CN110183524B - 一个促进大豆主根伸长的基因GmKRP2a、蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个促进大豆主根伸长的基因GmKRP2a、蛋白及其应用，公开了促进大豆主根伸长的基因GmKRP2a的核苷酸序列、蛋白序列，利用大豆根组织特异表达的启动子以及干旱诱导表达的启动子驱动本专利中的GmKRP2a基因，可有效促进大豆根系在干旱胁迫时的根长。较长的主根系能有效吸收土壤深处的水，显著促进大豆的抗旱性，从而增加大豆产量。可在高产但是抗旱性较差的大豆品种中过量表达本发明涉及的基因，转基因株系的根长较非转基因株系的根长可长35‑50%。

Description

一个促进大豆主根伸长的基因GmKRP2a、蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一个促进大豆主根伸长的基因GmKRP2a、蛋白及其应用。

背景技术

我国大豆消费主要应用在榨油和食品消费方面，由于近年来我国对植物油脂和饲用蛋白的需求量急剧增加，导致大豆供不应求，进口量逐渐攀升。2009至2010年度，大豆进口量飙升到5034万吨，2017年全国大豆消费量9300万吨，其中国内产量才1000多万吨，进口大豆8169万吨、豆油881.79万吨。因此加快我国大豆产业发展，对于保障我国粮油食品安全具有重要的战略意义。2019年中央“一号文件”提出实施大豆振兴计划，全力推进大豆产业的发展。未来5年，大豆种植被国家列为种植的黄金产业！国家拿出35亿补贴种植和玉米相同收益的大豆，不仅是种植结构的调整，更是给规模农业种植者指明了至少5年非常明确的种植方向！因此大豆种植市场要求通过加快科技创新、实现增产增效、节本增效、提质增效。然而，大豆根系不发达，种植过程中需水量多，在豆类作物中对缺水最为敏感，我国每年因为干旱对大豆产量和品质造成的损失不可估量。另外随着人口增长、城镇和工业的发展、全球气候的变化以及环境污染的加重，农业的可持续发展又面临着严重的水危机(Boyer etal.,2013；Lesk et al.,2016)。我国2016-2018年平均每年农作物因旱灾造成的直接经济损失超300亿元(国民经济和社会发展统计公报)。因此培育转基因抗旱大豆是有效的快捷途径。

细胞周期(cell cycle)在植物生长发育过程中是受到严格调控的。在细胞周期的调控中，细胞周期蛋白(Cyclin,CYC)和细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependentKinase,CDK)是控制细胞分裂过程的调控机器的核心组分，在细胞周期的各个阶段，不同的CDK与CYC结合从而推动细胞周期的运转(Velappan et al.,2017)。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(inhibitor of CDK，CKI)是细胞周期中一种重要的调控蛋白，通过与CDK/CYC复合体结合而抑制CDK的活性。CKI使细胞分裂减慢，进而细胞周期进程被阻滞，失去增殖活性，从而影响到植物的生长和发育(Kumar and Larkin,2017)。

植物根系的生长发育离不开细胞的分裂和分化，无论是根原基的起始与分裂,还是分生组织的形成和活化,都涉及到细胞周期中的细胞分裂和细胞生长两个交替循环的过程(吴娇娇等，2008)。改变细胞周期蛋白的表达水平会影响根系的发育，如在拟南芥根中过量表达CYCD2；1促进细胞分裂，抑制核内复制(Qi and John,2007)。

植物根系发育是一个非常复杂且被精确调控的过程，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子以及多种激素都参与这个过程。根系也是作物吸收水分和养分的重要器官，其形态决定了作物获得养分和水分的能力，根系发育愈好,受水分胁迫危害的程度就愈小,抗旱性亦愈强，具有强大的根系是作物抗旱品种的重要特征(郭宾会等，2018)。

本发明涉及的基因尚未在大豆中克隆，其如何参与根系发育尚未有报道。

发明内容

目前干旱灾害频繁发生，而绝大多数的大豆品种抗旱性不强，因此培育具有强大根系的大豆品种，提高土壤的水分利用效率，是解决现代农业发展水资源匮乏的有力措施。为了克服上述缺陷，本发明提供一个促进大豆主根伸长的基因GmKRP2a、蛋白及其应用，本发明中GmKRP2a基因的过量表达显著促进大豆主根的伸长，增强大豆在干旱导致的土壤低水位时的适应性。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：一个促进大豆主根伸长的蛋白，所述的蛋白为如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与促进大豆主根伸长相关的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白质。

SEQ ID NO.2

MEMAQVKARARTALAMAASASSRKRRKISINNNFVQIKSLSNATVPATGERISGESPASCCSSNGSVDDENRIIKFSDLEVESTRVVTSTCDCGEQQQQIRREMSLTSELRITNSSSQEVDSAEEQITQTKSLPPQKMPTELELDEFFAAAEKDIRKRFSDKYNYDIVKDVSLEGRYEWVKLKP

本发明还提供编码前述蛋白的GmKRP2a基因(即GmKRP2a基因)。所述基因是如下(a1)-(a3)中任何一种的DNA分子；

(a1)SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA序列杂交且编码促进大豆主根伸长相关蛋白的DNA分子；

(a3)与(a1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性且编码促进大豆主根伸长相关蛋白的DNA分子。

SEQ ID NO.1

5’ATGGAGATGGCTCAGGTTAAGGCACGAGCTCGAACTGCATTGGCCATGGCCGCTTCCGCAAGTTCACGGAAGAGAAGAAAAATCTCGATCAACAACAACTTCGTTCAAATCAAGAGTTTGAGCAACGCAACCGTGCCGGCGACGGGGGAACGAATCTCCGGGGAATCTCCGGCGTCTTGCTGCTCCAGCAACGGATCCGTCGACGATGAAAACCGAATCATCAAATTCTCAGATCTAGAGGTTGAGAGCACGCGAGTTGTAACGTCGACGTGCGACTGCGGTGAACAACAACAACAAATAAGGAGAGAGATGAGTCTCACGAGCGAGCTTCGAATCACGAATTCTTCTTCGCAAGAGGTGGATTCAGCGGAGGAGCAGATCACCCAAACCAAATCTTTGCCGCCGCAGAAAATGCCGACGGAGTTGGAGCTCGATGAATTCTTCGCCGCTGCTGAGAAAGATATTCGGAAACGCTTCTCAGACAAGTATAATTATGATATTGTGAAGGACGTGTCATTGGAAGGACGATACGAGTGGGTTAAATTGAAGCCATAA3’

本发明还提供前述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

本发明又提供(b1)或(b2)或(b3)或(b4)的应用：

(b1)前述蛋白，或，前述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在促进大豆主根伸长中的应用；

(b2)前述蛋白，或，前述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育大豆抗旱新品种中的应用；

(b3)前述蛋白，或，前述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控大豆主根长度中的应用；

(b4)前述蛋白，或，前述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育根深大豆品种中的应用。

本发明还公开一种培育增加根深的转基因植物的方法，通过提高目的植物中所述蛋白的含量或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的根深大于所述目的植物。所述的转基因植物表达所述的促进大豆主根伸长的蛋白，或者含有前述的基因。其中转基因植物和目的植物均为大豆，也可以为拟南芥等。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：利用大豆根组织中特异表达且受到干旱诱导的启动子驱动本专利中的GmKRP2a基因，可有效促进大豆根系在干旱胁迫时的根长。较长的主根系能有效吸收土壤深处的水，显著促进大豆的抗旱性，从而增加大豆产量。可在高产但是抗旱性较差的大豆品种中过量表达本发明涉及的基因，转基因株系的根长相较可长35-50％。

附图说明

图1.GmKRP2a在大豆不同组织中的表达模式；

图2.Glyma.11G034000基因的启动子的组织表达模式；

图3.GmKRP2a在大豆根中激素(图3A)和干旱胁迫(图3B)下的相对表达模式，

ABA_0.5h：施加200μM ABA 0.5小时；ABA_3h：施加200μM ABA 3小时；IAA_0.5h：施加100nM IAA 0.5小时；IAA_3h：施加100nM IAA 3小时；VMS-root：轻度土壤缺水胁迫时；MS-root：中度土壤缺水胁迫时；SS-root：重度土壤缺水胁迫时；SR-root：重度土壤缺水胁迫后复水48小时；

图4：(图4A和图4B)大豆发根转化实验表明过量表达GmKRP2a基因促进根伸长，(图4C和图4D)不同转基因拟南芥株系(18D、20D和22D)与野生型(Col-0)的根生长的差异，(图4E和图4F)不同转基因拟南芥株系与野生型的下胚轴生长的差异；

图5：利用基因共表达数据筛选到的可能与GmKRP2a相互作用的CYCLN和CDK的候选基因；

图6：细胞膜染色观察转基因拟南芥转基因根内细胞大小与野生型中的差异；

图7：以Glyma.11G034000基因的启动子驱动GmKRP2a基因的双元表达载体构建图(启动子序列SEQ ID NO.3 2098bp：5’-TAATCTCAGGTCCGACAAGGCCTAATTGCTCCAATCAACAAGACTCAGGAGGACGAATAGCCCATAAAGGCTCAAGCCAGCTTCCAACTCCTTATCAAATAAAAAATAATTTCAAAGGCTTAAGCCAGCCTCCAACAACATTAACTGTAGCTTTCCTTGTCAAATAAGAAATAAATTCAAAGACTCCTATTTTTTTAGAAGATAATGACCCTATCATGAAGAAGATAATTACTTTATCTCAATATGTTAGGGAGCATGAAGAGCATTAAACAAGTTAACGGGCTAATGATAAAGCATTGGATATGCGAGTCACATATCTTATATATCCTTCATTTGGCCGCCTTTCAAAATTATAATGTGAAATCTAACCATAACTTTAAAATTTGGGAGCACCTAAAAACTCTCTTAAATAACTAAGACTTTATTTAGATTTTCATAGAATTTATTTTAGAAAAATCAGTGTTAAGAAAATTACTAGTTTTTTAGAATGGTACTATAAGTGAGTTAAACAAATTTATTATATAAAGTTGATAAAAGAAAATAACTTTTTTGGAGTATAAAACCCAAAATCAATTACAGTTACCATAATATAAATTTTGGAACCTCTAAAATTTAACTAAACAAATAAGGATATACTAATTTAAAATTATTTGATATTTCATTCATATACATAAAAGTTGACGTAATATATACTTTTAAAATACACATAACTATGAATAGTTTAATTACTTTTTATTATTTTTCAAATTTGACAAACATTTAAATTATTATATAGTTATAATTCAATGTTTTGATTGATAAAATACACTTTCTGTTTAAAGCTATTACTGGTGTAAAAGTTTATGTGTATATCCTTTTTTTAAGGCACATGTTATTGATAAACTTTCACTTATTTTTAAAAGAAACATGCTGATAATTTACAACTTGAATTTGCTAATAAGCTTCAAAAAGTGTAGATTTATTAAAATAAGAATATATTTGTTGATCCCATCTCGACACTTAATATTGACATTACAACTAGTCGTAATTAAACAATCGAATCAATTATCAATAAATTTTTTATGCAAATTAACTGTATCACAATTATTCTATATATCTTTACCGGTATCTATTGATGCTATTTGCTACCAGAGGGTTGTACCACTAAGAGAAGCTACTGTATTGACTATAATTAATAAGTAAAATACATAGGCATCCAGAATCTTCTGTTTTCTAACAAAAGACTACAAAAAGGGAATGCAAAAAGACAGAGAAGAACAATTCCACTAAGCCGCCCAACCACTAGTGATCAATGGTAGTATTAATTATTGAACAATTCCAAATTGTCATTGAAATAAGGCCGAACAAACATTCTATTTTAAATGTTGGCTTCATTATTTATCGATCTGGAAAAAGAAATACTGGCATTATTAATTAATAGTCAATGAATAAAAACGTGAGCACATGTAATACCCATGTACAATCATCGGAGTTTATGAGCCACGAATATGAGGAGTCTCATTCATATATCTCTCTGTCGGCTGTCATAGTGGAAAAAAAAAATGCCCGTTAACCATATTATTGCCACCATTGTTATCATCATCAATTAATTTTACCCTCCTTTTGTTAATTTGACTAAATGGAAAACGACGTCTCAGGTCTCACATGTGTGTGTCTTTTCTTTTCTTTGTTTTTTTAATGCAAGTGGATCGTTGAGTATGATAATAATATTTGCTTAGGATGCTTATCCATCCAATTTTTATTTTTTTTTAAGTTCCTCGTTTATTGTACATCAATTAATTAATTACTATTGAGCTCATGACTAAGAAAATAAACATGAACACAAATCATAGGATTTTTAAAATACTGAAAAGAGTATACTAAGGGGTTAGATAGGTCCTCGATTATTAATCAAGCGTTATCCAACCACTCTTGTGGGTCCATGGTCGGTGCATGACAACCAAGAATGGCTGTACATTCACAATCAAATCCATTATATTTATGTAGTTTCTTGTTATATAAACCTAAGCAAAGGTTTATGAGGCAGCACTAATTTATATAGCAAGCTAGCTAGGTTGAAAATAGTTTGGTTTTGTAGTAAGTGAGGTGAGGTGCCAAA-3’)

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在克隆包含有GmKRP2a基因完整编码区段的DNA片段，以及验证GmKRP2a基因功能的方法。根据以下描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用于不同的用途和条件。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为本领域常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

农杆菌K599和GV3101菌株，大肠杆菌菌株DH5α和植物过表达载体pEarlyGate301和pMDC83由江苏省扬州大学大豆遗传育种研究室保存。

哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，以下简称为野生型拟南芥。大豆Williams 82种子由江苏省扬州大学大豆遗传育种研究室保存。本发明的主要研究基础如下：

实施例1：大豆GmKRP2a基因的组织表达模式

通过组织表达模式分析大豆Williams 82的花、叶、根瘤、果荚、根、根毛、种子、茎端分生组织和茎(附图1)，结果表明GmKRP2a在不同组织有不同的表达水平，GmKRP2a的表达受到ABA和IAA的调控，而且在土壤干旱时，在大豆根中的表达量较正常土壤水分含量时低(附图3)，预示着GmKRP2a基因受到内源生长信号激素的调控，而且可能参与干旱下大豆根系发育的调控。

实施例2：大豆GmKRP2a基因cDNA的克隆与鉴定

本发明以大豆Williams 82为植物材料，提取7天大豆幼苗根中的总RNA，RNA抽提用RNeasy Plant mini kit(Qiagen,Cat#:74904)，反转录按照RNA to cDNA EcopryTMPremix(Double primed)cDNA合成试剂盒(Cat#639549,Clontech,CA,USA)。以引物(GmKRP2-F:5`-caccATGGAGATGGCTCAGGTTAAG-3`和GmKRP2-R:5`-TGGCTTCAATTTAACCCACTCG-3`)扩增，扩增产物克隆至Gateway的pENTR-D-TOPO(Invitrogen,USA)载体。上述引物序列分别为SEQ ID NO.4-5。测序之后将所得序列与Phytozome和Soybase等数据库进行比对，结果表明该克隆包含完整的预测开放阅读框。该基因片段的编码区长度为555bp，编码区内含有3个内含子和4个外显子，外显子长度分别为240bp、62bp、183bp和70bp。该基因编码184个氨基酸，该蛋白的氨基酸序列为序列表SEQ IDNO.2，序列表中SEQ ID NO.1为其核苷酸序列。

实施例3：大豆根特异诱导性启动子克隆的获得

本发明以大豆Williams 82为植物材料，利用CTAB方法提取7天大豆幼苗根中的总DNA为模板，利用引物(Glyma11g03690.1-PF：5`-

CACCTAATCTCAGGTCCGACAAGG-3`和Glyma11g03690.1-PR:5`-

TTTGGCACCTCACCTCACTTACTAC-3`)扩增，上述引物为SEQ ID NO.6-7。扩增产物克隆至Gateway的pENTR-D-TOPO(Invitrogen,USA)载体。测序之后将所得序列与Phytozome和Soybase等数据库进行比对，该启动子的序列为序列表SEQ ID NO.3。图2表明该启动子驱动的基因主要在根，根毛和根瘤中表达(附图2)。

实施例4：大豆GmKRP2a基因在提高拟南芥主根及下胚轴伸长中的应用

我们的研究结果表明大豆GmKRP2a过量表达促进拟南芥主根和下胚轴伸长，利用发根农杆菌系统研究发现也显著促进大豆根伸长35-50％，因此GmKRP2a作为细胞周期关键调控因子参与大豆根系发育。

1、GmKRP2a基因植物过量表达载体的构建

首先利用Gateway载体的LR反应(LR反应体系中包括Entry克隆100～300ng、pENTR-D-TOPO-GmKRP2a载体1μl、5×LR ClonaseTM反应缓冲液4μl、LR ClonaseTM酶混合物4μl,补充TE缓冲液(pH8.0)至20μL。反应体系置25℃温育16h后加入2μl蛋白酶K溶液,37℃温育10min以终止LR反应)，将GmKRP2a基因克隆至pMDC83双元表达载体上。将LR反应产物转化大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞,提取质粒。对重组质粒进行PCR和酶切鉴定,以确定阳性克隆，并经测序证实构建的过表达重组载体pMDC83-GmKRP2a构建完全正确。

2、重组质粒电击转化根癌农杆菌细胞GV3101和发根农杆菌细胞K599及鉴定

将重组质粒pMDC83-GmKRP2a用电击转化法分别导入GV3101和K599感受态细胞。将电转化杯用75％乙醇浸泡30min后用无水乙醇浸泡，无菌超净台风干；使用前放置于冰上预冷10min。将冰冻的农杆菌感受态细胞GV3101或K599菌株在冰上放置5min，解冻感受态细胞。取1μL重组质粒加入50μL感受态细胞中，混匀，冰上放置30min。取出全部菌液加入电转化杯中，用BIO-RAD电转化仪在1800V电压下，电击1s。迅速加入900μLYEB液体培养基(无抗生素)到电转化杯中，混匀后，全部菌液移入无菌离心管中。于28℃250rpm恢复培养3h。取10μL菌液涂布于含有50mg/l卡那霉素YEB固体培养基上，28℃倒置培养2-3天。提取4个农杆菌单克隆中的质粒，PCR和酶切鉴定含有目的克隆的农杆菌菌株，将正确的菌株在含有50mg/l潮霉素的5mLYEP液体培养基中250rpm培养72h，将菌液加入预冷的50％灭菌甘油中保存于-70℃冰箱备用。

3、过表达GmKRP2a基因拟南芥株系的获得

根据Clough and Bent(1998)的Floral Dipping方法进行拟南芥转化(即：将上个步骤制备的含有重组质粒的菌液转化拟南芥)。取生长一个月左右，生长状况良好的植株，去除已经开放的花朵和结实的果荚，转化前一天浇足水。将含有转基因载体的农杆菌GV3101于28℃培养过夜，至OD600≈2.0，4,500rpm离心10min，菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液中，至终浓度OD600≈0.8。转化时将拟南芥地上部分浸泡于菌液中5-15s，确保全部花苞都被浸没。用吸水纸吸去多余的液体，将植物平放并保持湿度，避光过夜。第二天将植物取出，竖直并转移到正常条件下生长收种。转化液：1/2MS和5％蔗糖，0.02％Silwet L-77(Lehle seeds，Cat.VIS-02)。转基因植株T0种子在含25μg/mL Hyg的抗性培养基上萌发生长，两周后挑取正常生长的转化苗移入土壤中继续生长。

4、过表达GmKRP2A基因拟南芥株系的分子鉴定

利用CTAB的方法提取野生型及转基因植株(所述的植株为拟南芥)基因组DNA，以其为模板对转基因植株进行PCR鉴定。转基因植株鉴定引物同基因克隆引物；PCR检测为阳性的转基因植株种子继续抗性筛选，选择抗：感分离比例为3:1的单株，按单株收获为T2代株系。然后，再次筛选本代植株抗性为100％为T3代纯合转基因株系，用于进一步的实验。

为检测阳性转基因植株中外源基因GmKRP2a的转录表达情况，提取野生型及阳性T3代纯合转基因植株叶片总RNA，各取2μg进行反转录。RNA抽提用RNeasy Plant mini kit(Qiagen,Cat#:74904)，反转录按照RNA to cDNA EcopryTM Premix(Double primed)cDNA合成试剂盒(Cat#639549,Clontech,CA,USA)。检测了8个独立的转基因植株，结果显示GmKRP2a基因在对照野生型拟南芥中无扩增，大部分转基因植株中有外源基因的表达，但不同单株在表达水平上存在差异，选择3株过量表达的转GmKRP2a株系18D，20D和22D进行后续的表型分析和功能鉴定(附图4C-F)。

5、过表达GmKRP2a基因拟南芥株系的表型分析

表面消毒的拟南芥种子点播在MS培养基上(10×10cm方板)，4℃暗中春化处理2天后移至人工气候室中萌发生长。光下竖直培养10天后，分别测量主根的长度，春化后继续暗中培养5天后拍照，利用ImageJ软件测量下胚轴的长度。每个处理测量植株至少30株；重复3次。转基因拟南芥表型初步分析表明，当在拟南芥野生型中过量表达GmKRP2a时，促进主根伸长20-30％(图4：C和D)；进一步比较暗中生长4天的下胚轴长度发现，过量表达GmKRP2a可显著促进拟南芥下胚轴伸长22-38％(图4：E和F)。

实施例5：大豆GmKRP2a基因在提高大豆发根伸长中的应用

1、过表达GmKRP2a基因大豆发根的获得

筛选种皮完整的大豆Williams 82种子放于培养皿中，采用氯气灭菌法(烧杯中加100mL次氯酸钠及4mL浓盐酸)，培养皿及大豆种子共同放于干燥培养皿中密闭灭菌16h左右。将以上灭菌种子种脐朝下，种植于萌发培养基中，每个培养皿12粒左右大豆种子。置于25℃、16h/d光照、8h/d暗条件下使其发芽。萌发培养基为1/4MS+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH5.8。取萌发4-7d的大豆种子，自下胚轴0.3-0.5cm处切下，将子叶一分为二切开，去除顶芽。用刀片在子叶节处轻轻划5-7处伤口，即为外植体。分别取含有目的质粒的发根农杆菌K599菌株及含有空载体的发根农杆菌K599菌株，在超净台上划板过夜培养36h左右获得单克隆菌落。适量抗性LB液体培养基，28℃，220r/min摇床培养过夜。取小体积菌液与抗性LB液体按照1：100比例扩大体积，28℃，220r/min摇至OD600为0.5-0.6左右。将切好的外植体在菌液中浸染30min(水平摇床轻轻转动)。将转染后的子叶节接种到附加3层无菌滤纸的培养皿上(培养皿中加少量液体共培养基)，每个培养皿30-50子叶。黑暗，25℃，培养3-5d。共培养基的成分为1/10MS+154mg/L二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DDT)+40mg/L乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)+蔗糖30g/L，pH 5.8。将共培养后的外植体移入发根诱导培养基，25℃、16h/d光照，8h/d暗条件下中培养。发根诱导培养基为1/2MS+头孢克肟200mg/L+潮霉素50mg/L+琼脂7mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8。约培养2周左右，发根长出。

2、过表达GmKRP2a基因大豆发根的筛选

用镊子截取发根转移至含有潮霉素抗生素的培养基上，转基因根会继续生长，而非转基因根变黄，且不能继续生长。

3、过表达GmKRP2a基因大豆发根的表型分析

截取同等长度的转基因根(过表达GmKRP2a基因和空载体)至新的含有抗生素培养基上竖直培养，观察根的生长状况，并记录根的长度。研究发现：当过量表达GmKRP2a时，生长7天时，转目的基因发根较转空载体发根长35-50％(图4：A和B)。

实施例6：GmKRP2a参与调控细胞分裂的蛋白复合体及分子机理初步分析

通过大豆基因共表达网络(https://www.inetbio.org/soynet/)分析，确定了可能与GmKRP2a形成复合体调控细胞周期的细胞周期蛋白(CYC)和细胞周期蛋白依赖的激酶(CDK)，这为本研究利用酵母双杂交技术明确大豆中细胞周期调控蛋白复合体功能研究打下基础(附图5)。荧光染料PI(Propidium iodide，碘化丙啶)是一种溴化乙啶的类似物，它能与细胞壁上的碳水化合物共价结合，对细胞壁进行标记，在540nm波长的激发下，会在600nm处发出明亮的荧光。利用该染色试剂在荧光显微镜初步观察转基因拟南芥根尖时发现，过量表达GmKRP2a基因的拟南芥根尖细胞变大，细胞分裂是否受到影响需进一步观察更多的实验材料统计分析(图6)。

本发明将来应用主要涉及在大豆根特异高表达且受干旱诱导的启动子驱动该基因的表达，构建可用于大豆转化的双元转化载体，将该载体转入EHA101根癌农杆菌菌株，利用其介导的子叶节转化系统导致该基因在转基因大豆根中过量表达，从而达到转基因在干旱条件下根更长的实验结果，从而增强大豆的抗旱性能，经济效益显著。具体大豆转基因载体pEarlygate301载体构建过程：启动子(SEQ ID NO.3，以下同)克隆到pENTR/D-Topo载体得到pENTR/D-Topo-promoter载体，利用AscI单酶切的方式将GmKRP2a克隆至pENTR/D-Topo-promoter载体，再利用gateway系统的LR反应将启动子和基因克隆至pEarlyGate301载体(附图7)。大豆转基因构建以根癌农杆菌介导的子叶节转化系统，主要参考姬月梅等《农杆菌介导大豆子叶节遗传转化体系的优化研究》，大豆科学，2008年。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一个促进大豆主根伸长的基因GmKRP2a、蛋白及其应用

<130> xhx2019061101

<141> 2019-06-10

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 555

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 1

atggagatgg ctcaggttaa ggcacgagct cgaactgcat tggccatggc cgcttccgca 60

agttcacgga agagaagaaa aatctcgatc aacaacaact tcgttcaaat caagagtttg 120

agcaacgcaa ccgtgccggc gacgggggaa cgaatctccg gggaatctcc ggcgtcttgc 180

tgctccagca acggatccgt cgacgatgaa aaccgaatca tcaaattctc agatctagag 240

gttgagagca cgcgagttgt aacgtcgacg tgcgactgcg gtgaacaaca acaacaaata 300

aggagagaga tgagtctcac gagcgagctt cgaatcacga attcttcttc gcaagaggtg 360

gattcagcgg aggagcagat cacccaaacc aaatctttgc cgccgcagaa aatgccgacg 420

gagttggagc tcgatgaatt cttcgccgct gctgagaaag atattcggaa acgcttctca 480

gacaagtata attatgatat tgtgaaggac gtgtcattgg aaggacgata cgagtgggtt 540

aaattgaagc cataa 555

<210> 2

<211> 184

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2

Met Glu Met Ala Gln Val Lys Ala Arg Ala Arg Thr Ala Leu Ala Met

1 5 10 15

Ala Ala Ser Ala Ser Ser Arg Lys Arg Arg Lys Ile Ser Ile Asn Asn

20 25 30

Asn Phe Val Gln Ile Lys Ser Leu Ser Asn Ala Thr Val Pro Ala Thr

35 40 45

Gly Glu Arg Ile Ser Gly Glu Ser Pro Ala Ser Cys Cys Ser Ser Asn

50 55 60

Gly Ser Val Asp Asp Glu Asn Arg Ile Ile Lys Phe Ser Asp Leu Glu

65 70 75 80

Val Glu Ser Thr Arg Val Val Thr Ser Thr Cys Asp Cys Gly Glu Gln

85 90 95

Gln Gln Gln Ile Arg Arg Glu Met Ser Leu Thr Ser Glu Leu Arg Ile

100 105 110

Thr Asn Ser Ser Ser Gln Glu Val Asp Ser Ala Glu Glu Gln Ile Thr

115 120 125

Gln Thr Lys Ser Leu Pro Pro Gln Lys Met Pro Thr Glu Leu Glu Leu

130 135 140

Asp Glu Phe Phe Ala Ala Ala Glu Lys Asp Ile Arg Lys Arg Phe Ser

145 150 155 160

Asp Lys Tyr Asn Tyr Asp Ile Val Lys Asp Val Ser Leu Glu Gly Arg

165 170 175

Tyr Glu Trp Val Lys Leu Lys Pro

180

<210> 3

<211> 2098

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 3

taatctcagg tccgacaagg cctaattgct ccaatcaaca agactcagga ggacgaatag 60

cccataaagg ctcaagccag cttccaactc cttatcaaat aaaaaataat ttcaaaggct 120

taagccagcc tccaacaaca ttaactgtag ctttccttgt caaataagaa ataaattcaa 180

agactcctat ttttttagaa gataatgacc ctatcatgaa gaagataatt actttatctc 240

aatatgttag ggagcatgaa gagcattaaa caagttaacg ggctaatgat aaagcattgg 300

atatgcgagt cacatatctt atatatcctt catttggccg cctttcaaaa ttataatgtg 360

aaatctaacc ataactttaa aatttgggag cacctaaaaa ctctcttaaa taactaagac 420

tttatttaga ttttcataga atttatttta gaaaaatcag tgttaagaaa attactagtt 480

ttttagaatg gtactataag tgagttaaac aaatttatta tataaagttg ataaaagaaa 540

ataacttttt tggagtataa aacccaaaat caattacagt taccataata taaattttgg 600

aacctctaaa atttaactaa acaaataagg atatactaat ttaaaattat ttgatatttc 660

attcatatac ataaaagttg acgtaatata tacttttaaa atacacataa ctatgaatag 720

tttaattact ttttattatt tttcaaattt gacaaacatt taaattatta tatagttata 780

attcaatgtt ttgattgata aaatacactt tctgtttaaa gctattactg gtgtaaaagt 840

ttatgtgtat atcctttttt taaggcacat gttattgata aactttcact tatttttaaa 900

agaaacatgc tgataattta caacttgaat ttgctaataa gcttcaaaaa gtgtagattt 960

attaaaataa gaatatattt gttgatccca tctcgacact taatattgac attacaacta 1020

gtcgtaatta aacaatcgaa tcaattatca ataaattttt tatgcaaatt aactgtatca 1080

caattattct atatatcttt accggtatct attgatgcta tttgctacca gagggttgta 1140

ccactaagag aagctactgt attgactata attaataagt aaaatacata ggcatccaga 1200

atcttctgtt ttctaacaaa agactacaaa aagggaatgc aaaaagacag agaagaacaa 1260

ttccactaag ccgcccaacc actagtgatc aatggtagta ttaattattg aacaattcca 1320

aattgtcatt gaaataaggc cgaacaaaca ttctatttta aatgttggct tcattattta 1380

tcgatctgga aaaagaaata ctggcattat taattaatag tcaatgaata aaaacgtgag 1440

cacatgtaat acccatgtac aatcatcgga gtttatgagc cacgaatatg aggagtctca 1500

ttcatatatc tctctgtcgg ctgtcatagt ggaaaaaaaa aatgcccgtt aaccatatta 1560

ttgccaccat tgttatcatc atcaattaat tttaccctcc ttttgttaat ttgactaaat 1620

ggaaaacgac gtctcaggtc tcacatgtgt gtgtcttttc ttttctttgt ttttttaatg 1680

caagtggatc gttgagtatg ataataatat ttgcttagga tgcttatcca tccaattttt 1740

attttttttt aagttcctcg tttattgtac atcaattaat taattactat tgagctcatg 1800

actaagaaaa taaacatgaa cacaaatcat aggattttta aaatactgaa aagagtatac 1860

taaggggtta gataggtcct cgattattaa tcaagcgtta tccaaccact cttgtgggtc 1920

catggtcggt gcatgacaac caagaatggc tgtacattca caatcaaatc cattatattt 1980

atgtagtttc ttgttatata aacctaagca aaggtttatg aggcagcact aatttatata 2040

gcaagctagc taggttgaaa atagtttggt tttgtagtaa gtgaggtgag gtgccaaa 2098

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caccatggag atggctcagg ttaag 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggcttcaat ttaacccact cg 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacctaatct caggtccgac aagg 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttggcacct cacctcactt actac 25

Claims (4)

1.由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或编码所述蛋白质的基因或含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在促进大豆主根伸长中的应用。

2.由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或编码所述蛋白质的基因或含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在培育大豆抗旱新品种中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，编码所述蛋白质的基因序列如SEQ IDNO:1所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因的扩增引物序列为：

Glyma11g03690.1-PF：5 `- CACCTAATCTCAGGTCCGACAAGG-3`；Glyma11g03690.1-PR:5`- TTTGGCACCTCACCTCACTTACTAC-3`。

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