ES2560806T3 - Expresión de reguladores de la transcripción que proporcionan tolerancia al calor - Google Patents

Abstract

Un método de producción de una planta transgénica que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a un control de tipo salvaje, que comprende transformar una planta, un cultivo de tejido de planta, o una célula de planta con un vector que comprende un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido bHLH subgrupo 1b seleccionado del grupo constituido por bHLH38, bHLH39, bHLH100, y bHLH101 para obtener una planta transformada, un cultivo de tejido de planta transformada, o una célula de planta transformada con expresión o actividad aumentada del gen bHLH subgrupo 1b, y cultivar dicha planta transformada o regenerar una planta a partir de dicho cultivo de tejido de planta transformada o célula de planta transformada, en el que se produce una planta que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a un control de tipo salvaje.

Description

Expresión de reguladores dela transcripción que proporcionan tolerancia al calor

Campo de la invención

La invención pertenece al campo de la biología molecular de las plantas y se refiere a plantas transgénicas que tienen nuevos fenotipos, métodos de producción de dichas plantas y polinucleótidos y polipéptidos útiles en tales métodos. Más específicamente, la invención se refiere a la expresión de un regulador de la transcripción y plantas transgénicas que tienen actividad aumentada del regulador de la transcripción para producir una planta que tiene un fenotipo ventajoso.

Antecedentes de la invención

Los estados de estrés ambiental son responsables del aumento del rendimiento significativo en las cosechas agrícolas. Se ha estudiado la relación entre variación del clima y la producción demaíz y soja en los Estados Unidos durante el periodo 1982-1998 (Lobell y Asner, 2003) y se encontró que incluso cambios graduales de temperatura tienen un impacto medible sobre el rendimiento de las cosechas. En el maíz y la soja se ha estimado que el rendimiento se reduce en un 17% por grado a medida que se eleva la temperatura por encima del óptimo de la estación. Tanto las monocotiledóneas como las dicotiledóneas son sensibles al estrés térmico, particularmente durante la floración y desarrollo de las semillas que se traduce en un impacto significativo sobre la producción de semilla (Young et al., 2004; Sato et al., 2002; Angari et al., 2000; Carlson, 1990; Wahid, A. et al. 2007). En el campo, el estrés térmico va acompañado a menudo por otros estados de estrés ambiental como la sequía, que aumenta adicionalmente la carga de productividad de la planta. El estrés térmico puede tener un número enorme de efectos celulares en las plantas tales como fluidez y permeabilidad alteradas de la membrana, agregación de proteínas y desnaturalización de proteínas, y el deterioro celular resultante puede conducir a cambios deletéreos en el crecimiento y desarrollo de las plantas, lo cual impacta en su capacidad para sobrevivir. Se ha sugerido que las plantas poseen una capacidad inherente para termotolerancia basal y adquirida y que un mecanismo común de respuestaalcalorestápresenteendiversasespeciesdeplantas(Kapooretal., 1990;Vierling, 1991;Flahaut etal., 1996; Burke et al., 2000; Hong and Vieling, 2000; Massie et al., 2003; Larkindale et al., 2005). Se han realizado numerosos estudios para identificar y caracterizar genes y mecanismos que están involucrados en la termotolerancia de las plantas. Por ejemplo los factores de transcripción del choque térmico (HSF) y proteínas del choque térmico (HSP) han recibido gran atención para elucidar los papeles y efectos de estos genes en respuesta al estrés térmico al igual que las hormonas de crecimiento de las plantas tales como el ácido abscísico y el etileno. No está claro el modo en que las plantas sienten el calor, pero es evidente que están involucrados mecanismos múltiples de señalización y componentes celulares (Larkindale et al. 2005, Plant Physiol. 138: 882-897) y que existe una intermodulación de mecanismos de señalización entre los estados de estrés ambiental y nutricional tales como estrés por choque térmico, estrés por agua/sequía, estrés por frío, estrés por oxidación y estrés por metales pesados.

Los factores de transcripción son proteínas de fijación de DNA que interaccionan con secuencias específicas promotoras o intensificadoras y alteran la expresión génica del gen asociado. Donde la secuencia específica que fija el factor de transcripción está asociada con un conjunto de genes, los mecanismos completos pueden estar regulados de manera coordinada con diversos genes componentes que están regulados simultáneamente en sentido creciente o en sentido decreciente. Un factor de transcripción puede alterar de manera coordinada un conjunto de genes en respuesta a un estímulo tal como un estrés ambiental, estatus nutricional o ataque de patógenos, por ejemplo, o puede ser un componente de un mecanismo de señalización, tal como un mecanismo de señalización hormonal por ejemplo. Los factores de transcripción poseen una estructura modular y se clasifican fundamentalmente sobre la base del dominio de fijación de DNA. Algunos reguladores de la transcripción son participantes en cascadas de señales múltiples. El mecanismo y los genes regulados aguas abajo pueden variar dependiendo de la presencia o ausencia de otros reguladores y componentes del mecanismo. Los reguladores de la transcripcióninteraccionan como una red, por lo cual el resultado depende de una multitud de factores interactivos.

La activación de la transcripción está mediada fundamentalmente por factores de transcripción que interaccionan con elementos intensificadores y promotores. La fijación de factores de transcripción a tales elementos de DNA constituye un paso crucial en la iniciación de la transcripción. Cada factor de la transcripción se fija a su secuencia de fijación específica en un promotor y activa la expresión de la región codificante enlazada por interacciones con coactivadores y/o proteínas queforman parte del complejo de transcripción.

El factor de transcripción bHLH39 es un miembro de una de las mayores familias de factores de transcripción en Arabidopsis thaliana que comprende tantas como 162 proteínas (Heim et al., 2003, Toledo-Ortiz et al., 2003, Bailey et al., 2003). Esta familia de proteínas se distingue de otros factores de transcripción por su dominio básico hélicebucle-hélice (bHLH). Estudios realizados han demostrado que la región básica es crítica para la fijación de DNA, mientras que la región hidrófoba hélice-bucle-hélice se requiere para formación de homodímeros y heterodímeros. Las proteínas bHLH pueden tener parejas de fijación múltiples, y por consiguiente modulan el nivel de expresión de genes de un subconjunto diferente dependiendo de su pareja real (Zhang et al., 2003). Estudios funcionales han implicado las proteínas bHLH en una gama de procesos celulares tales como la determinación del destino celular de

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la epidermis de la raíz (Tominaga, R., et al., 2007), producción de antocianinas (Ramsay et al., 2003), y señalización por luz(Martinez-Garica et al., 2000) así como absorción de hierro (Ling et al., 2002).

La región básica de las proteínas bHLH, constituida por aproximadamente 15-17 residuos, es responsable de la fijación a elementos cis en promotores de genes diana. El 75% de todas las proteínas bHLH de Arabidopsis se predice que están fijadas al motivo central conocido como la caja E (5'-CANNTG-3') (Toledo-Ortiz et al., 2003). La especificidad para la caja E puede predecirse de acuerdo con la presencia de dos residuos críticos, ácido glutámico85 y aeginina-88. bHLH39, y sus tres homólogos más próximos de Arabidopsis, bHLH38, bHLH100, y bHLH101, contienen todos ellos el ácido glutámico yla arginina críticos, y por tanto se predice que se fijan a estemotivo. El tipo de fijación a la caja E puede dividirse ulteriormente conforme a la preferencia de fijación de dos nucleótidos centrales. Se predice que bHLH39 se fija al motivo de la caja G CACGTG conforme a la presencia de dos residuos, arginina-89 e histidina-81. Arginina-89 e histidina-81 son responsables del contacto de los dos nucleótidos centrales "CG" en la caja G y la estabilización de la interacción. Estos dos residuos críticos se encuentran también en los otros tres homólogos de Arabidopsis bHLH39. Los cuatro residuos críticos se conservan en la totalidad de los 95 homólogos excepto en dos casos, el homólogo de Cicer arietinum tiene una arginina en lugar de la histidina-81, y un homólogo de Vitis vinifera tiene una valina en lugar del ácidoglutámico-85 (Fig. 1).

Evidencia adicional que soporta la especificidad de fijación de bHLH39 proviene de informes del ortólogo de arroz OsIRO2, que se fija a 5'-CACGTGG-3' (Ogo et al., 2006). Como ocurre en el caso de OsIRO2, los residuos exteriores al motivo de fijación central afectan también muy probablemente a la especificidad defijación.

Las proteínas de bHLH se fijan como dímeros a sus dianas de DNA, y la especificidad de pareja de fijación está codificada en el dominio hélice-bucle-hélice. La evidencia de la estructura cristalina de un complejo humano intacto Max-DNA demostró que el residuo leucina 99 es crítico para la formación de dímeros (Brownlie et al., 1997). Este residuo se conserva a lo largo de todos los homólogos de bHLH39 excepto un homólogo de Vitis vinifera. Otros residuos que exhiben más de 95% de conservación en todos los homólogos de bHLH39 incluían Arginina-100, Tirosina-124, Isoleucina-125, y Prolina-126. El requerimiento de una prolina en la posición 126 parece ser específico para bHLH39, bHLH38, bHLH100, y bHLH101, lo que sugiere que este residuo es importante en la facilitación de la especificidad de dimerización para este grupo.

Conformea semejanzas estructurales aparte del dominio de fijación de DNA, bHLH39 es similar a otras 10 proteínas de bHLH, que forman juntas el subgrupo 1b (Heim et al., 2003). El bHLH39 y su homólogo más próximo en Arabidopsis, bHLH38, exhiben 79% de semejanza y están localizados en tándem en el genoma, lo que sugiere una duplicación evolutiva reciente. Otros miembros del subgrupo 1b incluyen bHLH100 y bHLH101. La semejanza porcentual entre AtbHLH39 y otros tres miembros del subgrupo 1b de AtbHLH (conforme a la alineación Clustal W) semuestran a continuación en la Tabla A.

Tabla A: Semejanza porcentual entre AtbHLH39, AtbHLH38, AtbHLH100 y AtbHLH101

AtbHLH39 AtbHLH38 AtbHLH100 AtbHLH101

AtbHLH39

100 79 60 31

AtbHLH38

100 57 32

AtbHLH100

100 29%

AtbHLH101

100

Tanto bHLH39 como bHLH38 se identificaron en una búsqueda de dianas aguas abajo de una fijación de DNA con el factor de transcripción de un dedo (Dof), el factor de fijación del elemento ocs (OBP3) que es inducible por ácido salicílico. En este caso, bHLH39 se designó ORG3 y bHLH38 se designó ORG2. Se demostró que bHLH39 y bHLH38 tenían expresión co-regulada e intensificada en las líneas de sobreexpresión de OBP3, y estaban regulados en sentido decreciente en las líneas de pérdida de función OBF3 (Kang et al., 2003). Subsiguientemente, se demostró que bHLH39 y bHLH 38 son responsables del estrés mediado por deficiencia en hierro, junto con sus dos homólogos más próximos en el subgrupo 1b de bHLH, bHLH100, y bHLH101. El papel de la expresión de bHLH39 y bHLH38 en relación con la deficiencia en hierro ha sido estudiado. Se ha demostrado que un regulador de la transcripción FIT (AtbHLH29) interacciona con bHLH28 o bHLH39 para regular transcripcionalmente los genes de absorción de hierro FRO2 e IRT1. La sobreexpresión de AtbHLH38 o AtbHLH39 con FIT se encontró que altera el patrón de expresión de FRO2 e IRT1 para activación constitutiva y da como resultado la tolerancia a la deficiencia en hierro (Yuang et al., 2008). FRO2, una quelato-reductasa férrica, es responsable del aumento de hierro en el suelo, un proceso requerido para aumentar la solubilidad y biodisponibilidad del hierro. El hierro es transportado subsiguientemente a través de la membrana por el transportador de hierro, IRT1. La expresión ectópica de la

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proteína AtbHLH38 o AtbHLH39 bajo el control del promotor 35S en las plantas de tabaco conduce a la síntesis y excreción de riboflavina, un mecanismo de defensa conocido para condiciones deficientes en hierro (Vorwieger et al., 2007).

En un mecanismo regulador de transcripción, es común que un primer regulador de la transcripción regule un segundo regulador de la transcripción, dependiendo de la red de factores de interacción, un regulador simple de la transcripción puede jugar papeles en una diversidad de mecanismos dando como resultado una diversidad de resultados fisiológicos o bioquímicos. Una relación de este tipo se ha demostrado entre algunas proteínas MYB y algunas proteínas bHLH (Ramsay y Clover, 2005).

La familia MYB de factores de transcripción está compuesta de al menos 198 genes (Yanhui et al. 2006) y se ha propuesto que tiene funciones reguladoras en una amplia red de procesos que van desde crecimiento y desarrollo a respuestas de defensa. Las proteínas MYB de las plantas se clasifican basándose en la presencia y el número de repeticiones MYB imperfectas compuestas cada una de aproximadamente 52 aminoácidos. El dominio MYB forma una conformación hélice-vuelta-hélice y representa el dominio de fijación de DNA. Tres grupos principales de proteínas MYB han sido clasificados como proteínas afines a R1R2R3-MYB, R2R3-MYB y a MYB.

La familia de proteínas R2R3-MYB en Arabidopsis está constituida por 125 proteínas y se caracteriza por tener un dominio de fijación de DNA R2R3 en su término N (Kranz et al., 1998, y Stracke et al., 2001). Estos genes están implicados en cierto número de procesos biológicos que incluyen acciones de mediación hormonal, metabolismo secundario (Paz-Ares et al., 1987), control de morfogénesis celular (Oppenheimer et al., 1991), desarrollo del meristemo, floral y de la semilla (Kirik et al., 1998, Schmitz et al., 2002) y la respuesta a diversos factores ambientales (Kranz et al., 1998; Jin y Martin, 1999; Meissner et al., 1999).

Sumario de la invención

Esta invención está basada en el descubrimiento de que la sobreexpresión de un regulador de la transcripción génica del subgrupo 1b de bHLH da como resultado una planta con un fenotipo alterado tal como, por ejemplo, tolerancia aumentada al estrés térmico, aborto reducido de la floración durante el estrés térmico, y rendimiento aumentado con relación a una planta de tipo salvaje.

Más específicamente, la invención se refiere a la identificación de un bHLH39 o bHLH101 como reguladores de la transcripción que, cuando se sobreexpresan, producirán plantas que tienen un fenotipo de tolerancia al estrés térmico.

En un aspecto, la invención proporciona un método de producción de una planta transgénica que tiene una tolerancia aumentada al estrés térmico comparada con un control de tipo salvaje, por transformación de una planta, un cultivo de tejido de planta, o una célula de planta con un vector que contiene un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido del subgrupo 1b de bHLH seleccionado del grupo constituido por bHLH38, bHLH39, bHLH100 y bHLH101, para obtener una planta transformada, un cultivo de tejido transformado o una célula de planta transformada con expresión o actividad aumentada del subgrupo 1b de bHLH y crecimiento de la planta o regeneración de una planta a partir de dicho cultivo de tejido de planta transformado o célula de planta transformada, en el cual se produce una planta que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a una planta de tipo salvaje.

La tolerancia al estrés térmico se refiere a la capacidad de una planta para soportar los efectos debilitantes del calor que reduce el rendimiento de una planta de tipo salvaje y supera a una planta de tipo salvaje. Como se utiliza en esta memoria, el término "tolerancia aumentada al estrés térmico" se refiere a una planta en la que la tolerancia al estrés térmico es mayor en comparación con la tolerancia al estrés térmico de una planta de tipo salvaje correspondiente. Por ejemplo, una planta que tiene tolerancia al estrés térmico aumentada en comparación con una planta de tipo salvaje puede tener tolerancia al estrés térmico 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75% o mayor quela planta de tipo salvaje correspondiente.

Los métodos de la invención implican aumento de la expresión o actividad de un gen del subgrupo 1b de bHLH por sobreexpresión o modificación de promotores, en donde se produce una planta que tiene tolerancia al estrés térmico aumentada con relación a una planta de tipo salvaje. En un aspecto, la invención proporciona un método de producción de una planta que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a una planta de tipo salvaje, por introducción en una célula de la planta de un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido del subgrupo 1b de bHLH seleccionado del grupo constituido por bHLH38, bHLH39, bHLH100 y bHLH101. Por ejemplo, una planta que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a una planta de tipo salvaje se produce a) proporcionar un constructo de ácido nucleico que contiene un promotor enlazado operativamente a un constructo de ácido nucleico que expresa actividad del subgrupo 1b de bHLH; b) insertar el constructo de ácido nucleico en un vector; c) transformar una planta, cultivo de tejido, o célula de planta con el vector para obtener una planta transformada, un cultivo de tejido transformado o una célula de planta transformada con actividad del subgrupo 1b de bHLH aumentada; d) cultivar la planta o regenerar una planta a partir del cultivo de tejido o célula de la planta, en el que se produce una planta que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a una planta de tipo salvaje. El constructo incluye un promotor tal como un promotor

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constitutivo, un promotor específico de tejido o un promotor inducible. Preferiblemente, el promotor específico de tejido es un promotor de raíz. Un promotor inducible preferible es un promotor inducible por calor o sequía.

El método de lainvención produce una planta transgénica que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico.

Se describe una planta que tiene una mutación no existente naturalmente en un gen bHLH, en donde la planta tiene expresión o actividad del subgrupo 1b de bHLH aumentada y la planta tiene tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a una planta de tipo salvaje. La expresión o actividad aumentada de bHLH se refiere a un aumento de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, ó 75 veces o mayor, al nivel de DNA, RNA, o proteínas de un gen bHLH en comparación con bHLH de tipo salvaje, o un aumento de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, ó 75 veces de actividad de bHLH en comparación con la actividad de bHLH de tipo salvaje.

Se describe también una planta que tiene un gen del subgrupo 1b de bHLH que tiene una secuencia promotora alterada asociada operativamente con él. La inserción de elementos intensificadores o mutaciones de promotores que dan como resultado expresión génica aumentada están contempladas por la presente invención.

Se describe adicionalmente una semilla transgénica producida por la o las plantas transgénicas de la invención, en donde la semilla produce planta que tiene un fenotipo ventajoso o propiedad mejorada tal como por ejemplo, tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a una planta de tipo salvaje.

Se describen también ácidos nucleicos para expresión de ácidos nucleicos en una célula de planta para producir una planta transgénica que tiene un fenotipo ventajoso o propiedad mejorada tal como tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a una planta detipo salvaje.

Secuencias ilustrativas que codifican un gen de bHLH de tipo salvaje o porción del mismo que encuentran uso en aspectos de la presente invención se describen en SEQ ID Núms.: 1-17, 29-52, 79-83 y 89-97. Secuencias ilustrativas que codifican un gen bHLH39 se describen en SEQ ID Núms.: 1-17. Secuencias ilustrativas que codifican un gen bHLH38 se describen en SEQ ID Núms.: 29-52. Secuencias ilustrativas que codifican un gen bHLH101 se describen en SEQ ID Núms.: 79-83. Secuencias ilustrativas que codifican un gen bHLH100 se describen en SEQ ID Núms.: 89-97. La invención proporciona adicionalmente composiciones que contienen los ácidos nucleicos de la invención para expresión en una célula de planta a fin de producir las plantas transgénicas descritas en esta memoria.

A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden utilizarsemétodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria en la práctica o los ensayos de la presente invención, métodos y materiales adecuados se describen a continuación.

En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, con inclusión de las definiciones. Adicionalmente, losmateriales, métodos, y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes por y están abarcadas por la descripción detallada que sigue y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una alineación Clustal W de diversas proteínas AtbHLH, con inclusión de AtbHLH39, AtbHLH38, AtbHLH100 y AtbHLH101.

Descripción detallada

La invención está basada en parte en el descubrimiento de plantas que tienen una propiedad agronómica mejorada, tal como por ejemplo, tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a un control de tipo salvaje. Más específicamente, la invención está basada en el descubrimiento de que la sobreexpresión de un regulador de la transcripción confiere a la planta una propiedad agronómica mejorada, tal como por ejemplo tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a un control de tipo salvaje que puede incluir aborto reducido de la floración y rendimiento aumentado.

El resultado sorprendente de que la sobreexpresión de un gen del subgrupo 1b de bHLH39 es suficiente para conferir tolerancia al calor ha sido demostrado. Conforme al análisis de microrredes y EMSA, bHLH39 es una diana aguas abajo de MYB68, otro factor de transcripción que confiere tolerancia al calor cuando se sobreexpresa. El análisis de microrredes demuestra que la expresión génica de IRT1 no se ve afectada significativamente en el 35SbHLH39, lo que sugiere que la tolerancia al calor conferida por bHLH39 ocurre por un mecanismo separado de la respuesta a la privación de hierro.

De acuerdo con ello, la invención se refiere a métodos demejora (v.g. aumento) de la tolerancia al estrés térmico de las plantas por aumento de la expresión o actividad de un gen del subgrupo 1b de bHLH o polipéptido. Métodos para aumentar la expresión o la actividad de un gen del subgrupo1b de bHLH se conocen en la técnica. Por ejemplo, una

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planta que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico en comparación con una planta de tipo salvaje (v.g., de control) se produce por introducción en una célula de la planta de un constructo de ácido nucleico que aumenta la expresión o actividad de un gen o polipéptido del subgrupo 1b de bHLH. Se describen también las plantas transgénicas producidas por los métodos de la invención y las semillas producidas por las plantas transgénicas que producen una planta que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico.

Por conveniencia, antes de la descripción ulterior de la presente invención, se definen en esta memoria ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas. Estas definiciones deberían leerse a la vista del resto de la descripción y como son entendida por una persona con experiencia ordinaria en latécnica.

A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden utilizarsemétodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria en la práctica o los ensayos de la presente invención, se describen a continuación métodos y materiales adecuados.

En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, con inclusión de las definiciones. Adicionalmente, losmateriales, métodos, y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Una "secuencia promotora", o "promotor", significa una secuencia de ácido nucleico capaz de inducir la transcripción de una secuencia génica enlazada operativamente en una célula de planta. Los promotores incluyen por ejemplo (pero sin carácter limitante) promotores constitutivos, promotores específicos de tejido tales como un promotor de raíz, y promotores inducibles tales como un promotor inducible por sequía, un promotor inducible por calor, o promotores endógenos tales como un promotor asociado normalmente con un gen de interés, a saber, un gen del subgrupo 1b de bHLH o secuencias promotoras cripticas o sintéticas que son capaces de dirigir la expresión de un gen en una célula de planta pero no están asociadas normalmente con un gen expresable.

El término "casete de expresión" significa un constructo vector en el que se transcribe un gen o secuencia de ácido nucleico. Adicionalmente, el mRNA expresado puede traducirse en un polipéptido.

Los términos "expresión" o "sobreexpresión" se utilizan intercambiablemente y significan la expresión de un gen de tal modo que se expresa el transgén o gen enlazado operativamente. El nivel total de expresión en una célula puede ser elevado con relación a una célula correspondiente de tipo salvaje.

El término "mutación no existente naturalmente" se refiere a cualquier método que introduce mutaciones o cambios genéticos en una planta o población de plantas. Por ejemplo, mutagénesis química tal como métodos de etanometilsulfonato o éster etílico de ácido metanosulfónico, mutagénesis por neutrones rápidos, medios de inserción de DNA tales como inserción de T-DNA o mutagénesis orientada. Se incluyen también métodos para inducir cambio genético tales como métodos de meganucleasas que son una clase particular de "tijeras de DNA" que son capaces de cortar un cromosoma en un sitio específico de una célula viva.

El término "estrés térmico" se refiere a una condición en la que el crecimiento o la productividad de la planta están inhibido con relación a una planta en la que el calor no es unfactor limitante.

El término "tolerancia al estrés térmico" se refiere a la capacidad de una planta para sobrepasar a una planta de tipo salvaje en condiciones de estrés térmico.

El término "estrés por sequía" se refiere a una condición en la que el crecimiento o la productividad de la planta están inhibido con relación a una planta en la que el agua no es limitante. El término "estrés por agua" se utiliza de manera sinónima e intercambiablemente con el estrés de agua por sequía.

El término "tolerancia a la sequía" se refiere a la capacidad de una planta para sobrepasar una planta de tipo salvaje en condiciones de estrés por sequía o condiciones limitadas por agua o para utilizar menos agua durante el crecimiento y desarrollo con relación a una planta detipo salvaje.

El término "peso seco" se refiere a tejido de planta que se ha secado para eliminar la mayor parte del agua celular y se utiliza demanera sinónima e intercambiablemente con el término biomasa.

El término "nulo" se define como un hermano segregado de un linaje transgénico que ha perdido el transgén insertado y se utiliza por tanto como linaje de control.

Cierto número de diversas abreviaturas estándar han sido utilizadas a lo largo de la descripción, tales como g, gramo;WT, tipo salvaje; DW, peso seco; WUE, eficiencia deuso de agua; d, día.

El término "bHLH subgrupo 1b" significa un regulador de la transcripción bHLH39, bHLH38, bHLH100 o bHLH101. En algunos casos, se utiliza el término bHLH para hacer referencia al bHLH subgrupo 1b, cuando es apropiado en el contexto.

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El término "ácido nucleico bHLH" se refiere a al menos una porción de un ácido nucleico bHLH. Análogamente, el término "proteína bHLH" o "polipéptido bHLH" se refiere a al menos una porción del mismo. Una porción es de al menos 21 nucleótidos de longitud con respecto a un ácido nucleico y una porción de una proteína o polipéptido es al menos 7 aminoácidos. El término "AtbHLH" se refiere a un gen de bHLH de Arabidopsis thaliana, y el término "Bn bHLH" se refiere a un gen bHLH de Brassica napus.

Determinación de la homología entre dos omás secuencias

Para determinar el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos ácidos nucleicos, se alinean las secuencias para propósitos de comparación óptima (v.g. pueden introducirse lagunas en cualquiera de las secuencias que se comparan para alineación óptima entre las secuencias). Se comparan luego los residuos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son homólogas en dicha posición (es decir, como se utiliza en esta memoria, la "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "identidad "de aminoácido o ácido nucleico).

La homología de secuencia de ácido nucleico puede determinarse como el grado de identidad entre dos secuencias. La homología puede determinarse utilizando programas de computadora conocidos en la técnica, tales como el software GAP proporcionado en el paquete de programas GCG. Véase, Needleman y Wunsch (1970). Utilizando el software GCG GAP con los ajustes siguientes para comparación de secuencias de ácido nucleico: penalidad de creación de GAP de 5,0 y penalidad por extensión de GAP de 0,3, la región codificante de las secuencias de ácido nucleico análogas a que se hace referencia anteriormente exhibe un grado de identidad preferiblemente de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99%, con la porción de secuencia codificante de la secuencia de DNA que semuestra en SEQ ID NO: 1.

El término "identidad de secuencia" se refiere al grado en que dos secuencias de polinucleótido o polipéptido son idénticas sobre una base de residuo-...-residuo en una región de comparación particular. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula por comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en dicha región de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica (v.g. A, T, C, G, U, o I, en el caso de ácidos nucleicos) existe en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la región de comparación (es decir, el tamaño de ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad sustancial", como se utiliza en esta memoria, denota una característica de una secuencia de polinucleótidos, en la cual el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 85% de identidad y a menudo 90 a 95% de identidad de secuencia, más usualmente al menos 99% de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia en una región de comparación. El término "porcentaje de residuos positivos" se calcula por comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en dicha región de comparación, determinación del número de posiciones en las cuales las sustituciones idénticas y conservadoras de aminoácidos, como se han definido arriba, existen en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la región de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de residuos positivos.

Expresión aumentada de la expresión y actividad del subgrupo 1b de bHLH

Un aspecto de la invención se refiere a medios y métodos de aumento o sobreexpresión de la expresión y actividad del gen del subgrupo 1b de bHLH, que dan como resultado un aumento de la expresión y actividad de proteínas del subgrupo 1b de bHLH. El término "expresión o actividad de bHLH" abarca los dos niveles de aumento citados. La expresión o actividad aumentada de bHLH se refiere a un aumento de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, ó 75 veces o mayor, al nivel de DNA, RNA o proteína de un gen del subgrupo 1b de bHLH en comparación con bHLH de tipo salvaje, o un aumento de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, ó 75 veces de la actividad de una proteína del subgrupo 1b de bHLH en comparación con la actividad del subgrupo 1b de bHLH detipo salvaje.

Secuencias que codifican un gen del subgrupo 1b de bHLH o porción del mismo que son útiles en la preparación de constructos para expresión del subgrupo 1b de bHLH incluyen por ejemplo SEQ ID Núms.: 1-17, 29-52, 79-83 y 89

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Los constructos de expresión tienen por objeto proporcionar sobreexpresión constitutiva en toda la planta, o en tejidos específicos. Alternativamente, la expresión puede diseñarse por ingeniería de modo que ocurra en respuesta a un estímulo regulado temporal, espacial, o ambientalmente.

Las estrategias de expresión génica serán evidentes para el operario experto, con inclusión de aquéllas que no se exponen en esta memoria ylas que se desarrollen en el futuro.

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Identificación de homólogos de AtbHLH

Homólogos de Arabidopsis thaliana bHLH subgrupo 1b (AtbHLH) se identificaron utilizando herramientas de búsqueda de secuencias en bases de datos, tales como la Basic Local Alignment Search Tool (Blast) (Altschul et al., 1990 y Altschul et al., 1997). Se emplearon los programas de análisis de secuencias tblastn o blastn utilizando la matriz de registro BLOSUM-62 (Henikoff y Henikoff 1992). La salida de un informe Blast proporciona un registro que tiene en cuenta la alineación de residuos similares o idénticos y cualesquiera lagunas necesarias a fin de alinear las secuencias. La matriz de registro asigna un registro para alineación de cualquier posible par de secuencias. Los valores P reflejan cuántas veces puede esperarse encontrar que aparezca un registro por casualidad. Se prefierenregistros más altos, prefiriéndose un umbral de valor umbral P bajo. Éstos son los criterios de identidad de secuencias. Se utilizó el programa de análisis de secuencias tblastn para cuestionar una secuencia de polipéptido contra traducciones de 6 vías de secuencias en una base de datos de nucleótidos. Aciertos con un valor P menor que -25, preferiblemente menor que -70, y más preferiblemente menor que -100, se identificaron como secuencias homólogas (criterios desecuencia seleccionados ilustrativos). Seutilizó el programa deanálisis desecuencias blastn para cuestionar una secuencia de nucleótido contra una base de datos de secuencia de nucleótidos. También en este caso se preferían registros mayores y un valor P umbral preferido era menor que -13, preferiblemente menor que -50, ymás preferiblementemenor que -100.

Un gen bHLH subgrupo 1b puede aislarse por técnicas estándar de amplificación PCR. El uso de cebadores para regiones conservadas de un gen bHLH subgrupo 1b y amplificación PCR produce un fragmento o copia de longitud total del gen deseado. El molde puede ser DNA, genómico o una biblioteca de cDNA, o RNA o mRNA para uso con técnicas PCR de transcriptasa inversa (RtPCR). Las regiones conservadas pueden identificarse utilizando herramientas de comparación de secuencias tales como Blast o CLUSTALW por ejemplo. Cebadores adecuados han sido utilizados y descritos en otro lugar de esta solicitud.

Alternativamente, un fragmento de una secuencia de un gen bHLH subgrupo 1b es 32P-radiomarcado por cebado aleatorio (Sambrook et al., 1989) y se utiliza para cribar una biblioteca genómica de plantas (los polinucleótidos de test ilustrativos). Como ejemplo, DNA total de plantas de Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Lycopersicon pimpinellifolium, Prunus avium, Prunus cerasus, Cucumis sativus, u Oryza sativa se aíslan conforme a Stockinger et al., (Stockinger et al., 1996). Aproximadamente 2 a 10 μg de cada muestra de DNA se digieren por restricción, se transfieren a membranas de nailon (Micron Separations, Westboro, Mass.) y se hibridan. Las condiciones de hibridación son: 42ºC en formamida al 50%, 5X SSC, tampón de fosfato 1X de Denhardt 20 mM, 10% de sulfato de dextrano, y 100 μg/ml de DNA de esperma de arenque. Se realizan 4 lavados de baja severidad a la temperatura ambiente en 2X SSC, 0,05% de sarcosil-sodio y 0,02% de pirofosfato de sodio antes de lavados de alta severidad a 55ºC en 0,2X SSC, 0,05% de sarcosil-sodio y 0,01% de pirofosfato de sodio. Se realizan lavados de alta severidad hasta que ya no se detectan conteos en el líquido de lavado conforme a Walling et al. (Walling et al., 1988). Los aislados positivos se identifican, purifican y secuencian. Están disponibles otros métodos para hibridación, por ejemplo la solución de hibridación SpressHybTM disponible de Clontech.

Vectores de Expresión Recombinantes de bHLH y Células Hospedadoras

El método de la invención emplea vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína bHLH subgrupo 1b, un gen o secuencia genómica de bHLH subgrupo 1b o porciones de los mismos y análogos u homólogos de los mismos. Como se utiliza en esta memoria, el término vector de expresión incluye vectores que están diseñados para proporcionar transcripción de la secuencia de ácido nucleico. Las secuencias transcritas pueden diseñarse para expresar el constructo génico a fin de aumentar la expresión o actividad total de una actividad de gen endógeno correlacionada con la secuencia transcrita. La secuencia expresada puede ser una proteína codificante de bHLH subgrupo 1b o de una especie heteróloga.

El ácido nucleico transcrito puede traducirse en un producto polipeptídico o proteínico. El polipéptido puede ser una variante de longitud no total, mutante o modificada de la proteína endógena. Como se utiliza en esta memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de DNA bicatenario circular al cual pueden ligarse segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en cuyo caso pueden ligarse segmentos adicionales de DNA al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen los mismos (v.g., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano). Otros vectores se integran en el genoma de una célula hospedadora después de introducción en la misma, y con ello se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están enlazados operativamente. A tales vectores se hace referencia en esta memoria como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de DNA recombinante se encuentran a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente dado que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la invención tiene por objeto incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales o vectores de transformación de plantas, binarios o de otro tipo, que desempeñan funciones equivalentes.

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Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico de una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospedadoras a utilizar para expresión, que está enlazada operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, debe entenderse que "enlazado operativamente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la o las secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica (v.g., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora).

El término "secuencia reguladora" tiene por objeto incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (v.g., señales de poliadenilacion). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (1990). Secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células hospedadoras (v.g., secuencias reguladoras específicas de tejido) o promotores inducibles (v.g., inducidos en respuesta a factores abióticos tales como condiciones ambientales, calor, sequía, estatus de nutrientes o estratos fisiológico de la célula o factor biótico tal como sensibilidad a patógenos). Ejemplos de promotores adecuados incluyen por ejemplo promotores constitutivos, promotores inducibles ABA, promotores específicos de tejido y promotores abióticos o bióticos inducibles por estrés. Será apreciado por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada así como la temporización y localización de la expresión, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir de este modo proteínas o péptidos, con inclusión de proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describen en esta memoria (v.g., proteínas bHLH subgrupo 1b, formas mutantes de proteínas bHLH subgrupo 1b, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes pueden diseñarse para expresión de genes bHLH subgrupo 1b, proteínas bHLH subgrupo 1b, o porciones de los mismos, en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los genes bHLH subgrupo 1b o proteínas bHLH subgrupo 1b pueden expresarse en células bacterianas tales como Escherichia coli, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura, células de plantas o células de mamífero. Células hospedadoras adecuadas se exponen adicionalmente en Goeddel (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo utilizando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.

En una realización, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de plantas utilizando un vector de expresión de plantas. Ejemplos de sistemas vectores de expresión de plantas incluyen el plásmido inductor de tumores (Ti) o porción del mismo encontrada en Agrobacterium, DNA del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y vectores tales como pBI121.

Para expresión en plantas, la casete de expresión recombinante contendrá además de los ácidos nucleicos bHLH subgrupo 1b, una región promotora que funciona en una célula de planta, un sitio de iniciación de la transcripción (si la secuencia codificante a transcribir carece de uno), y opcionalmente una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación. La región de terminación/poliadenilación puede obtenerse a partir del mismo gen que la secuencia promotora, o puede obtenerse a partir de genes diferentes. Sitios de enzimas de restricción singulares en los extremos 5' y 3' de la casete se incluyen típicamente para permitir inserción fácil en un vector preexistente.

Ejemplos de promotores adecuados incluyen promotores de virus de plantas tales como el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell et al., 1985), promotores de genes tales como actina de arroz (McElroy et al., 1990), ubiquitina (Christensen et al., 1992; pEMU (Last et al., 1991), MAS (Velten et al., 198,4) histona H3 del maíz (Lepetit et al., 1992; y Atanassvoa et al., 1992), el promotor 5' o 3' derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, el promotor Smas, el promotor de cinamil-alcohol-deshidrogenasa (Patente U.S. No. 5.683.439), el promotor Nos, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, promotor ALS, (WO 96/30530), un promotor sintético, tal como los promotores Rsyn7, SCP y UCP, ribulosa-1,3-difosfato-carboxilasa, promotores específicos de fruto, promotores del choque térmico (HSP81.1 o HSP18.2), promotores específicos de semilla, promotores específicos de raíz, a saber uclacianin2 (UCC2, At2g 44790) y otras regiones de iniciación de la transcripción de diversos genes de plantas, por ejemplo, que incluyen las diversas regiones de iniciación de opina, tales como por ejemplo, octopina, manopina, y nopalina. En algunos casos puede utilizarse un promotor asociado con el gen de interés (v.g. bHLH) para expresar un constructo direccionado al gen de interés, por ejemplo el promotor nativo AtbHLH. Elementos reguladores adicionales que pueden estar conectados a una secuencia de ácido nucleico codificante de bHLH subgrupo 1b para expresión en células de plantas incluyen terminadores, secuencias de poliadenilación, y secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos señal que permiten la localización en una célula de planta o secreción de la proteína por la célula. Tales elementos reguladores y métodos para adición o intercambio de estos elementos con los elementos reguladores del gen bHLH subgrupo 1b son conocidos e incluyen, pero sin carácter limitante, regiones de terminación 3' y/o poliadenilación tales como las del gen de nopalina-sintasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983); el gen del inhibidor II de proteinasa de patata (PINII) (Keil et al., 1986); y An et al. (1989); y el gen 19S de CaMV (Mogen et al., 1990).

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Secuencias señal de plantas, que incluyen, pero sin carácter limitante, secuencias de DNA/RNA codificantes de péptidos señal que direccionan proteínas a la matriz extracelular de la célula vegetal (Dratewka-Kos et al., 1989) y el gen de extensión de Nicotiana plumbaginifolia (De Loose et al., 1991), o péptidos señal que direccionan proteínas a la vacuola como el gen esporamina de la batata (Matsuoka et al., 1991) y el gen de lectina de la cebada (Wilkins et al., 1990), o señales que causan la secreción de proteínas tal como la de PRIb (Lund et al., 1992), o aquéllas que direccionan proteínas a los plastos tales como la de enoil-ACP-reductasa de la colza (Verwoert et al., 1994) son útiles en la invención.

Opcionalmente, el vector de expresión recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (v.g., se utilizan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Elementos reguladores específicos de tejido se conocen en la técnica. Por ejemplo, el promotor asociado con una secuencia codificante identificada en la base de datos TAIR como At2g44790 (P4790) es un promotor específico de raíz. Especialmente útiles en conexión con los ácidos nucleicos de la presente invenciónson sistemas de expresión que están operativos en plantas. Éstos incluyen sistemas que se hallan bajo control en un promotor específico de tejido, así como aquéllos que implican promotores que son operativos en todos los tejidos de plantas.

Son también bien conocidos promotores específicos de órganos. Por ejemplo, el gen de calcona-sintasa-A (van der Meer et al., 1990) o el promotor de dihidroflavonol-4-reductasa (dfr) (Elomaa et al., 1998) dirigen la expresión en tejidos específicos florales. Están disponibles también el promotor patatín clase I que se activa transcripcionalmente sólo en el tubérculo de la patata y puede utilizarse para direccionar la expresión del gen en el tubérculo (Bevan, 1986). Otro promotor específico de patata es el promotor almidón-sintasa fijado a los gránulos (GBSS) (Visser et al., 1991).

Otros promotores específicos de órganos apropiados para un órgano diana deseado pueden aislarse utilizando procedimientos conocidos. Estas secuencias de control están asociadas generalmente con genes que se expresan únicamente en el órgano deseado. En una planta superior típica, cada órgano tiene miles de mRNAs que están ausentes de otros sistemas de órgano (revisado en Goldberg, 1986).

El sistema o casete de expresión resultante está ligado a o construido de otro modo para incluirse en un vector recombinante que es apropiado para transformación de plantas. El vector puede contener también un gen marcador seleccionable por el cual las células de plantas transformadas pueden ser identificadas en cultivo. El gen marcador puede codificar resistencia a antibióticos. Estos marcadores incluyen resistencia a G418, higromicina, bleomicina, kanamicina, y gentamicina. Alternativamente, el gen marcador puede codificar un gen de tolerancia a herbicidas que proporciona tolerancia a los herbicidas tipo glufosinato o glifosato. Después de la transformación de las células de la planta, aquellas células que tienen el vector se identificarán por su capacidad para crecer en un medio que contiene el antibiótico o herbicida particular. Secuencias de replicación, de origen bacteriano o viral, se incluyen también generalmente para permitir que el vector pueda clonarse en un hospedador bacteriano o de fago, incluyéndose preferiblemente un origen de replicación procariota de amplia gama de hospedadores. Debería incluirse también un marcador seleccionable para bacterias a fin de permitir la selección de células bacterianas que lleven el constructo deseado. Marcadores seleccionables procariotas adecuados incluyen también resistencia a antibióticos tales como kanamicina o tetraciclina.

Otras secuencias de DNA que codifican funciones adicionales pueden estar presentes también en el vector, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, en el caso de transformaciones de Agrobacterium, se incluirán también secuencias de T-DNA para transferencia subsiguiente a los cromosomas de la planta.

Se describen en esta memoria células hospedadoras en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante. Los términos "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se utilizan en esta memoria intercambiablemente. Debe entenderse que dichos términos se refieren no sólo a la célula particular de que se trata sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Dado que pueden existir ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero se incluye todavía dentro del alcance del término tal como se utiliza en esta memoria.

Puede introducirse DNA vector en células procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se utilizan en esta memoria, los términos "transformación" y "transfección" debe entenderse que se refieren a una diversidad demétodos reconocidos en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (v.g., DNA) en una célula hospedadora.

Una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede utilizarse para producir (es decir, expresar) un polipéptido de la invención codificado en un marco de lectura abierto de un polinucleótido de la invención. De acuerdo con ello, se describen métodos para producir un polipéptido utilizando las células hospedadoras. Por ejemplo, el método comprende cultivar la célula hospedadora (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido) en un medio adecuado de tal modo que se produce el polipéptido. Opcionalmente, el método comprende además el aislamiento del polipéptido del medio o dela célula hospedadora.

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Varios tipos de células pueden actuar como célula hospedadora adecuada para expresión de un polipéptido codificado por un marco de lectura abierto en un polinucleótido. Células hospedadoras de plantas incluyen, por ejemplo, células de plantas que podrían funcionar como hospedadores adecuados para la expresión de un polinucleótido de la invención e incluyen células epidérmicas, mesófilas y otros tejidos base, y tejidos vasculares en hojas, tallos, órganos florales, y raíces de una diversidad de especies de plantas, tales como Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Brassica napus, Zea mays, Oryza sativa, Gossypium hirsutum y Glycine max.

Células de Plantas Transformadas y Plantas Transgénicas

Se describen un protoplasto, células de plantas, tejido de plantas y plantas (v.g., monocotiledóneas o dicotiledóneas) transformadas con un ácido nucleico bHLH subgrupo 1b, un vector que contiene un ácido nucleico bHLH subgrupo 1b, o un vector de expresión que contiene un ácido nucleico bHLH subgrupo 1b. Como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que "planta" incluye no sólo una planta entera sino también una porción de la misma (es decir, células, y tejidos, queincluyen por ejemplo, hojas, tallos, brotes, raíces, flores, frutos y semillas).

La planta puede ser cualquier tipo de planta que incluye, por ejemplo, especies de los géneros Arabidopsis, Brassica, Oryza, Zea, Sorghum, Brachypodium, Miscanthus, Gossypium, Triticum, Glycine, Pisum, Phaseolus,, Lycopersicon, Trifolium, Cannabis, Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesia, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Lolium, Avena, Hordeum, Secale, Picea, Caco, y Populus.

La descripción incluye también células, tejidos, que incluyen por ejemplo, hojas, tallos, brotes, raíces, flores, frutos y semillas yla progenie derivada de la planta transformada.

Numerososmétodos para introducción de genes extraños en plantas se conocen y pueden utilizarse para insertar un gen en una planta hospedadora, con inclusión de protocolos biológicos y físicos de transformación de plantas (véase, por ejemplo, Miki et al., (1993) "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc. Boca Raton, páginas 67-88; y Andrew Bent, en Clough SJ and Bent AF, (1998) “Floral dipping: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana”). Los métodos seleccionados varían con la planta hospedadora, e incluyen métodos de transfección química tales como fosfato de calcio, transformación con polietilenglicol (PEG), transferencia de genes mediada por microorganismos tales como Agrobacterium (Horsch et al., 1985), electroporación, transformación de protoplastos, microinyección, inmersión de la flor y bombardeo biolístico.

Transformación Mediada por Agrobacterium y

El método más ampliamente utilizado para introducir un vector de expresión en plantas está basado en el sistema de transformación natural de Agrobacterium tumefaciens y A. rhizogenes que son bacterias patógenas de plantas que transforman genéticamente las células de la planta. A este respecto, los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes llevan genes responsables de la transformación genética de plantas (véase, por ejemplo Kado, 1991). Descripciones de los sistemas vectores de Agrobacterium y métodos para transferencia de genes mediada por Agrobacterium se proporcionan en Gruber et al. (1993) y Moloney et al. (1989).

Pueden producirse fácilmente plantas transgénicas de Arabidopsis por el método de inmersión de las plantas en floración en un cultivo de Agrobacterium, basado en el método de Andrew Bent en, Clough SJ and Bent AF, (1998) “Floral dipping: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana”). Las plantas de tipo salvaje se cultivan hasta que la planta tiene a la vez flores en desarrollo y flores abiertas. Las plantas se invierten durante 1 minuto en una solución de cultivo de Agrobacterium que lleva el constructo génico apropiado. Las plantas se dejan luego en posición horizontal en una bandeja y se mantienen cubiertas durante dos días para mantener la humedad, después de lo cual se enderezan y se embolsan para continuar el crecimiento y desarrollo de semillas. La semillamadura se cosecha a granel.

Transferencia Directa deGenes

Un método de transformación de plantas aplicable generalmente es la transformación mediada por microproyectiles, en la que se transporta DNA en la superficie demicroproyectiles quemiden aproximadamente 1 a 4 μm. El vector de expresión se introduce en los tejidos de planta con un dispositivo biolístico que acelera los microproyectiles hasta velocidades de 300 a 600 m/s, que es suficiente para atravesar las paredes y membranas de la célula de la planta (Sanford et al., 1993; Klein et al., 1992).

La transformación de plantas puede conseguirse también por el método del Inyector de Haces de Aerosol (ABI) descrito en U.S. Pat. 5.240.842 y U.S. Pat. 6.809.232. La tecnología de haces de aerosol se utiliza para acelerar partículas húmedas o secas hasta velocidades que hacen posible que las partículas penetren en las células vivas. La tecnología de haces de aerosol emplea la expansión en chorro de un gas inerte a medida que el mismo pasa desde una región de mayor presión de gas a una región de menor presión de gas a través de un pequeño orificio. El gas que se expande acelera las gotitas de aerosol, que contienen las moléculas de ácido nucleico a introducir en

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una célula o tejido. Las partículas aceleradas se posicionan para impactar en una diana preferida, por ejemplo una célula de planta. Las partículas están construidas como gotitas de un tamaño suficientemente pequeño para que la célula sobreviva a la penetración. La célula o tejido transformado se deja crecer para producir una planta por métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica aplicable.

Regeneración de Transformantes

El desarrollo o la regeneración de plantas a partir de protoplastos simples de la planta o diversos explantes son bien conocido en la técnica (Weissbach y Weisswach, 1988). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye típicamente los pasos de selección de células transformadas, cultivando dichas células individualizadas a lo largo de las etapas usuales de desarrollo embrionario hasta la etapa de plántula enraizada. Embriones y semillas transgénicos se regeneran análogamente. Los brotes transgénicos enraizados resultantes se plantan después de ello en unmedio apropiado de crecimiento de plantas tal como el suelo.

El desarrollo o la regeneración de plantas que contienen el gen exógeno extraño que codifica un polipéptido de interés introducido por Agrobacterium a partir de explantes de hojas puede lograrse por métodos bien conocidos en la técnica tales como los descritos (Horsch et al., 1985). En este procedimiento, se cultivan transformantes en presencia de un agente de selección y en un medio que induce la regeneración de brotes en la cepa de la planta a transformar como se ha descrito (Fraley et al., 1983). En particular, U.S. Pat. No. 5.349.124 detalla la creación de células de lechuga transformadas genéticamente y plantas resultantes de ello que expresan proteínas cristalinas híbridas que confieren actividad insecticida contralarvas de Lepidópteros a tales plantas.

Este procedimiento produce típicamente brotes en el transcurso de 2 a 4 meses, y dichos brotes se transfieren luego a un medio apropiado inductor de raíz que contiene el agente selectivo y un antibiótico para prevenir el crecimiento bacteriano. Los brotes que se han enraizado en presencia del agente selectivo para formar plántulas se trasplantan luego a suelo u otro medio que permita la producción de raíces. Estos procedimientos varían dependiendo de la cepa de planta particular empleada, siendo tales variaciones bien conocidas en la técnica.

Preferiblemente, las plantas regeneradas se autopolinizan para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas, o el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza para crecimiento de semilla de plantas de importancia agronómica, preferiblemente linajes endogámicos. Inversamente, el polen de plantas de dichos linajes importantes se utiliza para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica que contiene un polipéptido deseado se cultiva utilizando métodos bien conocidos por un experto en la técnica.

Una planta transgénica preferida es un segregado independiente y puede transmitir el constructo del gen bHLH subgrupo 1b a su progenie. Una planta transgénica más preferida es homocigótica para el constructo génico, y transmite dicho constructo génico a toda la descendencia por apareamiento sexual. La semilla de una planta transgénica puede cultivarse en el campo o en invernadero, y plantas transgénicas resultantes sexualmente maduras se autopolinizan para generar plantas de progenie verdadera. La progenie de estas plantas se convierte en linajes de progenie verdadera que se evalúan respecto a expresión aumentada del gen bHLH subgrupo 1b.

Método de Producción de Plantas Transgénicas

Se describen métodos de producción de una planta transgénica que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico, aborto floral reducido, y rendimiento aumentado con relación a una planta tipo salvaje después de un estrés térmico. El método incluye introducir en una omás células de la planta un compuesto que aumenta la expresión ola actividad de bHLH subgrupo 1b en la planta para generar una célula de planta transgénica y la regeneración de una planta transgénica a partir de la célula transgénica. El compuesto puede ser, v.g., (i) un polipéptido bHLH subgrupo 1b; (ii) un ácido nucleico bHLH subgrupo 1b, análogo, homólogo, ortólogo, porción, variante o complemento del mismo; (iii) un ácido nucleico que aumenta la expresión de un ácido nucleico bHLH subgrupo 1b. Un ácido nucleico que aumenta la expresión de un ácido nucleico bHLH subgrupo 1b puede incluir promotores o elementos intensificadores. El ácido nucleico bHLH subgrupo 1b puede ser endógeno o exógeno, por ejemplo un ácido nucleico bHLH subgrupo 1b de Arabidopsis puede introducirse en una especie de Brassica o maíz. Preferiblemente, el compuesto es una secuencia de ácido nucleico bHLH subgrupo 1b endógena de la especie a transformar. Alternativamente, el compuesto es una secuencia de ácido nucleico bHLH subgrupo 1b exógena para la especie a transformar y que tiene homología de al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o mayor para la secuencia diana endógena.

La planta transgénica tiene un fenotipo alterado en comparación con una planta de tipo salvaje (es decir, no transformada). Por fenotipo alterado se entiende que la planta tiene una o más características que es o son diferente(s) de la planta de tipo salvaje. Por ejemplo, cuando la planta transgénica se ha puesto en contacto con un compuesto que aumenta la expresión o actividad de un ácido nucleico bHLH subgrupo 1b, la planta tiene un fenotipo tal como tolerancia aumentada al estrés térmico, aborto floral reducido, y rendimiento aumentado con relación a una planta de tipo salvaje después del estrés térmico.

La planta puede ser cualquier tipo de planta con inclusión, por ejemplo, de especies de los géneros Arabidopsis, Brassica, Oryza, Zea, Sorghum, Brachypodium, Miscanthus, Gossypium, Tritium, Glycine, Pisum, Phaseolus,, Lycopersicon, Trifolium, Cannabis, Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis,

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Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Germanium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Lolium, Avena, Hordeum, Secale, Picea, Caco, y Populus.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación deGenes Homólogos

Se realizaron búsquedas Blast de bHLH39 y sus homólogos de Arabidopsis bHLH38, bHLH100, y bHLH101 contra las bases de datos NCBI's de proteínas, nucleótidos, y EST y la base de datos Unigene TIGR's (1e-01). Se utilizaron bases de datos de secuencias genómicas para especies cuya secuencia completa se conoce, tales como arroz y sorgo. Para confirmar que una secuencia era de hecho un ortólogo de las secuencias de interés, todos los homólogos supuestos se compararon por Blast contra la base de datos de proteínas de Arabidopsis completa, y cualquier secuencia cuyo acierto máximo en Arabidopsis no era una de las cuatro secuencias de interés se retiró de cualquier análisis ulterior. Para minimizar la redundancia entre aciertos múltiples, todos los aciertos de secuencia EST se ensamblaron utilizando el programa de ensamblaje cap3, asegurando que los mismos tenían un mínimo de identidad de 90% de al menos 40 nucleótidos con un máximo de 5 lagunas. Los marcos de lectura abiertos se

ydeterminaron utilizando el programa Getorf de EMBOSS.

Las búsquedas Blast de AtbHLH39, AtbHLH38, AtbHLH100 y AtbHLH101 recuperaron 96 secuencias homólogas de 40 especies diferentes. La conservación de secuencia se limitaba a los dominios de fijación y dimerización de DNA, con poca o ninguna conservación fuera de esta área. Se descubrieron homólogos tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas, lo que sugiere un requerimiento funcional importante en las plantas. Se recuperaron los homólogos de AtbHLH39 en especies agronómicamente importantes tales como arroz y maíz, así como especies utilizadas en biocombustibles tales como Brachypodium y Mijo perenne.

Conforme a las búsquedas Blast contra la base de datos genómica de Brachypodium, existen tres homólogos de este grupo de genes, y los tres son muy similares a AtbHLH38. Existe evidencia EST para dos de los tres homólogos. Si el tercer homólogo es un pseudogén o codifica una proteína funcional estátodavía por determinar.

En otras dos especies de monocotiledóneas, arroz y sorgo, existe solamente un homólogo de este grupo, y en ambas especies el homólogo está más próximo a AtbHLH38. Tanto en arroz como en sorgo, el gen codifica al menos dos variantes de remodelación.

Existen al menos dos homólogos de este grupo en Brassica napus, una proteína con homología estrecha a AtbHLH39, y otra con homología estrecha para AtbHLH38. Sin embargo, el homólogo BnbHLH39 contiene una mutación sin sentido que da como resultado la codificación de una proteína parcial sin dominio de fijación o dimerización alguno de DNA. Este descubrimiento se ha confirmado con varias EST's, y ocurre también en Brassica rapa.

Ejemplo 2: Construcción de Vectores

El vector binario pBI121 se optimizó para transformación de Arabidopsis y diferentes cosechas. El gen GUS en pBI121 se delecionó por digestiones con SmaII y EcolCR1 y religación, dando como resultado el vector pBI121ΔGUS. Este vector se utilizó para clonar el gen para sobreexpresión. La porción C-terminal de 1,1 Kb del gen GUS se aisló de pBI121 como un fragmento EcoR V-Sac I (posiciones 6613-7715 en pBI121) y se clonó en los sitios Sma I y Sac I en pBI121ΔGUS, dando como resultado pBI121tGUS (con la porción N-terminal del gen GUS delecionada). El vector se utilizó para fabricar constructos horquilla de regulación decreciente del gen con la secuencia parcial GUS como el bucle o espaciador.

El gen NPTII en el vector pBI121 y sus derivados contiene una mutación puntual (G a T en la posición 3383 en pBI121, sustitución de aminoácidos E182D). La enzima mutante exhibía una actividad enzimática varias veces menor que su tipo salvaje (PNAS, 87:3435-3439, 1990). Con objeto de mejorar la eficiencia de transformación de diferentes cosechas, los vectores pBIΔGUS y pBItGUS se restauraron con el gen WT-NPTII: un fragmento Nhe I-BstB I (0,9 kb, posiciones 2715-3648) se reemplazó con un fragmento Nhe I-BstB I que tenía exactamente la misma secuencia, excepto la diferencia de un solo nucleótido. El fragmento se aisló por digestión de restricción del plásmido pRD400 que contenía el gen WT-NPTII (PNAS, 87: 3435-3439, 1990; Gene, 122: 383-384, 1992). Los vectores modificados se designaron pBI300ΔGUS y pBI300tGUS, respectivamente. El gen WT-NPTII se aisló también de pBI300ΔGUS como un fragmento Nhe I-Hind III (2,2 kb) y se clonó en los sitios correspondientes en pBI121. Esto generó el vector pBI300GUS. Para distinguir estos vectores de otros, los vectores binarios basados en pBI121 que contenían el gen WT-NPTII se designaron serie pBI300.

Con objeto de utilizar Basta como agente de selección, se subclonó un marcador de resistencia a Basta en pBI121. Un fragmento Ase I de 1,3 kb que abarcaba el marcador de selección Basta (35S-Bar-nosT) se amplificó por PCR a partir del vector pEGAD utilizando un cebador directo que contenía un sitio PmeI y un cebador inverso que contenía un sitio Hind III. El fragmento se clonó, entre los sitios de Pme I (posición 2492) a III (posición 4950) en pBI121, pBIΔGUS y pBItGUS. Como resultado, el marcador de selección de kanamicina (Pnos-NPTII-nosT) se reemplazó

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con el marcador de selección Basta en estos vectores. Para distinguir estos vectores de otros, los vectores binarios basados en pBI121 que contenían el gen del marcador de selección Basta se designaron serie pBI800.

Los vectores pBI300 contienen el gen WT-NPTII conducido por el promotor nopalina-sintasa (nos). Dado que el promotor no es activo en plantas monocotiledóneas, fue necesario reemplazarlo con un promotor fuerte para transformación de plantas monocotiledóneas. Para este propósito, el promotor del gen TIF1 de Brachypodium (BdTIF1, denominado también BdGOS2) se clonó en vectores de la serie pBI300 para conducir el gen WT-NPTII. La secuencia promotora PdDIF1 (-1 a -2548 con respecto al codón de inicio ATG, que incluía el primer exón, el primer intrón y una porción del segundo exón) se amplificó por PCR como un fragmento PmeI-NheI y se clonó en los sitios correspondientes en HSP81.1-AtMYB68-pBI300 (un vector basado en pBI300 que contenía el promotor 81.1 de la proteína del choque térmico de Arabidopsis y la secuencia codificante de Arabidopsis MYB68, véase más adelante para detalles). Como resultado, el promotor TIF1p quedó situado en posición 5' aguas arriba del gen WT-NPTII con un pequeño fragmento de aproximadamente 120 pb (que incluía 65 pb del promotor nos) entre ellos. Para eliminar el fragmento de 120 pb, la secuencia codificante de WT-NPTII y la secuencia del vector flanqueante se amplificó como un fragmento Nhe I-Sal I (2,1 kb) y se ligó al plásmido digerido con Nhe I y Sal I. La clonación dio como resultado el vector HSP81.1-AtMYB68-pBI500. Los vectores basados en pBI121 que contenían el gen WT-NPTII dirigido por el promotor BdTIF1 se designaron serie pBI500. La secuencia HSP81.1-AtMYB68 se reemplazó también con la secuencia del promotor 35S como un fragmento Hind III-BamH I aislado por digestión de restricción a partir de pBI300ΔGUS. Esto generó el vector pBI300ΔGUS.

Ejemplo 3: Constructos de Sobreexpresión de bHLH subgrupo b1

Constructo 35S-AtbHLH39:

La secuencia codificante de AtbHLH39 (At3g56980) se amplificó por RT-PCR a partir de Arabidopsis utilizando el cebador directo BHLH039FW-XbaI y el cebador inverso BHLH039RV-BamH I. El producto PCR (0,8 kb) se clonó en el sitio Xba I y BamH I en el vector binario pBI300ΔGUS y pBI800ΔGUS, generando el constructo 35S-AtbHLH39pBI300 y 35S-AtbHLH39-pBI800, respectivamente.

Constructo 35S-AtbHLH101:

La secuencia codificante de AtbHLH101 (At5g04150) se amplificó por RT-PCR a partir de Arabidopsis utilizando el cebador directo BHLH101FW-XbaI y el cebador inverso BHLH101RV-BamH I. El producto PCR (0,7 kb) se clonó en el sitio Xba I y BamH I en el vector binario pBI300ΔGUS y pBI800ΔGUS, generando el constructo 35S-AtbHLH101pBI300 y 35S-AtbHLH101-pBI800, respectivamente.

Constructo 35S-AtbHLH38:

Utilizando la misma estrategia que se ha descrito arriba, la secuencia codificante de AtbHLH38 (At3g56970) se amplifica por RT-PCR a partir de Arabidopsis utilizando un cebador directo que contiene un sitio XbaI y un cebador inverso que contiene un sitio Bam HI, y se somete a clonación en el sitio XBa I y BamH I en el vector binario pBI300ΔGUS, generando el constructo 35S-AtbHLH38-pBI300.

Constructo 35S-AtbHLH100:

Utilizando la misma estrategia que se ha descrito arriba, la secuencia codificante de AtbHLH100 (At2g41240) se amplifica por RT-PCR a partir de Arabidopsis utilizando un cebador directo que contiene un sitio XbaI y un cebador inverso que contiene un sitio Bam HI, y se somete a clonación en el sitio XBa I y BamH I en el vector binario pBI300ΔGUS, generando el constructo 35S-AtbHLH100-pBI300.

Constructos HSP81.1-AtbHLH39:

Se implicaron varios pasos en el desarrollo del constructo. Una primera secuencia promotora (-401 a -1 con respecto al codón de inicio ATG) del gen de la proteína del choque térmico de Arabidopsis HSP81.1 (At5g52640) se amplificó por PCR con cebadores que tenían extremos Sal I y Xba I del DNA genómico de Arabidopsis, y se clonó en los mismos sitios en pBI101, reemplazando con ello el promotor 35S. Este vector se designó pHSP81.1-GUS. La secuenciación reveló mutaciones puntuales de T a C en la posición -266 y C aT en -121 en el promotor. La tinción con GUS de las plantas jóvenes de Arabidopsis transformadas con este constructo demostró el mismo perfil de expresión de inducción térmica que se consigna en la bibliografía. Por tanto, estas mutaciones no afectan aparentemente a la funcionalidad del promotor. En segundo lugar, MCS2-oligo de New England Biolabs se reasoció y se ligó a pHSp81.1-GUS que se había digerido con Xba I y Sma I. Esto dio como resultado el vector pHSP81.1MCS-GUS. En tercer lugar, la secuencia GUS se delecionó por digestión con Sma I y EcolCRI, y autoreligación del vector. Esto condujo al vector pHSB81.1MCSΔGUS. En cuarto lugar, la secuencia codificante AtMYB68 (At5g65790) se clonó en los sitios XbaI y BamH I para sobreexpresión de MYB68. En quinto lugar, la secuencia mutante NPTII se remplazó con su secuencia WT como se ha descrito arriba, produciendo el vector HSP81.1-AtMYB68-pBI300. Finalmente, la secuencia codificante AtbHLH39 como fragmento Xba I-BamH I se clonó en el sitio Xba I y BamH I, reemplazando con ello la secuencia AtMYB68, dando como resultado el constructo HSP81.1-AtbHLH39-pBI300. Análogamente, el fragmento Xba I-BamH I de la secuencia codificante AtbHLH39

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reemplazó la secuencia AtMYB68 en HSP81.1-AtMYB68-pBI500, dando como resultado el vector HSP81.1AtbHLH39-pBI500.

Constructo UCC2-AtbHLH39:

El gen uclacianin2 de Arabidopsis (UCC2, At2g44790) se expresa a nivel muy alto en las raíces. Su expresión es detectable pero a niveles muy bajos en otras partes de la planta. Su perfil de expresión específico de la célula en la raíz es similar al de AtbHLH39, es decir se expresa predominantemente en la endodermis y el córtex y el estilo. La secuencia promotora del gen UCC2 (-1 a -1475 con respecto al codón deinicio ATG) se amplificó por PCR utilizando un cebador directo que contenía un sitio Sal I (P790-Sal-F) y un cebador inverso que contenía un sitio Xba I (P790Xb-R). El producto PCR del promotor UCC2 se clonó en los sitios Sal I y Xba I en el vector HSP81.1-AtMYB68pBI300 (véase arriba), reemplazando el promotor HSP81.1. La secuencia codificante de AtbHLH39 se clonó luego en este vector como un fragmento Xba I-BamH I, reemplazando la secuencia codificante AtMYB68. El vector resultante se designa UCC2-AtbHLH39-pBI300.

Constructo BdBS-AtbHLH39-pBI500:

El promotor del gen biotina-sintasa (BdBS) de Brachypodium (-1 a -553 con respecto al codón inicial ATG) se amplificó por PCR como un fragmento Sal I-Xba I y se clonó para sustituir el promotor HSP81.1 en HSP81.1AtbHLH39-pBI500. El vector resultante se designó BdBS-AtbHLH39-pBI500.

Constructo BdUCC-AtbHLH39-pBI500:/

El homólogo más próximo a Brachypodium del gen uclacianin2 de Arabidopsis se encontraba en la secuencia genómica super_67. La secuencia era idéntica en un 34% a uclacianin2 de Arabidopsis a lo largo de las regiones alineadas. Se determinó el marco de lectura abierto. Una búsqueda Blast inversa de la secuencia de proteína traducida para las proteínas TAIR8 de Arabidopsis encontró que la misma era la más similar a uclacianin 1 de Arabidopsis, un homólogo próximo de uclacianin2. En Arabidopsis, uclacianin1 comparte un patrón de expresión similar a uclacianin2, pero con una expresión total más débil. La secuencia promotora del homólogo de uclacianina de Brachypodium (BdUCC) (-22 a -1405 con relación al codón de inicio ATG) se amplificó como un fragmento Sal I-Xba I y se clonó para sustituir el promotor HSP81.1 en HSP81.1-AtbHLH39-pBI500. El vector resultante se designó BdUCC-AtbHLH39-pBI500.

Ejemplo 4: Clonación del bHLH30 de Brachypodium

Existen tres genes bHLH de Brachypodium con homología alta para el bHLH subgrupo 1b de Arabidopsis que comprenden bHLH39, bHLH38, bHLH100 y bHLH101. Los tres homólogos de Brachypodium están relacionados muy estrechamente con AtbHLH38. Existe una evidencia EST fuerte para el homólogo #1 (super_13.506): la porción 5' es idéntica a la secuencia en EST DV488230, mientras que la porción 3' es idéntica a DV488393, que contiene poliAs. Sin embargo, DV488393 contiene también una secuencia que pertenece aparentemente a un intrón. Por tanto, el marco de lectura abierto exacto sigue sin estar determinado. La secuencia codificante supuesta (BdBHLH39H1) se somete a clonación por RT-PCR utilizando el cebador directo BdH1-Xb-F (que contiene un sitio Xba I) y el cebador inverso BdH1-Bm-R (que contiene un sitio BamH I), y se somete a clonación en los sitios correspondientes en un vector para producir los constructos HSP81.1-BdbHLH39Hl-pBI500, BdBS-BdbHLH39-BI500 y BdUCC-BdbHLH39Hl -pBI500.

Cebadores

Tabla 1: Cebadores de Clonación

SEQ ID

Nombre Secuencia (5' a 3') Producto PCR

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BHLH039FW-XbaI aaaTCTAGAATGTGTGCATTAGTACCTCCATTGTTTC AtbHLH39 CDS, 0.8 Kb

107

BHLH039RV-BamHI

108

BHLH101FW-XbaI aaatCTAGAATGGAGTATCCATGGCTGCAGTCTC AtbHLH101CDS, 0.7 Kb

SEQ ID

Nombre Secuencia (5' a 3') Producto PCR

109

BHLH101RV-BamHI aaaGGATCCTTATGATTGGCGTAATCCCAAGAGC

110

P790-Sal-F argtGTCGAC CTT AGC CAA TGG ATG AGG ATG promotor AtUCC2, 1,5 Kb

111

P790-Xb-R argtTCTAGA TTT TTG TTT ACT GTA GAA GAG

112

BdGOS-Pm-F10 acgtGTTTAAAC GCA TAG ACT CTC AGC GGA GAG promotor BdTIF1, 2,5 Kb

113

BdGOS-Nh-R acgtGCTAGC gaaaactcctggtgagagtgg

114

NPTII-Nh-F acgtGCTAGC atgattgaacaagatggattgcac WT-NPTII y secuencia flanqueante, 2,1 Kb

115

NPTII-Sal-R acgtGTCGAC CTG CAG GCA TGC AAG CTT GG

116

BdBSp-Sal-F acgtGTCGAC ctctggatgcctaaacaaacgac promotor BdBS, 0,5 Kb

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BdBSp-Xb-R acgtTCTAGA ggcttttgtcggtcggcctg

118

BdUCCp-Sa-F4 acgtGTCGAC GGA GGT GCA GTT TGC AGC AG promotor BdUCC, 1,4 Kb

119

BdUCCp-Xb-R4 acgtTCTAGA TAT AGA GAG AGG GTG ATC AAC GA

120

BdH1-Xb-F acgtTCTAGA ATG GGG CAC AAG CAG CTG TTC homólogo de BdbHLH39, super_13.506 (0.7 Kb)

121

BdH1-Bm-R acgtGGATCC TCA CTG ATG CAT ATG CAG TCC

Ejemplo 5: Transformaciones de Plantas

Los constructos arriba descritos han sido transformados o se transforman en Arabidopsis y Brachypodium según sea apropiado. Otras especies se transforman con un vector apropiado y se producen plantas transformadas.

Tabla 2: Transformación delos Constructos

CONSTRUCTO

ESPECIE DIANA Transformado

35S-AtbHLH39-pBI300

Dicotiledóneas i.e.Arabidopsis(At), Brassica(Bn) At, Bn

35S-AtbHLH39-pBI800

Dicotiledóneas i.e.Arabidopsis(At), Brassica(Bn)

35S-AtbHLH101-pBI300

Dicotiledóneas i.e.Arabidopsis(At), Brassica(Bn) At

35S-AtbHLH101-pBI800

Dicotiledóneas i.e.Arabidopsis(At), Brassica(Bn)

35S-AtbHLH38-pBI300

Dicotiledóneas i.e.Arabidopsis(At), Brassica(Bn)

35S-AtbHLH100-pBI300

Dicotiledóneas i.e.Arabidopsis(At), Brassica(Bn)

HSP81.1-AtbHLH39-pBI300

Dicotiledóneas i.e.Arabidopsis(At), Brassica(Bn) At, Bn

HSP81.1-AtbHLH39-pBI500

Monocotiledóneas, i.e. Brachypodium

UCC2-AtbHLH39-pBI300

Dicotiledóneas i.e.Arabidopsis(At), Brassica(Bn)

HSP81.1-AtbHLH39-pBI500

Monocotiledóneas, i.e. Brachypodium

BdBS-AtbHLH39-pBI500

Monocotiledóneas, i.e. Brachypodium

HSP81.1-AtbHLH39-pBI500

Monocotiledóneas, i.e. Brachypodium

BdUCC-AtbHLH39-pBI500

Monocotiledóneas, i.e. Brachypodium

HSP81.1-BdbHLH39H1-pBI500

Monocotiledóneas, i.e. Brachypodium

BdBS-BdbHLH39-BI500

Monocotiledóneas, i.e. Brachypodium

BdUCC-BdbHLH39H1-pBI500

Monocotiledóneas, i.e. Brachypodium

Ejemplo 6: Métodos de Transformación

Se produjeron plantas transgénicas de Arabidopsis por el método de inmersión de las plantas en floración en un

5 cultivo de Agrobacterium, basado en el método de Andrew Bent en, Clough SJ y Bent AF, 1998, “Floral dipping: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana”). Se cultivaron plantas de tipo salvaje en condiciones estándar con un ciclo diario de 16 horas, 8 horas de luz a oscuridad, hasta que la planta había desarrollado tanto flores en desarrollo como flores abiertas. La planta se invirtió durante 2 minutos en una solución de cultivo de Agrobacterium que llevaba el constructo del génico apropiado. Las plantas se dejaron luego

10 en posición horizontal en una bandeja y se mantuvieron cubiertas durante 2 días para mantener la humedad, después de lo cual se enderezaron y embolsaron para continuar el crecimiento y desarrollo de semillas. La semilla madura se cosechó a granel.

Se seleccionaron plantas T1 transformadas por germinación y crecimiento en placas MS que contenían 50 μg/ml de kanamicina o un medio de selección apropiado. Las plantas jóvenes verdes resistentes a kanamicina (KanR) se

15 identificaron después de 2 semanas de crecimiento y se trasplantaron a suelo. Las plantas se embolsaron para asegurar la autofertilización y la semilla T2 de cada planta se cosechó por separado. Durante el crecimiento de las plantas T1 se cosecharon muestras de hoja, se extrajo el DNA y se realizó transferencia Southern y análisis PCR.

Las semillas T2 se analizaron respecto a segregación de KanR. A partir de aquellos linajes que exhibían un fenotipo resistente 3:1, se cultivaron las plantas T2 supervivientes, se embolsaron durante la producción de semillas, y se 20 recogió semilla T3 de cada linaje. La semilla T3 se utilizó de nuevo para análisis de segregación de KanR, y aquellos

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linajes que exhibían 100% del fenotipo KanR se seleccionaron como linajes homocigóticos. El análisis molecular y fisiológico ulterior se realizó utilizando plantas T3 jóvenes.

Se producen plantas transgénicas de Brassica napus, Glycine max y Zea maize utilizando transformación mediada por Agrobacterium del tejido del peciolo del cotiledón. Las semillas se esterilizan como sigue. Se humedecen las semillas con etanol de 95% durante un periodo de tiempo corto tal como 15 segundos. Se añaden aproximadamente 30 ml de solución esterilizante I (70% Javex, 100 μl Tween 20) y se dejan durante aproximadamente 15 minutos. Se retira la solución I y se reemplaza con 30 ml de solución II (0,25% cloruro mercúrico, 100 μl Tween 20) y se incuba durante aproximadamente 10 minutos. Las semillas se lavan con al menos 500 ml de agua estéril bidestilada y se guardan en una cápsula estéril. Las semillas se germinan en placas de medio ½ MS, pH 5,8, suplementado con 1% de sacarosa y 0,7% de agar. Los cotiledones totalmente expandidos se cosechan y se ponen en Medio I (compuestos orgánicos Murashige mínimos (MMO), 3% sacarosa, 4,5 mg/l bencil-adenina (BA), 0,7% fitoagar, pH 5,8). Un cultivo de Agrobacterium que contiene el constructo de ácido nucleico de interés se cultiva durante 2 días en medio AB Mínimo. Los explantes de cotiledón se sumergen de tal modo que solamente la porción corta la del peciolo está en contacto con la solución de Agrobacterium. Los explantes se embeben luego en Medio I y se mantienen durante 5 días a 24ºC, con ciclos luz-oscuridad de 16-8 horas. Los explantes se transfieren a Medio II (Medio I, 300 mg/l de timentina) durante 7 días más y luego a Medio III (Medio II, 20 mg/l de kanamicina). Cualquier tejido de raíz o brote que se haya desarrollado en este tiempo se elimina por disección. Los explantes se transfieren a placas nuevas de Medio III después de 14-21 días. Cuando el tejido de brote regenerado se desarrolla, el tejido regenerado se transfiere a Medio IV (MMO, 3% sacarosa, 1,0% fitoagar, 300 mg/l timentina, 20 mg/l kanamicina). Una vez que el tejido de brotes sano se desarrolla, el tejido de brote diseccionado de cualquier tejido de callo se sumerge en 10 X IBA y se transfiere a Medio V (Murashige y Skooge (MS), 3% sacarosa, 0,2 mg/l de ácido indolbutírico (IBA), 0,7% agar, 300 mg/l timentina, 20 mg/l kanamicina) para enraizado. Las plántulas sanas se transfieren a suelo. El método anterior, con o sin modificantes, es adecuado para la transformación de numerosas especies de plantas que incluyen Glycine Max, Zea maize y algodón.

Se producen Glycine Max, Zea maize y algodón transgénicos utilizando métodos basados en Agrobacterium que son conocidos por un experto en la técnica. Alternativamente, puede utilizarse un método de transformación por bombardeo biolístico con o sin partículas. Un ejemplo de una transformación biolística sin partículas se da en la Solicitud de Patente U.S. 20010026941. Estemétodo ha sido utilizado para producir plantas transgénicas de Glycine Max y Zea maize. Las plantas viables se propagan y se generan linajes homocigóticos. Las plantas se testan en cuanto a la presencia detolerancia a la sequía, y fenotiposfisiológicos y bioquímicos como se describe en otrolugar.

La transformación de tejido de planta tal como Zea maize, por ejemplo, se consigue por sonicación de cultivo de tejido de callo. El tejido de callo se produjo como sigue. Se cosecharon espigas de maíz 18 días después del desarrollo del estigma y se esterilizó la superficie en 50% v/v de lejía durante 20 minutos, seguido por 3 lavados con agua destilada estéril. Los embriones inmaduros que abarcaban en tamaño desde 2 a 4 mm se cosecharon a partir de los granos. Los embriones se pusieron en medio MSD1,5 (2% sacarosa, 1X MS de sales macronutrientes y micronutrientes, 1X MS vitaminas, 1,5 mg/L de 2,4-D, 0,8% agar, pH 5,8) con el lado del escudete hacia arriba. Los embriones se incubaron a 26-28ºC en la oscuridad. Los callos friables de cultivos de dos semanas se transfirieron a medio MSD1,5 nuevo y se incubaron ulteriormente a 26-28ºC en la oscuridad. El callo friable se subcultivó en medio MSD1,5 nuevo cada 21 días.

La transformación de tejido de callo se realizó como se describe a continuación. El constructo se introdujo en Agrobacterium GV3101 por inoculación de una sola colonia de Agrobacterium GV3101 que contenía el plásmido HPR-GUS en 10 ml de LB modificado con 150 μg/ml de rifampicina, 100 μg/ml de sulfato de gentamicina, y 50 μg/ml de kanamicina. El cultivo se dejó crecer durante una noche a 28ºC con agitación mediante sacudidas a 200 rpm. El callo demaízsecortó en trozos de tamaño aproximado 3-5mm. El cultivo de Agrobacterium secentrifugó a 1500 xg durante 10 minutos y se lavó dos veces con 10 ml de MSD1,5líquido (2% sacarosa, 1X MS de sales macronutrientes ymicronutrientes, 1X MS vitaminas, 1,5mg/L 2,4-D, pH 5,8). La bacteria seresuspendió en MSD1,5 líquido hasta una DO600nm de 0,25 y 1,0 L Agrobacterium diluido o MSD1,5 líquido, para controles negativos, se puso en tubos de microcentrifugación de 1,5 mL que contenían 4 trozos de callo añadidos a cada tubo. El cultivo de callo y Agrobacterium se trató por ultrasonidos en un Ultrasonic Branson Cleaner 200 durante 0, 3, 10, 30, 100, ó 300 segundos con bacterias ó 0 ó 300 segundos sin bacterias (en MSD1,5 líquido solo). Después dela sonicación, el callo se transfirió a papel de filtro estéril y se puso en medio MSD1,5 A (medio MSD1,5 sólido modificado con 100 μM de acetosiringona). El periodo de co-cultivo fue 4 días en la oscuridad a 28ºC. El callo se lavó en MSD1,5 líquido se transfirió a papel de filtro estéril, y se puso en medio MSD1,5 T (medio MSD1,5 sólido modificado con 400 μg/ml de dimentina) durante 3 días en la oscuridad a 28ºC. Siete días después de la sonicación, se añadió el callo a 1 ml de solución de tinción con GUS (NaPO4 50 mM, pH 7,0, 0,1% Triton X-100, EDTA 1 mM, DTT 2 mM, 0,5 mg/ml de X-GlcA) y se dejó incubar durante una noche a 37ºC. La solución de tinción se reemplazó con 1 ml de tampón de fijación (formaldehído 10%, etanol 50%) y se incubó durante 30 minutos a la temperatura ambiente. El tampón de fijación se reemplazó con etanol 80% y se incubó durante 1 hora a la temperatura ambiente. El etanol 80% se reemplazó con etanol 100% y se incubó durante 1 hora a la temperatura ambiente. El callo se evaluó respecto a tinción azul, que indicaba la actividad de GUS.

Otros métodos de transformación de plantas se utilizan en caso apropiado y están descritos comúnmente y conocidos en latécnica.

18 5

Ejemplo 7: Análisis de la Expresión

Se aisló RNA total de 22 linajes transgénicos 35S-AtbHLH39 y linajes de Arabidopsis tipo salvaje. Aproximadamente 100 µg de RNA total se cargaron en cada pista. La transferencia Northern se sondó con HPR cDNA radiomarcado en solución de hibridación ExpressHyb (Clontech) y se expuso utilizando una pantalla de obtención de imágenes por luminiscencia. Para cuantificación, las transferencias se sondaron de nuevo con tubulina, un gen expresado constitutivamente, como estándar comparativo.

El nivel de expresión de AtbHLH39 era 4 veces a 126 veces mayor que el del control Columbia WT. Los linajes de comportamiento óptimo (linaje -34 a linaje -97) basados en tolerancia al calor y la sequía tenían un aumento de 50 y 40 veces en la expresión de AtbHLH39 respectivamente.

Ejemplo 8: Análisis de Microrredes y Expresión

El bHLH subgrupo 1b incluye AtbHLH38, AtbHLH39, AtbHLH100 y AtbHLH101. Los datos de microrredes de los linajes transformados con un constructo de sobreexpresión para aumentar la expresión o actividad de MYB68 (35S-AtMYB68) demostraron que la expresión de RNA de AtbHLH39 y AtbHLH101 aumentaba 32 veces y 15 veces, respectivamente, cuando AtMYB68 se sobreexpresaba 37 veces. Los genes AtbHLH38 y AtbHLH100 no estaban presentes en el chip de microrredes, por lo que la expresión de estos genes estrechamente afines está todavía por determinar. Los cuatro miembros AtbHLH38, AtbHLH39, AtbHLH100 y AtbHLH101 tienen alta homología de secuencia en el grupo 1b, y pueden ser funcionalmente redundante al menos en parte.

La expresión de AtbHLH39 está co-localizada principalmente con AtMYB68 en el periciclo de la raíz, como lo está la de MYB68 (Birnbaum et al. 2003; Schmid et al. 2005). El análisis del promotor endógeno MYB68 y el promotor AtbHLH39 demuestra que estos promotores se expresan predominantemente en el tejido de raíz.

El análisis ulterior de microrredes, la expresión génica de IRT1 no se ve afectada significativamente en las plantas transgénicas que sobreexpresan AtbHLH39 (constructo 35S-AtbHLH39), lo que sugiere que el fenotipo de alta tolerancia conferido por sobreexpresión de AtbHLH39 no regula la expresión del gen IRT1, y que la implicación consignada de bHLH39 en las respuestas a la privación de hierro ocurre por un mecanismo separado.

Se analizaron las características de transcripción de la familia de genes del factor de transcripción bHLH subgrupo 1b AtbHLH39, AtbHLH38, AtbHLH100, y AtbHLH101. El AtbHLH39 se expresa predominantemente en la raíz, mientras que AtbHLH38, AtbHLH100, y AtbHLH101 tienen expresión baja en tejidos de hoja, yema, flor y raíz. La transcripción de AtbHLH38 es apenas detectable en raíz y hoja, AtbHLH100 se expresa a nivel muy bajo en la yema y la flor, y AtbHLH101 se expresa también a nivel muy bajo en raíz y hoja.

Ejemplo 9: MYB68 sefija al promotor bHLH39

Se realizaron ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) para determinar si la proteína MYB68 podría fijarse a la secuencia promotora de AtbHLH39. Semarcarony se testaron cuatro segmentos diferentes del promotor: P1 (-1 a -224, con respecto al codón de inicio ATG), P2 (-204 a -419), P3 (-401 a -623) y P4 (-601 a -788). El DNA de sonda marcado se incubó con la proteína de fusión MYB68 purificada. Se detectó un complejo DNA-proteína con la sonda P1, mientras que otras regiones del promotor no acusaban fijación alguna con MYB68. La formación del complejo P1/MYB68 se eliminó por la adición de DNA frío competidor con la misma secuencia que la sonda, pero que no estaba afectado por competidores fríos de P3. Además, no se formaba complejo DNA-proteína alguno cuando la sonda P1 se incubó con una proteína MYB68 truncada (MYB68CD) en la cual se habían delecionado los dominios R2R3 de fijación de DNA. Los datos demostraron que la proteína MYB68 se fija específicamente al promotor AtbHLH39 en la región -1 a -224.

Para localizar ulteriormente el sitio de fijación de MYB68, cuatro oligonucleótidos bicatenarios que abarcaban la región promotora -1 a -232 se testaron como competidores en ensayos de fijación: P11 (-1 a -61), P12 (-52 a -118), P13 (-109 a -178), y P14 (-169 a -232). La fijación de MYB68 a la sonda P1 era anulada por el competidor P12, pero no era afectada por otros fragmentos, lo que indicaba que el sitio de fijación de MYB68 está dentro de la secuencia 52 a -118.

Ejemplo 10: La expresión constitutiva de Atb-HLH39 en Arabidopsis da como resultado un aborto floral reducido después de estrés térmico

Se dispuso un experimento con 14 linajes transgénicos 35S-AtbHLH39 y con un control de tipo salvaje (WT). Se cultivaron plantas en tiestos de 2,25 pulgadas (5,6 cm) en condiciones óptimas (22ºC, 18 horas de luz de 200 μE, 60% RH) en una cámara de crecimiento hasta 3 días después de la aparición de la primera flor. Se aplicó un tratamiento de estrés térmico sometiendo las plantas a 42ºC durante 2 horas. Una semana después del periodo de estrés, se evaluaron las plantas respecto a número de flores abortadas. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Diez de los linajes transgénicos tenían aborto floral reducido con relación a los controles WT. Uno de los linajes (341) tenía en términos estadísticos significativamentemenos flores abortadas que el WT.

Tabla 3: Aborto floral reducido después de 2 horas a 42ºC (n = 6 a 11) ± SE

Entrada

# de flores abortadas Aborto floral como % del WT

97-7

2,5±0,5 44%

34-1

2,9±0,3 51%

46-10

3,2±0,3 56%

57-2

3,6±0,4 64%

1-7

3,8±0,2 67%

41-2

4,1±0,3 72%

38-10

4,5±0,7 79%

96-4

4,5±0,5 79%

12-4

4,7±0,5 82%

30-2

4,8±0,5 85%

94-10

5,1±0,9 90%

10-1

5,7±0,5 100%

52-4

6,2±0,7 108%

103-1

6,2±0,6 109%

WT

5,7±0,6 100%

Ejemplo 11: La expresión constitutiva de AtbHLH39 en Arabidopsis da como resultado tolerancia de las plantas a la sequía

5 Se evaluó la tolerancia a la sequía en 6 linajes transgénicos At-bHLH39 que exhibían también aborto floral reducido después del estrés térmico. Las plantas se cultivaron (tiestos de 5 x 3 pulgadas (12,5 cm x 7,5 cm) en condiciones óptimas en una cámara de crecimiento (22ºC, 18 horas de luz de 200 µE, 60% RH) hasta que se abrió la primera flor. El tratamiento de sequía se aplicó por riego de todas las plantas hasta el mismo nivel de saturación. Se retuvo ulteriormente el agua. Las plantas se pesaron diariamente para determinar la pérdida diaria de agua y todas las

10 plantas se cosecharon el día 4 del tratamiento, en cuyo momento todas las plantas estaban marchitándose visiblemente. Se calculó la pérdida de agua con relación a labiomasa final del brote, y es unindicador representativo de la tolerancia a la sequía. Los datos se normalizaron para WT, que se estableció como 100% (Tabla 4). La totalidad de los 6 linajes exhibían una pérdida de agua reducida con relación a la biomasa de brotes, 3 de las cuales eran estadísticamente significativas. Esto es indicativo del fenotipo de tolerancia a la sequía. Dos de los linajes

15 tolerantes a la sequía que se comportaban óptimamente eran también los linajes óptimos de comportamiento tolerante al calor, lo que indicaba una relación estrecha entre los dos rasgos: tolerancia a la sequía y tolerancia al calor, como resultado dela expresión constitutiva de AtbHLH39 en Arabidopsis.

Tabla 4: Pérdida de agua con relación al peso seco del brote y tolerancia a la sequía en los linajes transgénicos 35SpHLH39

Entrada

Pérdida de agua en 3d/brote DW d4 Tolerancia a la sequía (% del WT) Brote DW d4 (g)

34-1

125±3 128% 0,56±0,01

97-7

140±5 119% 0,51±0,02

94-10

150±5 113% 0,46±0,02

-65-1

153±6 112% 0,47±0,02

30-2

162±4 106% 0,43±0,01

1-7

166±3 104% 0,43±0,01

WT

173±5 100% 0,40±0,01

Ejemplo 12: La expresión constitutiva de At-bHLH101 en Arabidopsis da como resultado aborto floral reducido después de estrés térmico

Se dispuso un experimento con 17 linajes transgénicos de 35S-AtbHLH101 y un control WT. Las plantas se

5 cultivaron en tiestos de 2,25 pulgadas (5,6 cm) en condiciones óptimas (22ºC, 18 horas de luz de 200 µE, 60% RH) en una cámara de crecimiento hasta 3 días después de la aparición de la primera flor. Se aplicó un tratamiento de estrés térmico sometiendo las plantas a 42ºC durante 1,75 horas. Una semana después del periodo de estrés, las plantas se evaluaron respecto a número de flores abortadas. Los resultados semuestran en la Tabla 5 y demuestran que 10 de los linajes transgénicos tenían al menos un aborto floral reducido en un 10% con relación a los controles

10 WT,ydoslinajesteníanabortofloralreducidomásde50%conrelaciónaloscontrolesWT.

Tabla 5: Aborto floral después del estrés térmico(n = 12)

Entrada

% de flores abortadas Aborto floral (% del WT)

61-1

1,3±0,3 41%

88-3

1,3±0,4 43%

18-1

2,0±0,5 65%

90-1

2,3±0,5 73%

15-2

2,5±0,5 81%

49-5

2,5±0,5 81%

19-4

2,7±0,4 86%

70-8

2,7±0,3 86%

75-2

2,7±0,5 86%

16-2

2,8±0,4 89%

39-11

2,8±0,4 92%

11-1

2,9±0,4 95%

81-3

3,0±0,4 97%

79-6

3,1±0,4 100%

97-2

3,1±0,4 100%

45-2

3,2±0,5 103%

9-1

3,2±0,4 103%

WT

3,1±0,3 100%

Ejemplo 13: La expresión constitutiva de AtbHLH101 en Arabidopsis da como resultado tolerancia de las plantas a la sequía

Se evaluó la tolerancia a la sequía en 10 linajes transgénicos AtbHLH101 que exhibían también aborto floral reducido después de estrés térmico. Las plantas se cultivaron en tiestos de 5 x 3 pulgadas (12,5 x 7,5 cm) en 5 condiciones óptimas en una cámara de crecimiento (22ºC, 18 horas de luz de 200 μE, 60% RH) hasta que se abrió la primera flor. Se aplicó luego tratamiento de sequía por riego de todas las plantas hasta el mismo nivel de saturación. Ulteriormente se retuvo el agua. Las plantas se pesaron diariamente para determinar la pérdida diaria de agua, y todas las plantas se cosecharon el día 4 de tratamiento, en cuyo momento todas las plantas estaban marchitándose visiblemente. Se calculó la pérdida de agua con relación a la biomasa final del brote, y es un

10 indicador representativo de la tolerancia a la sequía. Los datos se normalizaron para WT, que se estableció como 100% (Tabla 6). Ocho de los 10 linajes examinados acusaban cierto grado de tolerancia a la sequía, y un linaje tenía una tolerancia a la sequía estadísticamente significativa, que era 27% mayor con relación al WT. Este linaje era también uno de los 4 linajes que se comportaban mejor con respecto a tolerancia al calor como se apreciaba por aborto floral reducido.

15 Tabla 6: Pérdida de agua con relación al peso seco del brote y tolerancia a la sequía en los linajes transgénicos 5SbHLH101

Entrada

Pérdida de agua en 3d/brote DW d4 Tolerancia a la sequía (% del WT) Brote DW d4 (g)

90-1

147±5 127% 0,48±0,02

16-2

174±6 114% 0,41±0,02

61-1

176±5 113% 0,40±0,01

70-8

177±7 112% 0,41±0,02

6-5

181±3 110% 0,39±0,01

11-1

187±7 107% 0,38±0,02

45-2

189±8 106% 0,37±0,02

19-4

191±5 105% 0,37±0,01

79-6

203±7 100% 0,35±0,01

82-4

203±3 99% 0,34±0,01

WT

202±6 100% 0,34±0,01

Ejemplo 14: La expresión constitutiva de AtbHLH39 en Arabidopsis da como resultado rendimiento aumentado de semillas con relación a un control detipo salvaje después deestrés térmico

20 Se cultivan plantas (tiestos de 3 x 3 pulgadas (7,5 x 7,5 cm)) en condiciones óptimas en una cámara de crecimiento (22ºC, 18 horas de luz de 200 μE, 60% humedad relativa) hasta floración. Todas las plantas en floración se dividen en dos grupos, de los cuales el primer grupo se expone a estrés térmico (todas las plantas producían flores al cabo de un par de días) y el segundo grupo se mantiene en condiciones óptimas hasta la maduración. El tratamiento de estrés térmico consiste en una exposición diaria a 45ºC. Las temperaturas se elevan desde 22 a 45ºC durante un

25 periodo de 1 hora y se mantienen a 45ºC durante un periodo de tiempo de 2 a 3 horas. Se aplican tratamientos diarios de estrés térmico durante un periodo de 10 días. Después de los tratamientos de estrés térmico, las plantas se llevan de nuevo a condiciones óptimas y se cultivan hasta maduración. Todas las plantas se cosechan una vez maduras y se determina el rendimiento final de semillas por tiesto. Por comparación del rendimiento (como % del óptimo) de las plantas transgénicas con el deWT, se calculael grado de protección del rendimiento.

Tabla 7: CUADRO DE REFERENCIA DE LA IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS

ESPECIE

SEQ ID NO: bHLH Referencia Tipo de secuencia Longitud

ARABIDOPSIS THALIANA

1 bHLH39 AT3G56980 nucleótido 777

AVENA SATIVA

2 bHLH39 CN817002 nucleótido 222

BRACHYPODIUM DISTACHYON

3 bHLH39 super_13.506_gen nucleótido 2091

BRACHYPODIUM DISTACHYON

4 bHLH39 super_13.506_cds nucleótido 729

BRASSICA NAPUS

5 bHLH39 EE515575 nucleótido 587

BRASSICA NAPUS

6 bHLH39 TC84782 nucleótido 595

BRASSICA NAPUS

7 bHLH39 TC88840 nucleótido 631

BRASSICA RAPA

8 bHLH39 Contig2 nucleótido 693

GLYCINE MAX

9 bHLH39 TC269627 nucleótido 723

HORDEUM VULGARE

10 bHLH39 AK251746 nucleótido 738

PANICUM VIRGATUM

11 bHLH39 Contig2 nucleótido 723

SOLANUM LYCOPERSICUM

12 bHLH39 DV105842 nucleótido 351

TRITICUM AESTIVUM

13 bHLH39 TC358765 nucleótido 714

TRITICUM AESTIVUM

14 bHLH39 TC343683 nucleótido 617

TRITICUM AESTIVUM

15 bHLH39 TC300244 nucleótido 434

TRITICUM AESTIVUM

16 bHLH39 CA618726 nucleótido 261

ZEA MAYS

17 bHLH39 TC429418 nucleótido 228

ARABIDOPSIS THALIANA

18 bHLH39 AT3G56980 proteína 258

AVENA SATIVA

19 bHLH39 CN817002 proteína 158

BRACHYPODIUM DISTACHYON

20 bHLH39 super_13.506_ORF proteína 242

GLYCINE MAX

21 bHLH39 TC269627 proteína 241

HORDEUM VULGARE

22 bHLH39 AK251746 proteína 246

PANICUM VIRGATUM

23 bHLH39 Contig2 proteína 241

SOLANUM LYCOPERSICUM

24 bHLH39 DV105842 proteína 117

TRITICUM AESTIVUM

25 bHLH39 TC358765 proteína 238

TRITICUM AESTIVUM

26 bHLH39 TC343683 proteína 206

TRITICUM AESTIVUM

27 bHLH39 TC300244 proteína 144

TRITICUM AESTIVUM

28 bHLH39 CA618726 proteína 87

ESPECIE

SEQ ID NO: bHLH Referencia Tipo de secuencia Longitud

ARABIDOPSIS THALIANA

29 bHLH38 AT3G56970 nucleótido 762

BRASSICA NAPUS

30 bHLH38 TC95626 nucleótido 753

BRASSICA OLERACEA

31 bHLH38 AM061155 nucleótido 765

BRASSICA RAPA

32 bHLH38 EX134222 nucleótido 435

CICER ARIETINUM

33 bHLH38 FE670123 nucleótido 300

HORDEUM VULGARE

34 bHLH38 TC164142 nucleótido 501

HORDEUM VULGARE

35 bHLH38 BAF30424.1 nucleótido 759

MEDICAGO TRUNCATULA

36 bHLH38 TC127269 nucleótido 767

MEDICAGO TRUNCATULA

37 bHLH38 TC115041 nucleótido 780

MEDICAGO TRUNCATULA

38 bHLH38 AJ496888 nucleótido 300

PANICUM VIRGATUM

39 bHLH38 Contig1 nucleótido 690

POPULUS

40 bHLH38 TC89850 nucleótido 549

POPULUS

41 bHLH38 EEF05011.1 nucleótido 795

POPULUS

42 bHLH38 EEE91492.1 nucleótido 474

RICINUS COMMUNIS

43 bHLH38 EEF30834 nucleótido 774

RICINUS COMMUNIS

44 bHLH38 EEF30835 nucleótido 555

SOLANUM LYCOPERSICUM

45 bHLH38 TC194645 nucleótido 717

SORGHUM BICOLOR

46 bHLH38 TC117663 nucleótido 642

TRITICUM AESTIVUM

47 bHLH38 TC337566 nucleótido 672

TRITICUM AESTIVUM

48 bHLH38 CA650144 nucleótido 390

TRITICUM AESTIVUM

49 bHLH38 CA502657 nucleótido 459

VIGNA UNGUICULATA

50 bHLH38 FF388259 nucleótido 732

VITIS VINIFERA

51 bHLH38 CAO17950.1 nucleótido 1563

VITIS VINIFERA

52 bHLH38 CAN79614 nucleótido 735

ARABIDOPSIS THALIANA

53 bHLH38 AT3G56970 proteína 253

BRASSICA NAPUS

54 bHLH38 TC95626 proteína 251

BRASSICA OLERACEA

55 bHLH38 AM061155 proteína 255

BRASSICA RAPA

56 bHLH38 EX134222 proteína 145

CICER ARIETINUM

57 bHLH38 FE670123 proteína 100

ESPECIE

SEQ ID NO: bHLH Referencia Tipo de secuencia Longitud

HORDEUM VULGARE

58 bHLH38 TC164142 proteína 167

HORDEUM VULGARE

59 bHLH38 BAF30424.1 proteína 252

MEDICAGO TRUNCATULA

60 bHLH38 TC127269 proteína 246

MEDICAGO TRUNCATULA

61 bHLH38 TC115041 proteína 260

MEDICAGO TRUNCATULA

62 bHLH38 AJ496888 proteína 100

ORYZA SATIVA

63 bHLH38 NP_001045424.1 proteína 247

PANICUM VIRGATUM

64 bHLH38 Contig1 proteína 230

POPULUS

65 bHLH38 TC89850 proteína 183

POPULUS

66 bHLH38 EEF05011.1 proteína 264

POPULUS

67 bHLH38 EEE91492.1 proteína 158

RICINUS COMMUNIS

68 bHLH38 EEF30834.1 proteína 257

RICINUS COMMUNIS

69 bHLH38 EEF30835.1 proteína 184

SOLANUM LYCOPERSICUM

70 bHLH38 TC194645 proteína 239

SORGHUM BICOLOR

71 bHLH38 TC117663 proteína 214

TRITICUM AESTIVUM

72 bHLH38 TC337566 proteína 224

TRITICUM AESTIVUM

73 bHLH38 CA650144 proteína 130

TRITICUM AESTIVUM

74 bHLH38 CA502657 proteína 153

VIGNA UNGUICULATA

75 bHLH38 FF388259 proteína 244

VITIS VINIFERA

76 bHLH38 CAN64266.1 proteína 245

VITIS VINIFERA

77 bHLH38 CAO17950.1 proteína 520

VITIS VINIFERA

78 bHLH38 CAN79614.1 proteína 244

ARABIDOPSIS THALIANA

79 bHLH101 AT5G04150 nucleótido 723

BRASSICA OLERACEA

80 bHLH101 AM060621 nucleótido 546

BRASSICA RAPA

81 bHLH101 Contig1 nucleótido 678

ORYZA SATIVA

82 bHLH101 CI296230 nucleótido 261

ORYZA SATIVA

83 bHLH101 TC345105 nucleótido 450

ARABIDOPSIS THALIANA

84 bHLH101 AT5G04150 proteína 240

BRASSICA OLERACEA

85 bHLH101 AM060621 proteína 182

BRASSICA RAPA

86 bHLH101 Contig1 proteína 226

ESPECIE

SEQ ID NO: bHLH Referencia Tipo de secuencia Longitud

ORYZA SATIVA

87 bHLH101 CI296230 proteína 87

ORYZA SATIVA

88 bHLH101 TC345105 proteína 150

ARABIDOPSIS THALIANA

89 bHLH100_2 AT2G41240.2 nucleótido 726

ARABIDOPSIS THALIANA

90 bHLH100_1 AT2G41240.1 nucleótido 729

ORYZA SATIVA

91 bHLH100_1 TC340917 nucleótido 621

PANICUM VIRGATUM

92 bHLH100_1 FL920216 nucleótido 711

SORGHUM BICOLOR

93 bHLH100_1 TC113263 nucleótido 732

TRITICUM AESTIVUM

94 bHLH100_2 TC317240 nucleótido 417

TRITICUM AESTIVUM

95 bHLH100_1 TC303529 nucleótido 705

TRITICUM AESTIVUM

96 bHLH100_1 CD865039 nucleótido 691

ZEA MAYS

97 bHLH100_1 TC409749 nucleótido 465

ARABIDOPSIS THALIANA

98 bHLH100_2 AT2G41240.2 proteína 241

ARABIDOPSIS THALIANA

99 bHLH100_1 AT2G41240.1 proteína 242

ORYZA SATIVA

100 bHLH100_1 TC340917 proteína 207

PANICUM VIRGATUM

101 bHLH100_1 FL920216 proteína 237

SORGHUM BICOLOR

102 bHLH100_1 TC 113263 proteína 244

TRITICUM AESTIVUM

103 bHLH100_2 TC317240 proteína 139

TRITICUM AESTIVUM

104 bHLH100_1 TC303529 proteína 235

ZEA MAYS

105 bHLH100_1 TC409749 proteína 155

Secuencias

-

Bibliografía

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Listado de secuencias

<110> Performance Plants, Inc.

Wan, Jiangxin 5 Huang, Yafan

<120> EXPRESIÓN DE REGULADORES DE LA TRANSCRIPCIÓNQUE PROPORCIONAN TOLERANCIA AL CALOR

10 <130>22542-018001WO

<150> US 61/221813

<151> 2009-06-30 15 <160> 125

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 20 <211> 777

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1 25

30 <210> 2

<211> 222

<212> DNA

<213> Avena sativa 45

<400> 2

<210> 3

<211> 2091

<212> DNA

<213> Brachypodium distachyon 10

<400> 3

<210> 4

<211> 729

<212> DNA

<213> Brachypodium distachyon

<400> 4

<210> 5

<211> 587

<212> DNA

<213> Brassica napus

<400> 5

<210> 6

<211> 595

<212> DNA

<213> Brassica napus 15

<400> 6

<210> 7

<211> 631

<212> DNA

<213> Brassica napus

<400> 7

<210> 8

<211> 693

<212> DNA

<213> Brassicarapa

<400> 8

<210> 9

<211> 723

<212> DNA

<213> Glycinemax 15

<400> 9

<210> 10

<211> 738

<212> DNA

<213> Hordeum vulgare

<400> 10

<210> 11

<211> 723

<212> DNA

<213> Panicum virgatum

<400> 11

<210> 12

<211> 351

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 12

<210> 13

<211> 714

<212> DNA 15 <213> Triticum aestivum

<400> 13

<210> 14

<211> 617 5 <212> DNA

<213> Triticum aestivum

<220>

<221>

característicamiscelánea 10 <222> (469)..(469)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221>

característicamiscelánea 15 <222> (504)..(505)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 14

<210> 15

<211> 434

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 15

<210> 16 15 <211> 261

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 16 20

<210> 17

<211> 228

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 17

<210> 18

<211> 258

<212> PRT 15 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 18

5 <210> 19

<211> 158

<212> PRT

<213> Avena sativa

10 <400> 19

<210> 20 5 <211> 242

<212> PRT

<213> Brachypodium distachyon

<400> 20 10

5 <210> 21

<211> 241

<212> PRT

<213> Glycinemax

10 <400> 21

<210> 22

<211> 246

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare 10

<400> 22

<210> 23

<211> 241

<212> PRT

<213> Panicum virgatum

<400> 23

<210> 24

<211> 117

<212> PRT 10 <213> Solanum lycopersicum

<400> 24 <212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 25 10 <210> 26

<211> 206 5 <212> PRT

<213> Triticum aestivum

<220>

<221>

característicamiscelánea 10 <222> (157)..(157)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221>

característicamiscelánea 15 <222> (168)..(169)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 26

<210> 27

<211> 144

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 27

<210> 28

<211> 87

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 28

<210> 29 15 <211> 762

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 29

<210> 30

<211> 753

<212> DNA 10 <213> Brassica napus

<400> 30 <210> 31

<211> 765 5 <212> DNA

<213> Brassica oleracea

<220>

<221> característicamiscelánea 10 <222> (758)..(760)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 31

<210> 32

<211> 435

<212> DNA

<213> Brassicarapa

<400> 32

<210> 33

<211> 300

<212> DNA

<213> Cicer arietinum

<400> 33

<210> 34

<211> 501

<212> DNA

<213> Hordeum vulgare 15

<400> 34

<210> 35

<211> 759

<212> DNA 25 <213> Hordeum vulgare

<400> 35 5 <210> 36

<211> 767

<212> DNA

<213> Medicago truncatula

10 <400> 36

<210> 37

<211> 780

<212> DNA

<213> Medicago truncatula

<400> 37

<210> 38

<211> 300

<212> DNA

<213> Medicago truncatula

<400> 38

<210> 39 15 <211> 690

<212> DNA

<213> Panicum virgatum

<400> 39 20

<210> 40

<211> 549

<212> DNA

<213> Populus

<400> 40 <210> 41

<211> 795

<212> DNA

<213> Populus

<400> 41 <210> 42

<211> 474

<212> DNA

<213> Populus

<400> 42

<210> 43

<211> 774

<212> DNA 15 <213> Ricinus communis

<400> 43

<210> 44

<211> 555

<212> DNA

<213> Ricinus communis

<400> 44

<210> 45

<211> 717

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 45

<210> 46 15 <211> 642

<212> DNA

<213> Sorghum bicolor

<400> 46

<210> 47

<211> 672 10 <212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 47

<210> 48

<211> 390

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (195)..(195)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (201)..(201)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (215)..(215)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (240)..(240)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (244)..(244)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (301)..(301)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

5 <221>característicamiscelánea

<222> (340)..(340)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

10 <221>característicamiscelánea

<222> (342)..(342)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

15 <221>característicamiscelánea

<222> (379)..(380)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 48 20

<210> 49

<211>

459 25 <212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 49

<210> 50

<211> 732

<212> DNA

<213> Vigna unguiculata

<400> 50

<210> 51

<211> 1563

<212> DNA

<213> Vitis vinífera

<400> 51

<210> 52

<211>

735 5 <212> DNA

<213> Vitis vinífera

<220>

<221> característicamiscelánea 10 <222> (293)..(293)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 52

<210> 53

<211> 253

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 53

<210> 54

<211> 251

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 54

5

<210> 55 <211> 255 <212> PRT <213> Brassica oleracea

10

<220> <221> característica miscelánea

88

<222> (253)..(254)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 55

10 <210> 56

<211> 145

<212> PRT

<213> Brassicarapa

<400> 56

10 <210> 57

<211> 100

<212> PRT

<213> Cicer arietinum

15 <400> 57 5 <210> 58

<211> 167

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

10 <400> 58

<210> 59

<211> 252

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 59

5

<210> 60 <211> 246 <212> PRT <213> Medicago truncatula

10

<400> 60

93

5

<210> 61 <211> 260 <212> PRT <213> Medicago truncatula

10

<400> 61

94

<210> 62

<211> 100

<212> PRT

<213> Medicago truncatula

<400> 62

<210> 63 10 <211> 247

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 63 15

<210> 64

<211> 230

<212> PRT

<213> Panicum virgatum

<400> 64

<210> 65

<211> 183

<212> PRT

<213> Populus

<400> 65 <210> 66

<211> 264

<212> PRT

<213> Populus

<400> 66

5 <210> 67

<211> 158

<212> PRT

<213> Populus

10 <400> 67

<210> 68

<211> 257

<212> PRT

<213> Ricinus communis

<400> 68

<210> 69

<211> 184

<212> PRT

<213> Ricinus communis

<400> 69

<210> 70

<211> 239 10 <212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 70 5 <210> 71

<211> 214

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor

10 <400> 71 5 <210> 72

<211> 224

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

10 <400> 72 5 <210> 73

<211> 130

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

10 <220>

<221> característicamiscelánea

<222> (65)..(65)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

15 <220>

<221> característicamiscelánea

<222> (67)..(67)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (72)..(72)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 5

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (82)..(82)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 10

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (101)..(101)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 15

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (114)..(114)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 20

<220>

<221> característicamiscelánea

<222> (127)..(127)

<223>

Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 25

<400> 73

30 <210> 74

<211> 153

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<400> 74

5 <210> 75

<211> 244

<212> PRT

<213> Vigna unguiculata

10 <400> 75 <210> 76

<211> 245 5 <212> PRT

<213> Vitis vinífera

<220>

<221> característicamiscelánea 10 <222> (20)..(20)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 76

5

<210> 77 <211> 520 <212> PRT <213> Vitis vinífera

10

<400> 77

110

<210> 78

<211> 244 5 <212> PRT

<213> Vitis vinífera

<220>

<221> característicamiscelánea 10 <222> (98)..(98)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 78 5 <210> 79

<211> 723

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

10 <400> 79

<210> 80

<211> 546

<212> DNA

<213> Brassica oleracea

<400> 80

<210> 81

<211> 678

<212> DNA

<213> Brassicarapa

<400> 81

<210> 82

<211> 261

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 82

<210> 83

<211> 450

<212> DNA 15 <213> Oryza sativa

<400> 83

<210> 84

<211> 240

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 84

<210> 85

<211> 182

<212> PRT

<213> Brassica oleracea

<400> 85

<210> 86

<211> 226

<212> PRT

<213> Brassicarapa

<400> 86

<210> 87

<211> 87

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 87

<210> 88 15 <211> 150

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 88

<210> 89

<211> 726

<212> DNA 10 <213> Arabidopsis thaliana

<400> 89

<210> 90

<211> 729

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 90

<210> 91

<211> 621

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 91

<210> 92

<211> 711

<212> DNA

<213> Panicum virgatum

<400> 92

<210> 93 15 <211> 732

<212> DNA

<213> Sorghum bicolor

<400> 93 20

<210> 94

<211> 417

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 94

<210> 95

<211> 705

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 95

10 <210> 96

<211> 691

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

15 <400> 96

<210> 97

<211> 465

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 97

<210> 98

<211> 241

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 98

10 <210> 99

<211> 242

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 99

<210> 100 10 <211> 207

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 100

<210> 101

<211> 237 10 <212> PRT

<213> Panicum virgatum

<400> 101 5 <210> 102

<211> 244

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor

10 <400> 102

5

<210> 103 <211> 139 <212> PRT <213> Triticum aestivum

10

<400> 103

133

5 <210> 104

<211> 235

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

10 <400> 104

5 <210> 105

<211> 155

<212> PRT

<213> Zea mays

10 <400> 105 <210> 106

<211> 37

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 106

aaatctagaatgtgtgcatt agtacctcca ttgtttc

<210> 107

<211> 40

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 107

aaaggatcct catatatatg agtttccaca ttcctcatac

<210> 108

<211> 34

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 108 aaatctagaatggagtatcc atggctgcag tctc

<210> 109

<211> 34

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 109 aaaggatcct tatgattggc gtaatcccaa gagc

<210> 110

<211> 31

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 110 acgtgtcgac cttagccaat ggatgaggat g

<210> 111

<211> 31

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 111 acgttctaga tttttgttta ctgtagaaga g

<210> 112

<211> 33

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 112 acgtgtttaa acgcatagac tctcagcgga gag

<210> 113

<211> 31

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 113 acgtgctagc gaaaactcct ggtgagagtg g

<210> 114

<211> 34

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 114

acgtgctagc atgattgaac aagatggatt gcac

<210> 115

<211> 30

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 115

acgtgtcgac ctgcaggcat gcaagcttgg

<210> 116

<211> 33

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 116

acgtgtcgac ctctggatgc ctaaacaaac gac

<210> 117

<211> 30

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 117

acgttctaga ggcttttgtc ggtcggcctg

<210> 118

<211> 30

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 118

acgtgtcgac ggaggtgcag tttgcagcag

<210> 119

<211> 33

<212> DNA

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 119 acgttctaga tatagagaga gggtgatcaa cga

<210> 120

<211> 31

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 120 acgttctaga atggggcaca agcagctgtt c

<210> 121

<211> 31

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

<400> 121 acgtggatcc tcactgatgc atatgcagtc c

<210> 122

<211> 258

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia proteica de AtbHLH39

<400> 122

<210> 123

<211> 253 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia proteica de AtbHLH38

<400> 123 <210> 124

<211> 242

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia proteica de AtbHLH100

10 <400> 124 <210> 125

<211> 240 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia proteica de AtbHLH101 10

<400> 125

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método de producción de una planta transgénica que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico con relación a un control de tipo salvaje, que comprende transformar una planta, un cultivo de tejido de planta, o una célula de planta con un vector que comprende un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de 5 ácido nucleico que codifica un polipéptido bHLH subgrupo 1b seleccionado del grupo constituido por bHLH38, bHLH39, bHLH100, y bHLH101 para obtener una planta transformada, un cultivo de tejido de planta transformada, o una célula de planta transformada con expresión o actividad aumentada del gen bHLH subgrupo 1b, y cultivar dicha planta transformada o regenerar una planta a partir de dicho cultivo de tejido de planta transformada o célula de planta transformada, en el que se produce una planta que tiene tolerancia aumentada al estrés térmico con relación

   10 a un control de tipo salvaje.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en el cual dicho constructo de ácido nucleico comprende un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido.

3. 3.

   Elmétododelareivindicación2,enelcualdichopromotorespecíficodetejidoesunpromotorderaíz.

4. 4. El método de la reivindicación 1, en el cual dicho constructo de ácido nucleico comprende una secuencia de 15 ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NOs: 1-17.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1, en el cual dicho constructo de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NOs: 29-52.

6. 6.

   El método de la reivindicación 1, en el cual dicho constructo de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NOs: 79-83.

   20 7. El método de la reivindicación 1, en el cual dicho constructo de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NOs: 89-97.

   Figuras Figura 1 Alineación ClustalW de las proteínas AtbHLH