ES2553384T3 - Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas - Google Patents

Abstract

Procedimiento para incrementar el rendimiento en semillas y/o la biomasa aérea en plantas en relación con plantas control adecuadas, que comprende incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción que comprende del extremo N-terminal al extremo C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) al menos 65 % de identidad de secuencia con el DBD de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y el Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278, en el que el motivo 1 y el motivo 2 tienen permitidos uno o más cambios conservadores en cualquier posición y / o uno, dos o tres cambio(s) no conservadore(s) en cualquier posición y, opcionalmente, la selección de plantas que tienen mayor rendimiento de semillas y / o biomasa aérea.

Description

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evaluando el nivel de expresión y el patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores bien conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se evalúa midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La fuerza del promotor y/o el patrón de expresión pueden después compararse con los de un promotor de referencia (tal como el utilizado en 5 los procedimientos de la presente invención). Como alternativa, la fuerza del promotor puede evaluarse cuantificando los niveles de ARNm o comparando los niveles de ARNm del ácido nucleico utilizado en el procedimientos de la presente invención, con niveles de ARNm de los genes constitutivos, tal como ARNr 18S, utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tal como transferencia de tipo Northern con análisis densitométrico de autorradiografías, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid y col., 1996 Genome Methods

10 6: 986–994). En general, con “promotor débil” se quiere decir un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificadora a un nivel bajo. Por “nivel bajo” se quiere decir niveles de aproximadamente 1/10.000 transcritos a aproximadamente 1/100.000 transcritos a aproximadamente 1/500.0000 transcritos. Por el contrario, un “promotor fuerte” dirige la expresión de una secuencia de codificación a alto nivel, o aproximadamente 1/10 transcritos a aproximadamente 1/100 transcritos a aproximadamente 1/1.000 transcritos por célula.

15 Unido operativamente

La expresión “unido operablemente” como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora es capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo

20 Un “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayor parte, pero no necesariamente todas, de las fases de crecimiento y desarrollo y en condiciones más ambientales, en al menos una célula, tejido u órgano. La Tabla 2 siguiente proporciona ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2: Ejemplos de promotores constitutivos

Fuente del gen

Referencia

Actina

McElroy et al, Plant Cell, 2: 163–171, 1990

HMGB

Documento WO 2004/070039

CAMV 35S

Odell et al, Nature, 313: 810–812, 1985

CaMV 19S

Nilsson y col., Physiol. Plant. 100:456–462, 1997

GOS2

de Pater et al, Plant J Nov;2(6):837–44, 1992, WO 2004/065596

Ubiquitina

Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992

Ciclofilina del arroz

Buchholz et al, Plant Mol Biol. 25(5): 837–43, 1994

Histona H3 del maíz

Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231:276–285, 1992

Histona H3 de alfalfa

Wu y col., Plant Mol. Biol. 11:641–649, 1988

Actina 2

An et al, Plant J. 10(1); 107–121, 1996

34S FMV

Sanger y col., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443

Subunidad pequeña Rubisco

Documento US 4.962.028

OCS

Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1

Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2

Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

nos

Shaw y col., (1984) Nucleic Acids Res. 12(20):7831–7846

V-ATPasa

Documento WO 01/14572

Súper promotor

Documento WO 95/14098

Proteínas de caja G

Documento WO 94/12015

25 Promotor ubicuo Un promotor ubicuo es activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo. Promotor regulado evolutivamente

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El término “modulación” significa en relación a la expresión o expresión de gen, un procedimiento en el que el nivel de expresión se cambia mediante dicho gen de expresión en comparación con la planta control, preferentemente el nivel de expresión puede aumentarse. La expresión no modulada original puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con traducción posterior. La expresión “modulación de la actividad” significará cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención o las proteínas codificadas, que conduce a un rendimiento aumentado y/o a un crecimiento aumentado de las plantas.

Expresión aumentada/sobreexpresión

El término “expresión aumentada” o “sobreexpresión” como se usa en el presente documento, significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión original de tipo silvestre.

Los procedimientos para aumentar la expresión de genes o productos génicos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos promotores o potenciadores pueden introducirse en una posición adecuada (típicamente cadena arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para regular por aumento la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden alterarse in vivo por mutación, deleción y/o sustitución (véase, Kmiec, patente de EE.UU. 5.565.350; Zarling y col., PCT/US93/03868), o pueden introducirse promotores aislados en una célula vegetal en la orientación y distancia apropiada de un gen de la presente invención de tal manera que se controle la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3 'de una región codificante de polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una diversidad de otros genes de planta, o de ADN-T. La secuencia en el extremo 3’ a añadir puede derivar de, por ejemplo, los genes nopalina sintasa u octopina sintasa, o, como alternativa, de otro gen vegetal, o, menos preferentemente de cualquier otro gen eucariota

También puede añadirse una secuencia intrónica a la región no traducida en 5’ (UTR) o la secuencia codificante de la secuencia de codificación parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha observado que la inclusión de un intrón de corte y empalme en la unidad de transcripción en construcciones de expresión tanto de plantas como de animales aumenta la expresión génica tanto a nivel de proteína como de ARNm hasta 1.000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395 – 4405; Callis y col., (1987) Genes Dev 1:1183– 1200). Dicha potenciación intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se pone cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. En la técnica se conoce el uso de los intrones de maíz, el intrón Adh1-S, 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Para una información general véase: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Gen endógeno

En el presente documento la referencia a un “gen endógeno”, no solo se refiere al gen en cuestión como se encuentra en una planta en su forma natural (es decir, sin existir ninguna intervención humana), sino también se refiere a aquel mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada posteriormente (re)introducida en una planta (un transgén). Por ejemplo, una planta transgénica que contiene dicho transgén puede encontrar una reducción sustancial de la expresión transgénica y/o reducción sustancial de la expresión del gen endógeno.

Expresión disminuida

En el presente documento, se toma que la referencia a “reducción o eliminación sustancial” significa una disminución en la expresión del gen endógeno y/o los niveles de polipéptido y/o actividad de polipéptido con respecto a las plantas control. La reducción o eliminación sustancial está en orden creciente de preferencia al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más reducido en comparación con el de las plantas control.

Para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere una longitud suficiente de nucleótidos sustancialmente contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos. Para realizar el silenciamiento génico, éste puede ser tan pequeño como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, como alternativa éste puede ser tanto como el gen completo (incluyendo la UTR 5' y/o 3' ya sea en parte o en su totalidad). El tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos puede proceder del ácido nucleico que codifica la proteína de interés (gen diana), o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo y homólogo de la proteína de interés. Preferentemente, el tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrógeno con el gen diana (cadena en sentido o antisentido), más preferentemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % con el gen diana (cadena en sentido o antisentido). Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito para los diversos procedimientos analizados en el presente documento para la reducción o eliminación

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secuencia de ácido nucleico antisentido de acuerdo con la Invención puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico antisentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o varios nucleótidos modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos por acridina. En la técnica se conocen bien ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar las secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Las modificaciones de nucleótidos conocidas incluyen metilación, ciclación y 'protecciones y sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo tal como inosina. En la técnica se conocen bien otras modificaciones de nucleótidos.

La secuencia de ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado una secuencia de ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés). Preferentemente, la producción de las secuencias de ácido nucleico antisentido en plantas se produce mediante una construcción de ácido nucleico establemente integrada que comprende un promotor, un oligonucleótido antisentido unido operativamente y un terminador.

Las moléculas de ácido nucleico usadas para el silenciamiento en los procedimientos de la invención (tanto si se introducen en una planta como si se generan in situ) se hibridan con, o se unen a, los transcritos de ARNm y/o ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir así la expresión de la proteína, por ejemplo, mediante la inhibición de la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser mediante complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácido nucleico antisentido que se une a los dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la hélice doble. Las secuencias de ácido nucleico antisentido pueden introducirse en una planta mediante transformación o inyección directa en un sitio de tejido específico. Como alternativa, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse para llegar a las células seleccionadas y después administrarse por vía sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden modificarse de tal manera que se unan específicamente a receptores o a antígenos expresados en una superficie de la célula seleccionada, por ejemplo, ligando la secuencia de ácido nucleico antisentido a los péptidos o anticuerpos que se unen a los receptores o antígenos de la superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también pueden administrarse a las células usando los vectores descritos en el presente documento.

De acuerdo con un aspecto adicional, la secuencia de ácido nucleico antisentido es una secuencia de ácido nucleico a-anomérica. Una secuencia de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con el ARN complementario en el que, al contrario que las unidades b habituales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier y col., (1987) Nucl Ac Res 15: 6625–6641). La secuencia de ácido nucleico antisentido también pueden comprender un 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue y col., (1987) Nucl Ac Res 15, 6131–6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y col., (1987) FEBS Lett. 215, 327–330).

La reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno también puede realizarse usando ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad de ribonucleasa que pueden escindir una secuencia de ácido nucleico monocatenaria, tal como ARNm, con la que tienen una región complementaria. Por tanto, las ribozimas (por ejemplo, las ribozimas de cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334, 585-591) pueden usarse para escindir catalíticamente los transcritos de ARNm que codifican un polipéptido, lo que reduce sustancialmente el número de transcritos de ARNm que van a traducirse en un polipéptido. Puede diseñarse una ribozima que tenga especificidad por una secuencia de ácido nucleico (véase, por ejemplo: Cech y col., patente de Estados Unidos N° 4.987.071; y Cech y col., patente de Estados Unidos N° 5.116.742). Como alternativa, pueden usarse transcritos de ARNm correspondientes a una secuencia de ácido nucleico para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad de ribonucleasa específica de un conjunto de moléculas de ARN (Bartel y Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento génico en plantas es conocido en la técnica (por ejemplo, Atkins y col., (1994) documento WO 94/00012; Lenne y col., (1995) documento WO 95/03404; Lutziger y col., (2000) documento WO 00/00619; Prinsen y col., (1997) WO 97/13865 y Scott y col., (1997) documento WO 97/38116).

El silenciamiento génico también puede producirse mediante mutagénesis de inserción (por ejemplo, inserción de ADN T o inserción de transposón) o mediante estrategias como las descritas, entre otros, por Angell y Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS documento WO 98/36083), o Baulcombe (documento WO 99/15682).

El silenciamiento génico también puede producirse si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un gen aislado/ácido nucleico posteriormente introducido en una planta. La reducción de eliminación sustancial puede estar provocada por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, un polipéptido puede unirse a diversas proteínas que interaccionan; por lo tanto, pueden proporcionarse una o más mutaciones y/o truncamientos para un polipéptido que sea aún capaz de unirse a las proteínas que interaccionan (tal como proteínas receptoras) pero que no pueden mostrar su función normal (tal como ligando de señalización).

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Una estrategia adicional para silenciamiento génico es dirigir las secuencias de ácido nucleico complementarias a la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples que impiden la transcripción del gen en las células diana. Véase Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; y Maher, L.J. Bioassays 14, 807–15.1992.

Otros procedimientos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos contra un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la que está implicada un polipéptido, serán muy conocidos por el experto. En particular, puede esperarse que las moléculas fabricadas por el hombre puedan ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido diana o para interferir con la ruta de señalización en la que está implicada el polipéptido diana.

Como alternativa, puede establecerse un programa de detección selectiva para identificar en una población de plantas las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican los polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también pueden usarse, por ejemplo, para realizar recombinación homologa.

Pueden usarse microARN (miARN) artificiales y/o naturales para desactivar la expresión génica y/o traducción del ARNm. Los miARN endógenos son ARN pequeños monocatenarios típicamente con una longitud de 19-24 nucleótidos. Actúan principalmente regulando la expresión génica y/o la traducción de ARNm. La mayoría de los microARN (miARN) vegetales tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana. Sin embargo, hay dianas naturales con hasta cinco emparejamientos erróneos. Se procesan a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras de plegamiento características mediante RNasas específicas bicatenarias de la familia Dicer. Después del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) mediante la unión a su componente principal, una proteína Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad del RISC, debido a que se emparejan con las bases a los ácidos nucleicos diana, principalmente ARNm, en el citoplasma. Los acontecimientos reguladores posteriores incluyen la escisión del ARNm diana y la destrucción y/o inhibición de la traducción. Por tanto, los efectos de la sobreexpresión de miARN a menudo reflejan en niveles de ARNm disminuidos de los genes diana.

Los microARN artificiales (miARNa), que tienen típicamente 21 nucleótidos de longitud, pueden modificarse por ingeniería genética específicamente para regular negativamente la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. En la técnica se conocen bien los determinantes de la selección diana de microARN vegetales. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento de dianas y pueden usarse para ayudar a diseñar los miARNa específicos, Schwab R, 2005. Las herramientas convenientes para el diseño y generación de los miARNa y sus precursores también están disponibles para el público, Schwab y col., 2006.

Para un rendimiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico usadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferentemente, una secuencia de ácido nucleico de cualquier especie de planta determinada se introduce dentro de esta misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito absoluto que la secuencia de ácido nucleico que se introduce se origine de la misma especie de planta que la planta en la que se introducirá. Basta con que haya una homología sustancial entre el gen diana endógeno y el ácido nucleico a introducir.

Anteriormente se han descrito ejemplos de diversos procedimientos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en la técnica podrá adaptar fácilmente los procedimientos anteriormente mencionados para el silenciamiento para conseguir la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta completa o en partes de la misma usando un promotor apropiado, por ejemplo.

Marcador de selección (gen)/gen indicador

Un "marcador de selección", "gen marcador de selección" o "gen indicador" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo sobre una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y / o selección de células que son transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia satisfactoria de las moléculas de ácido nucleico mediante una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar de marcadores que confieren resistencia a antibióticos o a herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten selección visual. Los ejemplos de genes marcadores de selección incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptlI que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo bar, que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporciona resistencia contra glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite a las plantas usar manosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales tiene como resultado la formación de color (por ejemplo β-glucuronidasa, GUS o β-galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X Gal), luminiscencia (tal como el sistema luciferina/luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP y

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natural del promotor natural de las secuencias de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica un polipéptido útil en los procedimientos de la presente invención, como se ha definido anteriormente, llega a ser un casete de expresión transgénica cuando este casete de expresión se modifica mediante procedimientos sintéticos no naturales (“artificiales”) tal como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Se describen procedimientos adecuados, por ejemplo, en los documentos US 5.565.350 o WO 00/15815.

Por tanto, una planta transgénica, para los fines de la invención se entiende que significa, como se ha indicado anteriormente, que los ácidos nucleicos usados en el procedimiento de la invención no están en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de manera homologa o heteróloga. Sin embargo, como se ha mencionado, transgénico también significa que, aunque los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o usados en el procedimiento de la invención están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Por transgénico se entiende, preferentemente, que significa la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la Invención en un locus no natural en el genoma, es decir, se produce la expresión homóloga o, preferentemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. En el presente documento se mencionan las plantas transgénicas preferidas.

Transformación

El término “introducción” o "transformación" como se refiere en el presente documento abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento utilizado para la transferencia. El tejido vegetal capaz de la propagación clonal posterior, ya sea por organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con una construcción genética de la presente Invención y una planta entera regenerada a partir del mismo. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y más adecuados para, las especies particulares que se están transformado. Ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemos radiculares), y tejido meristemático inducido (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo del hipocotiledón). El polinucleótido puede introducirse transitoria

o establemente en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Como alternativa, puede integrarse en el genoma huésped. La célula vegetal transformada resultante puede después utilizarse para regenerar una planta transformada de una manera conocida por los expertos en la técnica.

La transferencia de genes externos dentro del genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies de plantas es actualmente una técnica bastante habitual. Ventajosamente, puede usarse cualquiera de los diversos procedimientos de transformación para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los procedimientos descritos para la transformación y regeneración de plantas de tejidos de plantas o células de plantas pueden utilizarse para la transformación transitoria o estable. Los procedimientos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, pistola de bombardeo de partículas, transformación utilizando virus o polen y microproyección. Pueden seleccionarse procedimientos del procedimiento de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F. A. y col., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I y col. (1987) Plant Mol Biol 8: 363 --373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. y col., (1985) Bio/Technol 3, 1099 --1102); microinyección en el material de planta (Crossway A y col., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179–185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein TM y col., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrantes) y similares. Las plantas transgénicas, incluyendo plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacteríum. Un procedimiento de transformación ventajoso es la transformación en la planta. Para esta finalidad, es posible, por ejemplo, permitir que la agrobacterias actúen en las semillas de la planta o inocular las agrobacterias en el meristemo de la planta. Se ha demostrado de un modo particularmente conveniente, de acuerdo con la invención, permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe en la planta intacta o al menos en los primordios florales. Posteriormente, la planta crece hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los procedimientos para la transformación de arroz mediada por Agrobacteríum incluyen procedimientos bien conocidos para la transformación de arroz, tales como los descritos en cualquiera de las siguientes: la solicitud de Patente Europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612 --617, 1996); Chan y col., (Plant Mol Biol 22 (3): 491–506, 1993), Hiei y col., (Plant J 6 (2): 271–282, 1994), ), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. En el caso de la transformación de maíz, el procedimiento preferido es como se describe en Ishida y col., (Nat. Biotechnol 14(6): 745–50, 1996) o Frame y col., (Plant Physiol 129(1): 13 – 22, 2002), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. Dichos procedimientos se describen adicionalmente, a modo de ejemplo, en B. Jenes y col., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128–143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225). Los ácidos nucleicos o la construcción a expresar se clona preferentemente en un vector que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo, pBin19 (Bevan y col., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterlas transformadas por dicho vector pueden después usarse de una manera conocida para la transformación de plantas, tales como plantas usadas como un modelo, como Arabidopsis (Arabidopsis thaliana que se encuentra dentro del ámbito de la presente invención no se considera como una planta de cultivo) o plantas de cultivo tales como, a modo de ejemplo, plantas de tabaco, por

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Recombinación homologa

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición definida seleccionada. La recombinación homóloga es una tecnología convencional utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levaduras o el musgo Physcomitrella. Se han descrito procedimientos para realizar recombinación homóloga en plantas no solo para el modelo de plantas (Offringa y col., (1990) EMBO J 9(10): 3077 --84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada y col., (2002) Nat Biotech 20(10): 1030 --4; lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132–8).

Rendimiento

El término “rendimiento” en general significa un producto medible de valor económico, típicamente relacionado con un cultivo, un área y un periodo de tiempo específicos. Las partes de planta individuales contribuyen directamente al rendimiento en base a su número, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por acre (4.046 m2) de un cultivo y año, que se determina dividiendo la producción total (incluyendo la producción tanto cosechada como valorada) por metros cuadrados plantado.

Vigor inicial

El vigor inicial (crecimiento bien equilibrado saludable activo especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta) puede ser el resultado del aumento de la idoneidad de la planta debido a, por ejemplo, plantas que están mejor adaptadas a su ambiente (es decir, optimizando el uso de fuentes de energía y repartiendo entre brotes y raíces). Las plantas que tienen vigor inicial también muestran supervivencia aumentada de la plántula y un mejor establecimiento del cultivo, que a menudo produce campos muy uniformes (creciendo el cultivo de una manera uniforme, es decir, alcanzando la mayoría de las plantas las diversas etapas de desarrollo a sustancialmente el mismo tiempo) y a menudo mejor y mayor rendimiento. Por lo tanto, el vigor inicial puede determinarse midiendo diversos factores, tales como, peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de la plántula, altura de la plántula, longitud de la raíz, biomasa del brote y de la raíz y muchos más.

Aumento/Mejora/Potenciación

Los términos "aumento", "mejora" o "potenciación" son intercambiables y significan en el sentido de la solicitud un rendimiento y/o crecimiento de al menos 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, preferentemente al menos 15 % o 20 %, más preferentemente 25 %, 30 %, 35 % o 40 más en comparación con las plantas control como se define en el presente documento.

Rendimiento de semillas

El rendimiento de semillas aumentado puede manifestarse por sí mismo como uno o más de los siguientes: a) un aumento en la biomasa de las semillas (peso total de las semillas) que puede establecerse sobre una semilla individual y/o por planta y/o por acre o hectárea; b) número de flores por planta aumentado; c) número de semillas (llenas) aumentado; d) tasa de llenado de semillas aumentado (que se expresa como la proporción entre el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas); e) índice de recolección aumentado, que se expresa como una proporción del rendimiento de partes cosechables, tales como semillas, dividido entre la biomasa total, y f) peso de mil granos (PMG) aumentado, que se extrapola a partir del número de semillas llenas contadas y su peso total. Un PMG aumentado puede ser el resultado de un tamaño y/o peso de semilla aumentado y también puede ser el resultado de un aumento en el tamaño del embrión y/o endospermo.

También puede manifestarse un aumento en el rendimiento de la semilla como un aumento del tamaño de la semilla y/o volumen de la semilla. Además, también puede manifestarse un aumento en el rendimiento de la semilla en sí mismo como un aumento en el área de semilla y/o longitud de semilla y/o anchura de semilla y/o un perímetro de semilla. Un aumento en el rendimiento también puede ser el resultado de una arquitectura modificada o puede producirse como un resultado de arquitectura modificada.

Plant

El término “planta” como se usa en el presente documento incluye plantas completas, ancestros y progenie de las plantas y partes de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluidos tubérculos), flores y tejidos y órganos, donde cada uno de los elementos mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término “planta” también abarca células vegetales, cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, de nuevo donde cada uno de los elementos mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje

o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp,

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Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo,. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus Iongan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (e.g. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo,. Glycine max, Soja hispida or Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo,Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium or Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum or Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palusfris, Ziziphus spp., entre otras.

Descripción detallada de la invención

Sorprendentemente, ahora se ha comprobado que el aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15 como se define en el presente documento produce plantas que tienen un mayor rendimiento en cuanto a las semillas y/o la biomasa aérea con respecto a las plantas control. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de las semillas y/o la biomasa aérea con respecto a plantas de control, que comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor de transcripción SPL15 como se define en el presente documento.

Un procedimiento preferido para aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor de transcripción SPL15 es introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15 como se define en el presente documento.

Como se define en el presente documento, un “polipéptido del factor de transcripción SPL15” se refiere a un polipéptido que comprende un de N-terminal a C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y

(ii)

en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % con el DBP de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y (iii) Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278. Los aminoácidos más conservados dentro del motivo 1 son XLXFGXXXYFX y dentro del motivo DSXXALSLLSX (donde X es un subconjunto de aminoácidos que difieren para cada posición, como se presenta en la SEC ID N°: 276 y la SEC ID Nº 277). Dentro del motivo 1 y el motivo 2 se permiten uno o más cambios conservadores en cualquier posición, y / o uno, dos o tres cambios no conservadore(s) en cualquier posición.

Además, el polipéptido factor de transcripción SPL15 puede comprender uno cualquiera o ambos de los siguientes:

(a)

un tramo rico en G / S que precede al DBD del SPL; y (b) el tripéptido W (S / T) L en el extremo C-terminal del polipéptido.

Un ejemplo de un polipéptido de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente en el presente documento que comprende de N-terminal a C-terminal: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID N°: 276; y (ii) en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 98 % con el DBP de SPL representado por la SEC ID Nº 277; y (iii) Motivo 2 como se representa en la SEC ID N°: 278; y, además, que comprende: (a) un tramo rico en G / S que precede al DBD del SPL; y (b) el tripéptido W (S / T) L en el extremo C-terminal del polipéptido, se representa como en la SEC ID Nº 235. Otros ejemplos de este tipo están representados por una cualquiera de las SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285, SEC ID Nº 287 U ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº mencionadas anteriormente. La invención se ilustra mediante la transformación de plantas con la secuencia de Arabidopsis thaliana representada por la SEC ID Nº 234, que codifica el polipéptido de la SEC ID N°: 235. SEC ID Nº 237 de Arabidopsis thaliana (codificada por la SEC ID Nº: 236) es un parálogo del

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cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 235, SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285, SEC ID Nº 287 u ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº mencionadas anteriormente.

También son útiles en los procedimientos de la invención los ácidos nucleicos que codifican derivados de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por las SEC ID Nº: 235, SEC ID Nº 237, SEC ID Nº 239, SEC ID Nº 241, SEC ID Nº 243, SEC ID Nº 245, SEC ID Nº 247, SEC ID Nº 249, SEC ID Nº 251, SEC ID Nº 253, SEC ID Nº 255, SEC ID Nº 257, SEC ID Nº 259, SEC ID Nº 261, SEC ID Nº: 263, SEC ID Nº 283, SEC ID Nº 285, SEC ID Nº 287 u ortólogos o parálogos de cualquiera de las SEC ID Nº mencionadas anteriormente. “Derivados” incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, que pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de forma natural de la proteína, tal como la presentada en la SEC ID Nº 235, comprender sustituciones de aminoácidos con restos de aminoácido de origen no natural, o adiciones de restos de aminoácido de origen no natural.

Además, los polipéptidos deL factor de transcripción SPL15 (al menos en su forma nativa) normalmente tienen una actividad de unión a ADN y un dominio de activación. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la presencia de un dominio de activación y la actividad de unión a ADN utilizando herramientas y técnicas de rutina.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos del factor de transcripción SPL15 pueden proceder de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico puede modificarse con respecto a su forma nativa en composición y/o en medio genómico a través de manipulación humana deliberada. Preferentemente el ácido nucleico que codifica el polipéptido del factor de transcripción SPL15 es de una planta, adicionalmente de manera preferente, de una planta dicotiledónea, más preferentemente de la familia Brassicaceae, aún más preferentemente el ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.

Por tanto, cualquier referencia en este documento a un polipéptido del factor de transcripción SPL15 se considera que significa un péptido factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente. Cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido tal factor de transcripción SPL15 de este tipo es adecuado para su uso en la realización de los procedimientos de la invención.

La invención también proporciona construcciones génicas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión en una planta de las secuencias de ácido nucleico útiles en los procedimientos de acuerdo con la invención.

Por tanto, se proporciona una construcción que comprende:

(i)

un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente;

(ii)

una o más secuencias de control unidas operablemente al ácido nucleico de (i).

Las construcciones útiles en los procedimientos de acuerdo con la presente invención se pueden construir utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas expertas en la técnica. Las construcciones génicas se pueden insertar en vectores, que pueden estar comercialmente disponibles, adecuados para transformar en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención también proporciona el uso de una construcción génica como se ha definido anteriormente en el presente documento en los procedimientos de la invención.

Las plantas se transforman con un vector que comprende cualquiera la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 como se define en el presente documento). El experto en la técnica conocerá los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector para transformar, seleccionar y propagar satisfactoriamente células huésped que contengan la secuencia de interés. La secuencia de interés está unida operablemente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor). Ventajosamente, cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, puede usarse para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. El promotor puede ser un promotor inducible, es decir, que ha inducido o incrementado el inicio de la transcripción en respuesta a un estímulo del desarrollo, químico, ambiental o físico. El promotor puede ser un promotor específico de tejido, es decir uno que es capaz de iniciar la transcripción preferentemente en ciertos tejidos, tales como las hojas, raíces, tejido de la semilla, etc.

De acuerdo con la invención, el ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 está unido operablemente a un promotor constitutivo. El promotor constitutivo es preferiblemente un promotor HMGB (grupo B de movilidad alta), más preferentemente el promotor constitutivo es un promotor HMGB de arroz, más preferentemente el promotor constitutivo está representado por una secuencia de ácido nucleico sustancialmente similar a la SEC ID Nº 279, lo más preferentemente, el promotor constitutivo es como se representa mediante la SEC ID Nº 279 o SEC ID Nº 294.

Debe aclararse que la aplicabilidad de la presente invención no está limitada al ácido nucleico que codifica el polipéptido del factor de transcripción SPL15 representado por la SEC ID N°: 234, ni la aplicabilidad de la invención está limitada a la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15

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cuando se está dirigido por un promotor HMGB. Ejemplos de otros promotores constitutivos que también pueden utilizarse para realizar los procedimientos de la invención se muestran en la sección de definiciones.

Los elementos reguladores adicionales para aumentar la expresión de ácidos nucleicos o genes o productos génicos pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales. Los expertos en la técnica conocerán las secuencias terminadoras de terminación y potenciadoras que pueden ser adecuados para su uso en la realización de la invención. Otras secuencias de control (además de las secuencias promotoras, potenciadoras, silenciadoras, intrónicas, regiones 3'UTR y/o 5'UTR ) pueden ser elementos estabilizadores de proteína y/o ARN. Tales secuencias serían conocidas o pueden obtenerlas fácilmente un experto en la técnica. Opcionalmente, una o más secuencias terminadoras (también una secuencia control) se pueden utilizar en la construcción introducida en una planta.

También puede añadirse una secuencia intrónica a la región no traducida en 5’ (UTR) o la secuencia codificante de la secuencia de codificación parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir además una secuencia del origen de secuencia de replicación que se requiere para el mantenimiento y / o replicación en un tipo celular específico. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una construcción genética para en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo, una molécula de plásmido o de cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, entre otros, el f1–ori y colE1.

La construcción genética puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable.

Por tanto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen rendimiento de semillas y/o de biomasa aérea aumentado con respecto a las plantas de control, que comprende introducir y expresar en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido de factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente en el presente documento.

Más específicamente, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen mayor rendimiento de semillas y/o de biomasa aérea con respecto a las plantas control, en el que el procedimiento comprende:

i) introducir y expresar en una célula de planta un ácido nucleico que codifica polipéptido de factor de transcripción SPL15; y

(ii) cultivar la célula vegetal en condiciones que estimulan el crecimiento y desarrollo de la planta.

El ácido nucleico puede introducirse directamente en una célula de planta o en la propia planta (incluyendo la introducción en un tejido, órgano o en cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico se introduce preferentemente en una planta por transformación.

Generalmente después de la transformación, se seleccionan células vegetales o agrupaciones de células para determinar la presencia de uno o más marcadores que están codificados por genes expresables en plantas cotransferidos con el gen de interés, tras lo cual el material transformado se regenera en una planta entera.

Después de la transferencia de ADN y la regeneración, las plantas transformadas putativamente se pueden evaluar, por ejemplo utilizando análisis de tipo Southern, para detectar la presencia del gen de interés, el número de copias y / o la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recién introducido pueden controlarse utilizando análisis de tipo Northern y/o Western, o PCR cuantitativa, siendo todas las técnicas bien conocidas por los expertos habituales en la técnica.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar mediante diversos medios, tales como por propagación clonal o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, una primera generación (o T1) de planta transformada puede autofecundarse para dar transformantes de la segunda generación homocigota (o T2) y las plantas T2 se propagan adicionalmente a través de técnicas clásicas de reproducción.

Los organismos transformados generados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas que contengan el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, una planta madre transformada injertada a un vástago no transformado).

La presente invención se extiende claramente a cualquier célula vegetal o planta producida mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, y a todas las partes de plantas y propágulos de las mismas. La presente invención se extiende además se para incluir la progenie de una célula, tejido u órgano primario transformado o transfectado o la planta completa que se ha producido mediante cualquiera de los procedimientos anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la progenie presente las mismas características genotípicas y/o fenotípicas que las producidas por el precursor en los procedimientos de acuerdo con la memoria descriptiva.

La invención también incluye células huésped que contienen un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido

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factor de transcripción SPL15 como se ha definido anteriormente en el presente documento. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células vegetales.

La invención también se extienden a partes cosechables de una planta, tales como, pero sin limitación, semillas, hojas, frutos, flores, tallos, raíces, rizomas, tubérculos y bulbos. La invención adicionalmente se refiere a productos derivados, preferentemente derivados directamente, de una parte cosechable de dicha planta, tales como gránulos secos o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas.

Como se ha mencionado anteriormente, un procedimiento preferido para aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 es introduciendo y expresando en una planta un ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 ; sin embargo, también pueden obtenerse los efectos de la realización del procedimiento, es decir aumentar el rendimiento de semillas y/o la biomasa aérea, usando otras técnicas bien conocidas. A continuación se proporciona una descripción de estas técnicas.

Una de estas técnicas es el marcaje en activación de ADN-T. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de los genes cercanos al promotor introducido.

Los efectos de la invención también pueden reproducirse usando la técnica de TILLING (Targeted Induced Local Lesions In Genomes).

Los efectos de la invención también pueden reproducirse usando recombinación homologa.

“Rendimiento aumentado” como se define en el presente documento se considera que significa un aumento en la biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que puede incluir partes sobre la superficie (cosechables) y/o partes (cosechables) por debajo de la superficie.

En particular, dichas partes cosechables incluyen la biomasa vegetativa y / o las semillas y la realización de los procedimientos de la invención da como resultado plantas que tienen rendimiento aumentado (en la biomasa vegetativa y / o las semillas) con respecto al rendimiento de las plantas control.

Tomando el maíz como un ejemplo, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como uno o más de los siguientes: aumento en el número de plantas establecido por hectárea o acre, un aumento en el número de espigas por planta, un aumento en el número de filas, número de granos por fila, peso de grano, peso de mil granos, longitud/diámetro de espiga, aumento en la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas y multiplicado por 100), entre otros. Tomando el arroz como un ejemplo, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como un aumento en uno o más de los siguientes: número de plantas por hectárea o acre, número de panículas por planta, número de espiguillas por panícula, número de flores (floretes) por panícula (que se expresa como una proporción del número de semillas llenas dividido entre el número de panículas primarias), aumento en la tasa de llenado de semilla (que es el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas y multiplicado por 100), aumento en peso de mil granos, entre otros.

Dado que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen un rendimiento de semillas y/o biomasa aérea aumentado, es probable que estas plantas presenten una tasa de crecimiento aumentada (durante al menos parte de su ciclo de vida), con respecto a la tasa de crecimiento de las correspondientes plantas de tipo silvestre en una etapa correspondiente en su ciclo de vida. La tasa de crecimiento aumentada puede ser específica de una o más partes de una planta (incluyendo semillas) o puede ser sustancialmente en toda la planta. Una planta que tiene una tasa de crecimiento aumentada puede incluso exhibir una floración temprana. El aumento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de la cosecha de una planta, lo que permite que las plantas se siembren más tarde y/o se cosechen más pronto de lo que de otra manera sería posible. Si la tasa de crecimiento se aumenta suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de la planta (por ejemplo siembra y cosecha de plantas de arroz, seguido de siembra y cosecha de plantas de arroz adicionales todas dentro de un periodo de crecimiento convencional). De manera similar, si la tasa de crecimiento se aumenta suficientemente, puede permitir la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo, la siembra y cosecha de plantas de maíz seguidas de, por ejemplo, la siembra y cosecha opcional de plantas de soja, patata o cualquier otra planta adecuada). Los tiempos de cosecha adicionales del mismo rizoma en el caso de algunas plantas de cultivo también pueden ser posible. Alterar el ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un aumento en la producción de biomasa anual por acre (debido a un aumento en el número de tiempos (digamos en un año) que se puede cultivar y cosechar cualquier planta particular). Un aumento en la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus homólogos de tipo silvestre, debido a que las limitaciones territoriales para cosechar un cultivo a menudo se determinan por condiciones ambientales adversas en el momento de plantar (estación temprana) o en el momento de la recolección (estación tardía). Dichas condiciones adversas pueden evitarse si se acorta el ciclo de cosecha. La tasa de crecimiento puede determinarse derivando diversos parámetros a partir de las curvas de crecimiento, dichos parámetros pueden ser: T-Medio (el tiempo que tarda una planta en alcanzar el 50 % de su tamaño máximo) y T-90 (el tiempo que tarda una planta en alcanzar el 90 % de su tamaño de máximo), entre otros.

En el presente documento se describe un procedimiento para incrementar la tasa de crecimiento de las plantas,

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cuyo procedimiento comprende incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15.

Un aumento en el rendimiento de semillas y/o la biomasa aérea y/o en la tasa de crecimiento se produce cuando la planta está en condiciones de cero estrés o cuando la planta está expuesta a diversos tipos de estrés en comparación con las plantas de control. Típicamente las plantas responden a exposición frente al estrés creciendo más lentamente. En condiciones de estrés intenso, la planta puede incluso detener por completo el crecimiento. Por otro lado, estrés leve se define en el presente documento como cualquier estrés al que se expone una planta que no da como resultado el cese total del crecimiento de la planta sin la capacidad de reanudar el crecimiento. El estrés leve, en el sentido de la invención, conduce a una reducción en el crecimiento de la planta sometida a estrés de menos de 40 %, 35 % o 30 %, preferentemente menos del 25 %, 20 % o 15 %, más preferentemente menos del 14 %, 13 %, 12 %, 11 % o 10% o menos en comparación con la planta de control en condiciones de estrés cero. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (riego, fertilización, tratamientos con pesticidas), las formas de estrés intenso no se encuentran frecuentemente en plantas cultivadas. Como una consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por estrés leve es a menudo una característica indeseable para la agricultura. El estrés leve es un estrés biótico y/o abiótico diario (ambiental) al cual está expuesto la planta. El estrés abiótico puede deberse a sequía o a exceso de agua, a estrés anaeróbico, estrés salino, toxicidad química, estrés oxidativo y a temperaturas altas, frías o heladas. El estrés abiótico puede ser un estrés osmótico provocado por estrés al agua (particularmente debido a sequía), estrés salino, estrés oxidativo y estrés iónico. El estrés biótico es típicamente aquel estrés provocado por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos, e insectos.

En particular, los procedimientos descritos en el presente documento pueden realizarse en condiciones de cero estrés o en condiciones de sequía leve para dar plantas que tienen un rendimiento de semillas y/o biomasa aérea aumentado con relación a plantas de control. Como describen Wang y col., (Planta (2003) 218: 1–14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan adversamente al crecimiento de las plantas y a su productividad. Se sabe que la sequía, la salinidad, las temperaturas extremas y el estrés oxidativo se interconectan y que pueden inducir daño celular y en el crecimiento a través de mecanismos similares. Rabbani y col., (Plant Physiol (2003) 133: 1755–1767) describen un grado particularmente alto de “interferencia” entre estrés por sequía y estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, que produce la interrupción de la homeostasis y la distribución de iones en la célula. El estrés oxidativo, que frecuentemente acompañada a estrés por temperaturas altas o bajas, por salinidad o por sequía, puede producir desnaturalización de las proteínas funcionales y estructurales. Como una consecuencia, este diverso estrés ambiental a menudo activa rutas de señalización celular y respuestas celulares similares, tales como la producción de proteínas de estrés, regulación por aumento de antioxidantes, acumulación de solutos compatibles y paralización del crecimiento. La expresión en condiciones de “estrés cero” como se usa en el presente documento son las condiciones ambientales que permiten el crecimiento de las plantas. Los expertos en la técnica saben cuáles son las condiciones normales en el suelo y las condiciones climáticas en una localización determinada.

La realización de los procedimientos de la invención da lugar a plantas cultivadas en condiciones de cero estrés o en condiciones de sequía leve de rendimiento de semillas y/o biomasa aérea aumentado con respecto a plantas de control que crecen en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de semillas y/o biomasa aérea en plantas que crecen en condiciones de cero estrés o en condiciones de sequía leve, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SPL15.

La realización de los procedimientos de la invención da lugar a plantas cultivadas en condiciones de déficit de nutrientes, particularmente en condiciones de déficit de nitrógeno, rendimiento de semillas y/o biomasa aérea aumentado con respecto a plantas de control que crecen en condiciones comparables. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de semillas y/o biomasa aérea en plantas que crecen en condiciones de condiciones de déficit de nutrientes, cuyo procedimiento comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SPL15. El déficit de nutrientes puede producirse por una carencia o un exceso de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, cadmio, magnesio, manganeso, hierro y boro entre otros.

Los procedimientos de la invención son ventajosamente aplicables a cualquier planta. Las plantas que son particularmente útiles en los procedimientos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje o leguminosas forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles o arbustos. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata y tabaco. Adicionalmente de modo preferente, la planta es una planta monocotiledónea. Ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen caña de azúcar. Más preferentemente la planta es un cereal. Los ejemplos de cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo y avena.

La presente invención también abarca plantas que pueden obtenerse mediante los procedimientos de acuerdo con la presente invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona plantas, partes y células de dichas plantas obtenibles por los procedimientos de acuerdo con la presente invención, en los que las plantas o partes o

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de clones grandes (de varios kb a varios cientos de kb; véase Laan y col., (1995) Genome Res. 5:13–20), mejoras en sensibilidad pueden permitir la realización de mapeo FISH usando sondas más cortas.

Usando los ácidos nucleicos pueden realizarse diversos procedimientos basados en amplificación de ácidos nucleicos para el mapeo genético y físico. Ejemplos incluyen amplificación específica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95 --96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield y col., (1993) Genomics 16:325 --332), ligamiento específico de alelo (Landegren y col., (1988) Science 241:1077 --1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Mapeo Híbrido por Radiación (Walter y col., (1997) Nat. Genet. 7:22 --28) y Mapeo Happy (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795–6807). Para estos procedimientos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para su uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión con cebador. El diseño de dichos cebadores es bien conocido por los expertos en la técnica. En los procedimientos que emplean mapeo genético basado en PCR puede ser necesario identificar diferencias de secuencias de ADN entre los padres del cruce del mapeo en la región correspondiente a la secuencia de ácido nucleico instantánea. Sin embargo, generalmente esto no es necesario para procedimientos de mapeo.

Los procedimientos de acuerdo con la presente invención dan como resultado plantas que tienen rendimiento de semillas y/o biomasa aérea aumentado como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Estos rasgos también pueden combinarse con otros rasgos económicamente ventajosos, tales como rasgos de rendimiento aumentado, que, tolerancia a estrés abiótico y biótico, rasgos que modifican diversas características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las figuras

La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras en las que:

Fig. 1 árbol de unión de vecinos tras una alineación de secuencia múltiple de todos los polipéptidos del factor de transcripción de SPL de Arabidopsis thaliana y ortólogos del polipéptido del factor de transcripción de SPL15 usando CLUSTAL W (1.83) (en el GenomeNet service en la Kyoto University Bioinformatics Center), y parámetros predeterminados (Blosum 62 como matriz de ponderación, penalización por abertura de hueco de 10; penalización por extensión hueco de 0,05). Grupos polipéptidos factor de transcripción SPL15 de Arabidopsis thaliana con los otros ortólogos y parálogos de los polipéptidos factor de transcripción SPL15, como se muestra por el soporte rizado.

La Fig. 2 muestra un alineamiento del dominio de unión al ADN (DBD) de ortólogos y parálogos del polipéptido del factor de transcripción SPL15. Las secuencias se alinearon utilizando el programa AlignX de Vector NTI suite (InforMax, Bethesda, MD). El alineamiento múltiple se llevó a cabo con una penalización de apertura de hueco de 10 y una extensión de hueco de 0,01. Los restos de Cys e His conservados involucrados en la unión de los iones de cinc están en recuadros. La señal de localización nuclear bipartita (NLS) está subrayada.

La Fig. 3 es una alineación de los ortólogos y parálogos de polipéptidos del factor de transcripción SPL15. Las secuencias se alinearon utilizando el programa AlignX de Vector NTI suite (InforMax, Bethesda, MD). Se realizó alineación múltiple con una penalización por apertura de hueco de 10 y, una extensión de hueco de 0,01. También se realizó una edición manual menor cuando fue necesario para colocar mejor algunas regiones conservadas. Los tres principales dominios caracterizados, desde N-terminal a C-terminal, están recuadros y se identificaron como Motivo 1, el dominio de unión de ADN de SPL y Motivo 2. Además, el tramo rico en G / S que precede al DBP de SPL está marcado con Xs y el tripéptido W (S / T) L en el extremo C-terminal del polipéptido también en recuadros.

La Fig. 4 muestra un vector binario pHMGB :: SPL15, para el aumento de la expresión en Oryza sativa de un ácido nucleico de Arabidopsis thaliana que codifica un polipéptido factor de transcripción SPL15 bajo el control de un promotor de HMGB.

La Fig. 5 Detalla ejemplos de secuencias útiles en la realización de los procedimientos de acuerdo con la presente invención

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, que son solo a modo ilustrativo. Los siguientes ejemplos no pretenden definir completamente o de otra manera limitar el ámbito de la invención.

Manipulación de ADN: a menos que se indique lo contrario, las técnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y col., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Materiales y procedimientos estándar para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfase (1993) deR.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications (Reino Unido).

Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con la secuencia de ácido nucleico usada en los procedimientos de la invención

Las secuencias (ADNc de longitud completa, EST o genómicas) relacionadas con la secuencia de ácido nucleico usadas en los procedimientos de la presente invención se identificaron entre las conservadas en la base de datos de 5 nucleótidos Entrez en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando las herramientas de búsqueda de secuencia de bases de datos, tal como la Herramienta de Alineamiento Local Básica (BLAST) (Altschul y col., (1990) J. Mol. Biol. 215:403–410; y Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389–3402). El programa se utiliza para encontrar regiones de similitud local entre las secuencias comparando las secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos con las bases de datos de secuencia y calculando el significado estadístico de los 10 emparejamientos. El polipéptido codificado por el ácido nucleico usado en la presente invención se usó para el algoritmo TBLASTN, con configuraciones predeterminadas y el filtro para ignorar la activación de secuencias de baja complejidad. El resultado de los análisis se observó por comparación apareadas y se clasificó de acuerdo con la puntuación de probabilidad (valor E), en el que la puntuación refleja la probabilidad de que se produzca un alineamiento particular por casualidad (cuanto menor sea el valor E, más significativa es la coincidencia). Además de

15 valores E, también se puntuaron las comparaciones por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptido) comparadas sobre una longitud particular. En algunos casos, los parámetros por defecto se pueden ajustar para modificar la rigurosidad de la búsqueda.

La Tabla N a continuación proporciona una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con la secuencia de 20 ácido nucleico usada en los procedimientos de la presente invención.

Tabla N: secuencias de ácido nucleico relacionadas con la secuencia de ácido nucleico (SEC ID Nº 234) utilizada en los procedimientos de la presente invención, y los correspondientes polipéptidos deducidos

Nombre

SEC ID Nº de ácido nucleico SEC ID Nº del polipéptido Longitud de secuencia Número de acceso en NCBI Organismo fuente

Arath_SPL15 (At3g57920)

234 235 Longitud completa NM_115654.1 Arabidopsis thaliana

Arath_SPL9 (At2g42200)

236 237 Longitud completa AY150378 Arabidopsis thaliana

Aquf0_SPL

238 239 Longitud completa Contiguo de DR915312 DR949057.1 Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens

Goshi_SPL

240 241 Longitud completa DT566400 Gossypium hirsutum

Iponi_SPL

242 243 Longitud completa Contiguo de BJ576204.1 BJ556115 BJ567301 Ipomoea nil

Lacsa_SPL

244 245 Longitud completa Contiguo de DY966949 DW119178 Lactuca sativa

Maldo_SPL

246 247 Longitud completa Contiguo de CN891102.1 CO868185.1 CV523507 Malus domestica

Medtr_SPL

248 249 Longitud completa de corte y empalme de AC170989.2 Medicago truncatula

Nicbe_SPL

250 251 Longitud completa Contiguo de CK284078.1 CK294165 Nicotiana bentamiana

Orysa_SPL

252 253 Longitud completa XM_483285 Oryza sativa

Orysa_SPL II

254 255 Longitud completa de corte y empalme de AC108762 Oryza sativa

Soltu_SPL

256 257 Longitud completa contiguo de CK246692.1 Solanum tuberosum

Nombre

SEC ID Nº de ácido nucleico SEC ID Nº del polipéptido Longitud de secuencia Número de acceso en NCBI Organismo fuente

CK254420.1

Vitvi_SPL

258 259 Longitud completa contiguo de CV098277 CV092812.1 Vitis vinifera

Zeama_SPL

260 261 Longitud completa contiguo de EB160653 DY235599 DV029129 Zea mays

Zeama_SPL II

262 263 Longitud completa contiguo de AJ011619 DV033513.1 DY532686.1 Zea mays

Sorpr_SPL

264 265 Parcial BF422188 Sorghum propinquium

Allce_SPL

266 267 Parcial CF444518.1 Allium cepa

Antma_SPL

268 269 Parcial AMA011623 Antirrhinum majus

Brana_SPL

270 271 Parcial CX189447 Brassica napus

Sacof_SPL

272 273 Parcial contiguo de CA113070 CA254724 Saccharum officinarum

Fesar_SPL

274 275 Parcial DT706587.1 Festuca arundinacea

Brara_SPL

282 283 Longitud completa AC189445.1 Brassica rapa

Glyma_SPL

284 285 Longitud completa CX708501.1 BG651519.1 Glycine max

Poptr_SPL

286 287 Longitud completa scaff_XVI.416 Populus tremuloides

Citcl_SPL

288 289 Parcial DY293795 Citrus clementina

Betvu_SPL

290 291 Parcial BQ594361.1 Beta vulgaris

Hevbr_SPL

292 293 Parcial EC604947 Hevea brasiliensis

Ejemplo 2: Determinación de la similitud y la identidad global entre los factores de transcripción SPL15 y su DBP de SPL

Los porcentajes de similitud e identidad globales entre los factores de transcripción SPL15 se determinaron usando

5 uno de los procedimientos disponibles en la técnica, el programa informático MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; software de Ledion Bitincka). El software MatGAT genera matrices de similitud / identidad de secuencias de ADN o de proteína sin necesidad de pre-alineación de los datos. El programa realiza una serie de alineaciones apareadas utilizando el algoritmo de alineación global de Myers y

10 Miller (con una penalización por apertura de hueco de 12, y una penalización de extensión de hueco de 2), calcula la similitud y la identidad utilizando, por ejemplo Blosum 62 (para los polipéptidos), y luego coloca los resultados en una matriz de distancia. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de secuencia se muestra en la mitad superior de la línea divisoria diagonal. La secuencia de la SEC ID Nº: 235 se indica como el número 5 en la matriz.

15 Los parámetros utilizados en la comparación fueron:

Matriz de puntuación: Blosum62

Primer hueco: 12

Extensión de hueco: 2

Los resultados del análisis Informático se muestran en la Tabla O para la similitud e Identidad globales sobre la longitud completa de los polipéptidos del factor de transcripción SPL15. El porcentaje de identidad se proporciona encima de la diagonal y el porcentaje de similitud se proporciona por debajo de la diagonal. El porcentaje de identidad los parálogos y ortólogos del factor de transcripción SPL15 varía entre 30 y 70 %, reflejando la conservación de identidad de secuencia relativamente baja entre ellos fuera del DBD del SPL.

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Los resultados del análisis Informático se muestran en la Tabla P para la similitud e Identidad globales sobre el DBD del SPL de los polipéptidos del factor de transcripción SPL15. El porcentaje de identidad se proporciona encima de la diagonal y el porcentaje de similitud se proporciona por debajo de la diagonal. El porcentaje de identidad entre los parálogos y ortólogos del DBD de SPL del factor de transcripción de SPL15 oscila entre el 70 % y el 100 %.

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Después las semillas se cosecharon de tres a cinco meses después del trasplante. El procedimiento produjo transformantes de sitio único a una tasa de alrededor de 50 % (Aldemita and Hodges1996, Chan y col., 1993, Hiei y col., 1994).

Transformación de maíz

La transformación de maíz (Zea mays) se realizó con una modificación del procedimiento descrito por Ishida y col., (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50. La transformación es dependiente del genotipo en maíz y solo son genotipos específicos susceptibles a transformación y regeneración. Como progenitores, la línea endogámica A188 (Universidad de Minnesota) o híbridos con A188, son buenas fuentes de material donante para la transformación, pero también pueden usarse otros genotipos satisfactoriamente. Se cosecharon espigas de plantas de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DDP) cuando la longitud del embrión inmaduro era de aproximadamente 1 a 1, 2 mm. Los embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión y las plantas transgénicas se recuperaron a través organogénesis. Los embriones cortados se cultivaron en medio de inducción de callo y después en medio de regeneración de maíz que contenía el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, pero pueden usarse diversos marcadores de selección). Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25 ºC durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollasen los brotes. Los brotes verdes se transfirieron desde cada embrión al medio de enraizamiento de maíz y se incubaron a 25 ºC durante 2-3 semanas, hasta el desarrollo de las raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de trigo

La transformación de trigo se realizó con el procedimiento descrito por Ishida y col., (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50. La variedad de cultivo Bobwhite (disponible de CIMMYT, México) se utiliza normalmente para transformación. Embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión y las plantas transgénicas se recuperaron a través de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones cortados se cultivan in vitro en medio de inducción de callo y después en medio de regeneración que contenía el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, pero pueden usarse diversos marcadores de selección). Las placas de Petri se incubaron a la luz a 25 ºC durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollasen los brotes. Los brotes verdes se transfirieron desde cada embrión al medio de enraizamiento y se incubaron a 25 ºC durante 2-3 semanas, hasta el desarrollo de las raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de soja

La transformación de soja se realiza de acuerdo con una modificación del procedimiento descrito en el Texas A&M patente de Estados Unidos 5.164.310. Diversas variedades comerciales de soja son susceptibles a transformación mediante este procedimiento La variedad de cultivo Jack (disponible de la fundación Illinois Seed) se utiliza normalmente para transformación. Las semillas de soja se esterilizan para siembra in vitro. El hipocotilo, el radículo y un cotiledón se extirpan de plántulas jóvenes de siete días de vida. El epicótilo y el cotiledón restante se cultivan adicionalmente para desarrollar nodos axilares. Estos nodos axilares se extirpan y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión. Después de tratamiento de co-cultivo, los explantes se lavan y se transfieren al medio de selección. Los brotes regenerados se extirpan y se colocan en un medio de elongación de brote. Los brotes no mayores de 1 cm se colocaron se colocan en medio de enraizamiento hasta que se desarrollaron raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación colza/canola

Peciolos cotiledonarios e hipocótilos de plántulas jóvenes de 5–6 días de vida se utilizan como explantes para el cultivo tisular y se transforman de acuerdo con Babic y col., (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188). La variedad de cultivo comercial Westar (Agriculture Canada) es la variedad convencional usada para la transformación, pero también pueden usarse otras variedades. Las semillas de canola se esterilizan en la superficie para la siembra in vitro. Explantes de peciolos cotiledonarios con el cotiledón unido se extirpan de plántulas in vitro y se inoculan con Agrobacterium (que contenía el vector de expresión) sumergiendo el extremo cortado del explante del peciolo en la suspensión bacteriana. Después los explantes se cultivan durante 2 días en medio MSBAP-3 que contenía BAP 3 mg/l, sacarosa al 3 %, Fitagar al 0,7 % a 23 ºC, 16 h de luz. Después de dos días de co-cultivo con Agrobacterium, los explantes de peciolo se transfieren a medio MSBAP-3 que contenía BAP 3 mg/l, cefotaxima, carbenicilina o timentina (300 mg/l) durante 7 días y después se cultivan en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina o timentina y agente de selección hasta la regeneración del brote. Cuando los brotes tenían una longitud de 5 – 10 mm, se cortaron y se transfirieron al medio de elongación de brote (MSBAP-0,5 que contenía BAP 0,5 mg/l). Los brotes de aproximadamente 2 cm de longitud se transfieren al medio de enraizamiento (MS0) para la inducción de raíces. Los brotes enraizados se trasplantaron al suelo en el invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

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Transformación de alfalfa

Un clon de regeneración de alfalfa (Medicago sativa) se transforma utilizando el procedimiento de (McKersie y col., 1999 Plant Physiol 119: ) 839–847). La regeneración y transformación de la alfalfa es dependiente del genotipo y por lo tanto se requiere una planta regenerada. Se han descrito procedimientos para obtener plantas regeneradas. Por ejemplo, éstas pueden seleccionarse de variedades de cultivo Rangelander (Agriculture Canada) o de cualquier otra variedad comercial de alfalfa como describen Brown DCW y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112). Como alternativa, la variedad RA3 (Universidad de Wisconsin) se ha seleccionado para su uso en cultivo tisular (Walker y col., 1978 Am J Bot 65:654–659). Explantes de peciolo se co-cultivan con un cultivo durante una noche de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie y col., 1999 839–847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se co-cultivan durante 3 días en la oscuridad en un medio de inducción SH que contenía Pro 288 mg/l, tioprolina 53 mg/l, K2SO4 4, 35 g/l y 100 µm de acetositinginona. Los explantes se lavan en medio Murashige-Skoog de fuerza media (Murashige y Skoog, 1962) y se siembran en placas en el mismo medio de inducción SH con acetosiringinona pero con un agente de selección adecuado y un antibiótico adecuado para inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfirieron al medio de desarrollo BOi2Y que no contenía reguladores de crecimiento, sin antibióticos, y sacarosa 50 g/l. Posteriormente, los embriones somáticos germinaron en medio Murashige-Skoog de fuerza media. Las plántulas enraizadas se trasplantaron en macetas y se cultivaron en un invernadero. Se produjeron semillas T1 de plantas que presentaban tolerancia al agente de selección y que contenían una sola copia del inserto de ADN-T.

Ejemplo 6: Procedimiento de evaluación

6.1 Configuración de Evaluación

Se generaron aproximadamente 35 transformantes independientes de arroz T0. Los transformantes primarios se transfirieron de una cámara de cultivo de tejido a un invernadero para el cultivo y la cosecha de las semillas T1. Siete eventos, de los cuales la progenie T1 segrega 3: 1 para la presencia / ausencia del transgen, se retuvieron. Para cada uno de estos eventos, aproximadamente 10 plántulas T1 que contienen el transgén (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas T1 que carecen del transgén (nulicigotos) fueron seleccionados mediante el control de la expresión del marcador visual. Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes se hicieron crecer lado a lado en posiciones aleatorias. Condiciones de invernadero fueron días cortos (12 horas de luz), 28 °C en la luz y 22 °C en la oscuridad, y una humedad relativa de 70 %.

Cinco eventos T1 se evaluaron después en la generación T2 siguiendo el mismo procedimiento de evaluación como para la generación T1 pero con más Individuos por acontecimiento. Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez se pasaron las plantas varias veces a través de un gabinete de imágenes digitales. En cada punto de tiempo, se tomaron imágenes digitales (2048x1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta desde por lo menos 6 ángulos diferentes.

El vigor inicial es el área sobre el suelo de la planta (plántulas) tres semanas después de la germinación. El aumento de la biomasa de la raíz se expresa como un incremento en la biomasa total de las raíces (medida como máximo biomasa de raíces observadas durante la vida útil de una planta); o como un aumento en el índice de la raíz / tallo (medido como la relación entre la masa de raíces y disparar masa en el período de crecimiento activo de la raíz y brote).

6.2 Análisis estadístico: Prueba F

Un ANOVA de dos factores (análisis de variantes) se utilizó como un modelo estadístico para la evaluación global de las características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se llevó a cabo para comprobar si el efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para verificar un efecto general del gen, también conocido como un efecto de gen global. El umbral de significación para un verdadero efecto génico global se fijó en un nivel de probabilidad del 5 % para la prueba F. Un valor significativo de la prueba F apunta a un efecto génico, lo que significa que no es sólo la mera presencia o la posición del gen que causa las diferencias en el fenotipo.

Para comprobar si hay un efecto de los genes dentro de un acontecimiento, es decir, para un efecto específico de línea, se realizó una prueba t dentro de cada acontecimiento utilizando conjuntos de datos de las plantas transgénicas y las correspondientes plantas nulas. "Plantas nulas" o "segregantes nulos" o "nulicigotos" son las plantas tratadas de la misma forma que la planta transgénica, pero de la que el transgén ha segregado. Las plantas nulas también se pueden describir como las plantas transformadas negativas homocigotas. El umbral de significación para la prueba t se establece en nivel de probabilidad del 10 %. Los resultados para algunos acontecimientos pueden estar por encima o por debajo de este umbral. Esto se basa en la hipótesis de que un gen solamente podría tener un efecto en ciertas posiciones en el genoma y que la aparición de este efecto dependiente de la posición no es infrecuente. Este tipo de efecto génico también se denomina en el presente documento un "efecto de línea del gen". El valor p se obtiene comparando el valor t de la distribución t o, como alternativa, mediante la comparación del valor F con la distribución F. El valor p da después la probabilidad de que la hipótesis

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La Tabla W muestra el número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el peso de mil granos (PMG), el porcentaje de este aumento, así como la relevancia estadística de este incremento de acuerdo con la prueba F.

Tabla W: Número de acontecimientos transgénicos con un aumento en el peso de mil granos (PMG), el porcentaje de aumento, y el valor P de la prueba F en la generación T1 y T2 de arroz transgénico con aumento de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de transcripción SPL15.

Peso de mil granos

Número de acontecimientos que muestran un aumento

% de diferencia Valor p de la prueba F

Generación T1

4 de 7 2 0,0041

Generación T2

4 de 5 1 0,0259

Ejemplo 8: Resultados de la evaluación fenotípica de las plantas transgénicas que expresan la SEC ID Nº 234bajo el control de un promotor constitutivo

10 Los resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas que expresan la secuencia de ácido nucleico útil en la realización de los procedimientos de la invención bajo el control del promotor GOS2 constitutivo se presentan en la Tabla x. También se muestra la diferencia porcentual entre los transgénicos y los nulicigotos correspondientes.

Las plantas transgénicas que expresan la secuencia de ácido nucleico útil en la realización de los procedimientos de la invención tienen un mayor vigor inicial y un mayor PMG en comparación con las plantas control (en este caso, las

15 nulicigotas).

Tabla X: Resultados de la evaluación de plantas de arroz transgénicas de generación T1 que expresan la secuencia de ácido nucleico útil en la realización de los procedimientos de la invención, bajo el control de un promotor GOS2 constitutivo fuerte

Rasgo

% de incremento de los mejores acontecimientos en la generación T1

Aumento de vigor inicial

17 %

Rendimiento de semillas totales (por planta)

18 %

Número total de semillas llenas

19 %

Aumento del índice de llenado de las semillas

10 %

Aumento del índice de recolección

15 %

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