伝子が記載され、この遺伝子が
コードする遺伝子産物は、植物に水分ストレス耐性を付
与する機能があると考えられている。特開平１１−１８
７８７８号には、塩ストレスにより誘導される新規なカ
リウムチャンネル遺伝子が記載され、この遺伝子がコー
ドするカリウムチャンネル遺伝子は、植物に水分ストレ
ス耐性を付与する機能があると考えられている。特開平
１１−１８７８７９号には、塩ストレスにより誘導され
る新規なＩＮＰＳ遺伝子が記載され、この遺伝子がコー
ドするＩＮＰＳ遺伝子は、植物に水分ストレス耐性を付
与する機能を有する。特開平１１−１８７８８０号植物
には、塩ストレスにより誘導される新規な葉緑体型フル
クトースビスフォスフェートアルドラーゼが記載され、
この遺伝子がコードするアルドラーゼは、植物に水分ス
トレス耐性を付与する機能を有すると考えられる。

【０００６】イネにおいては、塩ストレスに対する応答
に関連のある遺伝子として、葉緑体グルタミン合成酵素
（ＧＳ２）遺伝子（Ｈｏｓｈｉｄａら、Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：１０３−１１（２０００））；
およびΔ１−ピロリン−５−カルボン酸（Ｐ５Ｃ）合成
酵素（ＯｓＰ５ＣＳ）遺伝子（Ｉｇａｒａｓｈｉら、Ｐ
ｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：８５７−６５（１
９９７））が知られている。上記文献において、ＧＳ２
遺伝子は、光呼吸能を増大させ、これにより塩ストレス
に対する耐性を植物に与えることが記載されている。プ
ロリンの生合成に関与するＯｓＰ５ＣＳの遺伝子は、高
濃度の塩、脱水、アブシジン酸での処理、および低温に
よって誘発される。塩ストレス下でのＯｓＰ５ＣＳの遺
伝子の発現は、塩耐性栽培種であるＤｅｅ−ｇｅｅ−ｗ
ｏｏ−ｇｅｎでは安定に増大したが、塩感受性育種系で
あるＩＲ２８では僅かに増大した。

【０００７】イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７が
培養によって活性化され転移をする性質を利用して、イ
ネの多数の遺伝子破壊系統が作出されている。トランス
ポゾンは、動物、酵母、細菌および植物のゲノムに遍在
することが知られる変異誘発遺伝子である。トランスポ
ゾンは、その転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）機構
により２つのクラスに分類されている。クラスＩＩに属
するトランスポゾンは、複製することなくＤＮＡの形態
で転移する。クラスＩＩに属するトランスポゾンとし
て、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）のＡｃ／Ｄｓ、
Ｓｐｍ／ｄＳｐｍおよびＭｕ要素（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ、
１９８９、Ｃｅｌｌ ５６、１８１−１９１；Ｆｅｄｏ
ｒｏｆｆら、１９８３、Ｃｅｌｌ ３５、２３５−２４
２；Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、４７
８３−４７８７）、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎ
ｕｍｍａｊｕｓ）のＴａｍ要素（Ｂｏｎａｓら、１９８
４、ＥＭＢＯ Ｊ、３、１０１５−１０１９）が知られ
ている。クラスＩＩに属するトランスポゾンは、トラン
スポゾン・タッギングを利用する遺伝子単離に広く利用
されている。この技術は、トランスポゾンがゲノム上で
転移して、ある遺伝子中に挿入されると遺伝子の生理学
的および形態学的変異が起こり、遺伝子が制御する表現
型が変化することを利用する。この変化を検出すること
により影響を受けた遺伝子を単離する（Ｂａｎｃｒｏｆ
ｔら、１９９３、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、５、
６３１−６３８；Ｃｏｌａｓａｎｔｉら、１９９８、Ｃ
ｅｌｌ、９３、５９３−６０３；Ｇｒａｙら、１９９
７、Ｃｅｌｌ、８９、２５−３１；Ｋｅｄｄｉｅら、１
９９８、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１０、８７７
−８８７；Ｗｈｉｔｈａｍら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７
８、１１０１−１１１５）。

【０００８】クラスＩに属するトランスポゾンは、レト
ロトランスポゾンとも呼ばれ、ＲＮＡ中間体を介して複
製し、転移する。クラスＩトランスポゾンは、最初、シ
ョウジョウバエおよび酵母で同定され、そして特徴付け
られたが、最近の研究により植物ゲノム中に遍在し、そ
のかなりの部分を占めていることが明らかにされている
（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏ．、４、３４７−３５３；Ｖｏｙｔａ
ｓ、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、７３７−７３
８）。レトロトランスポゾンの大部分は、非移動性の組
み込みユニットであるようである。最近の研究は、これ
らのいくつかが、創傷、病原体の攻撃および細胞培養な
どのストレス条件下で活性化されることを示している
（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、３、１８１−１
８７；Ｗｅｓｓｌｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏ
ｌ．６、９５９−９６１；Ｗｅｓｓｌｅｒら、１９９
５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．
５、８１４−８２１。例えば、タバコではＴｎｔ１Ａお
よびＴｔｏ１（Ｐｏｕｔｅａｕら、１９９４、Ｐｌａｎ
ｔ Ｊ．、５、５３５−５４２；Ｔａｋｅｄａら、１９
８８、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３６、３６
５−３７６）、およびイネではＴｏｓ１７（Ｈｉｒｏｃ
ｈｉｋａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７７８３−７７８８）につ
いて、ストレス条件下における活性化が報告されてい
る。

【０００９】イネのレトロトランスポゾンＴｏｓ１７
は、最も良く研究されている植物中のクラスＩ要素であ
る。Ｔｏｓ１７は、Ｔｙ１−ｃｏｐｉａ群レトロ要素の
間の逆転写酵素ドメインの保存アミノ酸配列を基に作成
された縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によりク
ローン化された（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９２、Ｍ
ｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．、２３３、２０９−２
１６）。Ｔｏｓ１７は、４．３ｋｂの長さの、２つの同
じ１３８ｂｐのＬＴＲ（長鎖末端反復）および開始メチ
オニンｔＲＮＡの３’末端に相補的なＰＢＳ（プライマ
ー結合部位）を持つ（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９
６、上述）。Ｔｏｓ１７の転写は、組織培養により強く
活性化され、そして培養時間とともにＴｏｓ１７のコピ
ー数が増加する。ゲノム研究のモデルジャポニカ品種で
ある日本晴では、Ｔｏｓ１７の当初のコピー数は２であ
るが、組織培養後、再生した植物では、５〜３０コピー
に増加している（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、上
述）。酵母およびショウジョウバエで特徴付けられたク
ラスＩトランスポゾンとは異なり、Ｔｏｓ１７は、染色
体中をランダムな様式で転移し、そして安定な変異を引
き起こし、そしてそれ故、イネにおける遺伝子の機能解
析の強力なツールを提供する（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、１
９９７、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５，２３１
−２４０；１９９９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ ｏｆ Ｒｉｃｅ（Ｋ．Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ編集、
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、４３−５８）。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、塩
ストレスおよび／または浸透圧ストレス感受性を決定し
得るタンパク質をコードする遺伝子を明らかにし、これ
により、塩ストレスおよび浸透圧ストレスを含む複数の
環境ストレスに対する感受性の操作および感受性の異な
る植物の選抜、ならびにさらには、これらの環境ストレ
スに対する耐性を強化した植物の作出のために有用な遺
伝子を提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、イネのレ
トロトランスポゾンＴｏｓ１７が培養によって活性化さ
れ転移をする性質を利用して作製された多数のイネ遺伝
子破壊系統の中から、塩ストレスに対して感受性の高い
変異体を発見した。この変異体は、塩ストレス条件下
で、器官の生育阻害および形態異常といった形質を示
す。形質の変化と塩ストレスとの関連を鋭意検討した結
果、この形質の変化が、塩ストレス感受性を決定し得る
遺伝子の変異に起因することを見出し、本発明を完成す
るに至った。

【００１２】本発明は、塩ストレス耐性を制御する植物
遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、該ポリ
ヌクレオチドが、配列表の配列番号２の１位のメチオニ
ンから２４３位のアスパラギンまでのアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、
または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列を有し、かつ塩ストレ
ス耐性を制御する機能を有するポリヌクレオチドを含
む、ポリヌクレオチドに関する。

【００１３】本発明の１つの実施形態では、上記植物遺
伝子は、浸透圧ストレス耐性をさらに制御する。

【００１４】本発明の１つの実施形態では、上記ポリヌ
クレオチドは、イネ由来である。

【００１５】本発明はまた、塩ストレス耐性を制御する
植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドであって、該
ポリヌクレオチドが、配列表の配列番号１の２３３位の
Ａから９６１位のＣまでに示されるヌクレオチド配列ま
たは該ヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズするヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドを含む、ポリヌクレオチドに関する。

【００１６】本発明の１つの実施形態では、上記植物遺
伝子は、浸透圧ストレス耐性をさらに制御する。

【００１７】本発明の１つの実施形態では、上記ポリヌ
クレオチドは、イネ由来である。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明は、Ｔｏｓ１７を用いて単
離され、機能が解明された植物新規遺伝子を提供する。

【００１９】本明細書中で使用する用語「遺伝子」は、
遺伝情報を担う構造単位で、形質を規定する因子をい
う。遺伝子は、高分子ＤＮＡまたはＲＮＡでの一定の領
域の塩基配列により規定される遺伝の作用単位として定
義され得る。従って、遺伝子は、最終的にタンパク質に
翻訳され得る、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、物質とし
ては、ポリヌクレオチドとして理解され得る。

【００２０】本明細書中で使用する「ストレス」とは、
外部から与えられる、植物の生育に変化を生じさせる要
因をいう。「環境ストレス」とは外部環境の変動により
与えられるストレスであり、このようなストレスには、
塩、高浸透圧、乾燥、高温、低温、強光、空気汚染など
が含まれる。

【００２１】本発明によれば、塩ストレス耐性を制御す
る植物遺伝子をコードするポリヌクレオチドが提供され
る。本願明細書で使用する用語「塩ストレス」とは、栽
培媒体（例えば、土壌、植物の栽培が可能な培地（固形
または液状）など）中の塩類濃度が上昇して、植物の生
育に対して有害となることを意味する。塩類には、植物
に吸水阻害を引き起こすあらゆる塩が含まれ、例えば、
マグネシウム塩、塩化物塩、アルミニウム塩などが含ま
れ得る。本願明細書で用いる用語「塩ストレス耐性」
は、上記の塩ストレスに対して抵抗性であることを意味
する。「塩ストレス感受性」とは、上記の塩ストレスに
対して感受性であること、例えば、生育に不利な影響を
受け得ることを意味する。「塩ストレス感受性」の株
は、中低濃度（例えば、５０〜３００ｍＭ、好ましく
は、１００〜１５０ｍＭ）の塩類濃度が含まれる栽培媒
体（例えば、土壌、植物の栽培が可能な培地（固形また
は液状）など）上で生育される場合、植物の器官および
組織の生育阻害および形態異常を示し得る。「塩ストレ
ス耐性を制御する」とは、塩ストレスに関与する遺伝子
の発現を抑制または促進する、あるいは、塩ストレス耐
性を決定するタンパク質をコードする、またはその働き
を制御することを意味する。

【００２２】本発明の植物遺伝子はさらに、浸透圧スト
レス耐性を制御し得る。「浸透圧ストレス」とは、浸透
圧が生じて、植物の生育に対して有害となることを意味
する。浸透圧は、内部に水を取り込んで体積を増加させ
る、植物細胞の成長（吸水成長）に関与する。一般に、
植物は、浸透圧が高くなるにつれて、吸水力が低下す
る。本願明細書で用いる用語「浸透圧ストレス耐性」
は、上記の浸透圧ストレスに対して抵抗性であることを
意味する。「浸透圧ストレス感受性」とは、上記の浸透
圧ストレスに対してある種の反応を示すことを意味す
る。「浸透圧ストレス感受性」の株は、高浸透圧（例え
ば、マンニトール当量として５０〜６００ｍＭ、好まし
くは、１５０ｍＭ以上）を生じる栽培媒体（例えば、土
壌、植物の栽培が可能な培地（固形または液状）など）
上で生育される場合、植物体（特に、根）の顕著な生育
阻害を示し得る。「浸透圧ストレス耐性を制御する」と
は、浸透圧ストレスに関与する遺伝子の発現を抑制また
は促進する、あるいは、浸透圧ストレス耐性を決定する
タンパク質をコードする、またはその働きを制御するこ
とを意味する。

【００２３】上述したような本発明のポリヌクレオチド
は、代表的には、配列表の配列番号２の１位のメチオニ
ン（Ｍｅｔ）から２４３位のアスパラギン（Ａｓｎ）ま
でのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、また
はこのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸
が欠失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを含む、ポリヌクレオチドである。１つの実施形態で
は、本発明のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１
の２３３位〜９６１位に示されたヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドであ
る。本発明のポリヌクレオチドは、上述した領域（配列
番号２の１位のメチオニン（Ｍｅｔ）から２４３位のア
スパラギン（Ａｓｎ）までのアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列領域または配列番号１の２３３位〜９
６１位に示されたヌクレオチド配列領域）の外側、すな
わち、５’末端側または３’末端側に、さらなるヌクレ
オチド配列（例えば、非翻訳領域）を含み得る。より好
ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の
１位〜１１５４位に示された全長配列からなる。ここ
で、本願発明のポリヌクレオチドは、配列番号１におけ
る縮重異性体をすべて含むものである。ここで、「縮重
異性体」とは、縮重コドンにおいてのみ異なっていて、
同一のポリペプチドをコードすることのできるＤＮＡを
意味する。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮ
Ａに対して、そのアミノ酸のどれかに対応するコドン、
例えばＡｓｎに対応するコドン（ＡＡＣ）が、これと縮
重関係にあるコドン例えばＡＡＴに変わったものを、縮
重異性体と呼ぶこととする。

【００２４】本発明のポリヌクレオチドは、イネのレト
ロトランスポゾンＴｏｓ１７が培養によって活性化され
転移をする性質を利用して作出されたイネの遺伝子破壊
系統の、塩ストレスに対して感受性の高い変異体の発見
から出発して、このＴｏｓ１７を目印としてイネゲノム
ＤＮＡから単離されたものである。従って、１つの実施
形態では、本発明のポリヌクレオチドは、イネに由来す
る。

【００２５】開示されたヌクレオチド配列およびそれに
よりコードされたタンパク質のフラグメントおよび改変
体もまた、本発明により包含される。「フラグメント」
によって、ヌクレオチド配列の一部またはアミノ酸配列
の一部、従って、それによってコードされるタンパク質
もまた意図される。ヌクレオチド配列のフラグメント
は、ネイティブタンパク質の機能的な生物学的活性の１
つ以上を保持するタンパク質フラグメントをコードし得
る。

【００２６】本発明のポリヌクレオチドによりコードさ
れるタンパク質の改変体とは、このタンパク質のＮ末端
および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠
失（いわゆる短縮化）または付加；このタンパク質中の
１つ以上の部位のアミノ酸の欠失または付加；あるいは
このタンパク質中の１つ以上の部位のアミノ酸の置換に
よりネイティブタンパク質から誘導されたタンパク質を
意図する。このような改変体は、例えば、遺伝的多型ま
たは人為操作から生じ得る。

【００２７】本発明のポリヌクレオチドによりコードさ
れるタンパク質は、種々の方法（アミノ酸置換、欠失、
短縮化、および挿入を包含する）で変化され得る。この
ような操作のための方法は、一般に、当該分野で公知で
ある。例えば、本発明のストレス耐性を制御し得る植物
遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列改
変体は、ＤＮＡにおける変異生成によって調製され得
る。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法
は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１
９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８
７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：
３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗ
ａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ （ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびその中
で引用されている参考文献を参照のこと。目的のタンパ
ク質の生物学的活性に影響しない適当なアミノ酸置換に
関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９８７）Ａｔｌａ
ｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅ
ｓ．Ｆｏｕｎｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、こ
れは、参考として本明細書中に援用される）のモデルに
見出され得る。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を
同様の特性を有する別のものと交換する置換）が好まし
いとされ得る。このような置換としては、疎水性アミノ
酸（Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒ
ｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）；親水性アミノ酸（Ａｒ
ｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌ
ｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）；脂肪族側鎖を
有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉ
ｌｅ、Ｐｒｏ）；水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ
ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）；硫黄原子含有側鎖を有するア
ミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）；カルボン酸およびアミド含
有側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇ
ｌｎ）；塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ、Ｈｉｓ）；芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈｉ
ｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）同士の置換が挙げられ
る。

【００２８】従って、「１もしくは数個が欠失、置換お
よび／もしくは付加された」とは、遺伝的多型または人
為操作（上述したような周知の方法を含む）によって置
換、欠失および／もしくは付加され得る程度の数のアミ
ノ酸が置換、欠失および／もしくは付加され得ることを
意味する。「１もしくは数個が欠失、置換および／もし
くは付加された」とは、本発明のポリヌクレオチドによ
りコードされるタンパク質が有する機能を発現し得る限
り、上記アミノ酸配列においていかなる数のアミノ酸が
欠失、付加、および／もしくは置換されていてもよい。
アミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加のような改
変が活性に与える影響は、改変されるアミノ酸の位置、
程度、種類などに依存し得ることは当業者には明らかで
ある。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリヌク
レオチドによりコードされるタンパク質が有する機能を
発現し得る限り、例えば、上記アミノ酸配列の全長にお
いて、以下のアミノ酸配列同一性を満たす個数で欠失、
置換および／もしくは付加され得る。

【００２９】本発明の塩ストレス耐性を制御する植物遺
伝子をコードするポリヌクレオチドは、植物において塩
ストレス耐性を制御し得る限り、配列表の配列番号２の
１位のＭｅｔから２４３位のＡｓｎまでのアミノ酸配列
と、少なくとも６０％の配列同一性、好ましくは少なく
とも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに
より好ましくは少なくとも７５％、なおより好ましくは
少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも９０
％、なおより好ましくは少なくとも９５％、最も好まし
くは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
ドを包含する。

【００３０】本発明の塩ストレス耐性を制御する植物遺
伝子をコードするポリヌクレオチドは、植物において塩
ストレス耐性を制御し得る限り、配列表の配列番号２の
１位のＭｅｔから２４３位のＡｓｎまでのアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列（好ましくは、配列番号
１の２３３位のＡから９６１位のＣまでに示されるヌク
レオチド配列）と、少なくとも７０％、好ましくは少な
くとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％の配列
同一性、なおより好ましくは少なくとも８５％の配列同
一性、さらにより好ましくは少なくとも９０％の配列同
一性、さらになおより好ましくは少なくとも９５％の配
列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一
性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを
包含する。

【００３１】本明細書中で使用される場合、「参照配
列」とは、配列比較の基準として使用される規定の配列
である。参照配列は、記載された配列のサブセットまた
は全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝
子配列のセグメント、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子
配列としてである。

【００３２】本明細書中で使用される場合、「比較ウィ
ンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続しかつ特定化
されたセグメントについて言及し、ここで比較ウィンド
ウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適
なアラインメントのために、参照配列（これは、付加ま
たは欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（す
なわち、ギャップ）を含み得る。一般的に、比較ウィン
ドウは、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長であ
り、そして必要に応じて、３０、４０、５０、１００以
上の長さであり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列
中にギャップを含むことにより、参照配列に対して高い
類似性となることを避けるために、典型的には、ギャッ
プペナルティーを導入し、そしてこれを、一致の数から
差し引くことを理解する。

【００３３】比較のための配列のアラインメントの方法
は、当該分野において周知である。参照配列（本発明の
配列）と対象配列との間の最適な全体の整合を決定する
ための好ましい方法として、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕ
ｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、２５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解
析が用いられる。配列整列において、参照配列および対
象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、
ＵをＴに変換することによって比較され得る。上記の全
体的配列整列の結果が、同一性％である。配列アライン
メントは、上記のプログラムのデフォルトのパラメータ
ーを使用して行われ得る。

【００３４】本明細書中で使用される場合、２つの核酸
配列またはポリペプチド配列の文脈において「配列同一
性」または「同一性」は、特定化された比較ウインドウ
にわたって最大に一致するように整列された場合に同一
である２つの配列中の残基に対して言及される。タンパ
ク質に関して配列同一性％が使用される場合、しばし
ば、保存的アミノ酸置換によって、同一ではない残基位
置は異なることが理解される。上述したように、保存的
アミノ酸置換では、アミノ酸残基が、類似の化学的特性
（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残
基で置換されるため、分子の機能的特性を変化させな
い。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性
パーセントは、置換の保存的性質について矯正するよう
に上方に調整され得る。このような保存的置換によって
異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有す
るといわれる。この調整をするための手段は、当業者に
は周知である。代表的には、これは、完全なミスマッチ
ではなく、部分的なものとして保存性置換を点数付けす
ることを含み、それによって配列同一性パーセントを増
加させる。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコ
アを与えられ、そして非保存的置換が０のスコアを与え
られる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与
えられる。保存的置換の点数付けは、例えば、プログラ
ムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，
Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）
において実行されるように計算される。

【００３５】本明細書中で使用される場合、「配列同一
性％」は、比較ウィンドウにわたって最適にアラインさ
れた２つの配列を比較することによって決定された値を
意味し、ここで比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチ
ド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントの
ために、参照配列（これは、付加または欠失を含まな
い）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャッ
プ）を含み得る。この割合（％）は、同一の核酸塩基ま
たはアミノ酸残基が両方の配列に存在して一致した位置
の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置
の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で除算すること、
およびその結果に１００をかけて配列同一性のパーセン
テージを得ることによって計算される。

【００３６】用語、ポリヌクレオチドの「実質的な同一
性」は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを
使用して、記載されるアラインメントプログラムの１つ
を用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、好ま
しくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９
０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の配列同
一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、コ
ドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレーム
の位置などを考慮に入れることによって、２つのヌクレ
オチド配列によってコードされるタンパク質の対応する
同一性を決定するために、これらの値が適切に調整され
得ることを理解する。これらのために、アミノ酸配列の
実質的な同一性は、通常、少なくとも６０％、より好ま
しくは少なくとも７０％、８０％、９０％、および最も
好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。

【００３７】ペプチドの文脈における用語「実質的同一
性」は、ペプチドが、特定化された比較ウィンドウにわ
たって、参照配列に対して、少なくとも７０％の配列同
一性、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、最も
好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性
を有する配列を含むことである。好ましくは、最適なア
ラインメントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライン
メントアルゴリズムを使用して行われる。例えば、２つ
のペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合に、ペ
プチドは、第２のペプチドと実質的に同一である。「実
質的に類似の」ペプチドは、同一ではない残基の位置が
保存的アミノ酸変化によって異なり得るということ以外
は、上記に示したような配列を共有する。

【００３８】本発明の塩ストレス耐性を制御するタンパ
ク質の生物学的に活性な部分をコードする、塩ストレス
耐性を制御する植物遺伝子ヌクレオチド配列のフラグメ
ントは、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、
１２５、１５０、１７５、２００、２２５の連続するア
ミノ酸、または本発明の全長タンパク質に存在するアミ
ノ酸の総数まで（例えば、配列番号２の２４３アミノ
酸）をコードする。ＰＣＲプライマーについてハイブリ
ダイゼーションプローブとして用いるための、塩ストレ
ス耐性を制御する植物遺伝子ヌクレオチド配列のフラグ
メントは、一般に、塩ストレス耐性を制御するタンパク
質の生物学的に活性な部分をコードする必要はない。

【００３９】イネ以外の他の植物に由来する塩ストレス
耐性を制御する植物遺伝子をコードするポリヌクレオチ
ドもまた、本願発明の範囲内に含まれ得る。そのような
ポリヌクレオチドは、例えば、開示された全長または一
部のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを
用いて、選択した植物のゲノミックＤＮＡを鋳型として
ＰＣＲを行い、その後、得られた増幅ＤＮＡ断片をプロ
ーブとして用いて同じ植物のゲノミックＤＮＡまたはｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単
離され得る。このようにして、ＰＣＲ、ハイブリダイゼ
ーションなどのような方法が、本明細書中に記載の配列
に対するそれらの配列同一性に基づいてこのような配列
を同定するために使用され得る。本明細書中に記載の配
列全体に対する、またはそれらのフラグメントに対す
る、それらの配列同一性に基づいて単離された配列は、
本発明によって包含される。

【００４０】ハイブリダイゼーション技術において、公
知のヌクレオチド配列の全てまたは部分が、選択された
生物由来のクローン化されたゲノムＤＮＡフラグメント
またはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわち、ゲノム
ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）中に存在す
る他の対応するヌクレオチド配列に選択的にハイブリダ
イズするプローブとして使用される。このハイブリダイ
ゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡフラグメント、ｃ
ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、または他の
オリゴヌクレオチドであり得、そして検出可能な基（例
えば、³²Ｐ）または任意の他の検出可能なマーカーで標
識化され得る。従って、例えば、ハイブリダイゼーショ
ンのためのプローブは、本発明の塩ストレス耐性を制御
する植物遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて合成オリ
ゴヌクレオチドを標識することによって作製され得る。
ハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡライブラリーお
よびゲノムライブラリーの構築のためのプローブの調製
のための方法は、一般に、当該分野で公知であり、そし
てＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖ
ｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（これは、本明細書中に参
考として援用される））において開示される。

【００４１】例えば、本明細書中に開示された塩ストレ
ス耐性を制御する植物遺伝子をコードするヌクレオチド
配列全体、またはそれらの１つ以上の部分が、対応する
塩ストレス耐性を制御する植物遺伝子配列およびメッセ
ンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズし得るプロー
ブとして使用され得る。種々の条件下で特異的なハイブ
リダイゼーションを達成するために、このようなプロー
ブは、塩ストレス耐性を制御する植物遺伝子配列間で独
特であり、そして好ましくは少なくとも約１０ヌクレオ
チド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド
長である配列を包含する。このようなプローブは、選択
された生物から対応する塩ストレス耐性を制御する植物
遺伝子配列をＰＣＲによって増幅するために使用され得
る。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣ
Ｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌｉｃｈ編、
Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ
（１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： ＡＧｕ
ｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉ
ｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａ
ｔｔｉｌａら（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ． １９： ４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．
Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
１： １７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒ
ｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏ
ｘｆｏｒｄ、これらは、本明細書中で参考として援用す
る）。この技術は、所望の生物からさらなるコード配列
を単離するために、または生物中のコード配列の存在を
決定するための診断アッセイとして使用され得る。ハイ
ブリダイゼーション技術は、プレート化したＤＮＡライ
ブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングを包
含する（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 、Ｐｌａｉｎｖ
ｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。

【００４２】このような配列のハイブリダイゼーション
は、ストリンジェントな条件下で実施され得る。「スト
リンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列
に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えば、
バックグラウンドよりも少なくとも２倍）で、その標的
配列に対してハイブリダイズする条件を意図する。スト
リンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる
環境下で異なる。ハイブリダイゼーションおよび／また
は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによ
り、プローブに対して１００％相補的である標的配列が
同定され得る。あるいは、ストリンジェンシー条件は、
より低い程度の類似性が検出され得るように、配列中に
いくらかミスマッチとなることが可能になるように調整
され得る。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチ
ド長未満であり、好ましくは５００ヌクレオチド長未満
である。

【００４３】代表的には、ストリンジェントな条件は、
塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオン未満であり、代表的に
は約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の
塩）（ｐＨ７．０から８．３）であり、そして温度が、
短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）につ
いては少なくとも約３０℃であり、そして長いプローブ
（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少
なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェント
な条件はまた、脱安定剤（例えば、ホルムアミド）の添
加によって達成され得る。ストリンジェントな条件とし
て、例えば、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣ
ｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液
を用いる３７℃でのハイブリダイゼーション、および１
×から２×のＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣ
ｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）を用いる５０〜５
５℃での洗浄が挙げられる。よりストリンジェントな条
件としては、例えば、４０〜４５％ホルムアミド、１．
０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリ
ダイゼーション、および０．５×から１×のＳＳＣを用
いる５５〜６０℃での洗浄が挙げられる。さらによりス
トリンジェントな条件としては、例えば、５０％ホルム
アミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃での
ハイブリダイゼーション、および０．１×のＳＳＣを用
いる６０〜６５℃での洗浄が挙げられる。

【００４４】特異性は、代表的には、ハイブリダイゼー
ション後の洗浄の関数であり、決定的な要因は、最終洗
浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリッドについては、Ｔ_mは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈお
よびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１３８：２６７−２８４の式：Ｔ_m＝８１．５℃＋１
６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１
（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算され得；ここでＭ
は、１価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ
中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチ
ドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダ
イゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージで
あり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さであ
る。Ｔ_mは、相補的な標的配列の５０％が完全に一致す
るプローブにハイブリダイズする温度（規定されたイオ
ン強度およびｐＨで）である。Ｔ_mは、１％のミスマッ
チにつき約１℃低下する；従って、Ｔ_m、ハイブリダイ
ゼーション、および／または洗浄条件は、所望の同一性
の配列にハイブリダイズするために調整され得る。例え
ば、９０％以上の同一性を有する配列が求められる場
合、Ｔ_mは、１０低下し得る。一般的に、ストリンジェ
ントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特
定の配列およびその相補物に対する熱融点（Ｔ_m）より
も約５℃低く選択される。しかし、厳しいストリンジェ
ントな条件は、熱融点（Ｔ_m）よりも１、２、３、また
は４℃低いハイブリダイゼーションおよび／または洗浄
を利用し得；中程度のストリンジェントな条件は、熱融
点（Ｔ_m）よりも６、７、８、９、または１０℃低いハ
イブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得；
低いストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔ_m）よりも
１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイ
ブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用し得る。
この式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、な
らびに所望されるＴ_mを使用して、当業者は、ハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシーおよび／または洗
浄溶液におけるバリエーションが固有に記載されること
を理解する。所望されるミスマッチの程度が４５℃（水
溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴ
_mを生じる場合、より高い温度が使用され得るようにＳ
ＳＣ濃度を増加させることが好ましい。核酸のハイブリ
ダイゼーションについての広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓ
ｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉ
ｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＰ
ｒｏｂｅｓ、第１部、第２章（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９
５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章（Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎ
ｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出され
る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎ
ｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと（これらは
本明細書中に参考として援用される）。

【００４５】得られた遺伝子の塩基配列は、当該分野で
公知のヌクレオチド配列解析法または市販されている自
動シーケンサーにより決定し得る。

【００４６】本発明のポリヌクレオチドは、代表的に
は、本明細書に記載の方法に従って得られるが、本発明
に開示された配列を基に、化学合成によっても得られ得
る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社（現Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ社）により市販されるポリヌクレオチド
合成機を用いて製造業者によって提供される仕様書に従
って合成され得る。

【００４７】本発明の植物遺伝子をコードするポリヌク
レオチドは、塩ストレスの感受性および浸透圧ストレス
の感受性を決定することが、以下の実施例において実証
されたように、明らかである。植物の塩ストレスに対す
る応答は、乾燥、高浸透圧、低温などの環境ストレスと
重複した応答を示し得ることが知られている（蛋白質核
酸 酵素（１９９９）Ｖｏｌ．４４、２１４７−２１４
８／２１８８−２１９８；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ．
Ｐｌａｎｔ．Ｂｉｏｌ．（２００１）ｖｏｌ．４ ２４
１−２４６；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ．
Ｂｉｏｌ．（２０００）ｖｏｌ．３ ２１７−２２３；
ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２
００１）Ｖｏｌ．６ ６６−７１）。本発明のポリヌク
レオチドは、乾燥または低温によるストレスにも関与し
ている可能性が高い。本発明のポリヌクレオチドがその
機能を発揮する場合、植物は、ストレス条件下でも通常
の生育を示すか、または生育に有害な影響を及ぼされな
い。しかし、本発明のポリヌクレオチドが何らかの理由
によって機能が働かない場合、ストレス条件下に置かれ
た植物に生育阻害をもたらし得る。

【００４８】上述のようにして遺伝子工学的手法または
化学合成手法のような手順に従って生成されたポリヌク
レオチドが、所望の活性、すなわち塩ストレス耐性を制
御する作用、を有することを、以下のようにして確認し
得る。すなわち、得られたポリヌクレオチドを、塩スト
レス感受性植物（例えば、下述の実施例１により得られ
たＮＤ１００４（−／−）系統）に当該分野で周知の技
術を用いて導入して、塩ストレス耐性が回復されること
により、所望の活性、すなわち塩ストレス耐性を制御す
る作用、を有することを、確認し得る。塩ストレス耐性
を制御する作用を有することは、以下の実施例５に記載
の手順と実質的に同様の手順によって確認し得る。例え
ば、ポリヌクレオチドは、ＮＤ１００４（−／−）系統
に導入されたとき、上記手順において、下述の実施例５
に記載されるような野生型植物と実質的に同等の程度の
塩ストレス耐性を示すと、塩ストレス耐性を制御する作
用を有することが確認される。「野生型植物と実質的に
同等の程度の塩ストレス耐性を示す」とは、塩ストレス
条件下および塩ストレスを与えない条件下で、当該ポリ
ヌクレオチドが導入された植物の生長において、実施例
５に示されるように、顕著な差異が見られないものであ
り得る。なお、ここでの「塩ストレス条件」とは、上述
した中低濃度（例えば、５０〜３００ｍＭ、好ましく
は、１００〜１５０ｍＭ）の塩類濃度が含まれる栽培媒
体（例えば、土壌、植物の栽培が可能な培地（固形また
は液状）など）上で生育される条件であり得る。

【００４９】従って、本発明のポリヌクレオチドは、塩
ストレスおよび浸透圧ストレスを含む上述のようなスト
レスに対する植物の感受性を操作する、またはこのスト
レスに対する感受性の異なる植物を選抜する（例えば、
本配列のポリヌクレオチドの全体または一部に基づくプ
ローブまたはプライマーを使用して、種々の植物系統を
スクリーニングすることにより）ために使用され得る。

【００５０】本発明のポリヌクレオチドはまた、上述し
たストレスに対する耐性を強化した植物を作出するため
に使用され得る。この植物が農業的に有用であれば、な
お好ましい。このようなストレス耐性植物の開発は、環
境ストレスによる農業上の被害の軽減のみならず、栽培
可能面積の拡大による作物の増収、環境の保全のよう
な、有益な効果をもたらすことが期待される。

【００５１】本発明のポリヌクレオチドは、そのままで
または改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切
な植物発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技
術により、植物細胞に導入され得る。導入された遺伝子
は、植物細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。な
お、植物細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物
細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンド
リア、葉緑体など）に含まれるＤＮＡを含む。

【００５２】「植物発現ベクター」は、本発明の遺伝子
の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメ
ントが宿主植物の細胞中で作動可能に連結されている核
酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」
は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要
素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡ
ＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列を
いう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、
遺伝子が発現し得るように、ポリヌクレオチドが、その
発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の
調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結
されることをいう。植物発現ベクターは、好適には、植
物遺伝子プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝
子、およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタ
イプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細
胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項であ
る。本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−Ｄ
ＮＡ領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバ
クテリウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の
導入の効率を高める。

【００５３】「植物遺伝子プロモーター」は、植物で発
現するプロモーターを意味する。再生植物のすべての組
織において、本発明のポリヌクレオチドの発現を指向さ
せる植物プロモーターフラグメントを採用し得る。構成
的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、
ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｌａｎｇｒｉ
ｄｇｅ，１９８５，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．
４，３５５）、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ−
ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｇｕｉｌｌｅｙ，１９８
２，Ｃｅｌｌ ３０，７６３）、カリフラワーモザイク
ウイルス３５Ｓ−ＲＮＡを生じるプロモーター（Ｏｄｅ
ｌｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３，８１０）、イ
ネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ，１９９１，Ｐ
ｌａｎｔＣｅｌｌ ３，１１５５）、トウモロコシユビ
キチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ １９９３，Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３，５６７）、ＲＥＸφ
プロモ−タ−（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ，１９９６，Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）などを
用いることができる。

【００５４】あるいは、植物プロモーターは、特定組織
において本発明のポリヌクレオチドの発現を指向させ得
るか、またはそうでなければ、より特異的な環境または
発達の制御下にあり得る。このようなプロモーターは、
本明細書では、「誘導可能な」プロモーターと称する。
誘導可能なプロモーターとしては、例えば、光、低温、
高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの
外因によって発現することが知られているプロモーター
などが挙げられる。この様なプロモーターとしては、例
えば、光照射によって発現するリブロース−１，５−２
リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットをコードする遺
伝子のプロモーター（Ｆｌｕｈｒ，１９８６，Ｐｒｏ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，２３５
８）、低温によって誘導されるイネのｌｉｐ１９遺伝子
のプロモーター（Ａｇｕａｎ，１９９３，Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４０，１）、高温によって誘導され
るイネのｈｓｐ７２、ｈｓｐ８０遺伝子のプロモーター
（Ｖａｎ Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ，１９９４，Ｐｌａｎｔ
ａ １９３，５７）、乾燥によって誘導されるシロイヌ
ナズナのｒａｂ１６遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄ
ｙ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７，１４０６）、紫外線の照射によって
誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ
遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒ
ｔ，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ．８，６５１）などが挙げ
られる。また、ｒａｂ１６遺伝子のプロモーターは植物
ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。

【００５５】「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク
質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡ
に転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加
に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの
安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼす
ことが知られている。ターミネーターの例としては、Ｃ
ａＭＶ３５Ｓターミネーター、およびノパリン合成酵素
遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、
これらに限定されない。

【００５６】「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選
抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシ
ン耐性を付与するためのネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグ
ロマイシン耐性を付与するためのハイグロマイシンフォ
スフォトランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ
得るが、これらに限定されない。

【００５７】「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効
率を高めるために用いられ得る。エンハンサーとして
は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含
むエンハンサー領域が好適である。エンハンサーは、１
つの植物発現ベクターあたり複数個用いられ得る。

【００５８】上記のような植物発現ベクターは、当業者
に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植物
発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクター
またはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、これ
らに限定されない。

【００５９】ＤＮＡ導入のための植物材料としては、導
入法などに応じて、葉、茎、根、塊茎、プロトプラス
ト、カルス、花粉、種子胚、苗条原基などから適当なも
のを選択することができる。「植物細胞」とは、任意の
植物細胞であり得る。「植物細胞」の例としては、葉お
よび根などの植物器官の細胞、カルスならびに懸濁培養
細胞が挙げられる。植物細胞は、培養細胞、培養組織、
培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよ
い。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官
であり、より好ましくは培養細胞である。

【００６０】また一般に、植物培養細胞へＤＮＡを導入
する場合、材料としてプロトプラストが用いられ、エレ
クトロポーレーション法、ポリエチレングリコール法な
どの物理・化学的方法によってＤＮＡの導入が行われる
のに対して、植物組織へＤＮＡを導入する場合、材料と
しては葉、茎、根、塊茎、カルス、花粉、種子胚、苗条
原基など、好ましくは葉、茎、カルスが用いられ、ウイ
ルスもしくはアグロバクテリウムを用いた生物学的方
法、またはパーティクルガン法などの物理・化学的方法
によってＤＮＡの導入が行われる。アグロバクテリウム
を介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法
（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５（１
９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、植物発
現ベクターで（例えば、エレクトロポレーションによっ
て）アグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転
換されたアグロバクテリウムをリーフディスク法などの
周知の方法により植物組織に導入する方法である。これ
らの方法は、当該分野において周知であり、形質転換す
る植物に適した方法が、当業者により適宜選択され得
る。

【００６１】植物発現ベクターを導入された細胞は、例
えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選
択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生
され得る。

【００６２】本発明のポリヌクレオチドが導入された植
物細胞から植物を再生させるには、このような植物細胞
を、再分化培地、ホルモンフリーのＭＳ培地などに培養
すればよい。発根した幼植物体は、土壌に移植して栽培
することにより植物体とすることができる。再生（再分
化）の方法は植物細胞の種類により異なる。様々な文献
にイネ（Ｆｕｊｉｍｕｒａ，１９９５，Ｐｌａｎｔ Ｔ
ｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．２，７４）、
トウモロコシ（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，１９８９，Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌ．７，５８１、Ｇｏｒｄｅｎ−Ｋａｍ
ｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，６０３）、
ジャガイモ（Ｖｉｓｓｅｒ，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａ
ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８，５９４）、タバコ（Ｎａｇ
ａｔａ，１９７１，Ｐｌａｎｔａ ９９，１２）など各
種の植物に対しての再分化の方法が記載されている。

【００６３】再生した植物体においては、当業者に周知
の手法を用いて、導入された本発明の遺伝子の発現を確
認し得る。この確認は、例えば、ノーザンブロット解析
を用いて行い得る。具体的には、植物の葉から全ＲＮＡ
を抽出し、変性アガロースでの電気泳動の後、適切なメ
ンブランにブロットする。このブロットに、導入遺伝子
の一部分と相補的な標識したＲＮＡプローブをハイブリ
ダイズさせることにより、本発明の遺伝子のｍＲＮＡを
検出し得る。

【００６４】本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転
換され得る植物は、遺伝子導入の可能ないずれの植物を
も包含する。「植物」は、単子葉植物および双子葉植物
の両方を包含する。このような植物には、任意の有用植
物、特に作物植物、蔬菜植物、および花卉植物が含まれ
る。好ましくは、イネ、トウモロコシ、モロコシ、オオ
ムギ、コムギ、ライムギ、ヒエ、アワ、アスパラガス、
ジャガイモ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ナタネ、ホ
ウレンソウ、トマト、ペチュニアなどが挙げられるが、
これらに限定されない。本発明が適用される最も好まし
い植物は、イネであり、特に、ジャポニカイネである。

【００６５】本発明が使用され得る植物種の例として
は、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウ
リ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げ
られる。

【００６６】ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅ
ｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げ
られ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、ト
ウガラシ、ペチュニアなどを含む。

【００６７】イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、
Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕ
ｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植
物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒ
エ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。

【００６８】アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈ
ａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する
植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナ
ズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。

【００６９】バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕ
ｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、また
はＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モ
モ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。

【００７０】マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎ
ｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖ
ｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌ
ｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が
挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エ
ンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシ
などを含む。

【００７１】ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、
Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植
物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、
メロンなどを含む。

【００７２】シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄ
ｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する
植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソな
どを含む。

【００７３】ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌ
ｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植
物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チュー
リップなどを含む。

【００７４】アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａ
ｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウ
を含む。

【００７５】セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉ
ｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、また
はＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシ
ウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。

【００７６】本明細書中、以下で使用される名称、およ
び以下で記載される実験室手順は、当該分野で周知で一
般的に用いられる手順を使用する。標準的な技術は、組
換え法、ポリヌクレオチド合成、ならびに細胞培養につ
いて使用される。この技術および手順は、一般的に、当
該分野、およびこの書類を通じて提供される種々の一般
的な参考文献（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ、Ｎ．Ｙ．を参照。これらは、本明細書中で参考とし
て援用される）。

【００７７】以下、本発明を実施例により説明するが、
本発明はこれに限定されない。実施例で使用した材料、
試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から
入手可能である。

【００７８】

【実施例】（実施例１：培養によるＴｏｓ１７の活性化
および得られた変異体の特徴付け）ジヤポニカ種の品種
「日本晴」、「ひとめぼれ」などの完熟種子を出発材料
に用い、先に記載のように（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１
９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、９３、７７８３−７７８８）（前述）、カルス開始
培養および細胞懸濁培養を行った。遺伝子破壊を行うた
めに使用したＴｏｓ１７を活性化するための培養条件
は、大槻（１９９０）の方法（イネ・プロトプラスト培
養系、農林水産技術情報協会）の方法に従った。

【００７９】要約すれば、イネの完熟種子を２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を添加したＭＳ培
地（大槻（１９９０）、前述）で培養し（２５℃、１ケ
月間）、カルス誘導を行った。得られたカルスを、２，
４−Ｄを添加したＮ６液体培地（大槻（１９９０）、前
述）で５ヶ月間培養したのち、再分化培地（大槻（１９
９０）、前述）に移し再分化イネ（第１世代（Ｒ１）植
物）を得た。

【００８０】得られたＲ１イネの各々を１株とし、それ
ぞれの株から約２０のＲ１種子を回収した。この種子
を、１．０％の次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、十分洗
浄した後、２５℃で２４時間水中に浸した。次いで、種
子を、塩ストレス条件下の１５０ｍＭの塩化ナトリウム
を含むＭＳ固形培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏ
ｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１
５、４７３−４９７に記載）に植え、第２世代（Ｒ２）
植物を得て形態分析を行った。Ｒ２集団の各植物の表現
型を発芽後３〜４週間にわたり注意深く観察した結果、
ＮＤ１００４（品種日本晴）株のＲ２集団の中に、塩ス
トレス条件下で、野生型のＮＤ１００４に比較して、地
上部および根の激しい生育阻害（図１のＡの最も左以外
の幼苗）、および根の著しい分岐（図１のＢの右側の幼
苗）を示す変異体が見出された。一方、野生型のＮＤ１
００４は、塩ストレス条件下においても顕著な生育の阻
害を示さなかった（図１のＡの最も左の幼苗；図１のＢ
の左側の幼苗）。

【００８１】従って、塩ストレス条件下でのこのような
表現型の発現は、Ｔｏｓ１７の転移による遺伝子破壊に
より生じた可能性が考えられる。

【００８２】（実施例２：Ｔｏｓ１７の隣接配列の単
離）実施例１で見られたような表現型を支配する遺伝子
を突き止めるために、ゲノムＤＮＡ中に転移されたＴｏ
ｓ１７の隣接配列を単離した。

【００８３】実施例１で得られたＲ２イネ（ＮＤ１００
４株）からＣＴＡＢ法（ＭｕｒｒａｙおよびＴｈｏｍｐ
ｓｏｎ、１９８０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．８、４３２１−４３２５）によりＤＮＡを調製し
た。Ｔｏｓ１７標的部位配列の増幅は、先に記載のよう
に（Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９９６、前述；Ｓｕｇｉ
ｍｏｔｏら、１９９４、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、５、８６３
−８７１）、総ＤＮＡを用いる逆ＰＣＲにより実施し
た。

【００８４】要約すれば、まず、ＮＤ１００４株におけ
るＴｏｓ１７が転移挿入された標的部位を持つ変異植物
（ＮＤ１００４−／−株）からの総ＤＮＡの約０．５μ
ｇを、ＸｂａＩで消化した。消化したＤＮＡをフェノー
ル／クロロホルム抽出、次いでエタノール沈澱により精
製し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼを用いることにより、
１２℃で総容量３００μｌで一晩連結した。連結された
ＤＮＡを精製し、その３分の１量をＰＣＲの鋳型として
用いた。以下に示すプライマーを用いるＰＣＲにより増
幅反応を行った：Ｔｏｓ１７−３９１１Ｆ、ＧＡＧＡＧ
ＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣおよびＴ
ｏｓ１７−ｘｂａＩ−Ｒ、ＣＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＣ
ＣＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴ。逆ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１
−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中にク
ローニングし、シークエンサー（ＡＢＩ社、モデル３１
０）を用いて配列を決定した。この配列を基にして設計
した、プライマー０Ｆ、ＧＣＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＣＡ
ＧＣＡＡＧＣおよびプライマー３Ｒ、ＡＴＧＧＡＴＴＧ
ＡＡＧＧＣＣＡＡＧＣＣＡＣを用いて、組織培養を行わ
ない通常植物の総ＤＮＡを鋳型とした逆ＰＣＲを行い、
Ｔｏｓ１７の挿入の標的部位を増幅した。上記と同様に
して、塩基配列を決定した。

【００８５】（実施例３：変異体の原因遺伝子の構造解
析）土壌で１１日間生育させた野生型イネ（日本晴）の
幼苗から以下のようにＲＮＡを調製した。まず、ＩＳＯ
ＧＥＮ溶液を用いて幼苗から総ＲＮＡを抽出した。ｍＲ
ＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に含まれるオ
リゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いて、総ＲＮＡから
ポリ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。得られたポリ（Ａ）ｍＲＮ
Ａから常法に従いｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラ
リーをＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１ベクター（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）中に構築した。このｃＤＮＡライブラリー
は、５×１０⁵プラークの感染能力を持つ。陽性のｃＤ
ＮＡ挿入片を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドの
インビボ切除は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ２株で行った。

【００８６】このｃＤＮＡライブラリーを、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記
載の方法に従って、実施例２で得たＴｏｓ１７が転移し
た隣接配列の逆ＰＣＲ産物をプローブとして用いてスク
リーニングした。

【００８７】ｃＤＮＡライブラリーから、強いハイブリ
ダイゼーションシグナルを示す９つのｃＤＮＡクローン
が得られた。

【００８８】９つのクローンの中で最長の約１．２ｋｂ
サイズのｃＤＮＡを３１００シークエンサー（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社（ＡＢＩ））を用いて
その両方向について配列決定し、オープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｈｕｌら、
１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２
５、３３８９−３４０２）を利用した相同性解析、およ
びＭａｃ Ｖｅｃｔｏｒ ６．０プログラム（帝人シス
テムテクノロジー（株））を用いる分析に供した。

【００８９】配列決定分析により、最長のｃＤＮＡクロ
ーンは１１５４ｂｐ（配列番号１）の長さを有した。Ｍ
ａｃ Ｖｅｃｔｏｒ ６．０パッケージを用いたｍＲＮ
Ａの分析により、２４３アミノ酸（配列番号２）からな
るタンパク質をコードする最長の７２９ｂｐオープンリ
ーディングフレームが同定された。配列番号１に示し
た、この１１５４ｂｐのｃＤＮＡ配列を図３に示す。オ
ープンリーディングフレームは、上記ｃＤＮＡ配列の２
３３〜９６１位に位置する。上記オープンリーディング
フレームによりコードされるポリペプチドの推定アミノ
酸配列（配列番号２）を図４に示す。

【００９０】（実施例４：独立な変異系統の探索）実施
例１において塩ストレス条件下で地上部および根の生育
阻害を示す変異系統ＮＤ１００４を選抜し、実施例３に
おいてはこの表現型を支配する候補遺伝子を単離した。
もし、同じ遺伝子にＴｏｓ１７の挿入変異をもつ他の独
立の変異系統で同じ表現型が観察されたら、実施例３で
単離された遺伝子が、表現型を支配する遺伝子であると
結論される。このことを確かめるために、以下のような
方法で、独立な変異系統のスクリーニングを行った。

【００９１】再分化イネ集団において、実施例２と同様
にしてＤＮＡを調製した。実施例３において得られたｃ
ＤＮＡの塩基配列に基いて以下の４種類のプライマーを
設計し、上記ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った：ＧＴ
ＣＴＧＧＣＣＡＧＴＣＧＴＧＣＡＡＴＧ；ＣＴＧＣＴＧ
ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＣＴＧＡＴ；ＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧ
ＧＴＧＧＣＣＴＣＡＴ；ＧＣＣＡＡＧＣＣＡＣＴＧＡＡ
ＧＣＣＡＴＴ）。変異体のＰＣＲスクリーニングは、宮
尾安藝雄、廣近洋彦（２００１）イネのＴｏｓ１７によ
る遺伝子破壊法、細胞工学別冊「植物のゲノムサイエン
スプロトコール」、秀潤社、７３−８１に記載の方法に
従って行った。その結果、１種類の変異系統ＮＣ８３２
８（品種日本晴由来）が得られた。

【００９２】また、図３に記載のｃＤＮＡ配列をクエリ
ーとしてＴｏｓ１７隣接配列データベース（ｈｔｔｐ：
／／ｐｃ７０８０．ａｂｒ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／
〜ｍｉｙａｏ／ｐｕｂ／Ｔｏｓ１７／）を検索すると、
もう１種類の変異系統Ｈ０８５１（品種ひとめぼれ由
来）が同定された。

【００９３】これらの系統もまた、実施例１と同様の塩
ストレス条件下で生育させたとき、地上部および根の生
育阻害、および形態異常を呈した（図２Ａ（ＮＣ８３２
８；最も左が野生型、中央および右側が変異型である）
および図２Ｂ（Ｈ０８５１；最も左が野生型、それ以外
の４つの幼苗が変異型である））。

【００９４】（実施例５：塩ストレス感受性の評価）本
実施例では、実施例２〜４で得た遺伝子と塩ストレス感
受性との関連を調べた。当該遺伝子を有する系統として
日本晴ＮＤ１００４株を選択し、当該遺伝子が破壊され
た変異体としてＮＤ１００４−／−株を使用した。

【００９５】ＮＤ１００４株のＲ２世代では、正常な当
該遺伝子を有する個体と、当該遺伝子が破壊された変異
体が分離してくる。前者をＮＤ１００４＋／＋株、後者
をＮＤ１００４−／−株として実験に用いた。変異体で
あるかどうかの判定はサザン解析によって行った。つま
り、ＮＤ１００４株のＲ２世代の植物からＤＮＡを抽出
し、制限酵素ＸｂａＩで切断後、アガロースゲル電気泳
動を行い、ナイロン膜にＤＮＡを転写した。その後³²Ｐ
で標識した当該遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼ
ーションを行い、遺伝子の変異を確認した。変異型のバ
ンドパターンを示す個体をＮＤ１００４−／−株とし
た。これら一連の解析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件で行っ
た。

【００９６】野生型ＮＤ１００４株および変異型ＮＤ１
００４−／−株の種子（１株あたり約３０の種子）を、
１．０％の次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、十分洗浄し
た後、２５℃で２４時間水中に浸した。次いで、これら
の種子を、０ｍＭおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウムを
含むＭＳ固形培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏ
ｇ、前出）にて無菌的に発芽させ、そして２５℃、明所
１４時間、暗所１０時間で、１８日間生育させた。これ
らの生育の様子を図５のＡおよびＢに示す。図５のＡ
は、塩化ナトリウムを添加しない培地における野生型お
よび変異型の地上部および根（左側）および根（右側）
を示す（左側の写真では、最も左が野生型であり、それ
以外は変異型である；右側の写真では、左側が野生型で
あり、右側は変異型である）。Ｂは、塩化ナトリウムを
添加した培地における野生型（最も左側）および変異型
（残りの３個体）の地上部および根を示す。野生型ＮＤ
１００４株は、塩ストレス条件下でも、塩ストレスを与
えない条件と比較して若干生育が遅れるものの、地上部
および根の形態に顕著な変化は見られなかった（図５Ａ
および５Ｂ）。変異型ＮＤ１００４−／−株は、塩スト
レス条件下において地上部および根の顕著な生育阻害、
根の形態異常が見られた（図５Ｂ）が、このような生育
阻害および形態異常は、ストレスを与えない条件下では
見られなかった（図５Ａ）。

【００９７】さらに、この変異型を、塩ストレスを与え
ない土壌で発芽させ、そして生育させたとき（温室で３
ヶ月生育）、正常に生育した（図５Ｃ）。

【００９８】従って、当該遺伝子の破壊が塩ストレスに
対する感受性を発現した。このことは、当該遺伝子が塩
ストレスに対する感受性を決定することを示す。

【００９９】（実施例６：浸透圧ストレス感受性の評
価）本実施例では、実施例２〜４により得られた遺伝子
と浸透圧ストレス感受性との関連を調べた。当該遺伝子
を有する系統として日本晴ＮＤ１００４株を選択し、当
該遺伝子が破壊された変異体としてＮＤ１００４−／−
株を使用した。本株は、実施例５と同様にして得た。

【０１００】野生型ＮＤ１００４株および変異型ＮＤ１
００４−／−株の種子（１株あたり約３０の種子）を、
１．０％の次亜塩素酸ナトリウムで殺菌し、十分洗浄し
た後、２５℃で２４時間水中に浸した。次いで、これら
の種子を、実施例５と同様の条件下で１１日間、マンニ
トールを含まないＭＳ固形培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅお
よびＳｋｏｏｇ、前出）にて無菌的に発芽させ、そして
生育させた。１１日間生育させた幼苗において、地上部
上方および根を切断除去した（切断部位を、図６におい
て矢印で示す）。残りの組織片を、１５０ｍＭのマンニ
トールを含むＭＳ固形培地に移植し、上記と同様の条件
下で、さらに７日間生育させた。野生型からは、新生根
が正常に生育するが、変異型では、新生根の顕著な生育
阻害が見られた（図６の右側が変異型であり、残りの２
個体が野生型である）。

【０１０１】従って、当該遺伝子の破壊はまた、浸透圧
ストレスに対する感受性を発現した。このことは、当該
遺伝子が浸透圧ストレスに対する感受性を決定すること
を示す。

【０１０２】

【発明の効果】植物育種に利用可能な環境ストレス耐性
を制御する新規ポリヌクレオチドが提供される。さら
に、環境ストレスに対する感受性の操作および感受性の
異なる植物の選抜、ならびに、これらの環境ストレスに
対する耐性を強化した植物の作出に有用なポリヌクレオ
チドが提供される。

【０１０３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Agrobiological Sciences Bio-oriented Technology Research Advancement Institution <120> A novel rice gene controlling salt tolerance <130> J1-01412279 <160> 10 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 1154 <212> DNA <213> Oryza sativa <220> <221> CDS <222> (233)..(964) <400> 1 aaaatttccc ctttcctctc cacgccaaga aacgcaaaac ccccacgccg accaaggcga 60 gaagcgccgc cgccgaatcg aaccgcgatc gcgcccttct cccgccgccc ccgcgcgctc 120 ttctcctcct cgtcctcgac gccgctgtgc cggagtttag gcggagatcg atccggagcg 180 gggtttctct tctacctggc aaggttgagg aagaaaagct tgctgatttg tg atg gct 238 Met Ala 1 gcc cca act gca aca gct gtt ttt ctt gat gag aac ctg cat atc cat 286 Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val Phe Leu Asp Glu Asn Leu His Ile His 5 10 15 agg ggg cct gct ggc aag agg gct gat gga ttg aag gcc aag cca ctg 334 Arg Gly Pro Ala Gly Lys Arg Ala Asp Gly Leu Lys Ala Lys Pro Leu 20 25 30 aag cca tta gca gca aag caa ggg ctt caa gag aag aag gcc ctg agg 382 Lys Pro Leu Ala Ala Lys Gln Gly Leu Gln Glu Lys Lys Ala Leu Arg 35 40 45 50 gat gta tcc aac att ggc aag ccc ccg gtg tct acg cgg aag ccc ctg 430 Asp Val Ser Asn Ile Gly Lys Pro Pro Val Ser Thr Arg Lys Pro Leu 55 60 65 cag gac gtg tcc aac acc gcc aag ccc cga ggg cgc aac att tct gat 478 Gln Asp Val Ser Asn Thr Ala Lys Pro Arg Gly Arg Asn Ile Ser Asp 70 75 80 ggc act acc ttg aag aag act gct ctt cgc agc cat gag gcc acc aag 526 Gly Thr Thr Leu Lys Lys Thr Ala Leu Arg Ser His Glu Ala Thr Lys 85 90 95 aac cca gtg aag aag act gta atc ttt tct gat gag acc gca aaa tgt 574 Asn Pro Val Lys Lys Thr Val Ile Phe Ser Asp Glu Thr Ala Lys Cys 100 105 110 cat gaa tgg gct aag gat ggg gtg gag ggc acc cac ttc act ggg aat 622 His Glu Trp Ala Lys Asp Gly Val Glu Gly Thr His Phe Thr Gly Asn 115 120 125 130 gat tct cag aag ttg gaa aag gac agt caa gac aaa cgt gtc aag aag 670 Asp Ser Gln Lys Leu Glu Lys Asp Ser Gln Asp Lys Arg Val Lys Lys 135 140 145 aag gtg gag aaa ata atg tca gca ttg cac gac tgg cca gac gcg gta 718 Lys Val Glu Lys Ile Met Ser Ala Leu His Asp Trp Pro Asp Ala Val 150 155 160 ttt gat cat gtg ctt ttt cca tct gag gtg gta gca gcg ttt ttt gaa 766 Phe Asp His Val Leu Phe Pro Ser Glu Val Val Ala Ala Phe Phe Glu 165 170 175 gaa gta aaa gag atg gag ctg gaa cct gag att ctt cca gag aac aat 814 Glu Val Lys Glu Met Glu Leu Glu Pro Glu Ile Leu Pro Glu Asn Asn 180 185 190 agg cgt cgc tca agt tca ggt gat aaa atg aag ctg gct gaa gat cct 862 Arg Arg Arg Ser Ser Ser Gly Asp Lys Met Lys Leu Ala Glu Asp Pro 195 200 205 210 ttc acg gaa gac gag ctt gac tac tac cca ttt ctt gag aac aat ccc 910 Phe Thr Glu Asp Glu Leu Asp Tyr Tyr Pro Phe Leu Glu Asn Asn Pro 215 220 225 gtt gag ttt cag ctg aga gat gag cta cca ctc ctg gag cct gga atg 958 Val Glu Phe Gln Leu Arg Asp Glu Leu Pro Leu Leu Glu Pro Gly Met 230 235 240 aac tga agaatgctaa tctgccccac ttgaaaagac ctcagaacag tgctattatc 1014 Asn atcattatcc tctttgcaaa ctctacttgc tcaggagcag tttatttgta gtagtagtag 1074 tagtaactag tatcctagat gttctgctgt atgtggttgg tgtgataatc attcacactt 1134 taggaagaac ccaagtagcg 1154 <210> 2 <211> 243 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ala Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val Phe Leu Asp Glu Asn Leu His 1 5 10 15 Ile His Arg Gly Pro Ala Gly Lys Arg Ala Asp Gly Leu Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Leu Lys Pro Leu Ala Ala Lys Gln Gly Leu Gln Glu Lys Lys Ala 35 40 45 Leu Arg Asp Val Ser Asn Ile Gly Lys Pro Pro Val Ser Thr Arg Lys 50 55 60 Pro Leu Gln Asp Val Ser Asn Thr Ala Lys Pro Arg Gly Arg Asn Ile 65 70 75 80 Ser Asp Gly Thr Thr Leu Lys Lys Thr Ala Leu Arg Ser His Glu Ala 85 90 95 Thr Lys Asn Pro Val Lys Lys Thr Val Ile Phe Ser Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Lys Cys His Glu Trp Ala Lys Asp Gly Val Glu Gly Thr His Phe Thr 115 120 125 Gly Asn Asp Ser Gln Lys Leu Glu Lys Asp Ser Gln Asp Lys Arg Val 130 135 140 Lys Lys Lys Val Glu Lys Ile Met Ser Ala Leu His Asp Trp Pro Asp 145 150 155 160 Ala Val Phe Asp His Val Leu Phe Pro Ser Glu Val Val Ala Ala Phe 165 170 175 Phe Glu Glu Val Lys Glu Met Glu Leu Glu Pro Glu Ile Leu Pro Glu 180 185 190 Asn Asn Arg Arg Arg Ser Ser Ser Gly Asp Lys Met Lys Leu Ala Glu 195 200 205 Asp Pro Phe Thr Glu Asp Glu Leu Asp Tyr Tyr Pro Phe Leu Glu Asn 210 215 220 Asn Pro Val Glu Phe Gln Leu Arg Asp Glu Leu Pro Leu Leu Glu Pro 225 230 235 240 Gly Met Asn <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tos17-3911F primer <400> 3 gagagcatca tcggttacat cttctc 26 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tos17-xbaI-R <400> 4 catgaaatag atccatgtat atct 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 0F <400> 5 gccatcacaa atcagcaagc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3R <400> 6 atggattgaa ggccaagcca c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer used in probing for Tos17-inserted mutant <400> 7 gtctggccag tcgtgcaatg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer used in probing for Tos17-inserted mutant <400> 8 ctgctggcaa gagggctgat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer used in probing for Tos17-inserted mutant <400> 9 tgggttcttg gtggcctcat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a primer used in probing for Tos17-inserted mutant <400> 10 gccaagccac tgaagccatt 20

【図面の簡単な説明】

【図１】日本晴再分化系統群から見出された塩ストレス
高感受性変異体および対照の野生型の幼苗の地上部およ
び根の形態を示す写真（Ａ）、ならびに根の形態を示す
写真（Ｂ）である。

【図２】日本晴再分化系統群（Ａ）、ひとめぼれ再分化
系統群（Ｂ）から独立に見出された塩ストレス高感受性
変異体および対照の野生型の幼苗の地上部および根の形
態を示す写真である。

【図３】塩ストレス感受性を決定するイネ遺伝子のｃＤ
ＮＡ配列を示す図である。

【図４】塩ストレス感受性を決定するイネ遺伝子にコー
ドされるタンパク質の推定アミノ酸配列を示す図であ
る。

【図５】塩化ナトリウムを添加しない培地（Ａ）および
塩化ナトリウム添加培地（Ｂ）で発芽および生育させた
野生型および変異型の地上部および根の形態、ならびに
通常の土壌で生育させた変異型の生育形態を示す写真で
ある。

【図６】マンニトール添加培地に移植して生育させた野
生型および変異型の地上部および根の生育形態を示す写
真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 宮尾 安藝雄 茨城県つくば市観音台２−１−２ 農業生 物資源研究所内 (72)発明者 武田 真 埼玉県さいたま市日進町１−40−２ 生物 系特定産業技術研究推進機構内 (72)発明者 阿部 清美 埼玉県さいたま市日進町１−40−２ 生物 系特定産業技術研究推進機構内 Ｆターム(参考） 4B024 AA08 BA79 BA80 CA04 CA09 CA20 HA11 HA13 HA14

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 塩ストレス耐性を制御する植物遺伝子を
   コードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオ
   チドが、配列表の配列番号２の１位のメチオニンから２
   ４３位のアスパラギンまでのアミノ酸配列をコードする
   ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または該
   アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠
   失、置換および／もしくは付加されたアミノ酸配列をコ
   ードするヌクレオチド配列を有し、かつ塩ストレス耐性
   を制御する機能を有するポリヌクレオチドを含む、ポリ
   ヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記植物遺伝子が浸透圧ストレス耐性を
   さらに制御する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 イネ由来である、請求項１または２に記
   載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 塩ストレス耐性を制御する植物遺伝子を
   コードするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオ
   チドが、配列表の配列番号１の２３３位のＡから９６１
   位のＣまでに示されるヌクレオチド配列または該ヌクレ
   オチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイ
   ズするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含
   む、ポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 前記植物遺伝子が浸透圧ストレス耐性を
   さらに制御する、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 イネ由来である、請求項４または５に記
   載のポリヌクレオチド。