CN114835788B - 蜡梅CpFUL-like基因及其编码的蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及蜡梅CpFUL‑like基因及其编码的蛋白与应用。将从转录组测序获得的CpFUL‑like基因CDS序列全长设计特异引物，以蜡梅花cDNA为模板，利用PCR扩增技术以得到该目的片段。测序结果显示CpFUL‑like基因最大ORF框729bp，编码242个氨基酸。将该基因转化拟南芥后表型观察发现转基因株系抽薹时间、第一朵花形成时间及第一个角果形成时间均早于野生型植株，且转基因植株莲座叶数目明显减少。此外，高表达量株系植株出现顶端花，2～3朵花合生为1朵花，花器官表型部分发生变化，萼片有卷曲现象，植株侧枝数增多。

Description

蜡梅CpFUL-like基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个蜡梅CpFUL-like基因、其编码的蛋白和应用。

背景技术

蜡梅(Chimonanthus praecox L.)，是蜡梅科(Calycanthaecae)蜡梅属(Chimonanthus)植物，落叶丛生灌木，高可达4米左右。蜡梅在我国栽培历史千年有余，最早于唐代开始种植，宋代时栽培较为普遍，明清时期应用较为广泛。蜡梅易混淆为“腊梅”，据文献考证，北宋黄庭坚《山谷诗序》曾有记录：“东洛间有一种花，香气似梅花，亦五出，而不能品明，类女工燃蜡所成，京洛人因谓蜡梅”。故，此蜡梅非彼“腊梅”。李时珍《本草纲目》也有记载：“蜡梅，释名黄梅花，此物非梅类，因其与梅同时，香又相近，色似蜜蜡，故得此名”。蜡梅花多为黄色，且花瓣具有“蜡”质光泽。蜡梅色、香、姿、韵俱全，是我国特产的传统名贵观赏花木，为广大人民钟爱。

随着分子生物学的发展，国内外学者对蜡梅的研究逐渐增多。蜡梅分子生物学研究集中在应用分子生物学技术为蜡梅品种分类提供依据和功能基因两方面，功能基因主要集中在花发育、花香、花色、抗性相关基因。

MADS-box基因家族FUL基因在植物生长发育过程中起着重要的作用，如控制开花时间、花分生组织分化、茎生叶的形态、心皮和果实的发育等方面。在拟南芥中，FUL基因，又称AGL8基因，位于第五条染色体上，属于AP1/FUL-like基因亚家族。植物在进化过程中发生了不同程度的基因复制事件，导致基因功能发生去功能化、亚功能化和新功能化。AP1/FUL-like基因亚家族为被子植物所特有，而且在进化过程中发生了多次基因复制事件，其中最重要的产生了euAP1、euFUL和FUL-like三个进化系。被子植物演化过程中，最开始出现的是被子植物的基部植物，如木兰类、睡莲等植物，只有FUL-like基因，AP1是后来出现的。euAP1和euFUL存在于核心双子叶植物中，FUL-like进化系存在于非核心双子叶植物。三者在C端有不同的基序，euAP1进化系具有法尼化基序(CF/YAA)，euFUL和FUL-like进化系具有高度疏水6氨基酸的FUL-like/paleoAP1基序(L/MMPWML)。euAP1是由于paleo AP1/FUL-like基序移码突变产生的。euAP1负责调控萼片和花瓣的形成，euFUL主要参与营养生长向生殖生长转变、茎生叶发育、复叶形成和果实发育。作为euAP1和euFUL进化系发生基因复制前的祖先，FUL-like进化系包含euAP1和euFUL的功能。

在拟南芥中，目前已克隆4个AP1/FUL-like功能的基因：AP1、CAL、FUL、AGL79。AP1具有双重作用，既是花分生组织特征基因，也是花器官特征基因，参与萼片和花瓣的发育。ap1突变体花瓣特征明显缺失。CAL是AP1的旁系同源基因，只促进花分生组织的形成。ap1cal双突变体增强了ap1突变体的表型，呈“花椰菜”结构。FUL基因与AP1和CAL基因在调控花发育方面具有冗余作用。cal和ful突变体花序特征无明显变化，但ap1 cal ful三突变体明显增强ap1 cal双突变的表型。FUL基因同AP1序列相似性较高，可通过C末端的基序加以区分。FUL基因具有更广泛作用：花发育早期可促进花序分生组织的形成，花发育晚期参与心皮及角果的发育，同时还可影响叶片的发育形态。ful突变体果壳的细胞不能正常分化，随着种子的发育，果实会提前裂开。此外，ful突变体茎生叶比野生型拟南芥宽，且内部细胞层减少。最近研究表明，FUL基因可直接通过负反馈调节茎尖分生组织AP2，维持WUS的表达，促进分生组织停滞。AGL79研究内容较少，仅在根中表达，该基因功能尚不清楚，待进一步研究。

研究发现，FUL-like基因在多个物种已有克隆并进行功能分析。单子叶植物的AP1/FUL-like基因主要分为FUL1、FUL2、FUL3三个亚类。小麦(Triticum aestivum)中有三个FUL-like基因：WFUL1(VRN1)、WFUL2、WFUL3。研究发现，敲除WFUL1基因时，小麦由营养生长转变为生殖生长阶段受阻，表明WFUL1调控营养阶段的转变。WFUL1基因可能通过上调WFUL3基因的表达水平来促进开花，WFUL2可和B类E类基因相互作用，具有A类基因的功能。水稻(Oryza sativa)中有三个FUL-like基因：OsMADS14(FUL1)、OsMADS15(FUL2)、OsMADS18(FUL3)。上述三个基因都可促进水稻开花，使用基因沉默技术降低OsMADS18基因的表达量后，植株在根、叶、花序及花器官上并没有明显的变化，表明OsMADS18基因和其他的A类基因功能上冗余。同时沉默OsMADS14、OsMADS15和OsMADS18基因，植株开花时间延迟。

多年生木本植物葡萄(Vitis vinifera)中FUL-like同源基因为VFUL-L(VITISFRUITFULL)，研究表明，VFUL-L调控花分生组织分化、浆果和种子的发育，可促进葡萄藤卷须的分化和发育。VFUL-L基因在休眠芽中至幼芽萌发阶段持续表达，根和叶中检测不表达。

苹果(Malus domestica)中的两个FUL-like基因：MdMADS2.1和MdMADS2.2，可调控苹果果肉的硬度。桃(Prunus persica)中FUL-like基因PpMADS6在拟南芥中过表达出现开花时间提前，单花花器官数目增多及果荚成熟期不开裂等表型。

FUL-like基因在农业上也有重要应用，有助于提高经济作物价值。拟南芥FUL基因在芥菜(Brassica juncea)中异源表达产生果荚不开裂性状，欧洲油菜(Brassica napus)的FUL同源基因与裂荚性状有关。大豆GmFULa基因在开花和成熟期起作用。黄瓜(Cucumissativus)CsFUL1基因可抑制CsSUP介导的细胞分裂和CsPIN1/7介导的生长素运输蛋白增加黄瓜长度，提高产量。番茄两个FUL基因：TDR4(FUL1)和MBP7(FUL2)基因可与SEP家族的同源基因果实成熟因子RIN蛋白互作来调控果实成熟。

二球悬铃木(Platanus acerifolia)的3个FUL-like基因(PlacFL1、PlacFL2、PlacFL3)超表达转化拟南芥都有早花现象，且PlacFL2表达量高于PlacFL1和PlacFL3，说明三者在成花转变和花序发育中具有调控作用。此外PlacFL2基因还参与叶片和营养芽的发育。

目前，已从多种物种中克隆FUL同源基因，但在蜡梅中关于此基因的研究还尚未报道。研究不同植物花发育相关基因，有助于充分理解花发育调控机理。综上所述，本研究旨在探究CpFUL-like基因在蜡梅花发育过程中的功能，为阐明蜡梅花发育分子机制奠定基础，为蜡梅育种提供理论依据。

发明内容

本发明的目的是提供蜡梅CpFUL-like及其编码的蛋白与应用。

首先，本发明提供蜡梅CpFUL-like蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的蜡梅CpFUL-like蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控花期中的用途。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

本发明还提供一种使植物提前开花的方法，其为将含有所述基因的载体转入所述植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

本发明的有益效果如下：

(1)利用PCR技术克隆蜡梅CpFUL-like基因，最大ORF框含729bp，编码242个氨基酸，在NCBI数据库进行Blastx分析，结果表明含有保守的MADS-box和K-box结构域，C末端含有典型的FUL-like/paleoAP1基序，属于MIKC型MADS-box基因。进行多序列比对及进化树分析可知，CpFUL-like蛋白属于MADS-box家族的AP1/FUL-like家族的FUL-like分支。CpFUL-like蛋白二级结构预测，结果显示含56.20％α螺旋、12.40％的延伸链和31.4％的随机卷曲。CpFUL-like蛋白不含有信号肽序列，无跨膜结构域，属于细胞核蛋白。

(2)实时荧光定量PCR对CpFUL-like的表达模式进行分析：CpFUL-like在不同营养组织器官和生殖器官中均有表达，其中营养组织中叶片的表达量最高，幼果表达量最低，花器官中外瓣表达量最高，雄蕊次之，雌蕊的表达量最低；CpFUL-like基因在各个时期都有表达，其中在雌雄蕊原基分化期和花芽分化完成期表达量较高，且在蜡梅花开放过程中持续表达。

(3)为了研究CpFUL-like基因在植物生长发育过程中的功能，将构好的植物表达载体转入野生型拟南芥中，最终得到9个株系14个纯合单株。以野生型拟南芥为对照，选取表达量高、中的两个株系进行表型观察。结果显示，35S::CpFUL-like/Col-0转基因株系的抽薹1cm时间、第一朵花开放时间及第一个角果形成时间均早于野生型拟南芥。35S::CpFUL-like/Col-0转基因植株莲座叶数目明显减少，且高表达量株系花器官发生变化，侧枝顶端产生顶端花，2～3花合生，所结角果似爪状。35S::CpFUL-like/Col-0转基因植株侧枝数较野生型有所增加，莲座叶和茎生叶形态较小，且植株整体矮小。对35S::CpFUL-like/Col-0转基因植株内源相关开花基因及花器官特征基因进行研究分析，发现在花序原基形成前，拟南芥AP1、LFY、FUL、SEP3、TFL1、AP3、PI、AG基因表达量均上调，SVP基因下调。

附图说明

图1所示为蜡梅CpFUL-like基因的克隆。M：DL 2000marker；1-2：PCR扩增产物电泳条带；CK：空白对照。。

图2所示为蜡梅CpFUL-like保守结构域预测。

图3所示为蜡梅CpFUL-like cDNA的核苷酸及其推导的氨基酸序列。注：横线表示起始密码子，*表示终止密码子。M、I、K和C结构域，分别用黄、绿、蓝和紫色阴影标注。灰色阴影表示FUL-like基序。左右两侧的数字表示核苷酸与氨基酸的位置。编码区前后的区域分别为5’端UTR和3’端UTR。

图4所示为蜡梅CpFUL-like蛋白与其他物种AP1/FUL-like蛋白氨基酸多序列比对。MADS结构域和K结构域分别用红色、绿色横线标出。euAP1基序和FUL-like基序分别用红色框和蓝色框表示。

图5所示为蜡梅CpFUL-like蛋白与其他物种AP1/FUL-like蛋白进化树构建。注：CpFUL-like蛋白用紫色方框标出。euAP1、euFUL、AGL79、FUL-like进化系分别用红色、蓝色、黄色竖线标出。选用拟南芥(Arabidopsis thaliana)AGL6蛋白作为外类群。

图6所示为蜡梅CpFUL-like基因在不同组织的表达量。a、b、c、d显著性差异表示*P＜0.05水平差异性显著。

图7所示为蜡梅CpFUL-like基因在不同花发育时期的相对表达量。BS：蕾期；DP：露瓣期；IB：初开期；OF：盛开期；SF：衰败期。

图8所示为pCAMBIA2300G-CpFUL-like双酶切验证。1：pCAMBIA-CpFUL-like双酶切产物；M：DL2000 marker。

图9所示为35S::CpFUL-like/Col-0 T0代转基因植株Kan抗性筛选。注：红色框表示筛选出来的苗子。

图10所示为35S::CpFUL-like/Col-0转基因植株PCR鉴定结果。M：DL 2000分子量；1-7：转基因拟南芥株系；PC：阳性对照；WT：野生型拟南芥；CK：空白对照。

图11所示为35S::CpFUL-like/Col-0 T2代不同单株CpFUL-like的表达量。

图12所示为35S::CpFUL-like/Col-0 T2和野生型拟南芥内源基因的表达量。A代表CpFUL-like基因；B、C、D、E、F、G、H、I、J分别代表LFY、AP1、FUL、TFL1、SVP、AP3、PI、AG、SEP3基因。a，b，c表示显著差异((*p<0.05)。

图13所示为35S::CpFUL-like/Col-0 T2转基因植株的表型分析。a、b、c、e：转基因株系和野生型的莲座叶数目；d：转基因株系和WT开花表型；f：第一朵花开放时间。标尺：2.1cm(a-c)；2.6cm(d)。

图14所示为35S::CpFUL-like/Col-0 OE 6-6早花和复合花表型。a：OE 6-6株系早花表型；b：顶端产生复合花表型。标尺：1.8cm(a)；2.5mm(b)。

图15所示为35S::CpFUL-like/Col-0和野生型拟南芥花器官、叶片及果实表型变化。a：OE 6-6株系花器官中两个雌蕊；b：OE 6-6株系萼片发生卷曲现象；c：OE 19-2株系花器官无变化；d：野生型拟南芥花器官；e：35S::CpFUL-like/Col-0和野生型拟南芥莲座叶形态(从左至右依次为OE 6-6、OE 19-2、WT)；f：35S::CpFUL-like/Col-0和野生型拟南芥茎生叶形态(从左至右依次为OE 6-6、OE 19-2、WT)；g：OE 6-6株系角果类型；h：OE 19-2株系角果；i：野生型拟南芥角果。标尺：0.5mm(a-d)；0.9cm(e-f)；1.3cm(g-i)。(图a和图b中花瓣经过人为处理，以便观察；图e中莲座叶为第四片莲座叶；图f中茎生叶为第一个侧枝茎生叶。)

图16所示为35S::CpFUL-like/Col-0转基因植株和野生型拟南芥侧枝数目。A：侧枝表型；B：侧枝数目。ab表示显著差异(*p<0.05)。标尺：2.8cm。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1蜡梅CpFUL-like基因的克隆

本试验所用植物材料为西南大学校园种植的素心蜡梅(Chimonanthus praecox‘concolor’)。生长状态良好，常规养护管理。各花器官材料均取自成年蜡梅植株。将所取材料于液氮中冷冻，-80℃冰箱保存，用于基因克隆。

从转录组获得的蜡梅CpFUL-like基因进行序列分析并设计特异引物(CpFUL-like-F/R)，以蜡梅花cDNA为模板，扩增蜡梅CpFUL-like基因CDS序列。引物序列见下表。

表1蜡梅CpFUL-like基因CDS序列引物

将蜡梅CpFUL-like基因开放阅读框PCR扩增结果进行电泳检测，结果显示目的条带特异(图1)。将PCR产物克隆到pMD19-T载体中，转化大肠杆菌。挑取单菌落于LB液体培养基(含Amp)培养12h左右，使用M13F和M13R引物进行菌液PCR检测，条带大小正确的阳性克隆送至华大基因公司测序，序列如SEQ ID No.1所示。

将蜡梅CpFUL-like基因在NCBI上进行比对分析，最大ORE框为729bp。NCBI cds进行结构域预测，发现蜡梅CpFUL-like基因所编码蛋白含有高度保守的MADS-MEF2-like结构域和K-box结构域，即推测该基因属于MADS-box基因家族(图2)。

利用DNAMAN软件将该基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列，如图3所示。CpFUL-like基因cDNA序列全长1198bp，编码区729bp，5’非编码区81bp，3’非编码区388bp。MADS结构域包含76个氨基酸，I结构域包含14个氨基酸，K结构域包含83个氨基酸，C结构域包含69个氨基酸(图3)。利用EditSeq软件分析CpFUL-like CDS区由223个A、143个T、186个G、177个C组成，A+T含量约为50.21％，G+C含量约为49.79％。

选取拟南芥AP1、FUL、CAL、AGL79蛋白，鳄梨AP1蛋白，五峰木兰AP1-like和荷花玉兰AP1-like蛋白，进行多序列比对分析(图4)。比对分析发现，它们都含有MADS结构域和K结构域，并且CpFUL-like在C末端有一个保守的FUL-like/paleoAP1基序，即L/MPPWML/V基序。拟南芥AP1和FUL基因有保守的euAP1基序，即CF/YAA。CpFUL-like蛋白具有FUL-like基序，不具有euAP1基序，表明CpFUL-like属于FUL-like进化系。推测该基因为蜡梅FUL同源基因，命名为CpFUL-like基因。

为了进一步分析CpFUL-like的进化地位，利用MEGA6.0软件，对CpFUL-like蛋白及其他物种中的AP1/FUL-like蛋白构建进化树。结果如图表明，分为4个分支：euAP1、euFUL、AGL79和FUL-like。CpFUL-like属于FUL-like进化分支，FUL-like分支主要包括木兰类、基部真双子叶植物和单子叶植物，其他三个分支仅包含核心真双子叶植物。CpFUL-like和鳄梨、五峰木兰和荷花玉兰A类基因聚为一支，其中与鳄梨亲缘关系较近(图5)。

实施例2蜡梅CpFUL-like基因的表达特性分析

为了进一步研究蜡梅CpFUL-like基因的表达模式，采取素心蜡梅植株的不同组织(根、茎、叶、果)和花器官(外瓣、中瓣、内瓣、雌蕊、雄蕊)及不同花芽分化期和开花时期(萌动期、蕾期、露瓣期、初开期、盛开期、衰败期)的花芽。上述材料采集于成年蜡梅植株，采集完立即放液氮冰冻，于-80℃冰箱保存，用于表达特异性分析。

选用蜡梅的CpActin与CpTublin基因作为蜡梅CpFUL-like基因实时荧光定量的双内参基因，运用Primer Premier 6.0软件设计内参基因的目标基因CpFUL-like的荧光定量特异引物(qCpFUL-like-F/R)，送至北京六合华大基因科技股份有限公司合成，本章所用引物序列见表2。

表2实时荧光定量PCR引物

以反转录获得的cDNA第一链为模板，对CpFUL-like基因在蜡梅不同组织及不同开花时期花器官中的表达情况进行实时荧光定量PCR分析。结果表明：在所检测的不同组织和花器官中，CpFUL-like基因均有所表达，其在叶中的表达量最高，叶片和其他组织的表达量差异显著，雄蕊的表达量最低，叶片中的表达量约为雄蕊的19.69倍；在检测的花器官中，外瓣表达量最高，雌蕊次之，雄蕊的表达量最低，外瓣的表达量约为雄蕊的2.38倍，雌蕊的表达量约为雄蕊的5.08倍(图6)。

通过荧光定量技术分析CpFUL-like基因在不同时期花器官的表达水平，结果如图7显示，3～4月份花芽分化前期及花被片原基分化阶段，蜡梅CpFUL-like基因表达量逐渐升高，于4月28日达到最高；5月份雌雄蕊原基分化阶段CpFUL-like基因表达量呈先降低后升高的趋势，5月25日达到最高，而后下降；6月份CpFUL-like表达量呈下降趋势；7～8月份初休眠阶段花芽中的表达量上升，但趋势较为平稳；9月份，花芽中的表达量有所升高，上升趋势较快于9月9日升到最高，而后于9月23日降至最低；10月份子房成熟阶段，花芽分化过程基本完成，10月1日有所升高，10月10日降至最低，而后10月16日升至最高而后下降；11月份低温积累阶段CpFUL-like表达量呈一直升高趋势，此时花粉粒逐渐形成；12月份开始进入花期，12月份蕾期(BS)9日升至最高，而后打破休眠露瓣阶段(DP)表达量急剧下降，初开期(IB)和盛开期(OF)逐渐下降，衰败期(SF)又逐渐升高。

实施例3蜡梅CpFUL-like基因表达载体的构建及拟南芥遗传转化

利用Prime Premier 6.0软件分析CpFUL-like基因序列是否含有表达载体pCAMBIA-2301g的酶切位点，选取BamHI和EcoRI二者为酶切位点，并在上下游引物序列5’端加入相应保护碱基，设计特异引物(CpFUL-like-BamHI-F/CpFUL-like-EcoRI-R)，引物序列见表3。

表3酶切位点引物序列

注：黑色下划线为酶切位点，酶切位点前为保护碱基。

根据CpFUL-like序列及载体结构特点选取BamHI和EcoRI为酶切位点，进行PCR扩增，相应条带切下胶回收连接pMD19-T，转化大肠杆菌，挑取单菌落培养经PCR鉴定后送测。经测序结果正确的阳性克隆菌液提取质粒，和植物表达载体pCAMBIA-2301g一起用BamHI和EcoRI限制性内切酶进行双酶切，回收相应片段，T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，送至华大公司验证序列。测序结果正确的阳性克隆菌液提取质粒进行双酶切验证，验证结果正确，将其命名为pCAMBIA-2301g-CpFUL-like，结果如图8。

将构建好的pCAMBIA-2301g-CpFUL-like通过电击法转入农杆菌GV3101感受态细胞中，成功转入农杆菌，对菌液进行检测，鉴定正确的菌液保存起来，用于后续的拟南芥侵染。

将通过侵染获得的转基因拟南芥T0代种子播种在MS固体培养基上(含Kan和Cb抗生素)，筛选结果如图9所示，转入目的基因的植株可正常生长，未转入的黄化死亡，T0代共筛选出25个转基因拟南芥植株。

提取转基因植株T0代植物叶片，提取DNA，进行PCR检测进一步确认是否成功转入。部分检测结果如图10所示，得到的转基因植株有假阳性植株(例图10中2号为假阳性植株)。

筛选出的植株经移栽培养获得种子，再次进行筛选，表现出分离比接近3：1的株系各单株进行移栽，T2代最终获得9个株系14个纯合单株。

取生长14天的幼苗提取RNA，反转录cDNA为模板，分析转基因植株CpFUL-like基因的表达量。结果显示，CpFUL-like基因在WT中不表达，其余所检测的植株中均有所表达。在6号株系表达量最高，13号株系次之，17号株系最低，几乎不表达。单株以OE 6-6表达量最高，OE 6-11次之，OE 13-1单株次之(图11)。根据荧光定量结果，选取表达量高的OE 6-6、表达量中的OE 19-2两个株系进行后续表型观察。OE 6-6株系表达量是OE 19-2的2.21倍。

为了研究分析35::CpFUL-like转入拟南芥后对自身开花基因的影响，选取相关开花基因进行定量检测。选取开花相关基因及花器官特征基因AP1、LFY、FUL、SVP、TFL1、AP3、PI、AG、SEP3基因在转基因株系检测，拟南芥AtActin作为内参基因。提取转基因植株和WT生长14天的幼苗的RNA，反转录为cDNA，用于实时荧光定量检测内源开花通路相关基因的表达量。引物如下表4：

表4实时定量PCR引物序列

结果显示，AP1、LFY、FUL、SEP3、TFL1、AP3、PI、AG基因在转基因株系中都有所上调，SVP基因在转基因株系中下调，且SVP基因在35S::CpFUL-like/Col-0的表达量不呈负相关，其他基因的表达量均呈正相关。

LFY基因相对表达量，转基因两个株系同野生型之间存在显著差异，OE 6-6的表达量为WT的3.80倍，OE 19-2株系是WT的1.51倍；AP1基因表达量，35S::CpFUL-like/Col-0转基因株系与WT差异显著，OE 6-6的表达量为WT的23.90倍，OE 19-2株系是WT的8.55倍；蜡梅CpFUL-like基因转入拟南芥后内源FUL基因表达水平显著上升，35S::CpFUL-like/Col-0转基因株系同野生型差异显著，OE 6-6的表达量为WT的3.15倍，OE 19-2株系是WT的2.44倍；开花抑制因子SVP基因的表达水平与CpFUL-like的表达水平不成正比，WT与OE 6-6株系差异不显著，WT与OE 19-2株系差异显著，WT是OE 6-6的表达量的1.10倍，WT是OE 19-2株系的1.58倍；TFL1基因，转基因株系同野生型差异显著，转基因株系之间差异也显著，OE 6-6的表达量为WT的3.16倍，OE 19-2株系是WT的1.69倍；对于B类基因AP3和PI基因来说，二者主要参与控制雄蕊的发育，AP3基因而言，转基因株系同WT之间差异显著，OE 6-6的表达量为WT的8.38倍，OE 6-6株系是OE 19-2的2.30倍；PI基因，OE 6-6与OE 19-2和WT差异显著，OE19-2和WT差异不显著，OE 6-6的表达量为WT的2.02倍，OE 19-2株系是WT的3.29倍；C类基因AG来说，转基因株系同WT植株差异显著，OE 6-6和OE 19-2之间差异不显著，OE 6-6的表达量为WT的2.29倍，OE 19-2株系是WT的1.38倍；E类SEP3基因，三个株系之间差异显著，OE 6-6的表达量为WT的42.14倍，OE 19-2株系是WT的11.94倍(图12)。

在长日照条件下，以野生型拟南芥为对照，选取高、中表达量的OE 6-6、OE 19-2两个株系进行表型观察。以下统计时间从播种之日开始计算。

表型观察结果显示，转基因植株的抽薹时间(抽薹1cm为标准)、第一朵花形成时间及第一个角果形成时间均早于拟南芥野生型植株(表5，图13e)。35S::CpFUL-like/Col-0OE 6-6和OE 19-2株系抽薹时间分别为25.94和29.54天，WT为39.69天，且三者差异显著。OE6-6株系开花时间明显提前，比WT提前14天左右，OE 19-2株系比WT提前8天左右(图13d和f)。WT形成第一个荚果所需时间为46.09天，而OE 6-6和OE 19-2株系只需33.89和37.20天。统计拟南芥开花时间的指标之一是莲座叶数目的多少。通常是，莲座叶数目越多，标志着植株营养生长阶段越长。转基因植株抽薹1cm时莲座叶数目明显减少，转基因植株莲座叶平均数目为7.30片，野生型为12.34片，OE 6-6株系莲座叶数目为6.71片，表明转基因植株从营养生长向生殖生长转变提前，开花时间明显提前(图13a-c和e)。高表达量OE 6-6株系早花表型较为明显，植株比较矮小，且侧枝花序有顶端花的产生，花器官表型发生变化，2-3多花合生为1朵花，但花器官数量没有发生变化(图14)。野生型拟南芥四轮花器官由4枚萼片、4片花瓣、6枚雄蕊及1枚雌蕊组成。此外,转基因植株OE 6-6萼片发生卷曲现象，OE 19-2株系花器官表型无变化(图15a-d)。转基因植株OE 6-6和OE 19-2侧枝数明显增加，OE 6-6株系7.57枝，WT植株侧枝数目仅仅只有4.91枝(图16)。转基因植株整体矮小，WT植株平均高度达27.19cm。且转基因株系莲座叶、茎生叶发生变化，形态远小于WT植株，高表达量的OE6-6株系茎生叶形态变化较大(图15e-f)。35S::CpFUL-like/Col-0 OE6-6株系角果类型丰富，1～4个角果不等，2个角果合生的似“V”字型，3～4个角果的似爪状，OE 19-2角果类型同WT植株一样(图15g-i)。

以上统计结果显示，35S::CpFUL-like/Col-0转基因植株的抽薹时间、第一朵花开时间及第一个角果形成时间与CpFUL-like基因的表达量成正比。莲座叶数目减少可能是由于植株开花时间提前，植株提前从营养生长转变为生殖生长，推测CpFUL-like在植株成花转变具有调控作用。此外35S::CpFUL-like/Col-0转基因植株的花器官、叶片形态和果实类型也发生变化。

表5 35S::CpFUL-like/Col-0 T2代植株表型观察统计数据

注：表中每组数据为“平均值±标准误差”，3次重复，每组重复12棵。a、b、c、d显著性差异表示P＜0.05水平差异性显著。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 蜡梅CpFUL-like基因及其编码的蛋白与应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1198

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 1

aaacagattt ctgtctgaat ttcaggtgaa ttgctggtga attggcggtg attttgttgg 60

cgggaagagc tgaagacgaa gatggggagg ggtagagtgc agctgaagcg gatcgagaac 120

aagataaatc gccaggtcac cttctccaag cgccggatgg ggctgctgaa gaaggcgcac 180

gagatctccg tcctctgcga tgccgaggtc gctctcatcg tcttctccac caaaggaaaa 240

ctctacgagt actccaccga ttcctgcatg ccaaggattc ttgaacgata cgagcgatat 300

tcctacgcag aacgggaact aactctctgt gggcctgaat ctgaggggaa ctggtgccaa 360

gaatacggaa aacttaaggc taaggttgag gcaatacaaa gaaacctaag gcattttatg 420

ggagaggagc ttgacgcctt gagtctcaga gagctccaac atttagaaca acagcttgat 480

gctgctttga agcatgttag agcaagaaag aaccaactta tgtttgaatc gatagctgat 540

cttcaaagaa aggagaagtc attgcaggag cagaacactg tgcttgagaa gaagcttcaa 600

gagaaggaaa aagcgatagc tctccaagct cactgggagc aaccccaaac cacatcatcc 660

ctcatgctgt caagtcctct tccccctcta aatagcggca catatcgcca cacaagcagt 720

ggcggagcag aagaagaagt aagtcgacgg ccagctcgga ccaatagcct tgttccacaa 780

tggatgctag gccacatcaa cgaacagtga gcaattatgg atgcccctct tccctttttc 840

ttttcttcta taatatctat tttatggaca gacataacta gttagaactg tgcatatcaa 900

cgaaaaggaa tgcttatgcc cactctttta tctattcatc catttcgaat tgtattaaat 960

gattgcttat tcccccaaaa gtggtaggcc atggatcttg cccaacttgc atgctaccca 1020

atgtttggat gcccttcaaa attttggcca tcttcttaac caagttatcc ttgccaatgt 1080

ttggctttgc cctaagatgg gattgattgt tggaaccccc gacttaaatt aaaaaaaaag 1140

aagtatcttt atttgtgtaa atttatgatt tctcttctat tcaacctatg actaatgc 1198

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 2

Met Gly Arg Gly Arg Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Met Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

35 40 45

Ser Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ser Thr Asp Ser Cys Met Pro

50 55 60

Arg Ile Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr Ser Tyr Ala Glu Arg Glu Leu

65 70 75 80

Thr Leu Cys Gly Pro Glu Ser Glu Gly Asn Trp Cys Gln Glu Tyr Gly

85 90 95

Lys Leu Lys Ala Lys Val Glu Ala Ile Gln Arg Asn Leu Arg His Phe

100 105 110

Met Gly Glu Glu Leu Asp Ala Leu Ser Leu Arg Glu Leu Gln His Leu

115 120 125

Glu Gln Gln Leu Asp Ala Ala Leu Lys His Val Arg Ala Arg Lys Asn

130 135 140

Gln Leu Met Phe Glu Ser Ile Ala Asp Leu Gln Arg Lys Glu Lys Ser

145 150 155 160

Leu Gln Glu Gln Asn Thr Val Leu Glu Lys Lys Leu Gln Glu Lys Glu

165 170 175

Lys Ala Ile Ala Leu Gln Ala His Trp Glu Gln Pro Gln Thr Thr Ser

180 185 190

Ser Leu Met Leu Ser Ser Pro Leu Pro Pro Leu Asn Ser Gly Thr Tyr

195 200 205

Arg His Thr Ser Ser Gly Gly Ala Glu Glu Glu Val Ser Arg Arg Pro

210 215 220

Ala Arg Thr Asn Ser Leu Val Pro Gln Trp Met Leu Gly His Ile Asn

225 230 235 240

Glu Gln

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 3

tcaggtgaat tgctggtgaa ttgg 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 4

cttaaccaag ttatccttgc caatg 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 5

cttgacgcct tgagtctcag ag 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 6

agtgagcttg gagagctatc gc 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 7

gttatggttg ggatgggaca gaaag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 8

gggcttcagt aaggaaacag ga 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 9

tagtgacaag acagtaggtg gaggt 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 10

gtaggttcca gtcctcactt catc 24

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 11

cgggatccat ggggaggggt agagtgcag 29

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 12

cggaattcca attatggatg cccctcttcc c 31

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 13

cttcgtcttc cacttcag 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 14

atcataccag tctcaacac 19

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 15

gcacaacaga tgctacgttt ggc 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 16

cctatgcttg gccttggcaa ttc 23

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 17

caaggacttg acattgaaga gcttca 26

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 18

ctgatctcac tcataatctt gtcac 25

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 19

attggttcaa gcaccacctc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 20

caagaagctc ccaacgaaag 20

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 21

ccaactctat ttgaatcttt ctcac 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 22

acaagacaga aaacatgaga gaggt 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 23

ctctgcctct gacatcatta ccttc 25

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 24

gttttagcaa caccatgcct tatg 24

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 25

ccaaatcttc aggaaaagat tat 23

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 26

aagacaaact aaagaccacg atatt 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 27

tgcaacctaa caatcaccat tactc 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 28

acccaattct ggtttttatt cactc 25

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 29

tagggctcaa caggagcagt 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 30

cagccaaggt tgcagttgta 20

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 31

gtaacctcct ccagagatgg cttt 24

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 32

acgtaacatc caagccggaa g 21

Claims (7)

1.蜡梅CpFUL-like蛋白，其为由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的蜡梅CpFUL-like蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在调控植物花期中的用途，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

7.一种使植物提前开花的方法，其特征在于，将含有权利要求2或3所述基因的载体转入植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

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