ES2542311T3 - Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para aumentar en las plantas al menos un rasgo relacionado con el rendimiento, seleccionado de, vigor de emergencia de la planta, índice de raíz/brote, rendimiento de semilla, tasa de llenado de semilla, índice de semilla y peso de mil granos en las plantas con respecto a plantas de control, que comprende aumentar en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC, en el que dicho polipéptido JMJC comprende un dominio JmjC representado por una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 60 % o más con: (i) SEC ID Nº: 6; y/o (ii) uno o más de los dominios JmjC comprendidos en los polipéptidos JMJC representados por SEC ID Nº: 12; SEC ID Nº: 14; SEC ID Nº: 24; SEC ID Nº: 26; SEC ID Nº: 32; SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36; SEC ID Nº: 38; SEC ID Nº: 40; SEC ID Nº: 42; SEC ID Nº: 44; SEC ID Nº: 46; SEC ID Nº: 48; SEC ID Nº: 50; SEC ID Nº: 52; SEC ID Nº: 56; SEC ID Nº: 58; SEC ID Nº: 60; y SEC ID Nº: 62, cuyas coordenadas de aminoácidos se proporcionan en la Tabla A4; y (iii) en el que dichos polipéptidos JMJC comprenden un motivo que tiene una identidad de secuencia de al menos 60 % o más con una cualquiera o más de: (a) SEC ID Nº: 7, (b) SEC ID Nº: 8, (c) SEC ID Nº: 9, (d) SEC ID Nº: 10.

Description

Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas
La presente invención se refiere, en líneas generales, al campo de la biología molecular y atañe a un procedimiento para potenciar diversas características del crecimiento de las plantas aumentando en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC (JUMONJI-C). La presente invención también atañe a plantas que tienen expresión aumentada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC, cuyas plantas tienen rasgos de crecimiento potenciados con respecto a plantas de tipo silvestre correspondientes u otras plantas de control. La invención también proporciona construcciones útiles en los procedimientos de la invención.
El continuo aumento de la población mundial y la disminución de suministro de tierra cultivable disponible para la agricultura incentivan la investigación hacia el aumento de la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para mejoras de cultivo y hortícolas utilizan técnicas de siembra selectiva para identificar plantas que tienen características deseables. Sin embargo, dichas técnicas de siembra selectiva tienen diversos inconvenientes, en concreto, que estas técnicas son típicamente laboriosas y producen plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterógenos que no siempre producen el rasgo deseable que se transmite desde las plantas progenitoras. Los avances en biología molecular han permitido a la humanidad modificar el plasma germinal de animales y plantas. La ingeniería genética de las plantas conlleva el aislamiento y la manipulación de material genético (típicamente en forma de ADN o ARN) y la introducción posterior de ese material genético en una planta. Dicha tecnología tiene la capacidad de producir cultivos o plantas que tienen diversos rasgos económicos, agronómicos u hortícolas mejorados.
Un rasgo de interés económico particular es el aumento del rendimiento. El rendimiento se define normalmente como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto puede definirse en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diversos factores, por ejemplo, del número y tamaño de los órganos, de la arquitectura de la planta (por ejemplo, del número de ramas), de la producción de semillas, de la senescencia de las hojas y de más factores. El desarrollo de raíces, la absorción de nutrientes, la tolerancia al estrés, y el vigor temprano también pueden ser factores importantes en la determinación del rendimiento. Por lo tanto, optimizar los factores mencionados anteriormente puede contribuir a aumentar el rendimiento del cultivo.
El rendimiento de las semillas es un rasgo particularmente importante, ya que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición humana y animal. Cultivos tales como maíz, arroz, trigo, canola y soja representan más de la mitad de la ingesta calórica humana total, bien a través del consumo directo de las propias semillas o a través del consumo de productos cárnicos generados sobre semillas procesadas. También son una fuente de azúcares, aceites y muchos tipos de metabolitos utilizados en los procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos brotes y raíces) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas). El desarrollo de una semilla implica muchos genes y requiere la transferencia de metabolitos desde las raíces, hojas y tallos al interior de la semilla en crecimiento. El endospermo, en particular, asimila los precursores metabólicos de los carbohidratos, aceites y proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para llenar el grano.
Otro rasgo importante para muchos cultivos es el vigor temprano. Mejorar el vigor temprano es un objetivo importante de los programas de siembra de arroz modernos en variedades de cultivo de arroz tanto de clima templado como tropical. Las raíces largas son importantes para el anclaje adecuado al suelo en arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos inundados, y cuando las plantas deben emerger rápidamente a través del agua, los brotes más alargados se asocian con el vigor. Cuando se practica siembra con perforación, para la buena emergencia de las plántulas, son importantes mesocótilos y coleóptilos más alargados. La capacidad de modificar genéticamente el vigor temprano en plantas sería de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, un vigor temprano pobre ha sido una limitación para la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) basados en plasma germinal del Cinturón de Maíz en el Atlántico Europeo.
Un rasgo importante adicional es el de tolerancia mejorada al estrés abiótico. El estrés abiótico es la causa principal de pérdidas de cultivo en todo el mundo, reduciendo en más de un 50 % los rendimientos promedio para la mayoría de las plantas de cultivo principales (Wang y col., Planta (2003) 218: 1-14). El estrés abiótico puede producirse por sequía, salinidad, temperaturas extremas, toxicidad química y estrés oxidativo. La capacidad de mejorar la tolerancia de la planta al estrés abiótico sería de gran ventaja económica para los granjeros de todo el mundo y permitiría la cosecha de cultivos durante condiciones adversas y en territorios cuando la cosecha de cultivos no pueda ser posible de otra forma.
Por lo tanto el rendimiento del cultivo puede aumentarse optimizando uno de los factores mencionados anteriormente.
Dependiendo del uso final, la modificación de determinados rasgos de rendimiento puede estar favorecida sobre otros. Por ejemplo, para aplicaciones tales como forraje o producción de madera, o fuente de biocombustible, puede ser deseable un aumento en las partes vegetativas de una planta, y para aplicaciones tales como producción de
harina, almidón o aceite, el aumento en los parámetros de semilla puede ser particularmente deseable. Incluso entre los parámetros de semilla, algunos pueden estar favorecidos sobre otros, dependiendo de la aplicación. Diversos mecanismos pueden contribuir a aumentar el rendimiento de las semillas, ya sea que esté en la forma de tamaño de semilla aumentado o número de semilla aumentado.
Una estrategia para aumentar el rendimiento (rendimiento de semillas y/o biomasa) en las plantas puede ser a través de la modificación de los mecanismos de crecimiento intrínsecos de una planta, tal como el ciclo celular o diversas rutas de señalización implicados en el crecimiento de la planta o en los mecanismos de defensa.
Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que el aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JUMONJI-C o JMJC produce pantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento, en particular varios rasgos de rendimiento potenciados en relación con las plantas de control.
De acuerdo con una realización, se proporciona un procedimiento para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento de una planta con relación a plantas de control, que comprende aumentar en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC. Los rasgos mejorados relacionados con el rendimiento comprenden el aumento del peso total de la semilla por planta, del peso de 1000 granos (1000 semillas), de la tasa de llenado de la semilla, del índice de cosecha, del vigor temprano y del índice de raíz/brote, en condiciones de crecimiento tanto óptimas como subóptimas como en condiciones de Sequía leve.
Antecedentes
El primer informe del gen JUMONJI (que significa cruciforme en japonés) se identificó por atrapamiento génico en ratones donde este desempeñaba un papel esencial en el desarrollo de tejidos múltiples. Hasta ahora los polipéptidos JUMONJI constituyen una clase distinta de proteínas encontrada en procariotas así como en eucariotas incluyendo bacterias, hongos y plantas.
La mayor parte de los miembros de la familia de polipéptidos JUMONJI se caracteriza por la presencia de un dominio JmjC o JUMONJI-C. Se crea la hipótesis de que durante la evolución, antiguas proteínas que solo comprendían el dominio JmjC adquirieron dominios adicionales ampliando el espectro de polipéptidos JMJC encontrados en la naturaleza. De particular interés son los polipéptidos JMJC que han adquirido dominios conservados implicados en la unión a ADN, ARN, y proteínas, tales como dominios de dedos de zinc, ricos en FY, de proteína de dedo RING y de caja F, lo que sugiere que los polipéptidos de la familia JUMONJI pueden regular la transcripción, la función de la cromatina y/o la renovación de proteínas. Por consiguiente, se han descrito muchas proteínas JUMONJI en animales que afectan al desarrollo mediante el control de la expresión génica y actividad de la cromatina. Por ejemplo un gen JUMONJI de ratón actúa reprimiendo ciclina D1 en embriones y esta actividad se requiere para la cardiogénesis normal (Toyoda et al. 2003 Dev Cell. 5(1):85-97).
Se han realizado muchos avances sobre el entendimiento del modo de acción de las proteínas que contienen el dominio JmjC. Crucial para su función biológica pueden ser algunas de las actividades enzimáticas recientemente reveladas en los polipéptidos JMJC, por ejemplo JHDM1, un polipéptido JMJC de origen humano (Tsukada, Nature. 2006; 439(7078):811-6) que tiene actividad histona dimetilasa, y actividad asparaginil hidroxilasa se ha descrito en FIH (factor de inhibición HIF-1alfa) un factor de la transcripción implicado en la respuesta celular contra la hipoxia (Linke et al. (2004) J. Biol. Chem., Vol. 279, 14391-14397).
Típicamente los dominios JmjC tienen estructuras que se parecen a las encontradas en algunas metaloenzimas. Recientes análisis estructurales del dominio JmjC presentes en la proteína JUMONJI FIH revelaron los restos de aminoácidos implicados en la unión con los cofactores 2-oxoglutarato e hierro Fe (II) (Dann et al.; Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99(24): 15351-15356). El FIH tiene el motivo de unión a hierro HXD/E característico de la mayoría de las 2-oxoglutarato oxigenasas. Además y coherente con la actividad hidroxilasa, la estructura secundaria de FIH está compuesta por un núcleo de tipo rollo de gelatina de cadena beta que envuelve el sitio de unión a Fe(II). Estas características están conservadas entre las proteínas que contienen el dominio JmjC (Trewick et al. EMBO Rep. 2005 (4):315-20).
En plantas, se han descrito dos polipéptidos JMJC implicados en el control del tiempo de floración. Ambos actúan como represores de las rutas de floración en Arabidopsis thaliana (Noh et al. Plant Cell. 2004. 16(10):2601-13). La actividad enzimática de las proteínas de las plantas aún no se ha determinado experimentalmente.
Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que aumentando en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JUMONJI-C o JMJC se producen pantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento, en particular rendimiento aumentado con respecto a plantas de control.
De acuerdo con una realización, se proporciona un procedimiento para mejorar rasgos relacionados con el rendimiento de una planta con respecto a plantas de control, que comprende aumentar en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC. Los rasgos mejorados relacionados con el rendimiento comprenden uno o más de aumento del preso de semilla total por planta, del peso de mil semillas (1000 semillas), de la tasa de llenado de la semilla, del índice de cosecha, del vigor de emergencia de la planta y del índice de raíz/brote, en condiciones de crecimiento tanto óptimas como subóptimas y en condiciones de sequía leve.
Definiciones
Polipéptido(s)/proteína(s)
Los términos “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a aminoácidos en una forma polimérica de cualquier longitud, unidos entre sí por enlaces peptídicos.
Polinucleótido(s)/Ácido(s) nucleico(s)/Secuencia(s) de ácidos nucleicos/Secuencia(s) de nucleótidos
En el presente documento, los términos “polinucleótido(s)”, “secuencia(s) de ácidos nucleicos”, “secuencia(s) de nucleótidos”, “ácido(s) nucleico(s)” y “molécula de ácido nucleico” se usan indistintamente y se refieren a nucleótidos, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica no ramificada de cualquier longitud.
Planta(s) de control
La elección de plantas de control adecuadas es una parte rutinaria de un montaje experimental y puede incluir plantas de tipo silvestre correspondientes o plantas correspondientes sin el gen de interés. La planta de control es típicamente de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad de planta que la planta que se va a evaluar. La planta de control también puede ser un nulicigoto de la planta que se va a evaluar. Los nulicigotos son individuos que perdieron el transgén por segregación. Una “planta de control” como se usa en el presente documento no solo se refiere a plantas completas, sino también a partes de planta, incluyendo semillas y partes de semilla.
Homólogo(s)
Los “homólogos” de una proteína incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos con respecto a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad funcional y biológica similar como la proteína no modificada de la cual proceden.
Una deleción se refiere a la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteína.
Una inserción se refiere a uno o más restos de aminoácido que se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones de N y/o C terminal, así como inserciones intra-secuencia de un solo aminoácido o múltiples aminoácidos. Generalmente, las inserciones en la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones de N o C terminal, del orden de aproximadamente 1 a 10 restos. Los ejemplos de proteínas de fusión de N o C terminal o péptidos incluyen el dominio de unión o dominio de activación de un activador transcripcional como se usa en el sistema de doble híbrido de levadura, proteínas de cubierta de fago, etiqueta de (histidina)-6, etiqueta de glutatión S-transferasa, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítope Tag•100, epítope c-myc, epítope FLAG®, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina), epítope HA, epítope de proteína C, epítope VSV.
Una sustitución se refiere a un reemplazo de aminoácidos de la proteína con otros aminoácidos que tiene propiedades similares (tales como similar hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensidad para formar o romper estructuras α-helicoidales o  laminares). Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de restos únicos, pero pueden agruparse dependiendo de las limitaciones funcionales puestas al polipéptido; las inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoácido. Las sustituciones de aminoácidos son preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas. En la técnica se conocen bien las tablas de sustitución conservativa (véase, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds) y la Tabla 1 más adelante).
Tabla 1: Ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservativas
Resto
Sustituciones conservativas Resto Sustituciones conservativas
Ala
Ser Leu Ile; Val
Arg
Lys Lys Arg; Gln
Asn
Gln; His Met Leu; Ile
Asp
Glu Phe Met; Leu; Tyr
Gln
Asn Ser Thr; Gly
Cys
Ser Thr Ser; Val
Glu
Asp Trp Tyr
Gly
Pro Tyr Trp; Phe
(continuación)
Resto
Sustituciones conservativas Resto Sustituciones conservativas
His
Asn; Gln Val Ile; Leu
Ile
Leu, Val
Las sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos pueden realizarse fácilmente usando técnicas sintéticas de péptidos bien conocidas en la técnica, tales como síntesis peptídica de fase sólida y similares, o por manipulación de ADN recombinante. En la técnica se conocen bien procedimientos de manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, inserción o deleción de una proteína. Por ejemplo, los expertos en la técnica conocen técnicas para realizar mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH), mutagénesis dirigida a sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida a sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida a sitio.
Derivados
Los “derivados” incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de forma natural de la proteína, tal como la proteína de interés, comprender sustituciones de aminoácidos con restos de aminoácido de origen no natural, o adiciones de restos de aminoácido de origen no natural. Los “derivados” de una proteína también incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, que comprenden restos de aminoácido modificados de origen natural (glucosilado, acilado, prenilado, fosforilado, miristoilado, sulfatado, etc.) o modificados de origen no natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de forma no natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones que no son de aminoácido en comparación con la secuencia de aminoácidos de la que procede, por ejemplo una molécula indicadora u otro ligando, unido covalente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos, tal como una molécula indicadora que se une para facilitar su detección, y restos de aminoácido que no son de origen natural con respecto a la secuencia de aminoácidos de una proteína de origen natural. Además, los “derivados” también incluyen fusiones de la forma de origen natural de la proteína con péptidos etiquetadores, tales como FLAG, HIS6 o tiorredoxina (para una revisión de péptidos etiquetadores, véase Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003).
Ortólogo(s)/Parálogo(s)
Los ortólogos y parálogos incluyen conceptos evolutivos usados para describir las relaciones antecesoras de los genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen antecesor; los ortólogos son genes de diferentes organismos que se han originado a través de la especiación, y también proceden de un gen antecesor común.
Dominio
El término “dominio” se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de las proteínas evolutivamente relacionadas. Aunque los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre los homólogos, los aminoácidos que están muy conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que son probablemente esenciales en la estructura, estabilidad o función de una proteína. Identificado por su alto gado de conservación en las secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteína, éstas pueden usarse como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia polipeptídica previamente identificada.
Motivo/Secuencia consenso/Firma
Las expresiones “motivo” o “secuencia consenso” o “firma” se refieren a una región conservada corta en la secuencia de las proteínas evolutivamente relacionadas. Los motivos son partes de dominios frecuentemente muy conservadas, pero también pueden incluir solo parte del dominio, o localizarse fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo se encuentran fuera de un dominio definido).
Hibridación
El término “hibridación”, como se define en el presente documento, es un proceso en el que secuencias de nucleótidos complementarias, sustancialmente homólogas, se hibridan entre sí. El proceso de hibridación puede producirse completamente en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El proceso de hibridación también puede producirse con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado en una matriz, tal como perlas magnéticas, perlas de Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede producirse adicionalmente con uno de los ácidos nucleicos complementario inmovilizado en un soporte sólido, tal como una membrana de nitrocelulosa o de nailon, o inmovilizado, por ejemplo, mediante fotolitografía a, por ejemplo, un soporte vítreo silíceo (el último conocido como matrices o micromatrices de ácido nucleico o como microplacas de
ácido nucleico). Para permitir que se produzca la hibridación, las moléculas de ácido nucleico están, generalmente, térmica o químicamente desnaturalizadas para fundir una doble cadena en dos cadenas únicas y/o retirar horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios.
El término “rigurosidad” se refiere a las condiciones en las que se realiza la hibridación. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como temperatura, concentración salina, fuerza iónica y composición del tampón de hibridación. Generalmente, se seleccionan condiciones de baja rigurosidad por ser aproximadamente 30 ºC menores que el punto de fusión térmico (Tf) para la secuencia específica a una fuerza iónica definida y pH. Las condiciones de rigurosidad media son cuando la temperatura es 20 ºC por debajo de la Tf, y las condiciones de rigurosidad alta son cuando la temperatura es 10 ºC por debajo de la Tf. Las condiciones de hibridación de rigurosidad alta se usan típicamente para aislar secuencias de hibridación que tiene alta similitud de secuencia con la secuencia de ácido nucleico diana. Sin embargo, los ácidos nucleicos pueden desviarse en cuanto a la secuencia y aún codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la generación del código genético. Por lo tanto, en ocasiones, pueden necesitarse condiciones de hibridación de rigurosidad media para identificar dichas moléculas de ácidos nucleicos.
La Tf es la temperatura bajo fuerza iónica definida y pH, en la que el 50 % de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La Tf depende de las condiciones de solución y de la composición base y longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas más altas. La tasa máxima de hibridación se obtiene de aproximadamente 16 ºC hasta 32 ºC por debajo de la Tf. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos cadenas de ácido nucleico por lo cual se promueve la formación del híbrido; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0,4 M (para mayores concentraciones, este efecto puede ignorarse). La formamida reduce la temperatura de fusión de dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0,6 a 0,7 ºC para cada porcentaje de formamida, y la adición de formamida al 50 % permite que se realice la hibridación de 30 a 40 ºC, aunque la tasa de hibridación disminuirá. Los emparejamientos erróneos de los pares de bases reducen la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. Por término medio y para sondas grandes, la Tf disminuye aproximadamente 1 ºC por % de emparejamiento erróneo de bases. La Tf puede calcularse usando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:
1) híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984): Tf = 81,5 ºC + 16,6xlog10[(Na+]a
+ 0,41x%[G/Cb] – 500x[Lc]-1 – 0,61x% formamida 2) híbridos de ADN-ARN o ARN-ARN: Tf = 79,8 + 18,5 (log10[(Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 – 820/Lc 3) híbridos de oligo-ADN u oligo-ARNd:
Para <20 nucleótidos: Tf= 2 (In)
Para 20-35 nucleótidos: Tf= 22 + 1,46 (In)
a o para otro catión monovalente, pero solo exacto en el intervalo de 0,01-0,4 M. b solo exacto para % GC en el intervalo de 30 % a 75 %. c L = longitud del dúplex en los pares de bases. d oligo, oligonucleótido; In, = longitud eficaz del cebador = 2x(nº de G/C)+(nº de A/T).
La unión no específica puede controlarse usando una cualquiera de las numerosas técnicas conocidas, tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen la proteína, adiciones del ARN heterólogo, ADN y SDS al tampón de hibridación y tratamiento con Rnasa. Para sondas no homólogas, puede realizarse una serie de hibridaciones al variar uno de (i) disminuir progresivamente la temperatura de hibridación (por ejemplo de 68 ºC a 42 ºC) o (ii) disminuir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo del 50 % al 0 %). El experto en la técnica es consciente de que durante la hibridación pueden alterarse diversos parámetros y que se mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.
Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de hibridación también depende típicamente de la función de los lavados post-hibridación. Para retirar el fondo resultante de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de dichos lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: a menor concentración salina y mayor temperatura de lavado, mayor rigurosidad de lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente a, o por debajo de, la rigurosidad de hibridación. Una hibridación positiva da lugar a una señal que es al menos dos veces la del fondo. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o los procedimientos de detección de amplificación de genes son como se expusieron anteriormente. También pueden seleccionarse condiciones más o menos rigurosas. El experto en la técnica es consciente de que, durante el lavado, pueden alterarse diversos parámetros y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.
Por ejemplo, las condiciones de hibridación típicas de alta rigurosidad para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos incluyen una hibridación a 65 ºC en 1x SSC o a 42 ºC en 1x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 65 ºC en 0,3x SSC. Los ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para híbridos de ADN más largos de 50 nucleótidos incluyen una hibridación a 50 ºC en 4x SSC o a 40 ºC en 6x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 50 ºC en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud prevista para la hibridación del ácido nucleico. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido puede determinarse
alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en el presente documento. 1x SSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM, la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalmente reactivo de Denhardt 5x, SDS al 0,5-1,0 %, 100 g/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado 100 g/ml, pirofosfato sódico al 0,5 %.
Con el fin de definir el nivel de rigurosidad, puede hacerse referencia a Sambrook y col. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 y actualizaciones anuales).
Variante de corte y empalme
La expresión “variante de corte y empalme” como se usa en el presente documento incluye variantes de una secuencia de ácido nucleico en la que los intrones y/o exones seleccionados se han escindido, reemplazado, desplazado o añadido, o en la que los intrones se han acortado o alargado. Dichas variantes serán aquellas en las que la actividad biológica de la proteína esté sustancialmente conservada; esto puede conseguirse conservando selectivamente los segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de corte y empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser sintetizadas por el hombre. En la técnica se conocen bien procedimientos para predecir y aislar dichas variantes de corte y empalme (véase, por ejemplo, Foissac y Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
Variante alélica
Los alelos o variantes alélicas son formas alternativas de un gen determinado, localizado en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas incluyen Polimorfismos Mononucleotídicos (SNP, por las siglas Single Nucleotide Polymorphisms), así como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Deleción (INDELs, por las siglas Small Insertion/Deletion Polymorphisms). El tamaño de los INDELs es normalmente menor de 100 pb. Los SNP y los INDELs forman la serie de variantes de secuencia más grande en las cepas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos.
Combinación de genes/Evolución dirigida
La combinación de genes o evolución dirigida consiste en repeticiones de combinación de ADN seguido de exploración y/o selección apropiada para generar variantes de ácidos nucleicos o partes de las mismas que codifican proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle y col., (2004) Science 304(5674): 1151-4; Patentes de Estados Unidos 5.811.238 y 6.395.547).
Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor
Las expresiones “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” se usan todas indistintamente en el presente documento y se toman en un contexto amplio para referirse a una secuencia de ácido nucleico reguladora capaz de efectuar la expresión de las secuencias a las que se unen. El término “promotor” se refiere típicamente a una secuencia de control de ácido nucleico localizada cadena arriba del inicio transcripcional de un gen y que está implicado en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo así la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. En los términos anteriormente mencionados se incluyen las secuencias reguladoras transcripcionales procedentes de un gen genómico eucariota clásico (incluyendo la caja TATA que es necesaria para el inicio de la transcripción adecuado, con o sin secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras cadena arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta al desarrollo y/o estímulo externo, o de una manera específica de tejido. También se incluye en el término una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladores transcripcionales de caja -10. La expresión “elemento regulador” también incluye una molécula de fusión sintética o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.
Un “promotor de planta” comprende elementos reguladores, que median la expresión de un segmento de secuencia codificante en células de plantas. Por consiguiente, un promotor de planta no tiene que ser de origen vegetal, sino que puede originarse de virus o microorganismos, por ejemplo de virus que atacan a las células de planta. El “promotor de planta” también puede originarse de una célula de planta, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácido nucleico a expresar en el proceso de la invención y descrito en el presente documento. Esto también se aplica a las otras señales reguladoras de “planta”, tales como terminadores de “planta”. Los promotores cadena arriba de la secuencias de nucleótidos útiles en los procedimientos de la presente invención pueden modificarse mediante una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de nucleótido sin interferir con la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, la fase de lectura abierta (ORF, Open Reading Frame) o la región reguladora 3’ tal como terminadores u otras regiones reguladoras 3’ que se localizan fuera de la ORF. Además es posible que la actividad de los promotores aumente por la modificación de su secuencia o que se reemplacen completamente mediante más promotores activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico debe, como se ha descrito anteriormente, estar unida operativamente a, o comprender, un promotor adecuado que exprese el gen de manera adecuada, en tiempo y con el patrón de expresión espacial requerido.
Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato pueden analizarse, por ejemplo, uniendo operativamente el promotor a un gen indicador y evaluando el nivel de expresión y el patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores bien conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o la beta-galactosidasa. La actividad del promotor se evalúa midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La fuerza del promotor y/o el patrón de expresión pueden después compararse con la de un promotor de referencia (tal como el que se usa en los procedimientos de la presente invención). Como alternativa, la fuerza del promotor puede evaluarse cuantificando niveles de ARNm o comparando niveles de ARNm del ácido nucleico usado en los procedimientos de la presente invención, con niveles de ARNm de genes constitutivos tal como ARNr 18S, usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como transferencia de Northern con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid y col., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Generalmente por “promotor débil” se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por “nivel bajo” se entiende niveles de aproximadamente 1/10.000 transcriptos a aproximadamente 1/100.000 transcriptos, a aproximadamente 1/5000000 transcriptos por célula. Por el contrario, un “promotor fuerte” dirige la expresión de una secuencia codificante a alto nivel, o a aproximadamente 1/10 transcriptos a aproximadamente 1/100 transcriptos a aproximadamente 1/1000 transcriptos por célula. Generalmente, por “promotor de fuerza media” se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel más bajo que el de un promotor fuerte, en particular a un nivel que es, en todos los casos, inferior al obtenido cuando está bajo el control de un promotor CaMV 35S.
Unido operativamente
La expresión “unido operativamente” como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora puede iniciar la transcripción del gen de interés.
Promotor constitutivo
Un “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayor parte, aunque no necesariamente en todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en la mayor parte de las condiciones ambientales, en al menos una célula, tejido u órgano. La siguiente Tabla 2a proporciona ejemplos de promotores constitutivos.
Tabla 2a: ejemplos de promotores constitutivos
Fuente del gen
Referencia
Actina
McElroy y col, Plant Cell, 2: 163-171, 1990
HMGP
WO 2004/070039
CAMV 35S
Odell y col, Nature, 313: 810-812, 1985
CaMV 19S
Nilsson y col., Physiol. Plant. 100:456-462, 1997
GOS2
de Pater y col, Plant J Nov; 2(6):837-44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitina
Christensen y col, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992
Ciclofilina de arroz
Buchholz y col, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994
Histona H3 de maíz
Lepetit y col, Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992
Histona H3 de alfalfa
Wu y col. Plant Mol. Biol. 11:641-649, 1988
Actina n 2
An y col, Plant J. 10(1); 107-121, 1996
34S FMV
Sanger y col., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443
Subunidad pequeña Rubisco
US 4,962,028
OCS
Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553
SAD1
Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2
Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
nos
Shaw y col. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846
V-ATPasa
WO 01/14572
Súper promotor
WO 95/14098
Proteínas de la caja G
WO 94/12015
Promotor ubicuo
Un promotor ubicuo es activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo.
Promotor regulado evolutivamente
Un promotor regulado evolutivamente es activo durante determinadas etapas del desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios evolutivos.
Promotor inducible
Un promotor inducible ha inducido o aumentado el inicio de la transcripción en respuesta a un estímulo químico (para una revisión véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108), ambiental o físico, o puede ser “inducible por estrés”, es decir, activado cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o un “patógeno inducible,” es decir, activado cuando una planta está expuesta a la exposición a diversos patógenos.
Promotor especifico de órgano/específico de tejido
Un promotor específico de órgano o específico de tejido es uno que es capaz de iniciar preferentemente la transcripción en determinados órganos o tejidos, tales como hojas, raíces tejido de semillas, etc. Por ejemplo, un “promotor específico de raíz” es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en las raíces las de plantas, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. En el presente documento a los promotores capaces de iniciar la transcripción solo en determinadas células se les denomina promotores “específicos de célula”.
En la siguiente Tabla 2b se indican ejemplos de promotores específicos de raíz:
Tabla 2b: ejemplos de promotores específicos de raíz
Fuente del gen
Referencia
RCc3
Plant Mol Biol. 1995 Jan;27(2):237-48
Arabidopsis PHT1
Kovama y col., 2005; Mudge y col. (2002, Plant J. 31: 341)
Transportador de fosfato en Medicago
Xiao y col., 2006
Arabidopsis Pyk10
Nitz y col. (2001) Plant Sci 161(2): 337-346
genes expresables en raíz
Tingey y col., EMBO J. 6: 1, 1987.
gen inducible por auxina en tabaco
Van der Zaal y col., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
-tubulina
Oppenheimer, y col., Gene 63: 87, 1988.
genes específicos de la raíz del tabaco
Conkling, y col., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
gen G1-3b de B. napus
Patente de Estados Unidos No. 5.401.836
SbPRP1
Suzuki y col., Plant Mol. Biol. 21: 109-119, 1993.
LRX1
Baumberger y col. 2001, Genes & Dev. 15:1128
BTG-26 de Brassica napus
US 20050044585
LeAMT1 (tomate)
Lauter y col. (1996, PNAS 3:8139)
The LeNRT1-1 (tomate)
Lauter y col. (1996, PNAS 3:8139)
gen de la patatina de clase I (patata)
Liu y col., Plant Mol. Biol. 153:386-395, 1991.
KDC1 (Daucus carota)
Downey y col. (2000, J. Biol. Chem. 275:39420)
gen de TobRB7
W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
OsRAB5a (raíz)
Wang y col. 2002, Plant Sci. 163:273
ALF5 (Arabidopsis)
Diener y col. (2001, Plant Cell 13:1625)
NRT2;1Np (N. plumbaginifolia)
Quesada y col. (1997, Plant Mol. Biol. 34:265)
Un promotor específico de semilla es transcripcionalmente activo predominantemente en tejidos de semilla, pero no necesariamente exclusivamente en tejidos de semilla (en casos de expresión parcial). El promotor específico de semilla puede ser activo durante el desarrollo y/o durante la germinación de la semilla. El promotor específico de semilla puede ser específico de endospermo/aleurona/embrión. En las Tablas 2d, 2e y 2f se muestran ejemplos de promotores específicos de semilla (específicos de endospermo/aleurona/embrión). Otros ejemplos de promotores específicos de semilla se dan en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004).
Tabla 2c: ejemplos de promotores específicos de semilla
Fuente del gen
Referencia
genes específicos de semilla
Simon y col., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
Scofield y col., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
Baszczynski y col., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
albúmina de Nuez del Brasil
Pearson y col., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.
Legumina
Ellis y col., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.
Glutelina (arroz)
Takaiwa y col., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986;
Takaiwa y col., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.
Zeína
Matzke y col Plant Mol Biol, 14(3):323-32 1990
napA
Stalberg y col, Planta 199: 515-519, 1996.
Gluteína-1 de BPM y APM de trigo
Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, 1989
SPA de trigo
Albani y col, Plant Cell, 9: 171-184, 1997
,  y  gliadinas de trigo
EMBO J. 3:1409-15, 1984
Promotor Itr1 de cebada
Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8
Hordeína B1, C, D de cebada
Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996
DOF de cebada
Mena y col, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998
blz2
EP99106056.7
promotor sintético
Vicente-Carbajosa y col., Plant J. 13: 629-640, 1998.
Prolamina NRP33 de arroz
Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998
 globulina Glb-1 de arroz
Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998
OSH1 de arroz
Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996
 globulina REB/OHP-1 de arroz
Nakase y col. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997
ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz
Trans Res 6:157-68, 1997
familia del gen ESR de maíz
Plant J 12:235-46, 1997
-kafirina de sorgo
DeRose y col., Plant Mol. Biol 32:1029-35, 1996
KNOX
Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999
Oleosina de arroz
Wu y col, J. Biochem. 123:386, 1998
Oleosina de girasol
Cummins y col., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992
(continuación)
Fuente del gen
Referencia
PRO0117, supuesta proteína ribosomal 40S de arroz
WO 2004/070039
PRO0136, alanina aminotransferasa de arroz
No publicado
PRO0147, inhibidor de tripsina ITR1 (cebada)
No publicado
PRO0151, WSI18 de arroz
WO 2004/070039
PRO0175, RAB21 de arroz
WO 2004/070039
PRO005
WO 2004/070039
PRO0095
WO 2004/070039
-amilasa (Amy32b)
Lanahan y col, Plant Cell 4: 203-211, 1992; Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991
gen similar a la  catepsina
Cejudo y col, Plant Mol Biol 20: 849-856, 1992
Ltp2 de cebada
Kalla y col., Plant J. 6: 849-60, 1994
Chi26
Leah y col., Plant J. 4: 579-89, 1994
B-Perú de maíz
Selinger y col., Genetics 149; 1125-38, 1998
Tabla 2d: ejemplos de promotores específicos de endospermo
Fuente del gen
Referencia
glutelina (arroz)
Takaiwa y col. (1986) Mol Gen Genet 208:15-22; Takaiwa y col. (1987) FEBS Letts. 221:43-47
zeína
Matzke y col., (1990) Plant Mol Biol 14(3): 323-32
gluteína-1 de BPM y APM de trigo
Colot y col. (1989) Mol Gen Genet 216:81-90, Anderson y col. (1989) NAR 17:461-2
SPA de trigo
Albani y col. (1997) Plant Cell 9:171-184
gliadinas de trigo
Rafalski y col. (1984) EMBO 3:1409-15
promotor Itr1 de cebada
Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8
hordeína B1, C, D de cebada
Cho y col. (1999) Theor Appl Genet 98:1253-62; Muller y col. (1993) Plant J 4:343-55; Sorenson y col. (1996) Mol Gen Genet 250:750-60
DOF de cebada
Mena y col, (1998) Plant J 116(1): 53-62
blz2
Onate y col. (1999) J Biol Chem 274(14):9175-82
promotor sintético
Vicente-Carbajosa y col. (1998) Plant J 13:629-640
prolamina NRP33 de arroz
Wu y col, (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889
globulina Glb-1 de arroz
Wu y col. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889
globulina REB/OHP-1 de arroz
Nakase y col. (1997) Plant Molec Biol 33: 513-522
ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz
Russell y col. (1997) Trans Res 6:157-68
familia del gen ESR de maíz
Opsahl-Ferstad y col. (1997) Plant J 12: 235-46
(continuación)
Fuente del gen
Referencia
Kafirina de sorgo
DeRose y col. (1996) Plant Mol Biol 32: 1029-35
Tabla 2e: ejemplos de promotores específicos de embrión:
Fuente del gen
Referencia
OSH1 de arroz
Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996
KNOX
Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999
PRO0151
WO 2004/070039
PRO0175
WO 2004/070039
PRO005
WO 2004/070039
PRO0095
WO 2004/070039
Tabla 2f: ejemplos de promotores específicos de aleurona:
Fuente del gen
Referencia
-amilasa (Amy32b)
Lanahan y col, Plant Cell 4:203-211, 1992; Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991
gen similar a  catepsina
Cejudo y col, Plant Mol Biol 20:849-856, 1992
Ltp2 de cebada
Kalla y col., Plant J. 6:849-60, 1994
Chi26
Leah y col., Plant J. 4:579-89, 1994
B-Perú de maíz
Selinger y col., Genetics 149;1125-38,1998
Un promotor específico de tejido verde como se define en el presente documento es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido verde, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta.
Los ejemplos de promotores específicos de tejido verde que pueden usarse para realizar los procedimientos de la invención se muestran en la Tabla 2g.
Tabla 2g: ejemplo de promotores específicos de tejido verde
Gen
Expresión Referencia
Ortofosfato diquinasa de maíz
Específica de hoja Fukavama y col., 2001
Fosfoenolpiruvato carboxilasa de maíz
Específica de hoja Kausch y col., 2001
Fosfoenolpiruvato carboxilasa de arroz
Específica de hoja Liu y col., 2003
Pequeña subunidad de Rubisco de arroz
Específica de hoja Nomura y col., 2000
beta expansina EXBP9 de arroz
Específica de brote WO 2004/070039
pequeña subunidad de Rubisco de frijol de palo
Específica de hoja Panguluri y col., 2005
RBCS3A de guisante
Específica de hoja
Otro ejemplo de un promotor específico de tejido es un promotor específico de meristemo, que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido meristemático, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. Los ejemplos de promotores específicos de meristemo verde que pueden usarse para realizar los procedimientos de la invención se muestran en la siguiente Tabla 2h.
Tabla 2h: ejemplos de promotores específicos de meristemo
Fuente del gen
Patrón de expresión Referencia
OSH1 de arroz
Meristemo apical de brote, desde la fase globular embrionaria a la fase de plántula Sato y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122
Metalotioneína de arroz
Específico de meristemo BAD87835.1
WAK1 y WAK 2
Meristemos apicales de brote y raíz y en hojas y sépalos en expansión Wagner y Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303-318
Terminador
El término “terminador” incluye una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señaliza el procesamiento y la poliadenilación en dirección 3’ de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede proceder del gen natural, de una variedad de otros genes de planta, o de ADN T. El terminador a añadir puede proceder, por ejemplo, de genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o como alternativa, de otro gen de planta, o menos preferentemente, de cualquier otro gen eucariota.
Modulación
El término “modulación” significa en relación a la expresión o expresión de un gen, un proceso en el que en el nivel de expresión se cambia mediante dicho gen de expresión en comparación con la planta de control, el nivel de expresión puede aumentarse o disminuirse. La expresión original, no modulada, puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con traducción posterior. La expresión “modulación de la actividad” significará cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención o proteínas codificadas, que conduce a un rendimiento aumentado y/o a un crecimiento aumentado de las plantas.
Expresión
El término “expresión” o “expresión génica” significa la transcripción de un gen específico o genes específicos o construcción genética específica. El término “expresión” o “expresión génica” significa en particular la transcripción de un gen o genes o construcción genética en ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin traducción posterior del último en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y el procesamiento del producto de ARNm resultante.
Expresión aumentada/sobreexpresión
La frase “expresión aumentada” o “sobreexpresión” como se usa en el presente documento, significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión original de tipo silvestre.
En la técnica se documentan bien procedimiento para aumentar la expresión de genes o productos génicos e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión conducida por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como promotores o elementos potenciadores pueden introducirse en una posición apropiada (típicamente cadena arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para regular positivamente la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, pueden alterarse promotores endógenos in vivo por mutación, deleción y/o sustitución (véase, Kmiec, US 5.565.350; Zarling y col., WO9322443) o pueden introducirse promotores aislados en una célula de planta en la orientación y distancia apropiada de un gen de la presente invención para controlar la expresión del gen.
Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región codificante polinucleotídica. La región de poliadenilación puede proceder del gen natural, de una diversidad de otros genes de planta, o de ADN T. La secuencia de extremo 3’ a añadir pude proceder, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o como alternativa de otro gen de planta, o menos preferentemente de cualquier otro gen eucariota.
También puede añadirse una secuencia intrónica a la región no traducida (UTR, untranslated region) 5’ ola secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se
acumula en el citosol. Se ha observado que la inclusión de un intrón de corte y empalme en la unidad de transcripción en construcciones de expresión tanto de plantas como de animales aumenta la expresión génica tanto a nivel de proteína como de ARNm hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405; Callis y col. (1987) Genes Dev 1: 1183-1200). Dicha potenciación intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se pone cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. En la técnica se conoce el uso de los intrones de maíz, el intrón Adh1-S, 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Para una información general véase: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N. Y. (1994).
Gen endógeno
En el presente documento la referencia a un gen “endógeno”, no solo se refiere al gen en cuestión como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin existir ninguna intervención humana), sino también se refiere a aquel mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada posteriormente (re)introducida en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene dicho transgén puede encontrar una reducción sustancial de la expresión transgénica y/o reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado puede aislarse de un organismo o puede fabricarlo el hombre, por ejemplo, mediante síntesis química.
Expresión disminuida
En el presente documento la referencia a “expresión disminuida” o “reducción o eliminación sustancial” de expresión significa una disminución en la expresión del gen endógeno y/o los niveles de polipéptido y/o actividad de polipéptido con respecto a las plantas de control. La reducción o eliminación sustancial está en orden creciente de preferencia al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más reducido en comparación con el de las plantas de control.
Para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos. Para realizar el silenciamiento génico, éste puede ser tan pequeño como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, como alternativa éste puede ser tanto como el gen completo (incluyendo la UTR 5’ y/o 3’, ya sea en parte o en su totalidad). El tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos puede proceder del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen diana), o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo y homólogo de la proteína de interés. Preferentemente, el tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrógeno con el gen diana (cadena en sentido o antisentido), más preferentemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 100 % con el gen diana (cadena en sentido o antisentido). Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito para los diversos procedimientos analizados en el presente documento para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de gen endógeno.
Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión puede realizarse usando herramientas y técnicas rutinarias. Un procedimiento preferido para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno es introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo y homólogo de cualquiera de las proteínas de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o completamente), separado por un espaciador (ADN no codificante).
En dicho procedimiento preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o elimina sustancialmente a través de silenciamiento mediado por ARN usando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte del mismo (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), preferentemente capaz de formar una estructura en horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias de control. Una secuencia de ácidos nucleicos de ADN no codificante (un espaciador, por ejemplo un fragmento de la región de unión de matriz (MAR, Matrix Attachment Region Fragment), un intrón, un poliengarce, etc.) se localiza entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura auto-complementaria (parcial
o completa). Esta estructura de ARN bicatenario se denomina ARN en horquilla (ARNh) El ARNh se procesa en la planta en los ARNip que se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El RISC escinde adicionalmente los transcriptos de ARNm, por lo cual se reduce sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en los polipéptidos. Para detalles adicionales generales véase, por ejemplo, Grierson y col. (1998) WO 98/53083; Waterhouse y col. (1999) WO 99/53050).
La realización de los procedimientos de la invención no se basa en introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que se clona el ácido nucleico como una repetición invertida, sino que pueden utilizarse cualquiera de uno o más de los diversos procedimientos de “silenciamiento génico” bien conocidos para conseguir los mismos efectos.
Un procedimiento de este tipo para la reducción de la expresión del gen endógeno es el silenciamiento mediado por ARN de la expresión génica (regulación negativa). En este caso, el silenciamiento se activa en una planta mediante una secuencia de ARN bicatenario (ARNbc) que es sustancialmente similar al gen endógeno diana. Este ARNbc se procesa adicionalmente por la planta de aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos denominado ARN de interferencia pequeño (ARNip). Los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que escinde el transcripto de ARNm del gen endógeno diana, reduciendo por tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que se traducen en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde a un gen diana.
Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de las mismas (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en una orientación en sentido en una planta. “Orientación en sentido” se refiere a una secuencia de ADN que es homóloga a un transcripto de ARNm de la misma. Por lo tanto, en una planta se introduciría al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos adicional reducirá la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como co-supresión. La reducción de la expresión del gen sería más pronunciada si en una planta se introdujesen varias copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos, cuando hay una correlación positiva entre altos niveles de transcripto y la activación de co-supresión.
Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica el uso de secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de “ácidos nucleicos “antisentido” comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos “en sentido” que codifica una proteína, es decir complementaria a la cadena que codifica una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de transcripto de ARNm. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido es preferentemente complementaria a gen endógeno a silenciar. La complementariedad puede localizarse en la “región codificante” y/o en la “región no codificante” de un gen. La expresión “región codificante” se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en restos de aminoácidos. La expresión “región no codificante” se refiere a las secuencias 5’ y 3’ que flanquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominadas regiones no traducidas 5’ y 3’).
Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden diseñarse de acuerdo con las normas de emparejamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede ser complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos completa (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), pero también puede ser un oligonucleótido que sea antisentido para solo una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (incluyendo la UTR 5’ y 3’ del ARNm). Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos antisentido puede ser complementaria a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción de un transcripto de ARNm que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos antisentido adecuada se conoce en la técnica y puede comenzar desde aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácidos nucleicos antisentido de acuerdo con la invención puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o varios nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. En la técnica se conocen bien ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Las modificaciones de nucleótido conocidas incluyen metilación, ciclación y ‘protecciones’ y sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. En la técnica se conocen bien otras modificaciones de nucleótidos.
La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado una secuencia de ácidos nucleicos en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés). Preferentemente, la producción de las secuencias de ácidos nucleicos antisentido en plantas se produce mediante una construcción de ácido nucleico establemente integrada que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido unido operativamente y un terminador.
Las moléculas de ácido nucleico usadas para el silenciamiento en los procedimientos de la aplicación (tanto si se introducen en una planta como si se generan in situ) se hibridan con, o se unen a, los transcriptos de ARNm y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, al inhibir la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la hélice doble. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden introducirse en una planta por transformación o inyección directa en un sitio de tejido específico. Como alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse para dirigir las células seleccionadas y después administrarse por vía sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse de tal manera que se unan específicamente a
receptores o a antígenos expresados en una superficie de la célula seleccionada, por ejemplo, ligando la secuencia de ácidos nucleicos antisentido a los péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores o antígenos de la superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también pueden administrarse a las células usando los vectores descritos en el presente documento.
De acuerdo con un aspecto adicional, la secuencia de ácidos nucleicos antisentido es una secuencia de ácidos nucleicos α-anomérica. Una secuencia de ácidos nucleicos α-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con ARN de complementariedad en el que, contrario a las unidades β normales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier y col. (1987) Nucl Ac Res 15: 6625-6641). La secuencia de ácidos nucleicos antisentido también pueden comprender un 2’-o-metilrribonucleótido (Inoue y col. (1987) Nucl Ac Res 15, 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y col. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).
La reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno también puede realizarse usando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que pueden escindir una secuencia de ácidos nucleicos monocatenaria, tal como ARNm, con el que tienen una región complementaria. Por tanto, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585591) pueden usarse para escindir catalíticamente los transcriptos de ARNm que codifican un polipéptido, reduciendo por tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en un polipéptido. Puede diseñarse una ribozima que tenga especificidad por una secuencia de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo: Cech y col. Patentes de Estados Unidos Nº 4.987.071; y Cech y col. Patente de Estados Unidos Nº 5.116.742). Como alternativa, pueden usarse transcriptos de ARNm correspondientes a una secuencia de ácidos nucleicos para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad de ribonucleasa específica de un conjunto de moléculas de ARN (Bartel y Szostak (1993) Science 261, 1411-1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas es conocido en la técnica (por ejemplo Atkins y col. (1994) documento WO 94/00012; Lenne y col. (1995) documento WO 95/03404; Lutziger y col. (2000) documento WO 00/00619; Prinsen y col. (1997) documento WO 97/13865 y Scott y col. (1997) documento WO 97/38116).
El silenciamiento génico también puede producirse por mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de ADN T o inserción de transposón) o mediante estrategias como las descritas, entre otros, por Angell y Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS documento WO 98/36083), o Baulcombe (documento WO 99/15682).
El silenciamiento génico también puede producirse si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un gen aislado/ácido nucleico posteriormente introducido en una planta. La reducción de eliminación sustancial puede estar provocada por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, el polipéptido puede unirse a diversas proteínas que interaccionan; por lo tanto pueden proporcionarse una o más mutaciones y/o truncamientos para un polipéptido que sea aún capaz de unir las proteínas que interaccionan (tal como proteínas receptoras) pero que no pueden mostrar su función normal (tal como ligando de señalización).
Una estrategia adicional para silenciamiento génico es dirigir la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples que impiden la transcripción del gen en células diana. Véase Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene y col., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y Maher, L. J. Bioassays 14, 807-15, 1992.
Otros procedimientos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos contra un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la que está implicado un polipéptido, serán muy conocidos por el experto. En particular, puede esperarse que las moléculas fabricadas por el hombre puedan ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido diana o para interferir con la ruta de señalización en la que está implicado el polipéptido diana.
Como alternativa, puede establecerse un programa de exploración para identificar en una población de plantas las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican los polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también pueden usarse, por ejemplo, para realizar recombinación homóloga.
Pueden usarse microARN (miARN) artificiales y/o naturales para desactivar la expresión génica y/o traducción del ARNm. Los miARN endógenos son ARN pequeños monocatenarios típicamente con una longitud de 19-24 nucleótidos. Actúan principalmente regulando la expresión génica y/o la traducción de ARNm. La mayoría de los microARN (miARN) de planta tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana. Sin embargo, hay dianas naturales con hasta cinco emparejamientos erróneos. Se procesan a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras de plegamiento características mediante RNasas específicas bicatenarias de la familia Dicer. Después del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, RNA-induced silencing complex) uniéndose a su componente principal, una proteína Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad del RISC, debido al emparejamiento con bases de ácidos nucleicos diana, principalmente ARNm, en el citoplasma. Los acontecimientos reguladores posteriores incluyen la escisión de ARNm diana y la destrucción y/o inhibición traduccional. Por tanto, los efectos de la sobreexpresión de miARN a menudo reflejan en niveles de ARNm disminuidos de los genes diana.
Los microARN artificiales (amiARN), que tienen típicamente 21 nucleótidos de longitud, pueden modificarse por ingeniería genética específicamente para regular negativamente la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. En la técnica se conocen bien los determinantes de la selección diana de microARN de planta. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento diana y pueden usarse para ayudar a diseñar los amiARN específicos, (Schwab y col., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Herramientas convenientes para el diseño y generación de los amiARN y sus precursores también están disponibles para el público (Schwab y col., Plant Cell 18, 1121-1133, 2006).
Para un rendimiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico usadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferentemente, una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie de planta determinada se introduce dentro de esta misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito absoluto que la secuencia de ácidos nucleicos que se introduce se origine de la misma especie de planta como la planta en la que se introducirá. Basta con que haya una homología sustancial entre el gen diana endógeno y el ácido nucleico a introducir.
Anteriormente se han descrito ejemplos de diversos procedimientos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en la técnica podrá adaptar fácilmente los procedimientos anteriormente mencionados para el silenciamiento para conseguir la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta completa o en partes de la misma usando un promotor apropiado, por ejemplo.
Marcador de selección (gen)/Gen indicador
Un “marcador de selección”, “gen marcador de selección” o “gen indicador” incluye cualquier gen que confiere un fenotipo a una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o transforman con una construcción de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia satisfactoria de las moléculas de ácido nucleico mediante una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse de marcadores que confieren resistencia a antibióticos
o a herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten selección visual. Los ejemplos de genes marcadores de selección incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptll que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporciona resistencia contra glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite a las plantas usar manosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo -glucuronidasa, GUS o -galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X Gal), luminiscencia (tal como el sistema luciferina/luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP y derivados de los mismos). Esta lista solo representa una pequeña cantidad de marcadores posibles. El experto está familiarizado con dichos marcadores. Se prefieren diferentes marcadores dependiendo del organismo y del procedimiento de selección.
Se sabe que, después de la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en células de plantas, solo una minoría de las células capta el ADN exógeno y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión usado y de la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, normalmente se introduce un gen que codifica un marcador de selección (tal como los descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, deleción por procedimientos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador de selección pueden introducirse en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usarse en los procedimientos de la invención, o incluso en un vector distinto. Las células que se han transfectado de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, por selección (por ejemplo, células que tienen integrado el marcador de selección sobreviven mientras que las otras mueren).
Dado que los genes marcadores, particularmente genes para resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no se requieren o no se desean en la célula huésped transgénica una vez que se han introducido satisfactoriamente los ácidos nucleicos, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos emplea ventajosamente técnicas que permiten la retirada o escisión de estos genes marcadores. Un procedimiento de este tipo es lo que se conoce como co-transformación. El procedimiento de co-transformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, un vector que lleva el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo que lleva el gen (o genes) marcador. Una proporción grande de transformantes recibe o, en el caso de plantas, comprende (hasta el 40 % o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de transformación con Agrobacteria, los transformantes normalmente solo reciben una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el ADN-T, que normalmente representa el casete de expresión. Posteriormente los genes marcadores pueden retirarse de la planta transformada realizando cruzamientos. En otro procedimiento, se usan genes marcadores
integrados en un transposón para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, de manera transitoria o estable. En algunos casos (aprox. 10 %), el transposón salta del genoma de la célula huésped una vez que se ha producido la transformación satisfactoriamente y se pierde. En una serie de casos adicionales, el trasposón salta a una localización diferente. En estos casos, el gen marcador debe eliminarse realizando cruzamientos. En microbiología, se desarrollan técnicas que hacen posible, o facilitan, la detección de dichos acontecimientos. Un procedimiento ventajoso adicional se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación; cuya ventaja es que la eliminación puede dispensarse por cruzamiento. El sistema mejor conocido de este tipo es lo que se conoce como sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que retira las secuencias localizadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, éste se elimina una vez se haya producido la transformación satisfactoriamente, por expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble y col., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan y col., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). De acuerdo con la invención, es posible una integración específica de sitio en el genoma de la planta de la secuencia de ácidos nucleicos. Naturalmente, estos procedimientos también pueden aplicarse a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.
Transgénico/Transgén/Recombinante
Para los fines de la invención, “transgénico”, “transgén” o “recombinante” significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos, un casete de expresión, una construcción génica o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con las secuencias de ácidos nucleicos, casetes o vectores de expresión de acuerdo con la invención, todas estas construcciones realizadas por procedimientos recombinantes en los que
(a)
las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas útiles en los procedimientos de la invención o
(b)
la secuencia (o secuencias) de control genético que se une operativamente con la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o
(c)
a) y b)
no se localizan en su ambiente genético natural o se han modificado por procedimientos recombinantes, siendo posible que se produzca la modificación de, por ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más restos de nucleótido. Se entiende que, ambiente genético natural, significa el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o la presencia en una genoteca. En el caso de una genoteca, el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos se conserva preferentemente, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácidos nucleicos al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferentemente al menos 500 pb, en especial preferentemente al menos 1000 pb, más preferentemente al menos 5000 pb. Un casete de expresión de origen natural -por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente que codifica un polipéptido útil en los procedimientos de la presente invención, como se ha definido anteriormente -llega a ser un casete de expresión transgénica cuando esta casete de expresión se modifica mediante procedimientos sintéticos no naturales (“artificiales”) tal como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Se describen procedimientos adecuados, por ejemplo, en los documentos US 5.565.350 o WO 00/15815.
Por tanto, una planta transgénica, para los fines de la invención, se entiende que significa, como se ha indicado anteriormente, que los ácidos nucleicos usados en el procedimiento de la invención no están en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de manera homóloga o heteróloga. Sin embargo, como se ha mencionado, transgénico también significa que, aunque los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o usados en el procedimiento de la invención están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Por transgénico se entiende preferentemente que significa la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un locus no natural en el genoma, es decir, se produce la expresión homólogo o, preferentemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. En el presente documento se mencionan las plantas transgénicas preferidas.
Transformación
El término “introducción” o “transformación” como se denomina en el presente documento, incluye la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento usado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal posterior, mediante organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con una construcción genética de la presente invención y a partir del mismo regenerarse una planta completa. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clonales disponibles para, y mejor adaptados a, la especie particular que se va a transformar. Las dianas tisulares ejemplares incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, brotes axilares y meristemos radiculares) e inducen tejido meristemático (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocotiledón). El polinucleótido puede introducirse de manera estable o transitoria en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo,
como un plásmido. Como alternativa, éste puede integrarse en el genoma huésped. La célula de la planta transformada resultante puede después usarse para regenerar una planta transformada de una manera conocida por los expertos en la técnica.
La transferencia de genes externos dentro del genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies plantas es actualmente una técnica muy habitual. Ventajosamente, cualquiera de los diversos procedimientos de trasformación puede usarse para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los procedimientos descritos para la transformación y regeneración de plantas de tejidos de plantas o células de plantas pueden utilizarse para la transformación transitoria o estable. Los procedimientos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, pistola de bombardeo de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Pueden seleccionarse procedimientos entre, el procedimiento de calcio/polietilenglicol para protoplastos (ica, F. A. y col., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I y col. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R. D. y col. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en el material de planta (Crossway A y col., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas revestido con ADN o ARN (Klein TM y col., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrantes) y similares. Las plantas transgénicas, incluyendo plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacterium. Un procedimiento de transformación ventajoso es la transformación en la planta. Para esta finalidad, es posible, por ejemplo, permitir que la agrobacterias actúen en las semillas de la planta o inocular las agrobacterias en el meristemo de la planta. Se ha demostrado de un modo particularmente conveniente, de acuerdo con la invención, permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe en la planta intacta o al menos en los primordios florales. Posteriormente la planta crece hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los procedimientos para la transformación de arroz mediada por Agrobacterium incluyen procedimientos bien conocidos para la transformación de arroz, tales como los descritos en cualquiera de las siguientes referencias bibliográficas: solicitud de patente Europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan y col. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei y col. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994). En el caso de la transformación de maíz, el procedimiento preferido es como se describe en Ishida y col. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o en Frame y col. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002). Dichos procedimientos se describen adicionalmente, a modo de ejemplo, en B. Jenes y col., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o la construcción a expresar se clona preferentemente en un vector, que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, pBin19 (Bevan y col., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas por dicho vector pueden después usarse de una manera conocida para la transformación de plantas, tales como plantas usadas como un modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana que se encuentra dentro del ámbito de la presente invención no se considera como una planta de cultivo) o plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo, sumergiendo hojas laceradas o picadas en una solución agrobacteriana y después cultivarlas en un medio adecuado. La transformación de plantas mediante Agrobacterium tumefaciens la describen, por ejemplo, Höfgen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, de F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 15-38.
Además de la transformación de células somáticas, que después deben regenerarse en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemos de planta y en particular aquellas células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. Por tanto, por ejemplo, semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y se obtienen semillas del desarrollo de plantas de las que se transforma una determinada proporción y por tanto transgénicas [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208: 274-289; Feldmann K (1992). In: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pp. 274-289]. Los procedimientos alternativos se basan en la retirada repetida de las inflorescencias e incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, por lo que las semillas transformadas pueden obtenerse de modo similar en un punto de tiempo final (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un procedimiento especialmente eficaz es el procedimiento de infiltración por vacío con sus modificaciones tal como el procedimiento de “inmersión floral”. En el caso de la infiltración por vacío de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], mientras que en el caso del procedimiento de “inmersión floral” el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con tensioactivo [Clough, SJ y Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. En ambos casos se recoge una determinada proporción de semillas transgénicas y estas semillas pueden diferenciarse de semillas no transgénicas al cultivar bajo las condiciones selectivas descritas anteriormente. Además, la transformación estable de los plástidos es ventajosa ya que estos se heredan por vía materna en la mayor parte de los cultivos reduciendo o eliminando el riesgo de flujo transgénico a través del polen. La transformación del genoma del cloroplasto generalmente se realiza mediante un proceso que han presentado esquemáticamente Klaus y col., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. En resumen, las secuencias a transforman se clonan junto con un gen marcador de selección entre las secuencias flanqueantes homólogas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueantes homólogas dirigen la integración específica de sitio en el plastoma. La transformación plastidial se ha descrito para muchas especies de plantas diferentes y se ofrece una
revisión en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Recientemente se han descrito progresos biotecnológicos adicionales, en forma de transformantes plastidiales sin marcador, que pueden producirse mediante un gen marcador co-integrado transitorio (Klaus y col., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).
El etiquetado en activación de ADN T (Hayashi y col. Science (1992) 1350-1353), implica la inserción de ADN T, que normalmente contiene un promotor (también puede ser un potenciador de traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb cadena arriba o cadena abajo de la región codificante de un gen en una configuración de tal manera que el promotor dirige la expresión del gen diana. Típicamente, la regulación de la expresión del gen diana mediante su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor nuevamente introducido. El promotor se incorpora típicamente en un ADN T. Este ADN T se inserta al azar el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección por Agrobacterium y conduce a expresión modificada de genes cerca al ADN T insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debidos a la expresión modificada de los genes cerca al promotor introducido.
TILLING
El término “TILLING” es la abreviatura de “Targeted Induced Local Lesions In Genomes” (Inducción Dirigida de Lesiones Locales en el Genoma) y se refiere a una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificada. El TILLING también permite la selección de plantas que llevan dichas variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden presentar expresión modificada, en fuerza o en localización o en tiempo (si las mutaciones afectan, por ejemplo, al promotor). Estas variantes mutantes pueden presentar mayor actividad que la mostrada por el gen en su forma natural. El TILLING combina mutagénesis de alta densidad con procedimientos de detección de alto rendimiento. Las etapas seguidas típicamente en el TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP y Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, páginas 16-82; Feldmann y col., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 137-172; Lightner J y Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, páginas 91-104); (b) preparación y agrupamiento de ADN en individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heteroduplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heteroduplex en un grupo se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del mutante individual; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. Los procedimientos de TILLING son bien conocidos en la técnica (McCallum y col., (2000) Nat Biotechnol 18: 455457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).
Recombinación homóloga
La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición definida seleccionada. La recombinación homóloga es una tecnología convencional utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levaduras o el musgo Physcomitrella. Se han descrito procedimientos para realizar recombinación homóloga en plantas no solo para el modelo de plantas (Offringa y col. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo, arroz (Terada y col. (2002) Nat Biotech 20(10): 1030-4; lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8), y existen estrategias que son generalmente aplicables independientemente del organismo diana (Miller y col, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).
Rendimiento
El término “rendimiento” en general significa un producto medible de valor económico, típicamente relacionado con un cultivo, un área y un periodo de tiempo específicos. Las partes de planta individuales contribuyen directamente al rendimiento en base a su número, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado de un cultivo y año, que se determina dividiendo la producción total (incluyendo la producción tanto cosechada como valorada) por metro cuadrado plantado. El término “rendimiento” de una planta puede estar relacionado con biomasa vegetativa (biomasa de raíz y/o brote), con órganos reproductores y/o con propágulos (tal como semillas) de esta planta.
Vigor temprano
“Vigor temprano” se refiere a un crecimiento bien equilibrado saludable activo especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y puede ser el resultado del aumento de la eficacia biológica de la planta debido a, por ejemplo, plantas que están mejor adaptadas a su ambiente (es decir, optimizando el uso de fuentes de energía y repartiendo entre brotes y raíces). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran supervivencia aumentada de plántula y un mejor establecimiento del cultivo, que a menudo produce campos muy uniformes (creciendo el cultivo de una manera uniforme, es decir, alcanzando la mayoría de las plantas las diversas etapas de desarrollo a sustancialmente el mismo tiempo) y a menudo mejor y mayor rendimiento. Por lo tanto, el vigor temprano puede determinarse midiendo diversos factores, tales como, peso de mil granos, porcentaje de
germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de plántula, altura de plántula, longitud de raíz, biomasa de brote y raíz y muchos más.
Aumento/Mejora/Potenciación
Los términos “aumento”, “mejora” o “potenciación” son intercambiables y significan en el sentido de la solicitud al menos 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, preferentemente al menos 15 % o 20 %, más preferentemente 25 %, 30 %, 35 % o 40 % más rendimiento y/o crecimiento en comparación con plantas de control como se define en el presente documento.
Rendimiento de semilla
El rendimiento de semilla aumentado puede manifestarse por sí mismo como uno o más de los siguientes: a) un aumento en biomasa de semilla (peso total de semilla) que puede establecerse sobre una semilla individual y/o por planta y/o por metro cuadrado; b) número de flores por planta aumentado; c) número de semillas (llenas) aumentado; d) tasa de llenado de semilla aumentado (que se expresa como la proporción entre el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas); e) índice de cosecha aumentado, que se expresa como una proporción del rendimiento de partes cosechables, tales como semillas, dividido entre la biomasa total, y f) peso de mil granos (PMG) aumentado, que se extrapola a partir del número de semillas llenas contadas y su peso total. Un PMG aumentado puede ser el resultado de un tamaño y/o peso de semilla aumentado y también puede ser el resultado de un aumento en el tamaño del embrión y/o endospermo.
También puede manifestarse un aumento en el rendimiento de la semilla como un aumento del tamaño de la semilla y/o volumen de la semilla. Además, también puede manifestarse un aumento en el rendimiento de la semilla en sí mismo como un aumento en el área de semilla y/o longitud de semilla y/o anchura de semilla y/o un perímetro de semilla. El rendimiento aumentado puede ser también el resultado de arquitectura modificada, o puede ocurrir debido a la arquitectura modificada.
Índice de verdor
El “índice de verdor” como se usa en el presente documento se calcula a partir de imágenes digitales de plantas. Para cada píxel que pertenece al objeto de la planta sobre la imagen, se calcula la proporción del valor verde frente al valor rojo (en el modelo RGB por el que se codifica el color). El índice de verdor se expresa como el porcentaje de píxeles por el que la proporción con verde con respecto a rojo supera un umbral determinado. En condiciones de crecimiento normales, en condiciones de crecimiento de estrés salino y en condiciones de crecimiento de disponibilidad de nutrientes reducido, el índice de verdor de las plantas se mide en la última imagen antes de la floración. Por otro lado, en condiciones de crecimiento de estrés por Sequía, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera imagen después de la Sequía.
Planta
El término “planta” como se usa en el presente documento incluye plantas completas, antecesores y progenie de las plantas y partes de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores y tejidos y órganos, donde cada uno de los elementos anteriormente mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término “planta” también incluye células de planta, cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, de nuevo donde cada uno de los elementos mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés.
Las plantas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje
o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp.,
Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otras.
Descripción detallada de la invención
Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que aumentando en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC se obtienen plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento con respecto a plantas de control. De acuerdo con una primera realización, la presente invención proporciona un procedimiento para potenciar en plantas rasgos relacionados con el rendimiento con respecto a plantas de control, que comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC.
Un procedimiento preferido para aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC es introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC.
En lo sucesivo, en el presente documento, cualquier referencia a una “proteína útil en los procedimientos de la invención” se considera que significa un polipéptido JMJC como se define en el presente documento. En lo sucesivo, en el presente documento, cualquier referencia a un “ácido nucleico útil en los procedimientos de la invención” se considera que significa un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido JMJC. El ácido nucleico a introducir en una planta (y por lo tanto útil en la realización de los procedimientos de la invención) es cualquier ácido nucleico que codifique el tipo de proteína que se describirá ahora, denominado también en el presente documento “ácido nucleico de JMJC” o “gen de JMJC”.
Como se define en el presente documento, un polipéptido JMJC se refiere a un polipéptido que comprende un dominio JmjC representado por una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 60% o más con:
(i)
SEC ID Nº: 6; y/o
(ii)
uno o más de los dominios JmjC comprendidos en los polipéptidos JMJC representados por SEC ID Nº: 12; SEC ID Nº: 14; SEC ID Nº: 24; SEC ID Nº: 26; SEC ID Nº: 32; SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36; SEC ID Nº: 38; SEC ID Nº: 40; SEC ID Nº: 42; SEC ID Nº: 44; SEC ID Nº: 46; SEC ID Nº: 48; SEC ID Nº: 50; SEC ID Nº: 52; SEC ID Nº: 56; SEC ID Nº: 58; SEC ID Nº: 60; y SEC ID Nº: 62, cuyas coordenadas de aminoácidos se proporcionan en la Tabla A4; y
(iii) en el que dichos polipéptidos JMJC comprenden un motivo que tiene una identidad de secuencia de al menos 60 % o más con una cualquiera o más de:
(a)
SEC ID Nº: 7,
(b)
SEC ID Nº: 8,
(c)
SEC ID Nº: 9,
(d)
SEC ID Nº: 10.
El dominio JmjC es una Secuencia conservada encontrada en proteínas de organismos procariotas y eucariotas. Los dominios JmjC tienen una longitud promedio de 111 aminoácidos.Típicamente, la longitud de un dominio JmjC puede variar entre 25 a 200 áminoácidos aunque pueden ser posibles versiones más cortas y más largas. Se espera que los dominios JmjC sean metaloenzimas que adoptan el plegamiento de las cupinas y son candidatos para enzimas que regulan la remodelación de la cromatina (Clissold et al. Trends Biochem Sci. Enero de 2001;26(1):7-9).
Los polipéptidos JMJC pueden encontrarse en bases de datos especializadas tales como Pfam, (Finn y col. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34: D247-D251). Pfam compila un gran conjunto de alineamientos de secuencias múltiples y modelos ocultos de Markov (HMD, Hidden Markov Models) que abarca muchos dominios de proteínas y familias comunes y se encuentra disponible en el Instituto Sanger en Reino Unido.
El umbral límite de entrada del dominio JMJC en el modelo Pfam HMM_fs es de 16,0 y de -8,0 en el modelo HMM_ls es de 25,0. Las coincidencias de confianza como se considera en la base de datos Pfam son aquellas secuencias de puntuación más alta que la del umbral límite de entrada. Sin embargo, las posibles coincidencias, que comprenden dominios JMJC verdaderos, pueden incluso caer en el límite de entrada. Preferentemente, un polipéptido JMJC es una proteína que tiene uno o más dominios en su secuencia que superan el límite de entrada de la familia del
dominio de proteínas Pfam PF02373, jumonji, jmjC.
Como alternativa, un dominio JmjC en un polipéptido puede identificarse realizando una comparación de secuencias con polipéptidos conocidos que comprenden un dominio JmjC y establecer la similitud en la región del dominio JmjC. Las secuencias pueden alinearse usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica tales como los algoritmos Blast. La probabilidad de que se produzca el alineamiento con una secuencia determinada se considera como base para identificar polipéptidos similares. Un parámetro que típicamente se usa para representar dicha probabilidad en comparaciones por pares se denomina valor e. El valor e describe cuanta frecuencia se espera que se produzca al azar una puntuación. El límite del valor e puede ser tan alto como 1,0. Típicamente las alineaciones con mayor probabilidad que se producen tienen un valor e menor de 0,1, 0,01, 0,001, 1.e-05, 1.e-10, 1.e-15, 1.e-20, 1.e-25, 1.e-50, 1.e-75, 1.e-100 y 1.e-200. Preferentemente los polipéptidos JMJC de la invención comprenden una secuencia que tiene, en orden creciente de preferencia, un valor e inferior a 0,1, 0,01, 0,001, 1.e05, 1.e-10, 1.e-15, 1.e-20, 1.e-25, 1.e-50, 1.e-75, 1.e-100 e 1.e-200 para un alineamiento con el dominio encontrado en un polipéptido JMJC conocido.
En la Tabla A1 se proporcionan ejemplos de polipéptidos JMJC.En la Tabla A4 se dan las coordenadas de los aminoácidos de los dominios JmjC como se presentan en los polipéptidos JMJC representativos de origen dicotiledóneo. Un ejemplo de dominio JmjC se da en la SEC ID Nº: 6
La identidad de secuencia entre dominios JmjC es típicamente baja, en promedio del 23 % y puede ser tan solo del 10 %. Los polipéptidos JMJC preferidos de la invención son los que tienen, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o más con la SEC ID Nº: 6 o con cualquiera de los dominios JmjC comprendidos en los polipéptidos JMJC representados por la SEC ID Nº: 12; SEC ID Nº: 14; SEC ID Nº: 24; SEC ID Nº: 26; SEC ID Nº: 32; SEC ID Nº: 36; SEC ID Nº: 38; SEC ID Nº: 112; SEC ID Nº: 42; SEC ID Nº: 44; SEC ID Nº: 46; SEC ID Nº: 48; SEC ID Nº: 50; SEC ID Nº: 52; SEC ID Nº: 56; SEC ID Nº: 58; SEC ID Nº: 60; y SEC ID Nº: 62, cuyas coordenadas de aminoácidos se dan en la Tabla A4.
Además del dominio JmjC, los polipéptidos JMJC pueden comprender opcionalmente otros motivos de secuencias altamente conservadas, tales como las representadas en la SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, que se encuentran en la SEC ID Nº: 2. Además, los polipéptidos de la invención pueden comprender una secuencia conservada encontrada en oxigenasas que se han implicado en la coordinación de cationes de hierro, representada en este documento por HXD(V) o EXnH (SEC ID Nº: 10), en la que "X" representa cualquier aminoácido y "n" representa el número de X restos que varía entre 1-5, ambos incluidos.
Un polipéptido JMJC de la invención se refiere a cualquier polipéptido que comprenda un dominio JmjC y que tenga, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más con una cualquiera o más de los motivos de secuencias conservadas representadas por la SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9 ySEC ID Nº: 10.
Se han descrito pruebas de intercambio de dominios en la familia de proteínas JUMONJI, (Balciunas and Ronne. Trends Biochem Sci 2000;25:274-276). Por consiguiente, además del dominio JmjC, los polipéptidos JMJC contienen típicamente uno o más tipos diferentes de otros dominios conservados conocidos. Importantes para los polipéptidos de la invención son los polipéptidos JMJC que además del dominio JmjC comprenden otros dominios conservados, que están presumiblemente implicados en actividades de unión y transcripción del ADN tales como dedos de zinc y/o en interacción de proteínas y renovación de proteínas, tales como los dominios de la caja F y de tipo dedo de zinz RING.
Por lo tanto, el polipéptido JMJC útil en los procedimientos de la invención comprenden un JmjC y opcionalmente uno o más de los siguientes dominios conservados: JmJN (número de acceso pfam PF02375); dedo de zinc C5HC2 (número de acceso pfam: PF02928), dominio rico en FY, N terminal (número de acceso InterPro: IPR003888) y dominio rico en FY, C terminal (número de acceso InterPro: IPR003889), un dedo de zinc de tipo FYVE/PHD-Zn (número de acceso InterPro: IPR011011), un dedo de zinc de tipo C2H2 (número de acceso pfam: PF00096), un dedo de zinc de tipo RING (zf-C3HC4) (número de acceso pfam PF00097) y un dominio de caja F (número de acceso pfam: PF00646).
El polipéptido JMJC de la invención comprende una secuencia que tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia del 60 %, 70 %, 75 %, 60 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 98 % o más con la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 32, SEC ID Nº: 50, SEC ID Nº: 62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 68, SEC ID Nº: 70 and SEC ID Nº: 76.
Preferentemente, cuando la secuencia polipéptidica que se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con el grupo de polipéptidos JMJC (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235(9): 2449-59) comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 más que con cualquier otro grupo.
Los términos “dominio” y “motivo” se definen en la sección de “Definiciones” del presente documento. Existen bases de datos especializadas para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic y col. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244, InterPro (Mulder y col., (2003)
Nucl. Acids. Res. 31, 315-318, Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular SECuences motifs and its function in automatic SECuence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., páginas 53-61, AAAl Press, Menlo Park; Hulo y col., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004), o Pfam (Bateman y col., Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002). En el servidor de proteomics ExPASy (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger y col., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788(2003)) se encuentra disponible un conjunto de herramientas para realizar análisis informatizados de secuencias de proteínas. Los dominios también pueden identificarse usando técnicas rutinarias, tales como mediante alineamiento de secuencias.
Los procedimientos para el alineamiento de las secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica, dichos procedimientos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar el alineamiento global (es decir el tramo de las secuencias completas) de dos secuencias que maximizan el número de emparejamientos y minimiza el número de espacios. El algoritmo BLAST (Altschul y col. (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El programa informático para realizar el análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Los homólogos pueden identificarse fácilmente usando, por ejemplo, el algoritmo de alineamiento de secuencia múltiple ClustalW (versión 1,83), con los parámetros de alineamiento por pares predeterminados y un procedimiento de clasificación en porcentaje. Los porcentajes globales de similitud e identidad también pueden determinarse utilizando uno de los procedimientos disponibles en el paquete informático MatGAT (Campanella y col., BMC Bioinformatics. Jul 2003 10; 4: 29. MatGAT: una aplicación que genera matrices de similitud/identidad utilizando secuencias de ADN
o proteína). Puede realizarse una edición manual menor para optimizar el alineamiento entre los motivos conservados, como sería obvio para un experto en la técnica. Adicionalmente, en lugar de usar secuencias de longitud completa para la identificación de homólogos, también pueden usarse dominios específicos. Los valores de identidad de secuencia pueden determinarse sobre toda la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos o sobre los dominios seleccionados o uno o más motivos conservados, usando los programas mencionados anteriormente usando los parámetros predeterminados.
Adicionalmente, los polipéptidos JMJC pueden tener típicamente actividad de proteín hidroxilasas, en particular actividad de péptido-aspartato-beta-dioxigenasa (PABD) (EC 1.14.11.16). La reacción catalizada es: péptido Laspartado + 2-oxoglutarato + O(2) <=> péptido 3-hidroxi-L-aspartato + sucinato + CO(2). Los cofactores en la reacción son hierro y 2-Oxoglutarato. Las herramientas y técnicas para medir la actividad PABD son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Lavaissiere et al. J Clin Invest. 1996;98(6):1313-23; Linke et al. J Biol Chem. 2004;279(14):14391-7; Lee, et al. J. Biol. Chem. 278:7558-7563; 2003; Lando et al. Genes Dev. 16:1466-1471; 2002). Las oxigenasas dependientes de hierro (II)/2-oxoglutarato (2-OG) catalizan reacciones oxidativas en diversas reacciones metabólicas. Recientemente se ha propuesto que los polipéptidos JMJC también puedan tener actividad de histona desmetilasa (Trewick et al. 2005).
La presente invención se ilustra mediante la transformación de plantas con la secuencia de ácidos nucleicos representada por la SEC ID Nº: 1, que codifica la secuencia polipeptídica de la SEC ID Nº: 2. Sin embargo, la realización de la invención no está limitada a estas secuencias; pudiendo realizarse los procedimientos de la invención ventajosamente usando cualquier ácido nucleico que codifique a JMJC o un polipéptido JMJC, como se define en el presente documento.
En la Tabla A1 del Ejemplo 1 del presente documento se proporcionan ejemplos de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos JMJC. Dichos ácidos nucleicos son útiles para realizar los procedimientos de la invención. Las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1 son secuencias ejemplo de ortólogos y parálogos del polipéptido JMJC representado por la SEC ID Nº: 2, siendo los términos “ortólogos” y “parálogos” como se define en el presente documento. Adicionalmente, los ortólogos y parálogos pueden identificarse fácilmente realizando una búsqueda BLAST denominada recíproca. Típicamente, esto implica un primer BLAST que implica una secuencia de consulta BLASTing (por ejemplo usando cualquiera de las secuencias indicadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1) contra cualquier base de datos de secuencia, tal como la base de datos NCBI públicamente disponible. BLASTN o TBLASTX (utilizando valores predeterminados convencionales) pueden usarse cuando se parte de una secuencia de nucleótidos y BLASTP o TBLASTN (usando valores predeterminados convencionales) pueden usarse cuando se parte de una secuencia de proteína. Los resultados BLAST pueden filtrarse opcionalmente. Las secuencias de longitud completa de los resultados filtrados o no filtrados vuelven después a buscarse con BLAST (segundo BLAST) contra las secuencias del organismo del cual procede la secuencia de consulta (donde la secuencia de consulta es la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2, por lo que el segundo BLAST se realizaría contra las secuencias de Arabidopsis). Después se comparan los resultados del primer y segundo BLAST. Se identifican un parálogo si un acierto de alta clasificación del primer BLAST es de la misma especie de la que procede la secuencia de consulta, después, un BLAST posterior da como resultado idealmente la secuencia de consulta entre los mayores aciertos; un ortólogo se identifica si un acierto de alta clasificación en el primer BLAST no es de la misma especie de la que procede la secuencia de consulta, y preferentemente los resultados basados en un BLAST posterior en la secuencia de consulta se encuentran entre los mayores aciertos.
Los aciertos de alta clasificación son aquellos que tienen un valor E bajo. Cuanto menor es el valor E, más
significativa la clasificación (o en otras palabras menor es la probabilidad de que se encuentre el acierto casualmente). El cálculo del valor E es bien conocido en la técnica. Además de los valores E, las comparaciones también se clasifican mediante el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptido) sobre una longitud particular. En el caso de grandes familias, puede usarse ClustalW, seguido de la generación de un árbol de unión del vecino más próximo para ayudar a visualizar el agrupamiento de los genes relacionados y para identificar los ortólogos y parálogos.
Las variantes de ácidos nucleicos también pueden ser útiles en la realización práctica de los procedimientos de la invención. Los ejemplos de dichas variantes incluyen ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionada en la Tabla A1 del Ejemplo 1, siendo los términos “homólogo” y “derivado” como se definen en el presente documento. También son útiles en los procedimientos de la invención los ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1. Los homólogos y derivados útiles en los procedimientos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la proteína no modificada de la cual proceden.
Las variantes de ácido nucleico adicionales útiles en la realización práctica de los procedimientos de la invención incluyen porciones de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC, ácidos nucleicos que se hibridan con ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC, variantes de corte y empalme de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC, variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC y variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC obtenidos por combinación de genes. Las expresiones hibridación de secuencias, variante de corte y empalme, variante alélica y combinación de genes son como se describen en el presente documento.
Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC no tienen por qué ser ácidos nucleicos de longitud completa, dado que la realización de los procedimientos de la invención no se basa en el uso de secuencias de ácidos nucleicos completas. De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para potenciar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una porción de una cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1, o una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo y homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1.
Una porción de un ácido nucleico puede prepararse, por ejemplo, realizando una o más deleciones en el ácido nucleico. Las porciones pueden usarse en forma aislada o pueden fusionarse a otras secuencias codificantes (o no codificantes) para producir por ejemplo, una proteína que combine diversas actividades. Cuando se fusiona con otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido después de la traducción puede ser más grande que el esperado para la porción proteica.
Las porciones útiles en los procedimientos de la invención codifican un polipéptido JMJC como se define en el presente documento, y tiene sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1. Preferentemente, la porción es una porción de uno cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en la Tabla A1 del Ejemplo 1, o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo
1. Preferentemente la porción tiene al menos 70, 100, 200, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 nucleótidos consecutivos de longitud, siendo los nucleótidos consecutivos de una cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1,
o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1. Más preferentemente la porción es una porción del ácido nucleico de SEC ID Nº: 1. Preferentemente, la porción codifica una secuencia de aminoácidos que cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con el grupo de polipéptidos JMJC (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235(9):2449-59) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 más que con cualquier otro grupo.
Otra variante de ácido nucleico útil en los procedimientos de la invención es un ácido nucleico capaz de hibridarse, en condiciones de rigurosidad reducida, preferentemente en condiciones rigurosas, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se define en el presente documento, o con un porción como se define en el presente documento.
De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para potenciar en plantas rasgos relacionados con el rendimiento, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con uno cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en la Tabla A1 del Ejemplo 1, o que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos proporcionada en la Tabla A1 del Ejemplo 1.
Las secuencias de hibridación útiles en los procedimientos de la invención codifican un polipéptido JMJC como se
define en el presente documento, y tiene sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1. Preferentemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con uno cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en la Tabla A1 del Ejemplo 1, o con una porción de cualquiera de estas secuencias, siendo una porción como se define anteriormente, o en el que la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1. Más preferentemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridarse con un ácido nucleico como se represente en la SEC ID Nº: 1 o con una parte de la misma.
Preferentemente, la secuencia de hibridación codifica una secuencia de aminoácidos que, cuando se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con el grupo de polipéptidos JMJC (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235(9):2449-59) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 más que con cualquier otro grupo.
Otra variante de ácido nucleico útil en los procedimientos de la invención es una variante de corte y empalme que codifica un polipéptido JMJC como se define anteriormente en el presente documento, siendo una variante de corte y empalme como se define en el presente documento.
De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para potenciar en plantas rasgos relacionados con el rendimiento, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de corte y empalme de una cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1, o una variante de corte y empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1. Un ejemplo de una variante de corte y empalme del gen que codifica la SEC ID Nº: 2 se representan por la SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 83 (que codifica la SEC ID Nº: 12).
Las variantes de corte y empalme preferidas son variantes de corte y empalme de un ácido nucleico representado por la SEC ID Nº: 1, o una variante de corte y empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de la SEC ID Nº: 2. Preferentemente, cuando la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de corte y empalme, se usa en la construcción del árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con el grupo de polipéptidos JMJC (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235(9):2449-59) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 más que con cualquier otro grupo.
Otra variante de ácido nucleico útil en la realización de los procedimientos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se define en el presente documento anteriormente, siendo una variante alélicas como se define en el presente documento.
De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para potenciar en plantas rasgos relacionados con el rendimiento, que comprende introducir y expresar en una planta una variante alélica de un ácido nucleico proporcionado en la Tabla A1 del Ejemplo 1, o que comprende introducir y expresar en una planta o una variante alélicas de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1.
Las variantes alélicas útiles en los procedimientos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica que la del polipéptido JMJC de SEC ID Nº: 2 y cualquiera de los aminoácidos representados en la Tabla A1 del Ejemplo 1. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y en los procedimientos de la presente solicitud se incluye el uso de estos alelos naturales. Preferentemente, la variante alélica es una variante alélica de SEC ID Nº: 1 o una variante alélicas de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEC ID Nº: 2. Preferentemente, cuando la secuencia de aminoácidos codificada por la variante alélica se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con los polipéptidos JMJC (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235(9):2449-59) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 más que con cualquier otro grupo.
La combinación de genes o evolución dirigida también puede usarse para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC como se define anteriormente; siendo la expresión “combinación de genes” como se define en el presente documento.
De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento para potenciar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar en una planta una variante de una cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1, o que comprende introducir y expresar en una planta una variante de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo y homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla A1 del Ejemplo 1, cuya variante de ácido nucleico se obtiene por combinación de genes.
Ventajosamente, la presente invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de JMJ hasta ahora desconocidas.
De acuerdo con una realización adicional de la presente solicitud, se proporciona una molécula de ácido nucleico
aislada que comprende:
(i)
un ácido nucleico representado por la SEC ID Nº: 25;
(ii)
un ácido nucleico o un fragmento del mismo que es complementario a la SEC ID Nº: 25;
(iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC que tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más con la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEC ID Nº: 26;
(iv) un ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con uno cualquiera de los ácidos nucleicos proporcionados en (i), (ii) o (iii) anteriores.
De acuerdo con una realización adicional de la presente solicitud se proporciona por tanto un polipéptido aislado que comprende:
(i)
una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % o más con la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEC ID Nº: 26;
(ii)
derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en (i).
Preferentemente, cuando la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico variante obtenido por combinación de genes, se usa en la construcción de un árbol filogenético, tal como el representado en la Figura 3, se agrupa con el grupo de polipéptidos JMJC (Takeuchi et al. Dev Dyn. 2006 235(9):2449-59) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 más que con cualquier otro grupo.
Además, también pueden obtenerse variantes de ácido nucleico por mutagénesis dirigida a sitio. Se dispone de diversos procedimientos para realizar mutagénesis dirigida a sitio, siendo los más habituales los procedimientos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).
Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC pueden proceder de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico puede modificarse de su forma nativa en composición y/o entorno genómico a través de manipulación humana deliberada. Preferentemente el ácido nucleico que codifica el polipéptido JMJC es de una planta, adicionalmente de manera preferente, de una planta dicotiledónea, más preferentemente de la familia Brassicaceae, aún más preferentemente el ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.
La realización de los procedimientos de la invención da lugar a plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento. En particular, la realización de los procedimientos de la invención da lugar a plantas que tienen rendimiento aumentado, especialmente rendimiento aumentado de semilla con respecto a plantas de control. Las expresiones “rendimiento” y “rendimiento de semilla” se describen con más detalle en la sección de “definiciones” del presente documento.
En el presente documento la referencia a rasgos potenciados relacionados con el rendimiento se considera que significa un aumento en biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que puede incluir partes sobre la superficie (cosechables) y/o partes (cosechables) por debajo de la superficie. En particular, dichas partes cosechables son semillas, y la realización de los procedimientos de la invención da como resultado plantas que tienen rendimiento aumentado con respecto al rendimiento de las plantas de control.
Tomando el maíz como un ejemplo, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como uno o más de los siguientes: aumento en el número de plantas establecido por hectárea o metro cuadrado, un aumento en el número de espigas por planta, un aumento en el número de filas, número de granos por fila, peso de grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de espiga, aumento en la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando el arroz como un ejemplo, un aumento en el rendimiento puede manifestarse en sí mismo como un aumento en uno o más de los siguientes: número de plantas por hectárea o metro cuadrado, número de panículas por planta, número de espiguillas por panícula, número de flores (floretes) por panícula (que se expresa como una proporción del número de semillas llenas dividido entre el número de panículas primarias), aumento en la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas y multiplicado por 100), aumento en peso de mil granos, entre otros.
La presente invención proporciona un procedimiento para aumentar al menos un rasgo relacionado con el rendimiento seleccionado de vigor de emergencia de la planta, índice de raíz/brote, rendimiento de semilla, tasa de llenado de semilla, índice de cosecha y peso de mil granos, respecto a las plantas de control, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se define en el presente documento.
Dado que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen un rendimiento aumentado, es probable que estas plantas presenten una tasa de crecimiento aumentada (durante al menos parte de su ciclo de vida) con respecto a la tasa de crecimiento de plantas de control en una etapa correspondiente en su ciclo de vida.
La tasa de crecimiento aumentada puede ser específica a una o más partes de una planta (incluyendo semillas), o puede ser sustancialmente en toda la planta. Las plantas que tienen una tasa de crecimiento aumentada pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede significar el tiempo necesario para crecer a partir de una semilla madura seca hasta la etapa en la que la planta ha producido semillas maduras secas, similar al material de partida. Este ciclo de vida puede estar influenciado por factores tales como vigor temprano, tasa de crecimiento, índice de verdor, tiempo de floración y velocidad de la maduración de la semilla. El aumento en la tasa de crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente el ciclo de vida completo de una planta. Una tasa de crecimiento aumentada durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar vigor potenciado. El aumento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de la cosecha de una planta lo que permite que las plantas se siembren más tarde y/o se cosechen más pronto de lo que de otra manera sería posible (puede obtenerse un efecto similar con un tiempo de floración más temprano). Si la tasa de crecimiento se aumenta suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de la planta (por ejemplo siembra y cosecha de plantas de arroz seguido de siembra y cosecha de plantas de arroz adicionales todas dentro de un periodo de crecimiento convencional). De manera similar, si la tasa de crecimiento se aumenta suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo, la siembra y cosecha de plantas de maíz seguido de, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de plantas de soja, patata o cualquier otra planta adecuada). Los tiempos de cosecha adicionales del mismo rizoma en el caso de algunas plantas de cultivo también pueden ser posibles. Alterar el ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un aumento en producción de biomasa anual por metro cuadrado (debido a un aumento en el número de tiempos (dicho en un año) que se puede cultivar y cosechar cualquier planta particular). Un aumento en la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus homólogos de tipo silvestre, debido a que las limitaciones territoriales para cosechar un cultivo a menudo se determinan por condiciones ambientales adversas bien en el momento de plantar (estación temprana) o bien en el momento de cosechar (estación tardía). Dichas condiciones adversas pueden evitarse si se acorta el ciclo de la cosecha. La tasa de crecimiento puede determinarse derivando diversos parámetros de curvas de crecimiento, dichos parámetros pueden ser: T-Medio (el tiempo que tardan las planta en alcanzar el 50 % de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que tardan las plantas en alcanzar el 90 % de su tamaño máximo) entre otros.
De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la realización de los procedimientos de la invención proporciona plantas que tienen una tasa de crecimiento aumentada en comparación con plantas de control. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar la tasa de crecimiento en plantas, cuyo procedimiento comprende modular, en una planta, la expresión, preferentemente aumentar la expresión, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se define en el presente documento.
Un aumento en el rendimiento y/o tasa de crecimiento se produce cuando la planta está en condiciones sin estrés o cuando la planta está expuesta a diversos tipos de estrés en comparación con las plantas de control. Típicamente las plantas responden a exposición frente al estrés creciendo más lentamente. En condiciones de estrés intenso la planta puede incluso detener por completo el crecimiento. Por otro lado, en el presente documento estrés leve se define como cualquier estrés al que se expone la planta que no da como resultado el cese total del crecimiento de la planta sin la capacidad de reanudar el crecimiento. El estrés leve, en el sentido de la invención, conduce a una reducción en el crecimiento de la planta estresada de menos de 40 %, 35 % o 30 %, preferentemente menos del 25 %, 20 % o 15 %, más preferentemente menos de 14 %, 13 %, 12 %, 11 % o 10 % o menos en comparación con la planta de control en condiciones sin estrés. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (riego, fertilización, tratamientos con pesticidas) las formas de estrés intenso no se encuentran frecuentemente en las plantas cultivadas. Como consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés leve es a menudo una característica indeseable para la agricultura. El estrés leve es un estrés biótico y/o abiótico (ambiental) común al cual está expuesta la planta. El estrés abiótico puede deberse a Sequía o a exceso de agua, a estrés anaeróbico, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y a temperaturas altas, frías o heladas. El estrés abiótico puede ser un estrés osmótico causado por estrés hídrico (particularmente debido a Sequía), estrés salino, estrés oxidativo y estrés iónico. El estrés biótico es típicamente aquel estrés provocado por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos.
En particular, los procedimientos descritos en el presente documento pueden realizarse en condiciones sin estrés o en condiciones de Sequía leve para dar plantas que tienen un rendimiento aumentado con relación a plantas de control. Como describen Wang y col. (Planta (2003) 218: 1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan adversamente al crecimiento y productividad de las plantas. Se sabe que la Sequía, la salinidad, las temperaturas extremas y el estrés oxidativo están interconectados y que pueden inducir daño celular y al crecimiento a través de mecanismos similares. Rabbani y col. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describen un grado particularmente alto de “interferencia” entre estrés por Sequía y estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la Sequía y/o salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, que produce la interrupción de la homeostasis y la distribución de iones en la célula. El estrés oxidativo, que frecuentemente viene acompañado por estrés debido a alta o baja temperatura, por salinidad o Sequía, puede producir desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, este diverso estrés ambiental a menudo activa rutas de señalización celular y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas de estrés, regulación positiva de antioxidantes, acumulación de solutos compatibles y paralización del
crecimiento. La expresión condiciones “sin estrés”, como se usa en el presente documento, son aquellas condiciones ambientales que permiten el crecimiento óptimo de las plantas. Los expertos en la técnica saben cuáles son las condiciones normales en el suelo y las condiciones climáticas en una localización determinada. Las plantas con condiciones de crecimiento óptimas, (crecimiento en condiciones sin estrés) típicamente producen en orden creciente de preferencia al menos un 90 %, 87 %, 85 %, 83 %, 80 %, 77 % o 75 % de la producción promedio de dicha planta en un entorno determinado. Una producción promedio puede calcularse basándose en la cosecha y/o estación. Los expertos en la técnica sabrán calcular los promedios de las producciones de rendimiento de un cultivo.
La realización de los procedimientos de la invención da lugar a plantas cultivadas en condiciones sin estrés o en condiciones de Sequía leve de rendimiento aumentado con respecto a plantas de control que crecen en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de la semilla en plantas que crecen en condiciones sin estrés o en condiciones de Sequía leve, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC.
La realización de los procedimientos de la invención da lugar a plantas que crecen en condiciones de déficit de nutrientes, particularmente en condiciones de déficit de nitrógeno, rendimiento aumentado con respecto a plantas de control que se cultivan en condiciones comparables. Por lo tanto de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de semilla en plantas que se cultivan en condiciones de déficit de nutrientes, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC. El déficit de nutrientes puede producirse por una carencia o un exceso de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, cadmio, magnesio, manganeso, hierro y boro entre otros.
La presente invención incluye plantas o partes de las mismas (incluyendo semillas) obtenibles por los procedimientos de acuerdo con la presente invención. Las plantas o partes de las mismas comprenden un transgén de ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se define anteriormente.
La invención también proporciona construcciones génicas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión en plantas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC. Las construcciones génicas pueden insertarse en vectores, que pueden estar disponibles en el comercio, adecuados para la transformación en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención también proporciona el uso de una construcción génica como se define en el presente documento en los procedimientos de la invención.
Más específicamente, la presente invención proporciona una construcción que comprende:
(a)
un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se ha definido anteriormente;
(b)
una o más secuencias de control capaces de conducir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a) que comprende un promotor GOS2; y opcionalmente
(c)
una secuencia de terminación de la transcripción.
Preferentemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC es como se define anteriormente. La expresión “secuencia de control” y “secuencia de terminación” son como se define en el presente documento.
Las plantas se transforman con un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. El experto en la técnica conocerá los elementos genéticos que deben estar presentes en un vector para transformar, seleccionar y propagar satisfactoriamente células hospedadoras que contengan la secuencia de interés. La secuencia de interés está unida operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor).
Ventajosamente, cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, puede usarse para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. Un promotor constitutivo es particularmente útil en los procedimientos. Véase la sección “Definiciones” del presente documento para las definiciones de los diversos tipos de promotores.
Debe aclararse que la aplicabilidad del procedimiento de la presente invención no está limitada al ácido nucleico que codifica el polipéptido JMJC representado por la SEC ID Nº: 1, ni la aplicabilidad del procedimiento de la invención está limitada a la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC cuando se dirige por un promotor constitutivo.
El promotor constitutivo es preferentemente un promotor GOS2, preferentemente un promotor GOS2 de arroz. Adicionalmente de manera preferida el promotor constitutivo está representado por una secuencia de ácido nucleico sustancialmente similar a la SEC ID Nº: 3, más preferentemente el promotor constitutivo es como se representa en la SEC ID Nº: 3. Véase la sección “Definiciones” del presente documento para otros ejemplos de promotores constitutivos.
Opcionalmente, en la construcción introducida en una planta pueden usarse una o más secuencias terminadoras. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales. Los expertos en la técnica serán conscientes de que pueden ser adecuadas sustancias terminadoras y potenciadoras para su uso en la realización de la invención. También puede añadirse una secuencia intrónica en la región no traducida (UTR) 5’ o en la secuencia codificante para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de definiciones. Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, potenciadoras, silenciadoras, intrónicas, regiones UTR3’ y/o UTR5’) pueden ser elementos estabilizadores de proteína y/o ARN. Un experto en la materia conocería dichas secuencias o podría obtenerlas fácilmente.
Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir adicionalmente un origen de secuencia de replicación que es necesario para la conservación y/o replicación en un tipo de célula específico. Un ejemplo es cuando en una célula bacteriana se requiere conservar una construcción genética como un elemento genético episomal (por ejemplo, una molécula de plásmido o de cósmido). Como orígenes de replicación preferidos se incluyen, pero sin limitación f1-ori y colE1.
Para la detección de la transferencia satisfactoria de las secuencias de ácidos nucleicos como se usa en los procedimientos de la invención y/o selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucleicos, es ventajoso usar genes marcadores (o genes indicadores). Por lo tanto, la construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador de selección. Los marcadores de selección se describen con más detalle en la sección “definiciones” del presente documento.
Se sabe que, después de integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en las células de plantas, solo una minoría de las células capta el ADN exógeno y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión utilizado y de la técnica de transfección utilizada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, normalmente en las células huésped se introduce un gen que codifica un marcador de selección (tal como los descritos anteriormente) junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden utilizarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales por ejemplo, mediante deleción por procedimientos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador de selección pueden introducirse en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o utilizarse en los procedimientos de la invención, o incluso en un vector distinto. Las células que se han transfectado de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por ejemplo mediante selección (por ejemplo, células que tienen integrado el marcador de selección sobreviven mientras que las otras células mueren. Los genes marcadores pueden retirarse o escindirse de la célula transgénica una vez que ya no se necesitan. Las técnicas para retirar genes marcadores son conocidas en la materia, en la sección de definiciones anterior se describen técnicas útiles.
La invención también proporciona un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen rendimiento de semilla aumentado con respecto a las plantas de control, que comprende la introducción y expresión en una planta de cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se define anteriormente en el presente documento.
Más específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento, particularmente rendimiento (de semillas) aumentado, cuyo procedimiento comprende:
(i)
introducir y expresar en una planta o en una célula de planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC unido operativamente a un promotor GOS2; y
(ii)
cultivar la célula de planta en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.
El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido JMJC como se define en el presente documento.
El ácido nucleico puede introducirse directamente en una célula de planta o en la propia planta (incluyendo la introducción en un tejido, órgano o en cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce preferentemente en una planta por transformación. El término “transformación” se describe con más detalle en la sección “definiciones” del presente documento.
Las células de planta modificadas genéticamente pueden regenerarse mediante todos los procedimientos con los que está familiarizado el experto en la técnica. Pueden encontrarse procedimientos adecuados en las publicaciones anteriormente mencionadas de S. D. Kung y R. Wu, Potrykus o Höfgen y Willmitzer.
Generalmente, después de la transformación, las células o grupos de células de planta se seleccionan para detectar la presencia de uno o más marcadores que están codificados por genes que pueden expresarse en plantas cotransferidos con el gen de interés, después de lo cual el material transformado se regenera en una planta completa. Para seleccionar plantas transformadas, el material de planta obtenido en la transformación, como norma, se somete a condiciones selectivas de tal manera que las plantas transformadas pueden diferenciarse de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las señales obtenidas de la manera descrita anteriormente pueden plantarse y, después
de un periodo de crecimiento inicial, someterse a una selección adecuada por pulverización. Una posibilidad adicional consiste en cultivar las semillas, si fuera apropiado, después de esterilización, en placas de agar usando un agente de selección adecuado de tal manera que solamente las semillas transformadas puedan desarrollarse en plantas. Como alternativa, las plantas transformadas se exploran para determinar la presencia de un marcador de selección tal como el descrito anteriormente.
Después de la transferencia y regeneración de ADN, las plantas supuestamente transformadas pueden evaluarse utilizando, por ejemplo, análisis de Southern, para determinar la presencia del gen de interés, número de copias y/u organización genómica. Como alternativa o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recién introducido pueden supervisarse usando análisis de Northern y/o Western, ambas técnicas bien conocidas por los expertos habituales en la materia.
Las plantas transformadas generadas pueden propagarse mediante diversos medios, tales como mediante técnicas clásicas de propagación clonal o de reproducción. Por ejemplo, una primera generación (o T1) de planta transformada puede reproducirse asexualmente y puede seleccionarse una segunda generación homocigota (o T2) y después las plantas T2 pueden propagarse adicionalmente a través de técnicas de reproducción clásicas. Los organismos transformados generados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no trasformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas que contengan el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, una planta madre transformada injertada a un vástago no transformado).
La presente invención se amplía claramente a cualquier célula de planta o planta producida mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, y a todas las partes de la planta y propágulos de la misma. La presente invención se amplía adicionalmente para incluir la progenie de una célula, tejido u órgano primario transformado o transfectado o la planta completa que se ha producido mediante cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la progenie presente la misma característica, o características, genotípicas y/o fenotípicas que las producidas por el precursor en los procedimientos de acuerdo con la invención.
La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido JMJC como se ha definido anteriormente en el presente documento. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células de plantas. Las plantas huésped para los ácidos nucleicos o el vector usados en el procedimiento de acuerdo con la invención, el casete de expresión o construcción o vector son, en principio, ventajosamente todas las plantas, que pueden sintetizar los polipéptidos usados en el procedimiento inventivo.
Los procedimientos de la invención son ventajosamente aplicables a cualquier planta. Las plantas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata y tabaco. Adicionalmente de modo preferente, la planta es una planta monocotiledónea. Ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. Más preferentemente la planta es un cereal. Ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo y avena.
La invención también se amplía a partes cosechables de una planta, tales como, pero sin limitación, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, raíces, rizomas, tubérculos y bulbos. Adicionalmente la invención se refiere a productos derivados, preferentemente directamente derivados, de una parte cosechable de dicha planta, tales como gránulos deshidratados o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.
De acuerdo con la invención, la expresión génica es expresión aumentada. Los procedimientos para aumentar la expresión de ácidos nucleicos o genes, o productos génicos, están bien documentados en la técnica y en la sección definiciones se proporcionan ejemplos.
Como se ha mencionado anteriormente, un procedimiento preferido para aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC es introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC; sin embargo, también pueden obtenerse los efectos de la realización del procedimiento, es decir potenciar rasgos relacionados con el rendimiento, usando otras técnicas bien conocidas, incluyendo, pero sin limitación, etiquetado en activación de ADN T, TILLING, recombinación homóloga. Una descripción de estas técnicas se proporciona en la sección definiciones.
La presente invención también incluye el uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC como se describe en el presente documento y el uso de estos polipéptidos JMJC en la potenciación de cualquiera de los rasgos relacionados con el rendimiento anteriormente mencionadas en plantas.
Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos JMJC descritos en el presente documento, o los propios polipéptidos JMJC, pueden encontrar uso en programas de reproducción en los que se identifica un marcador de ADN, que puede estar unido genéticamente a un gen que codifica un polipéptido JMJC. Los ácidos nucleicos/genes, o los propios polipéptidos JMJC pueden usarse para definir un marcador molecular. Este marcador de ADN o de proteína
puede después usarse en programas de reproducción para seleccionar plantas que tengan rasgos potenciados relacionados con el rendimiento como se ha definido en el presente documento anteriormente en los procedimientos de la invención.
Las variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido JMJC también pueden encontrar uso en programas de reproducción asistida mediante marcador. Dichos programas de reproducción a veces requieren la introducción de variación alélicas por tratamiento mutagénico de las plantas, usando, por ejemplo, mutagénesis con EMS; como alternativa, el programa puede comenzar con una colección de variantes alélicas de origen denominado “natural” producida involuntariamente. Después se realiza la identificación de variantes alélicas, por ejemplo, por PCR. A esto le sigue una etapa de selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que dará un rendimiento aumentado. La selección se realiza típicamente supervisando el rendimiento del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. El rendimiento de crecimiento puede supervisarse en un invernadero o en el campo. Etapas opcionales adicionales incluyen cruzamiento de plantas en el que se identificó la variante alélica superior con otra planta. Esto podría usarse, por ejemplo, para realizar una combinación de características fenotípicas interesantes.
Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos JMJC también pueden usarse como sondas para mapear genética y físicamente, genes que forman parte de, y como marcadores para rasgos ligados a estos genes. Dicha información puede ser útil en reproducción de plantas para desarrollar líneas con fenotipos deseados. Dicho uso de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido JMJC requiere solo una secuencia de ácido nucleico de al menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido JMJC pueden usarse como marcadores de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (PLFR). Con los ácidos nucleicos que codifican JMJC pueden explorarse transferencias de Southern (Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) de ADN genómico de planta digerido por enzimas de restricción. Los patrones de banda resultantes pueden después someterse a análisis genético usando programas informáticos tales como MapMaker (Lander y col. (1987) Genomics 1: 174-181) para construir un mapa genético. Además, los ácidos nucleicos pueden usarse para explorar transferencias de Southern que contienen ADN genómicos tratados con endonucleasas de restricción de un conjunto de individuos que representan a los padres y a la progenie de un cruce genético definido. La segregación de polimorfismos de ADN se observa y se usa para calcular la posición del ácido nucleico que codifica el polipéptido JMJC en el mapa genético previamente obtenido usando esta población (Botstein y col. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).
La producción y uso de sondas derivadas de genes de plantas para su uso en mapeo genético se describe en Bernatzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de ADNc específicos utilizando la metodología indicada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, para el mapeo pueden utilizarse poblaciones de intercruzamiento F2, poblaciones de retrocruzamiento, poblaciones apareadas al azar, líneas isogénicas cercanas y otros grupos de individuos. Dichas metodologías son bien conocidas por los expertos en la técnica.
Las sondas de ácido nucleico también pueden usarse para mapeo físico (es decir, colocación de secuencias en mapas físicos; véase Hoheisel y col. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, páginas 319-346, y referencias citadas en su interior).
En otra realización, pueden usarse las sondas de ácidos nucleicos en mapeo directo de hibridación in situ con fluorescencia (HISF, Fluorescent In Situ Hybridization) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149-154). Aunque los procedimientos actuales del mapeo HISF favorecen el uso de clones grandes (de varios kb a varios cientos de kb; véase Laan y col. (1995) Genome Res. 5: 13-20), mejoras en sensibilidad pueden permitir la realización de mapeo HISF usando sondas más cortas.
Usando los ácidos nucleicos pueden realizarse diversos procedimientos basados en amplificación de ácidos nucleicos para el mapeo genético y físico. Como ejemplos se incluyen la amplificación específica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95-96), el polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield y col. (1993) Genomics 16: 325-332), el ligamiento específico de alelo (Landegren y col. (1988) Science 241: 1077-1080), las reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), el Mapeo Híbrido por Radiación (Walter y col. (1997) Nat. Genet. 7: 22-28) y el Mapeo Happy (por las siglas en inglés mapping based on the analysis of approximately HAPloid DNA samples using the PolYmerase chain reaction) (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795-6807). Para estos procedimientos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para su uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión con cebador. El diseño de dichos cebadores es muy conocido por los expertos en la técnica. En los procedimientos que emplean mapeo genético basado en PCR puede ser necesario identificar diferencias de secuencias de ADN entre los padres del cruce del mapeo en la región correspondiente a la secuencia de ácido nucleico instantánea. Sin embargo, generalmente esto no es necesario para procedimientos de mapeo.
Los procedimientos de acuerdo con la presente invención dan como resultado plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Estos rasgos también pueden combinarse con otros rasgos económicamente ventajosos, tales como rasgos que potencian adicionalmente el rendimiento, la tolerancia a diversos estreses abióticos y bióticos, rasgos que modifican diversas
características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.
Descripción de las figuras
La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras en las que:
La Figura 1 representa la secuencia de aminoácidos y la estructura del dominio de la SEC ID Nº: 2. Se indican los motivos conservados y los dominios. El dominio JmjC se indica en negrita. Los motivos conservados SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8 y SEC ID Nº: 9 se indican con rectángulos de una, dos y tres líneas respectivamente. Se subrayan los restos de aminoácidos T (Treonina) y K (Lisina) que típicamente participan en la coordinación del 2-Oxoglutarato. La H mayúscula indica el resto de aminoácido Histidina que coordina el ión de hierro.
La Figura 2 representa un alineamiento múltiple de proteínas JMJC. El origen de la proteína se indica con los dos primeros dígitos alfanuméricos en el nombre, At: Arabidopsis thaliana, Pp: Populus trichocarpa, Os: Oryza sativa, Ot: Streococcus tauri, Ce: Caenorhabditis elegans, Hs: Homo sapiens. En la Figura 1 se indica la posición de los restos de aminoácidos conservados y los dominios correspondientes a los descritos. Se proporciona una secuencia consenso. En la secuencia consenso se proporcionan los aminoácidos altamente conservados; los espacios vacíos en blanco representan cualquier aminoácido.
La Figura 3 muestra un árbol filogenético de polipéptidos JMJC. La flecha muestra la SEC ID Nº: 2. Otros polipéptidos JMJC se nombran usando el número de registro Genbank. El grupo I (GI) comprende proteínas de origen vegetal; el grupo II (GII) comprende proteínas de origen no vegetal.
La Figura 4 representa el vector binario para la expresión aumentada en Oryza sativa de SEC ID Nº: 1 bajo el control de un promotor GOS2 de arroz (pGOS2).
La Figura 5 detalla ejemplos de secuencias JMJC útiles en la realización de los procedimientos de acuerdo con la presente invención.
Ejemplos
La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que son solo a modo ilustrativo. Los siguientes ejemplos no pretenden definir completamente o de otra manera limitar el alcance de la invención.
Manipulación de ADN: a menos que se indique otra cosa, se realizarán técnicas de ADN recombinante de acuerdo con los protocolos convencionales descritos en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York, o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y col. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Standard materiales y procedimientos convencionales de trabajos moleculares en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).
Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con la secuencia de ácidos nucleicos JMJC usada en los procedimientos de la invención
Las secuencias (ADNc de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con la secuencia de ácidos nucleicos usadas en los procedimientos de la presente invención se identificaron entre las conservadas en la base de datos de Nucleótidos Entrez en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando herramientas de búsqueda de secuencias de bases de datos, tales como la Herramienta Básica de Alineamiento Local (BLAST, Basic Local Alignment Tool) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). La búsqueda de secuencias también se realizó en otras bases de datos públicas y de patente. Se usaron herramientas de búsqueda de secuencia tales como la Herramienta de Alineamiento Local Básica (BLAST, Basic Local Alignment Tool) (Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410; y Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). El programa se usa para encontrar regiones de similitud local entre las secuencias comparando las secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos con las bases de datos de secuencia y calculando el significado estadístico de los emparejamientos. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico usado en la presente invención se usó para el algoritmo TBLASTN, con configuraciones predeterminadas y el filtro para ignorar la activación de secuencias de baja complejidad. El resultado de los análisis se observó por comparación por pares, y se clasificó de acuerdo con la puntuación de probabilidad (valor E), en el que la puntuación refleja la probabilidad de que se produzca un alineamiento particular por casualidad (cuanto menor sea el valor E más significativo es el acierto). Además de los valores E, las comparaciones también se puntuaron por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipeptídicas) comparadas sobre una longitud particular.
La Tabla A1 proporciona una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con las secuencias de ácidos nucleicos de JMJC usada en los procedimientos de la presente invención. Los polipéptidos con una entrada extendida por un punto y un dígito representan variantes de corte y empalme.
Tabla A1: Ejemplos de polipéptidos JMJC
Fuente Vegetal
Número (o locus) de registro Genbank Acido nucleico SEC ID Nº: Proteínas SEC ID Nº:
Arabidopsis thaliana
AT3G20810 1 2
Arabidopsis thaliana
AT3G20810 11 12
Arabidopsis thaliana
AT5G19840 13 14
Arabidopsis thaliana
AT3G45880 15 16
Medicago truncatula
ABE92082 17 18
Brachypodium sylvaticum
CAJ26373 19 20
Oryza sativa
Os09g0483600 21 22
Arabidopsis thaliana
AT1G08620 23 24
Arabidopsis thaliana
AT1G09060 25 26
Arabidopsis thaliana
AT1G09060 27 28
Arabidopsis thaliana
AT1G09060 29 30
Arabidopsis thaliana
AT1G11950 31 32
Arabidopsis thaliana
AT1G30810 33 34
Arabidopsis thaliana
AT1G62310 35 36
Arabidopsis thaliana
AT1G63490 37 38
Arabidopsis thaliana
AT1G78280 39 40
Arabidopsis thaliana
AT2G34880 41 42
Arabidopsis thaliana
AT2G38950 43 44
Arabidopsis thaliana
AT3G07610 45 46
Arabidopsis thaliana
AT3G48430 47 48
Arabidopsis thaliana
AT4G00990 49 50
Arabidopsis thaliana
AT4G20400 51 52
Arabidopsis thaliana
AT4G20400 53 54
Arabidopsis thaliana
AT5G04240 55 56
Arabidopsis thaliana
AT5G06550 57 58
Arabidopsis thaliana
AT5G46910 59 60
Arabidopsis thaliana
AT5G63080 61 62
Oryza sativa
Os01g36630 63 64
Oryza sativa
Os01g67970 65 66
Oryza sativa
Os02g01940 67 68
Oryza sativa
Os02g58210 69 70
Oryza sativa
Os02g58210 71 72
Oryza sativa
Os03g05680 73 74
Oryza sativa
Os03g22540 75 76
Oryza sativa
Os03g27250 77 78
Oryza sativa
Os03g31594 79 80
Oryza sativa
Os03g31594 81 82
Oryza sativa
Os05g10770 83 84
Oryza sativa
Os05g23670 85 86
Oryza sativa
Os09g22540 87 88
Oryza sativa
Os10g42690 89 90
Oryza sativa
Os11g36450 91 92
Oryza sativa
Os12g18149 93 94
Oryza sativa
Os12g18150 95 96
Glicine max
Gm_JMJ_1 97 98
En algunos casos, las secuencias relacionadas se han agrupado provisionalmente y desvelado públicamente por instituciones de investigación, tales como El Institute for Genomic Research (TIGR). La base de datos Eukaryotic Gene Orthologs (EGO) puede usarse para identificar dichas secuencias relatcionadas, bien como búsqueda por palabras clave o usando el algoritmo BLAST con las secuencias de ácidos nucleicos o polipeptídicas de interés.
Ejemplo 2: alineamiento de secuencias polipeptídicas JMJC
El alineamiento de las secuencias polipeptídicas se realizó usando el programa AlignX a partir del Vector NTI (Invitrogen) que se basa en el conocido algoritmo Clustal W de alineamiento progresivo (Thompson y col. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876-4882; Chenna y col. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497-3500). Los valores predeterminados son para la penalización por apertura de hueco de 10, para la penalización de extensión de hueco de 0,1 y la matriz de peso seleccionada es Blosum 62 (si los polipéptidos se alinean). Puede realizarse una edición manual menor para optimizar adicionalmente el alineamiento. La conservación de secuencias entre polipéptidos JMJC está principalmente en el dominio JmjC de los polipéptidos. La región correspondiente a los motivos representada por SEC ID Nº: 7 y por SEC ID Nº: 9 está más conservada que la del motivo 8. Se da una secuencia consenso. Los restos aminoacídicos en las secuencias consenso están muy conservados. Los espacios en blanco en las secuencias conservadas representan cualquier aminoácido. En la Figura 2 se alínean los polipéptidos JMJC.
Ejemplo 3: cálculo del porcentaje de identidad global entre las secuencias polipeptídicas JMJC útiles en la realización de los procedimientos de la invención
Los porcentajes de similitud e identidad globales entre las secuencias polipeptídicas de longitud completa útiles en la realización de los procedimientos de la invención se determinaron usando uno de los procedimientos disponibles en la técnica, el programa informático MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: una aplicación que genera matrices de similitud/identidad utilizando secuencias de proteína o de ADN. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; programa informático presentado por Ledion Bitincka). El programa informático MatGAT genera matrices de similitud/identidad para secuencias de ADN o proteína sin la necesidad de alinear previamente los datos. El programa realiza una serie de alineamientos por pares usando el algoritmo de alineamiento global de Myers y Miller (con una penalización por apertura de hueco de 12, y una penalización por extensión de hueco de 2), calcula la similitud e identidad usando, por ejemplo, Blosum 62 (para polipéptidos), y después pone los resultados en una matriz de distancias. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de secuencia se muestra en la mitad superior de la línea divisoria diagonal.
Los parámetros usados en la comparación fueron:
Matriz de puntuación:
Blosum62
Hueco inicial:
12
Extensión de hueco:
2
Los resultados del análisis informático se muestran en la Tabla A2 para la similitud e identidad global sobre la longitud completa de las secuencias polipeptídicas. El porcentaje de identidad se proporciona encima de la diagonal en negrita y el porcentaje de similitud se proporciona debajo de la diagonal (cara normal).
El porcentaje de identidad entre las secuencias polipeptídicas JMJC útiles en la realización de los procedimientos de la invención puede ser tan solo del 15 % de identidad de aminoácidos en comparación con la SEC ID Nº: 2.
Tabla A2: resultados MatGAT de similitud e identidad global sobre la longitud completa de las secuencias polipeptídicas.
SEC ID Nº: 2
SEC ID Nº: 12 SEC ID Nº: 14 SEC ID Nº: 18 SEC ID Nº: 20 SEC ID Nº: 22 SEC ID Nº: 64
AT3G20810.1
SEC ID Nº: 2 97,4 16,1 15,5 16,9 17,3 15,5
AT3G20810.2
SEC ID Nº: 12 97,4 15,5 14,5 17,5 17,1 14,9
AT5G19840
SEC ID Nº: 14 30,3 30,7 16,9 17 16,9 16,9
ABE92082
SEC ID Nº: 18 28,2 27,7 28,5 51,8 51,7 17,3
CAJ26373
SEC ID Nº: 20 30,1 29,6 27,7 67,6 82,5 12,4
Os09g0483600
SEC ID Nº: 22 30,1 30,1 27,5 67,3 89,6 16,1
Os01g36630
SEC ID Nº: 64 33,7 31,2 32,9 34,2 29,1 29,6
Ejemplo 4: identificación de dominios comprendidos en las secuencias polipeptídicas JMJC útiles en la realización de los procedimientos de la invención
La base de datos de Recursos Integrados de Familias de Proteínas, Dominios y Sitios (InterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos de firma normalmente usadas para búsquedas basadas en texto y secuencia. La base de datos InterPro combina estas bases de datos, que usan diferentes metodologías y diversos grados de información biológica sobre proteínas bien caracterizadas, para obtener firmas de proteína. Las bases de datos colaboradoras incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom y Pfam, Smart y TIGRFAMs. Pfam es una gran recolección de alineamientos de secuencias múltiples y modelos ocultos de Markov que cubren muchos dominios y familias de proteínas comunes. Pfam se distribuye a través del servidor del Sanger Institute en Reino Unido. Interpro se distribuye en el European Bioinformatics Institute en Reino Unido. La Tabla A3 muestra las configuraciones (Límite de entrada, límite de confianza y límite de interferencia) como se describe en la base de datos Pfam que se usó para producir la HMMs_fs para los dominios diferentes.
Tabla A3: configuraciones HMMs_fs.
Dominio
Límite de entrada Límite de confianza Límite de interferencia
PF02373
16 16,1 16,9
PF02375
15 16,8 13,8
PF02928
25 44,4 21,1
PF00646
17,7 17,7 17,6
PF00096
22,5 22,5 22,4
PF04967
15,4 15,4 3
Los resultados del análisis Pfam para polipéptidos JMJC representativos de origen vegetal se presentan en la Tabla A4. Las coordenadas de aminoácidos para cada dominio SBP en la secuencia de referencia se indican en las columnas Inicio y Fin. También se proporciona el valor E del alineamiento. También se proporciona el número de registro de InterPro ID de cada dominio identificado.
Ejemplo 5: clonación de la secuencia de ácidos nucleicos JMJC usada en los procedimientos de la invención
La secuencia de ácidos nucleicos usada en los pacientes de la invención se amplificó por PCR usando como molde una biblioteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis thaliana hecha a medida (en pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, RU). La PCR se realizó usando la Taq ADN polimerasa Hifi en condiciones estándar, usando 200 ng de molde en una mezcla PCR de 50 pI. Se utilizó un cebador cadena arriba y cadena abajo representado por la SEC ID Nº: 3 y SEC ID Nº: 4 respectivamente, para amplificar por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) la región codificante de un ácido nucleico JMJC representado por la SEC ID Nº: 1. Los cebadores incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway para facilitar la clonación del fragmento de ADN amplificado por PCR en un vector de clonación Gateway.
El fragmento de PCR amplificado se purificó también usando procedimientos convencionales. Después se realizó la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento de PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un “clon de entrada”, pJMJC. El plásmido pDONR201 se adquirió en Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.
El clon de entrada que comprendía la SEC ID Nº: 1 se usó posteriormente en una reacción LR con un vector destinatario utilizado para transformación de Oryza sativa. Este vector contiene, como elementos funcionales dentro de los límites del ADN T: un marcador de selección de plantas; un casete de expresión marcador detectable y un casete Gateway diseñado para recombinación LR in vivo con la secuencia de ácidos nucleicos de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor GOS2 de arroz (SEC ID Nº: 5) para expresión constitutiva se localizaba cadena arriba de este casete Gateway.
Después de la etapa de recombinación LR, el vector de expresión resultante pGOS2::JMJC (Figura 4) se transformó en la cepa LBA4044 de Agrobacterium de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica.
Ejemplo 6: transformación de plantas
Transformación de arroz
El Agrobacterium que contenía el vector de expresión se usó para transformar plantas de Oryza sativa. Se descascarillaron semillas secas maduras de la variedad de cultivo japónica de arroz Nipponbare. La esterilización se realizó incubando durante un minuto en etanol al 70 %, seguido de 30 minutos en HgCl2 al 0,2 %, seguido de un lavado de 6 veces durante 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles germinaron después en un medio que contenía 2,4-D (medio de inducción de callo). Después de incubación en la oscuridad durante cuatro semanas, los callos embrionarios, derivados de escutelo, se cortaron y se propagaron en el mismo medio. Después de 2 semanas, los callos se multiplicaron o se propagaron mediante subcultivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Trozos de callos embriogénicos se subcultivaron en medio reciente 3 días antes del co-cultivo (para reforzar la actividad de la división celular).
Para el co-cultivo se usó la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contenía el vector de expresión. Se inoculó Agrobacterium en medio AB con los anticuerpos apropiados y se cultivó durante 3 días a 28 ºC. Después, las bacterias se recogieron y se suspendieron en medio de co-cultivo líquido a una densidad (DO600) de aproximadamente 1. Después, la suspensión se transfirió a una placa de Petri y los callos se sumergieron en la suspensión durante 15 minutos. Después, los tejidos de callo se secaron por transferencia en un papel de filtro y se transfirieron a medio de co-cultivo solidificado y se incubaron durante 3 días en la oscuridad a 25 ºC. Los callos cocultivados crecieron sobre un medio que contenía 2,4-D durante 4 semanas en la oscuridad a 28 ºC en presencia de un agente de selección. Durante este periodo, rápidamente se desarrollaron islas de callos resistentes a crecimiento. Después de la transferencia de este material a un medio de regeneración e incubación a la luz, el potencial embriogénico se liberó y se desarrollaron brotes las siguientes cuatro a cinco semanas. Los brotes se extirparon de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en un medio que contenía auxina desde el cual se transfirieron al suelo. Los brotes endurecidos se cultivaron a alta humedad y en días cortos en un invernadero.
Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes para una construcción. Los transformantes primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo tisular a un invernadero. Después de un análisis de PCR cuantitativa para verificar el número de copias del inserto de ADN-T, solo una única copia de plantas transgénicas que presentaban tolerancia al agente de selección, se guardaron para la cosecha de la semilla T1. Después, las semillas se cosecharon de tres a cinco meses después del trasplante. El procedimiento produjo transformantes de locus único a una tasa de aproximadamente 50 % (Aldemita y Hodges 1996, Chan y col. 1993, Hiei y col. 1994).
Transformación de maíz
La transformación de maíz (Zea mays) se realizó con una modificación del procedimiento descrito por Ishida y col. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación es dependiente del genotipo en maíz y solo genotipos específicos son susceptibles a transformación y regeneración. Como progenitores, la línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o híbridos con A188, son buenas fuentes de material donante para la transformación aunque también pueden usarse otros genotipos satisfactoriamente. Se cosecharon espigas de plantas de maíz
aproximadamente 11 días después de la polinización (DDP) cuando la longitud del embrión inmaduro era de aproximadamente 1 a 1,2 mm. Los embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión y las plantas transgénicas se recuperaron a través de organogénesis. Los embriones cortados se cultivaron en medio de inducción de callo y después en medio de la regeneración de maíz, que contenía el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, aunque pueden usarse diversos marcadores de selección). Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25 ºC durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollasen los brotes. Los brotes verdes se transfirieron desde cada embrión al medio de enraizamiento de maíz y se incubaron a 25 ºC durante 2-3 semanas, hasta el desarrollo de las raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.
Transformación de trigo
La transformación de trigo se realizó con el procedimiento descrito por Ishida y col. (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. Normalmente se utiliza la variedad de cultivo Bobwhite (disponible en CIMMYT, México) para la transformación. Embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión y las plantas transgénicas se recuperaron a través de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones se cultivaron in vitro en medio de inducción de callo, después en medio de regeneración que contiene el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, aunque pueden utilizarse diversos marcadores de selección). Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25 ºC durante 2-3 semanas o hasta que se desarrollasen los brotes. Los brotes verdes se transfirieron desde cada embrión al medio de enraizamiento y se incubaron a 25 ºC durante 2-3 semanas, hasta el desarrollo de las raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.
Transformación de soja
La soja se transformó de acuerdo con una modificación del procedimiento descrito en el Texas A y M patente de Estados Unidos 5.164.310. Diversas variedades comerciales de soja son susceptibles a transformación mediante este procedimiento. La variedad de cultivo Jack (disponible en la fundación Illinois Seed) se utiliza normalmente para la transformación. Se esterilizaron semillas de soja para la siembra in vitro. El hipocotiledóneo, el radículo y un cotiledón se extirparon de plántulas jóvenes de siete días de vida. El epicótilo y el cotiledón restantes se cultivaron adicionalmente para desarrollar nodos axilares. Estos nodos axilares se extirparon y se incubaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión. Después del tratamiento de co-cultivo, los explantes se lavaron y se transfirieron a medios de selección. Los brotes regenerados se extirparon y se colocaron en un medio de elongación de brote. Los brotes no mayores de 1 cm se colocaron en medio de enraizamiento hasta que se desarrollaron las raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.
Transformación de colza/canola
Peciolos cotiledonarios e hipocótilos de plántulas jóvenes de 5-6 días de vida se utilizaron como explantes para el cultivo tisular y se transformaron de acuerdo con Babic y col. (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). La variedad de cultivo comercial Westar (Agriculture Canadá) es la variedad convencional usada para transformación, pero también pueden usarse otras variedades. Se esterilizaron semillas de canola en la superficie para la siembre in vitro. Explantes de peciolos cotiledonarios con el cotiledón unido se extirparon de las plántulas in vitro y se inocularon con Agrobacterium (que contenía el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante del peciolo en la suspensión bacteriana. Después, los explantes se cultivaron durante 2 días en medio MSBAP-3 que contenía BAP 3 mg/l, sacarosa al 3 %, Fitagar al 0,7 % a 23 ºC, 16 h de luz. Después de dos días de co-cultivo con Agrobacterium, los explantes de peciolos se transfirieron a medio MSBAP-3 que contenía BAP 3 mg/l, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días y después se cultivaron en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración del brote. Cuando los brotes tenía una longitud de 5 -10 mm, se cortaron y se transfirieron al medio de elongación de brote (MSBAP-0,5 que contenía BAP 0,5 mg/l). Los brotes de aproximadamente 2 cm de longitud se transfirieron al medio de enraizamiento (MS0) para la inducción de raíces. Los brotes enraizados trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.
Transformación de alfalfa
Utilizando el procedimiento de (McKersie y col., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) se transformó un clon de regeneración de alfalfa (Medicago sativa). La regeneración y transformación de la alfalfa es dependiente del genotipo y por lo tanto se requiere una planta regenerada. Se han descrito procedimientos para obtener plantas regeneradas. Por ejemplo, estas pueden seleccionarse de variedades de cultivo Rangelander (Agriculture Canadá) o de cualquier otra variedad comercial de alfalfa como describen Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112). Como alternativa, se ha seleccionado la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) para su uso en cultivo tisular (Walker y col., 1978 Am J Bot 65: 654-659). Explantes de peciolos se co-cultivaron durante
una noche con un cultivo de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie y col., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contenía el vector de expresión. Los explantes se co-cultivaron durante 3 días en la oscuridad en un medio de inducción SH que contenía Pro 288 mg/l, tioprolina 53 mg/l, K2SO4 4,35 g/l y acetosiringinona 100 m. Los explantes se lavaron en medio Murashige-Skoog de fuerza media (Murashige y Skoog, 1962) y se sembraron en placas en el mismo medio de inducción SH con acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y un antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfirieron al medio de desarrollo BOi2Y que no contenía reguladores de crecimiento, sin antibióticos, y sacarosa 50 g/l. Posteriormente, los embriones somáticos germinaron en medio Murashige-Skoog de fuerza media. Las plántulas enraizadas se trasplantaron en macetas y se cultivaron en un invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.
Transformación de algodón
La transformación de algodón (Gossypium hirsutum L.) se realizó usando Agrobacterium tumefaciens en explantes de hipocotiledóneos. Las variedades de cultivo comerciales tales como Coker 130 o Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) son variedades estándar usadas para la transformación, pero también pueden usarse otras variedades. Las semillas se esterilizaron en la superficie y germinaron en la oscuridad. Los explantes de hipocotiledóneos se extirparon de las plántulas germinadas a longitudes de aproximadamente 1-1,5 cm. El explante hipocotiledóneo se sumergió en el inóculo de Agrobacterium tumefaciens, que contenía el vector de expresión, durante 5 minutos y después se co-cultivó durante aproximadamente 48 horas en MS +1,8 mg/l KNO3 + glucosa al 2 % a 24 ºC en la oscuridad. Los explantes se transfirieron al mismo medio que contenía marcadores seleccionables apropiados de bacterias y plantas (renovados varias veces) hasta observar callos embriogénicos. Los callos se separaron y se subcultivaron hasta aparecer embriones somáticos. Las plántulas procedentes de los embriones somáticos maduraron en medio de enraizamiento hasta el desarrollo de las raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron a macetas en el suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.
Ejemplo 7: procedimiento de evaluación fenotípica
7.1 Configuración de la Evaluación
Se generaron aproximadamente 35 transformantes de arroz T0 independientes. Los transformantes primarios se transfirieron desde una cámara de cultivo tisular a un invernadero para siembra y cosecha de la semilla T1. Se conservaron siete acontecimientos, de los cuales la progenie T1 segregó 3:1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos acontecimientos, se seleccionan aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían el transgén (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas T1 que carecían del transgén (nulicigotos) supervisando la expresión con marcador visual. Las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotos se cultivaron a cada lado en posiciones aleatorias. Las condiciones en el invernadero eran días cortos (12 horas de luz), 28 ºC con luz y 22 ºC en oscuridad, y una humedad relativa del 70 %. Las plantas crecieron en condiciones sin estrés y se les proporcionó agua a intervalos regulares para asegurar que el agua y los nutrientes no eran limitantes para satisfacer las necesidades de la planta para el crecimiento completo y desarrollo.
Adicionalmente se evaluaron cuatro acontecimientos T1 en la generación T2 siguiendo el mismo procedimiento de evaluación que el de la generación T1 pero con más individuos por acontecimiento. Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez las plantas pasaron varias veces a través de una cabina de formación de imágenes digital. En cada punto de tiempo se tomaron imágenes digitales (2048x1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.
Detección de Sequía
Se cultivaron plantas de semillas T2 en suelo de maceta en condiciones normales hasta que alcanzaron la etapa de encabezamiento. Después se transfirieron a una sección “seca” donde se mantenía el riego. Se insertaron sondas de humedad en macetas seleccionadas al azar para supervisar el contenido hídrico del suelo (CHS). Cuando el CHS estaba por debajo de determinados umbrales, las plantas volvieron a regarse automáticamente de manera continua hasta que de nuevo alcanzaron un nivel normal. Después las plantas se volvieron a transferir a condiciones normales. El resto del cultivo (maduración de planta, cosecha de semilla) fue igual que para las plantas que no se cultivaron en condiciones de estrés abiótico. Los parámetros de cultivo y rendimiento se registraron como se detalla para el cultivo en condiciones normales.
Detección de la eficiencia del uso de nitrógeno
Se cultivaron plantas de arroz de semillas T2 en suelo de maceta en condiciones normales excepto para la solución de nutrientes. Las macetas se regaron desde el trasplante hasta la maduración con una solución de nutrientes específica que contenía un contenido de nitrógeno N (N) reducido, normalmente entre 7 a 8 veces menor. El resto del cultivo (maduración de planta, cosecha de semilla) es igual que para las plantas que no se cultivaron bajo estrés abiótico. Los parámetros de cultivo y rendimiento se registraron como se detalla para el cultivo en condiciones normales.
7.2 Análisis estadístico: ensayo F
Se utilizó un ANOVA (análisis de varianza) de dos factores como un modelo estadístico para la evaluación global de las características fenotípicas de la planta. Se realizó un ensayo F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los acontecimientos transformados con el gen de la presente invención. El ensayo F se realizó para verificar un efecto del gen sobre todos los acontecimientos de transformación y para verificar un efecto global del gen, también conocido efecto génico global. El umbral de significado de un efecto génico global verdadero se establece a un nivel de probabilidad de 5 % para el ensayo F. Un valor significativo del ensayo F para un efecto génico, significa que no solo la mera presencia o la posición del gen ocasionan las diferencias en el fenotipo.
Dado que se habían realizado dos experimentos con acontecimientos solapantes, se realizó un análisis combinado. Esto es útil para verificar la coherencia de los efectos sobre los dos experimentos, y si fuera este el caso, acumular pruebas de ambos experimentos para aumentar la confianza en la conclusión. El procedimiento utilizado fue una estrategia de modelo mixta que considera la estructura multinivel de los datos (es decir, experimento acontecimiento -segregantes). Los valores de P se obtuvieron comparando el ensayo de relación de probabilidad con distribuciones de chi cuadrado.
7.3 Parámetros medidos
Medición de parámetros relacionados con biomasa
Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez las plantas pasaron varias veces a través de una cabina de formación de imágenes digital. En cada punto de tiempo se tomaron imágenes digitales (2048x1536 pixeles, 16 millones de colores) de cada planta desde al menos 6 ángulos diferentes.
El área por encima de la superficie de la planta (o biomasa foliar) se determinó contando el número total de pixeles en las imágenes digitales de las partes de la planta por encima de la superficie discriminadas del fondo. Este valor se promedió para las imágenes tomadas en el mismo momento de los diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración. Los experimentos mostraron que el área de la planta por encima de la superficie medida de este modo se correlacionaba con la biomasa de las partes de la planta por encima de la superficie. El área por encima de la superficie es el área medida en el momento en el que la planta ha alcanzado su máxima biomasa foliar. El vigor temprano es el área por encima de la superficie de la planta (plántula) tres semanas después de la germinación. El aumento de la biomasa radicular se expresa como un incremento en la biomasa radicular total (medido como biomasa radicular máxima observada durante la vida útil de una planta); o como un aumento en el índice de raíz/brote (medido como la relación entre la masa radicular y la masa de brote en el período de crecimiento activo de raíces y brotes).
El vigor de emergencia se determinó contando el número total de pixeles de las partes de la planta por encima de la superficie discriminadas del fondo. Este valor se promedió para las imágenes tomadas en el mismo momento desde diferentes ángulos y se convirtió a un valor de superficie física expresado en mm cuadrados por calibración. Los resultados descritos a continuación son para plantas tres semanas después de la germinación.
Mediciones de parámetros relacionados con la semilla
Las panículas primarias maduras se cosecharon, se contaron, se metieron en bolsas, se etiquetaron con código de barras y después se secaron durante tres días en un horno a 37 ° C. Después, las panículas se trillaron y todas las semillas se recogieron y se contaron. Las vainas llenas se separaron de las vacías utilizando un dispositivo de soplado de aire. Las vainas vacías se desecharon y la fracción restante volvió a contarse. Las vainas llenas se pesaron en una balanza analítica. El número de semillas llenas se determinó contando el número de vainas llenas que quedaron después de la etapa de separación. El rendimiento total de la semilla se midió pesando todas las vainas llenas cosechadas de una planta. El número total de semillas por planta se midió contando el número de vainas cosechadas de una planta. El peso de mil granos (PMG) se extrapoló del número de semillas llenas contadas y de su peso total. El índice de cosecha (IC) en la presente invención se define como la relación entre el rendimiento de semilla total y el área por encima de la superficie (mm2), multiplicado por un factor de 106. El número total de flores por panícula como se define en la presente invención es la relación entre el número total de semillas y el número de panículas primarias maduras. La tasa de llenado de semilla, como se define en la presente invención, es la proporción (expresada en %) del número de semillas llenas sobre el número total de semillas (o floretes).
Ejemplo 8: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas transgénicas
A continuación se presentan los resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas que expresan el ácido nucleico de JMJC como se representa por la SEC ID Nº: 1 en condiciones sin estrés. Se observó un aumento de al menos 5% para el vigor de emergencia (vigor temprano), índice de raíz/brote, rendimiento total de las semillas, índice de cosecha, y de al menos 3% para el peso de mil granos en las plantas transgénicas en comparación con las plantas de control nulizigotas.
Los resultados de la evaluación de las plantas de arroz trasgénicas que expresan SEC ID Nº: 1 en condiciones de estrés por sequía se presentan de acuerdo con este documento. Se observó un aumento de al menos 5 % para el
índice de raíz/brote, peso total de las semillas, número de semillas llenas, tasa de llenado, índice de cosecha y de al menos 3 % para el peso de mil granos en las plantas trasgénicas cuando se compararon con las plantas nulicigotas de control.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> BASF Plant Science GmbH
<120> Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas
<130> PF59065-EP-4
<160> 98
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 1257
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 1
<210> 2
<211> 418
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 2
<210> 3
<211> 2194
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 3
<210> 4
<211> 54
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 1
<400> 4 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aaacaatgtc aggagctacc accg 54
<210> 5
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 2
<400> 5 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta aaataaatcc attcgctacg 50
<210> 6
<211> 152
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio JMJ-de SEC ID Nº: 02
<400> 6
<210> 7
<211> 32
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> caja conservada en el dominio JMJ-C de SEC ID Nº: 02
<400> 7
<210> 8
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio DUF335
<400> 8
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> motivo conservado
<220>
<221> INCIERTO
<222> (11)..(11)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<400> 9
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia consenso de unión a FE(II)
<220>
<221> INCIERTO
<222> (2)..(2)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)..(3)
<223> / reemplazar = "Val"
<400> 10
<210> 11
<211> 1290
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 11
<210> 12
<211> 429
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 12
<210> 13
<211> 1518
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 13
<210> 14
<211> 505
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 14
<210> 15
<211> 1038
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 15
<210> 16
<211> 431
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 16
<210> 17
<211> 1142
<212> ADN
<213> Medicago truncatula
<400> 17
<210> 18
<211> 361
<212> PRT
<213> Medicago truncatula
<400> 18
<210> 19
<211> 1071
<212> ADN
<213> Brachypodium sylvaticum
<400> 19
<210> 20
<211> 356
<212> PRT
<213> Brachypodium sylvaticum
<400> 20
<210> 21
<211> 1080
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 21
<210> 22
<211> 354
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 22
<210> 23
<211> 3552
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 23
<210> 24
<211> 1183
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 24
<210> 25
<211> 2793
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 25 <210> 26
<211> 930
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 26
<210> 27
<211> 2793
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 27 <210> 28
<211> 930
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 28
<210> 29
<211> 2835
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 29 <210> 30
<211> 944
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 30
<210> 31
<211> 2643
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 31 <210> 32
<211> 880
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 32
<210> 33
<211> 2364
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 33 <210> 34
<211> 787
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 34
<210> 35
<211> 2652
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 35 <210> 36
<211> 883
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 36
<210> 37
<211> 3351
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 37 <210> 38
<211> 1116
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 38
<210> 39
<211> 2751
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 39 <210> 40
<211> 916
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 40
<210> 41
<211> 2421
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 41 <210> 42
<211> 806
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 42
<210> 43
<211> 2127
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 43 <210> 44
<211> 708
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 44
<210> 45
<211> 3084
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 45 <210> 46
<211> 1027
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 46
<210> 47
<211> 4083 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 47 <210> 48
<211> 1360
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 48
<210> 49
<211> 2523
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 49 <210> 50
<211> 840
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 50
<210> 51
<211> 2865
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 51 <210> 52
<211> 954
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 52
<210> 53
<211> 2694
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 53 <210> 54
<211> 897
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 54
<210> 55
<211> 4023
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 55 <210> 56
<211> 1340
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 56
<210> 57
<211> 1509
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 57
<210> 58
<211> 502
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 58 <210> 59
<211> 2124
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 59
<210> 60
<211> 707
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 60
<210> 61
<211> 1389
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 61 <210> 62
<211> 462
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 62 <210> 63
<211> 1188
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 63
<210> 64
<211> 395
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 64 <210> 65
<211> 3861
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 65 <210> 66 <211> 1286
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 66
<210> 67
<211> 2994
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 67 <210> 68
<211> 997
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 68
<210> 69
<211> 2988
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 69 <210> 70
<211> 995
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 70
<210> 71
<211> 2607
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 71 <210> 72
<211> 868
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 72
<210> 73
<211> 1062
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 73
<210> 74
<211> 353
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 74
<210> 75
<211> 2784
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 75 <210> 76
<211> 927
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 76
<210> 77
<211> 2862
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 77 <210> 78
<211> 953
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 78
<210> 79
<211> 3171
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 79 <210> 80
<211> 1056
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 80
<210> 81
<211> 3159
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 81 <210> 82
<211> 1052
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 82
<210> 83
<211> 3717
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 83 <210> 84
<211> 1238
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 84
<210> 85
<211> 2916
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 85 <210> 86
<211> 971
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 86
<210> 87
<211> 1140
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 87 <210> 88
<211> 379
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 88 <210> 89
<211> 2577
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 89 <210> 90
<211> 858
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 90
<210> 91
<211> 1566
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 91
<210> 92
<211> 521
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 92
<210> 93
<211> 432
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 93
<210> 94
<211> 143
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 94 <210> 95
<211> 4101
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 95 <210> 96
<211> 1366
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 96
<210> 97
<211> 1242
<212> ADN
<213> Glycine max
<400> 97 <210> 98
<211> 413
<212> PRT
<213> Glycine max
<400> 98

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para aumentar en las plantas al menos un rasgo relacionado con el rendimiento, seleccionado de, vigor de emergencia de la planta, índice de raíz/brote, rendimiento de semilla, tasa de llenado de semilla, índice de semilla y peso de mil granos en las plantas con respecto a plantas de control, que comprende aumentar en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC, en el que dicho polipéptido JMJC comprende un dominio JmjC representado por una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 60 % o más con:
    (i)
    SEC ID Nº: 6; y/o
    (ii)
    uno o más de los dominios JmjC comprendidos en los polipéptidos JMJC representados por SEC ID Nº: 12; SEC ID Nº: 14; SEC ID Nº: 24; SEC ID Nº: 26; SEC ID Nº: 32; SEC ID Nº: 34, SEC ID Nº: 36; SEC ID Nº: 38; SEC ID Nº: 40; SEC ID Nº: 42; SEC ID Nº: 44; SEC ID Nº: 46; SEC ID Nº: 48; SEC ID Nº: 50; SEC ID Nº: 52; SEC ID Nº: 56; SEC ID Nº: 58; SEC ID Nº: 60; y SEC ID Nº: 62, cuyas coordenadas de aminoácidos se proporcionan en la Tabla A4; y
    (iii) en el que dichos polipéptidos JMJC comprenden un motivo que tiene una identidad de secuencia de al menos 60 % o más con una cualquiera o más de:
    (a)
    SEC ID Nº: 7,
    (b)
    SEC ID Nº: 8,
    (c)
    SEC ID Nº: 9,
    (d)
    SEC ID Nº: 10.
  2. 2.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha expresión aumentada se efectúa introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC.
  3. 3.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC codifica una cualquiera de las proteínas indicadas en la Tabla A1 o es una porción de dicho ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridar con dicho ácido nucleico.
  4. 4.
    El procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia de ácido nucleico codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las proteínas proporcionadas en la Tabla A1
  5. 5.
    Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho ácido nucleico codifica la SEC ID Nº: 2.
  6. 6.
    Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichos rasgos aumentados relacionados con el rendimiento comprenden aumento del índice de cosecha y/o del rendimiento de la semilla con respecto a las plantas de control.
  7. 7.
    Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho rasgo aumentado relacionado con el rendimiento comprende vigor de emergencia de la planta con respecto a plantas de control.
  8. 8.
    Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho rasgo aumentado relacionado con el rendimiento se obtiene en condiciones sin estrés.
  9. 9.
    Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho rasgo aumentado relacionado con el rendimiento se obtiene en condiciones de crecimiento de estrés por sequía leve.
  10. 10.
    Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho rasgo aumentado relacionado con el rendimiento se obtiene en condiciones de crecimiento de déficit de nitrógeno.
  11. 11.
    Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que dicho ácido nucleico está unido operativamente a un promotor constitutivo, preferentemente a un promotor GOS2, más preferentemente a un promotor GOS2 de arroz.
  12. 12.
    Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC es de origen vegetal, preferentemente de una planta dicotiledónea, preferentemente además de la familia Brassicaceae, más preferentemente del género Arabidopsis, lo más preferentemente de Arabidopsis thaliana.
  13. 13.
    Planta o parte de la misma, incluyendo las semillas, que puede obtenerse mediante un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha planta o parte de la misma comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido JMJC como se define en la reivindicación 1, unido operativamente a un promotor GOS2.
  14. 14.
    Construcción que comprende:
    (i)
    un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se define en la reivindicación 1;
    (ii)
    una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácido nucleico de (i) que comprende un promotor GOS2; y opcionalmente
    (iii) una secuencia de terminación de la transcripción
  15. 15.
    Construcción de acuerdo con la reivindicación 14, en la que dicho promotor GOS2 es de arroz.
  16. 16.
    El uso de una construcción de acuerdo con la reivindicación 14 o 15 en un procedimiento para producir plantas que tienen rendimiento aumentado, particularmente vigor de emergencia de planta y/o rendimiento de semilla aumentado con respecto a plantas de control.
  17. 17.
    Planta, parte de planta, o célula de planta transformada con una construcción de acuerdo con la reivindicación 14 o15.
  18. 18.
    Procedimiento de producción de una planta transgénica que tiene rendimiento aumentado, particularmente vigor de emergencia de planta y/o rendimiento de semilla aumentado con respecto a plantas de control, que comprende:
    (i)
    introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se define en la reivindicación 1 bajo el control de un promotor GOS2; y
    (ii)
    cultivar la célula de la planta en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.
  19. 19.
    Planta transgénica que tiene rendimiento aumentado, particularmente vigor de plántula de la planta aumentado y/o rendimiento de semilla aumentado, respecto a plantas de control, resultante de expresión aumentada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se define en la reivindicación 1 o 2, o una célula de planta transgénica procedente de dicha planta transgénica, en la que dicha planta comprende una construcción de acuerdo con la reivindicación 14 o 15.
  20. 20.
    Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 13, 17, o 19, o una célula de planta transgénica obtenida de la misma, en la que dicha planta es una planta de cultivo o una monocotiledónea o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo y avena.
  21. 21.
    Partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 20, en las que dichas partes cosechables son preferentemente biomasa de brotes y/o semillas y en las que dichas partes cosechables comprenden una construcción de acuerdo con la reivindicación 14 o 15.
  22. 22.
    El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido JMJC como se define en la reivindicación 1 en el aumento del rendimiento, particularmente en el aumento del rendimiento de semilla y/o biomasa de brote en plantas, con respecto a plantas de control.
    FIGURA 1
    SEC ID Nº: 1, ADN -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 2, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 3, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5
    SEC ID Nº: 4, ADN -Secuencia artificial-cebador 1 SEC ID Nº: 5, ADN -Secuencia artificial-cebador 2 SEC ID Nº: 6, proteína -Secuencia artificial-dominio JMJ-C de
    SEC ID Nº: 2
    SEC ID Nº: 7, proteína -Secuencia artificial-caja conservada en el dominio JMJ-C de SEC ID Nº: 2
    SEC ID Nº: 8, proteína -Secuencia artificial-dominio DUF335
    SEC ID Nº: 9, proteína -Secuencia artificial -motivo conservado
    SEC ID Nº: 10, proteína -Secuencia artificial -secuencia consenso de unión a Fe(II)
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 11, ADN -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 12. -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 13. ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 14, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 15, ADN -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 16, proteína -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 17, ADN -Medicago truncatula
    SEC ID Nº: 18, proteína -Medicago truncatula
    SEC ID Nº: 19, ADN -Brachypodium sylvaticum
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 20, proteína -Brachypodium sylvaticum
    SEC ID Nº: 21, ADN -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 22, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 23, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 24, proteína -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 25, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 26, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 27, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 28, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 29, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 30, proteína -Arabidopsis thaliana.
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 31, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 32, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 33, proteína -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 34, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 35, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 36, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 37, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 38, proteína -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 39, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 41, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 42 -ADN -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 43 -ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 44, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 45, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 46, proteína -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 47, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 48, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 49, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 50, proteína -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 51, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 52, proteína -Arabidopsis thaliana.
    SEC ID Nº: 53, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 54, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 55, ADN -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 56, proteína -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 57, ADN -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 58, proteína -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 59, ADN -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 60, proteína -Arabidopsis thaliana
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 61, ADN -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 62, proteína -Arabidopsis thaliana
    SEC ID Nº: 63, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 64, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 65, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 66, proteína -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 67, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 68, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 69, proteína -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 70, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 71, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 72, proteína -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 73, ADN -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 74, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 75, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 76, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 77, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 78, proteína -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 79, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 80, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 81, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 82, proteína -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 83, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 84, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 85, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 86, proteína -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 87, ADN -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 88, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 89, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 90, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 91, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 92, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 93, ADN -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 94, proteína - Oryza sativa
    SEC ID Nº: 95, ADN -Oryza sativa
    FIGURA 5 (continuación) FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 96, proteína -Oryza sativa
    SEC ID Nº: 97, ADN -Glycine max
    FIGURA 5 (continuación)
    SEC ID Nº: 98, proteína -Glycine max
    FIGURA 5 (continuación)
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