CN102872955B - 一种微生物固态培养基的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物固态培养基无菌粉碎方法，包括如下步骤：施力于盛放有微生物固态培养基的容器，使容器按预定轨迹作往复运动并使容器内的固态培养基形成与容器运动轨迹相反的往复运动料流。本发明的微生物固态培养基粉碎方法，具有无污染、粉碎过程对微生物损伤小、培养基利用率高等优点；本发明的粉碎方法可根据需要选择不同时间、强度和运动轨迹，能够满足各类微生物固态培养需求。本发明的微生物固态培养基的培养方法，在培养过程中，对固态培养基间歇性地采用本发明的粉碎方法进行粉碎，相对于传统固态培养技术，可以显著提高微生物培养质量及效率，适合在生物制药、食品发酵、生化实验等领域大规模应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物固态培养基的培养技术领域，尤其涉及一种对高湿度培养基进行非剪切式无菌粉碎的粉碎方法以及应用此粉碎方法的培养方法。
背景技术
在微生物固态纯培养过程中，氧气、养分的充足供给、无污染是扩培质量保证的关键。但现有的扩培技术中，为了满足微生物对氧气的需求会采用隔菌式培养或敞开式培养。为了满足微生物对养分的需求会采用小扩培量培养、静置式培养或较大扩培量培养、粉碎式培养。采用隔菌式培养方法能有效避免污染，但由于隔菌容器中的氧气自主渗透效果较差、位于培养基底层的微生物难以利用，因此该方法存在单次扩培量少、培养时间长、产能低等缺陷；采用敞开式或粉碎式培养方法，由于在粉碎的过程中，氧气可充分渗透到培养基底部，因此单次的敞开式扩培量较大，但该法在粉碎过程中明显存在容易引入外源污染的缺陷，而且在粉碎时，还会因使用振动、切割或挤压研磨等产生剪切力的粉碎方法，而破坏微生物的繁殖体，使扩培质量下降。
如专利申请号为200910244881.0、发明名称为“一种食用菌二级种(原种)培养基配方及制作方法”的中国专利申请，其使用敞开式和静置式培养，而该方法下进行的食用菌培养过程中，由于装入培养基与空间氧气接触面积有限，对内部培养基养分的利用较困难，因此培养长达25～30天才获得成曲种。且该专利并未使用隔菌式培养容器，因此存在污染及需在发菌期进行污染后处理。
又如专利申请号为90104141.6、发明名称为“一种酱油制曲新工艺”的中国专利申请，则使用了敞开式和粉碎式培养方法，该方法是通过在扩大培养过程中对固态培养基进行人工碾压或设备剪切的方式来粉碎打散结块的曲料，使接入的微生物孢子与曲料接触面积增大，以利于微生物对培养基的充分利用，因此培养时间只需2-3天即获得成种。但由于该方法中，翻曲的过程无法避免引入外源杂菌污染问题，且在进行人工碾压或设备剪切粉碎曲料时产生的强剪切力对培养基中微生物的菌丝体细胞造成细胞结构断裂粉碎、完整性受到严重破坏，故大大降低了微生物的扩大培养质量。
因此，目前现有的微生物固态培养方法均存在各自的缺陷，都无法同时解决氧气养分的充足供给、培养量少、扩培时间长、易受污染以及过程加入强剪切力粉碎容易导致微生物的菌丝体细胞结构性断裂受到严重损伤破坏等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种微生物固态培养基的粉碎方法，使得物料能在避免引入污染物又不会对菌体细胞造成机械损伤的情况下被分散、粉碎。基于此，本发明还提供一种利用此粉碎方法的培养方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种微生物固态培养基无菌粉碎方法，包括如下步骤：施力于盛放有微生物固态培养基的容器，使容器按预定轨迹作往复运动并使容器内的固态培养基形成与容器运动轨迹相反的往复运动料流。
优选地，所述预定轨迹为弧形轨迹或直线轨迹。
优选地，微生物固态培养基随容器往复运动的频率为0.08HZ～0.11HZ，往复运动的时间为10～300秒。
优选地，微生物固态培养基占容器体积的百分比为50％以下，容器体积为0.1m3以下。
本发明的一种微生物固态培养基的培养方法，包括如下步骤：在培养过程中，将微生物固态培养基设置在无菌容器内，间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎，粉碎方式为：施力于盛放有微生物固态培养基的容器，使容器按预定轨迹作往复运动并使容器内的固态培养基形成与容器运动轨迹相反的往复运动料流。
优选地，所述预定轨迹为弧形轨迹或直线轨迹。
优选地，所述间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎为：在培养过程中，出现粒径大于5mm的团块时，对微生物固态培养基进行粉碎。
优选地，所述间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎为：在培养过程中每个微生物固态培养基温度高峰期对微生物固态培养基进行粉碎。
优选地，所述间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎为：在微生物繁殖体生长过程中，温度大于34摄氏度时，对微生物固态培养基进行粉碎。
优选地，所述间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎为：在微生物的调整期(或称延迟期)或对数期内，当温度达到34摄氏度以上时进行粉碎。
优选地，所述间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎为：在微生物的对数期内，当温度达到34摄氏度以上且出现直径大于5mm的团块时进行粉碎。
与现有技术相比，本发明的微生物固态培养基的粉碎方法，由于对盛放微生物固态培养基的容器进行作用，而不直接对容器中的物料进行剪切，在粉碎过程中，微生物固态培养基仅与容器壁进行撞击以及在容器内翻滚，因而具有无污染、粉碎过程对微生物损伤小、培养基利用率高等优点；本发明的粉碎方法可根据需要选择不同的时间、强度和运动轨迹，能够满足各类微生物固态培养需求。
本发明的微生物固态培养基的培养方法，在培养过程中，对固态培养基间歇性地采用本发明的粉碎方法进行粉碎，相对于传统固态培养技术，可以显著提高微生物培养质量及效率，适合在生物制药、食品发酵、生化实验等领域大规模应用。
附图说明
图1为实施本发明微生物固态培养基的粉碎方法时容器及容器内物料的运动状态示意图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
微生物固态培养基的粉碎方法实施例
本实施例的方法包括如下步骤：
施力于盛放有微生物固态培养基的容器，使容器按预定轨迹作往复运动并使容器内的固态培养基形成与容器运动轨迹相反的往复运动料流。其中，预定轨迹可以为如图1所示的弧形轨迹C，图1示出容器A在外力作用下从下方位置移动到上方位置的状态图，微生物固态培养基在容器A中形成料流D与容器作相对运动。
本实施例的粉碎方法，无污染、非剪切粉碎操作的实现，是通过有效的运动轨迹和往复频率，结合重力惯性、离心力和摩擦阻力，使培养容器内的固态培养基形成与容器运动轨迹相反的往复运动料流，使得料流在往复端点与容器内壁发生有力拍打撞击，从而使物料粉碎。由于粉碎过程不使用剪切力直接作用于固态培养基，因而可以减少剪切力对菌体细胞造成的机械损伤，也能达到有效的分散效果。该方法可以在60秒内将直径大于300mm、水分含量为10％-70％的固态培养基均匀地粉碎成直径小于5mm的颗粒。对于不同湿度、容器大小和装料量，可以通过调节料流流速和频率来达到同等粉碎效果。
毛霉传代扩大培养方法实施例
在毛霉传代扩大培养过程中，经121℃、30分钟灭菌后冷却，盛装在隔菌容器内部的高湿度培养基容易变硬结团。此时，对变硬结团的高湿度培养基进行充分分散粉碎将有利于后续接入母种的混合，使之容易混合进入培养基内，使菌种萌发前期对培养基中养分能够充分利用。
在隔菌容器内，接入母种后的培养基在28-32℃的温度下恒温静置培养15小时后，菌种萌发并长出大量菌丝繁殖体，这些菌丝将相互缠绕并产生大量热，使培养基结成硬块状，在此培养过程中的各个结块时期及温度高峰点，对培养基以本发明的粉碎方法进行无菌充分粉碎混合，有利于及时散热避免烧曲，以及使前期位于培养基深层、底部的母种菌丝重新均匀分布、更好地利用空间氧气和增大其与培养基颗粒的接触面积，进一步充分利用养分，提高扩培质量和效率。由此可见，本发明的粉碎方法对毛霉传代扩培可起到巨大的作用。
具体实施过程如下：
1、将500g水分重量含量为60％～70％的固态培养基装入底面积约为0.08㎡的容器内，容器开口处封以隔菌棉，铺料厚度约2-3cm；
2、将装载有铺平上述培养基的容器在高压灭菌后冷却至40℃～50℃，然后施力于容器A，使之按预定的轨迹做往复运动，如可采用图1所示的弧形轨迹C进行往复运动，频率为1次/s，约30s。在沿弧形轨迹C的往复运动过程中，在重力惯性、离心和摩擦助力等作用力牵引下，容器A呈弧形轨迹往复运动，而置于其内部的固态培养基B在容器A的传导作用力下形成料流并被翻动、粉碎、分散，并于每次到达往返交点前撞击容器内壁分散。应用该方法后，底面积约为0.08m2块状的高湿度培养基被粉碎至粒度<3mm并混合均匀；
3、在无菌室内，按培养基重量的0.1％-0.5％接入母种；
4、接过母种后的培养基在28℃-32℃的恒温下经过12小时的培养，开始发热并结成硬块；
5、重复步骤2中所用的粉碎方法，对固态培养基粉碎混合60s后，即可将容器内底面积约为0.08m2的培养基硬块或粒度约300mm的团曲块培养基精粉碎至粒度<5mm并混合均匀；
6、培养基铺平后，在28-32℃下恒温静置培养，当培养过程中固态培养基再次升温结块时，重复步骤2中所用的粉碎方法对培养基进行处理，再恒温培养至成曲。
在其他实施例中，根据实际情况，在0.08HZ～0.11HZ的范围内调整微生物固态培养基随容器往复运动的频率，往复运动的时间可在10～300秒的范围内调整。
应用本发明的粉碎方法而进行的毛霉传代扩大培养方法，通过该培养方法培养后，毛霉固态培养基的菌种生长扩培质量得到有效提高，由于在培养过程中并未采用外部机构进行对培养基团块进行粉碎，所以这种隔菌式培养有效预防了外源污染；而在每个团块出现的时期都进行粉碎，这种周期性的粉碎方法使毛霉对培养基养分和无菌氧气更充分地利用，有效增加单次扩培量、缩短扩培时间，产孢量上升77.8％。彻底解决传统工艺下，毛霉扩培过程中，由于菌种散热不及时而导致烧曲或因过度使用剪切力粉碎破坏了菌丝等繁殖体细胞而严重影响扩培质量以及单次产量、周期等问题，操作简单而经济效益较大。
以上对本发明进行了详细介绍，文中应用具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.一种微生物固态培养基的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：在培养过程中，将微生物固态培养基设置在无菌容器内，间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎，粉碎方式为：施力于盛放有微生物固态培养基的容器，使容器按预定轨迹作往复运动并使容器内的固态培养基形成与容器运动轨迹相反的往复运动料流。
2.根据权利要求1所述的微生物固态培养基的培养方法，其特征在于，微生物固态培养基随容器往复运动的频率为0.08HZ～0.11HZ，往复运动的时间为10秒～300秒。
3.根据权利要求1所述的微生物固态培养基的培养方法，其特征在于，微生物固态培养基占容器体积的百分比为50％以下，容器体积为0.1m3以下。
4.根据权利要求1所述的微生物固态培养基的培养方法，其特征在于，所述预定轨迹为弧形轨迹或直线轨迹。
5.根据权利要求1所述的微生物固态培养基的培养方法，其特征在于，所述间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎为：在培养过程中，出现粒径大于5mm的团块时，对微生物固态培养基进行粉碎。
6.根据权利要求1所述的微生物固态培养基的培养方法，其特征在于，所述间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎为：在培养过程中每个微生物固态培养基温度高峰期对微生物固态培养基进行粉碎。
7.根据权利要求1所述的微生物固态培养基的培养方法，其特征在于，所述间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎为：在微生物繁殖体生长过程中，温度大于34摄氏度时，对微生物固态培养基进行粉碎。
8.根据权利要求1所述的微生物固态培养基的培养方法，其特征在于，所述间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎为：在微生物的调整期或对数期内，当温度达到34摄氏度以上时进行粉碎。
9.根据权利要求1所述的微生物固态培养基的培养方法，其特征在于，所述间歇性地对微生物固态培养基进行粉碎为：在微生物的对数期内，当温度达到34摄氏度以上且出现直径大于5mm的团块时进行粉碎。
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