CN112745376A - 一种转录抑制因子lip1调控水稻产量的功能及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种转录抑制因子LIP1调控水稻产量的功能及应用。本发明克隆的LIP1蛋白基因与LAX1基因的互作，LIP1基因在侧生小穗分生组织发育后期表达，通过与LAX1互作抑制LAX1蛋白转录活性。LIP1基因功能的缺失或时空异位表达，将改变LAX1蛋白的时空活性，影响水稻小穗的形成。本发明的LIP1的时空表达界定了LAX1在小穗侧生分生组织中活性作用的范围，保障水稻侧生小穗的形成从而控制产量。利用本发明克隆的LIP1基因及其编码蛋白，通过基因操作手段调控其表达活性可以改变LAX1的时空活性，从而调控小穗的形成，对水稻产量性状的遗传改良具有重要意义。

Description

一种转录抑制因子LIP1调控水稻产量的功能及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种转录抑制因子LIP1调控水稻产量的功能及应用。 LAX1是一种水稻产量性状基因互作的蛋白抑制子。本发明克隆的LIP1基因在侧生小穗分生组织发育后期 表达，并通过与LAX1基因互作抑制LAX1的蛋白活性，LIP1的时空表达界定了LAX1在小穗侧生分生 组织中活性作用的范围，保障水稻侧生小穗的形成从而控制产量。利用本发明克隆的LIP1基因及其编码 蛋白，通过基因操作手段调控其时空表达可以改变LAX1的时空活性，从而调控侧生小穗的形成，对水稻 产量性状的遗传改良具有重要的意义。

背景技术

水稻单株产量主要由每株有效穗数、每穗实粒数、粒重三个因素决定，稻穗是产量形成的重要器官。 稻穗的形态(穗型)主要由分枝多少、分枝的长短及着粒密度等多种因素决定。水穗由最初的花序分生组 织发育而来的，花序分生组织伸长的程度决定了穗轴长，一次或二次枝梗原基伸长的程度决定了一次或二 次枝梗长。一次枝梗的数量是由花序分生组织的分枝能力决定的，二次枝梗和一次枝梗颖花的数量反映了 枝梗原基转化为小花原基的能力。而一次或二次枝梗长以及一次枝梗和二次枝梗颖花的数量决定了穗的形 态，通过影响每穗小花数从而影响水稻产量(见Ikeda等，Developmental course ofinflorescence and spikelet in rice.Breeding Science,(2004):147–156)。因此，通过基因工程方法调控水稻穗的分枝和小花的形成是水 稻产量性状遗传改良的有效手段之一。

国内外对水稻穗形态建成的分子机制开展了较为深入的研究，通过幼穗发育的不同阶段基因表达谱、 穗型突变体的方法分离克隆了相关的功能基因。LAX1是影响水稻穗分枝的形成的关键基因之一，LAX1的 不同等位突变体表现出强弱不同的突变表型，在温和型的lax1-1突变体中，稻穗只在一次和二次枝梗顶端 发育出小花，没有侧生的小穗形成，而在表型严重的等位突变体lax1-2中所有的枝梗、侧生小穗和顶端小 穗均不能形成(见Komatsu等，LAX and SPA:Major regulator of shoot branching inrice.Proc.Natl.Acad.Sci. USA,(2003):11765–11770)，由此可见，LAX1基因对于穗分枝的形成是必需的。LAX1编码一个植物特有 的bHLH类转录因子，LAX1 mRNA在茎顶端分生组织与新形成的侧生分生组织之间的边界区域表达(见 Komatsu等，LAX and SPA:Majorregulator of shoot branching in rice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA, (2003):11765–11770)。进一步的研究表明LAX1发挥功能具有时空特异性，在分蘖形成过程中，叶片发育P4期，LAX1的mRNA在顶端分生组织和将要形成腋芽原基的边界几层细胞中大量表达并翻译成蛋白质， 随后LAX1蛋白特异移动到腋芽原基中，起始腋芽的发育；在穗侧生分生组织发育过程中，也观察到LAX1 mRNA边界表达模式和蛋白的特异性移动，LAX1蛋白的时空性特异移动对于侧生分生组织的起始和维持 是必需的(见Oikawa等，Two-step regulation ofLAX PANICLE1 protein accumulation in axillary meristem formation inrice.Plant Cell,(2009):1095–1108)。LAX1移动到侧生分生组织中可能与LAX2互作，形成复 合体协同调控侧生分生组织的发育(见Tabuchi等，LAX PANICLE2 of rice encodes anovel nuclear protein and regulates the formation of axillary meristems.PlantCell,(2011):3276–3287)。LAX1不仅影响穗分枝的形成， 它也是一个影响产量性状的数量位点(QTL)。为解析两系杂交稻两优培九高产的遗传基础，利用亲本9311 和PA64s构造的重组自交系群体，定位到一个控制二次枝梗数的QTL qSPB1，进一步精细定位于LAX1基 因座位，表明LAX1是影响水稻产量的QTL。分析两亲本在LAX1基因座位的序列差异，发现仅有一个SNP 的差异，在9311亲本中第+222位碱基为腺嘌呤(A)，而在PA64s中为胞嘧啶(C)，该SNP导致一个谷 氨酸(9311)替换天冬氨酸(PA64s)，表达量检测发现9311中的LAX1的表达量高于PA64s，表明9311 单倍型可能通过影响LAX1表达量或转录活性进而导致二次枝梗数增加，提高水稻产量(见Gao等， Dissecting yield-associated loci in super hybridrice by resequencing recombinant inbred lines and improving parental genomesequences.Proc Natl Acad Sci U S A,(2013):14492-14497)。此外，GWAS分析表明来自母本 PA64s的LAX1单倍型也可以提高水稻的千粒重(见Huang等，Genomic architectureof heterosis for yield traits in rice.Nature,(2016):629-633)。综上所述，LAX1通过调控穗分枝的形成，从而影响水稻产量的形成。

LAX1在调控穗分枝的形成和影响产量方面发挥着重要功能，但是，LAX1发挥功能的分子机制尚不清 楚。本发明通过分子生化实验鉴定到一个与LAX1互作的蛋白LIP1(LAX1Interacting Protein1)，LIP1编 码由271个氨基酸组成的表达蛋白。超量表达LIP1影响侧生分生组织的发育，LIP1和其同源基因PCF5 双突变体导致侧生分生组织发育受到抑制，说明LIP1协同LAX1参与调控侧生分生组织发育过程。LIP1 在已形成的侧生分生组织中与LAX1共表达，从而抑制LAX1的转录活性。因此，LIP1通过时空性地抑制 LAX1的转录活性，与LAX1协同调控侧生分枝和侧生小穗的形成，是控制水稻产量形成的重要因子。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，鉴定并克隆了一个与LAX1互作蛋白LAX1Interacting Protein1 (简称LIP1)，通过分子生物学、细胞学和遗传学方法解析LIP1时空性限定LAX1的表达模式，从而维持 侧生分生组织的发育的分子机制，确定LIP1是控制水稻产量形成的重要因子。

本发明鉴定到的LIP1基因的核苷酸酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，LIP1基因编码的蛋白质序 列如SEQ ID NO：2所示。

本发明在分子和细胞水平证实LIP1与LAX1蛋白直接互作，同源分析鉴定到LIP1的同源基因PCF5。 超量表达LIP1影响侧生分生组织的发育，LIP1和PCF5功能缺失突变体导致侧生分生组织发育受到抑制， 说明LIP1参与调控穗侧生分生组织发育过程。LIP1在穗侧生分生组织发育后期中与LAX1共表达，LIP1 抑制LAX1的转录活性，从而限定LAX1的功能。超量表达LAX1改变了LAX1蛋白的时空性，也导致穗 分枝减少表型。由此表明，LIP1通过时空性限定LAX1在穗侧生分生组织中的表达模式，维持穗分枝和侧 生小穗的形成，保证水稻的产量。

本发明提供了一种利用LIP1基因进行植物遗传转化从而改变水稻穗分枝的核苷酸序列和蛋白质序列。 具体地说，本发明提供了一种含有SEQ ID NO：1所示序列的基因载体，如发明人构建的载体pU1301-LIP1 (参见实施例2的第1部分)。

本发明克隆的水稻LIP1基因可用于与其它调控元件，如幼穗特异性启动子融合构建基因表达载体，通 过转基因技术精细调控LAX1的表达模式，从而调控作物穗分枝和小穗的多少，进而遗传改良作物产量的 性状。

本发明的技术方案如下所述：

1.LIP1基因的鉴定

本发明采用酵母双杂交技术(见Yang等，The RING-Finger ubiquitin ligaseHAF1 mediates Heading date1 degradation during photoperiodic flowering inrice.Plant Cell,(2015):2455–2468)筛选到LAX1的互作蛋白， 被命名为LAX1Interacting Protein1(简称LIP1)，酵母双杂交结果表明LIP1与LAX1的bHLH结构域互作，体外pul-down实验(见Xia等，The ubiquitin receptor DA1 interacts with the E3ubiquitin ligase DA2 to regulate seed and organ size in Arabidopsis.PlantCell,(2013):3347–3359；Yang等，The RING-Finger ubiquitin ligase HAF1 mediatesHeading date1 degradation during photoperiodic flowering in rice.Plant Cell,(2015): 2455–2468)进一步证实LIP1与LAX1存在直接互作关系(见实施例1的第1部分)。通过生物信息学网 站(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)分析，LIP1基因的登录号为LOC_Os01g55100，对应水稻 品种“日本晴”参考基因组的位置为Chr1：31699450–31701494，仅有一个外显子，编码区长度为813bp。 结构域分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)表明LIP1编码271个氨基酸组成的表达蛋白。LIP1家族同 源蛋白分析表明LIP1与PCF5同源性最高(见实施例1的第2部分)，表明LIP1和PCF5可能功能冗余地 发挥相同的生物学功能。定量RT-PCR(见Huang等，Down-regulation of a SILENTINFORMATION REGULATOR2-related histone deacetylase gene,OsSRT1,induces DNAfragmentation and cell death in rice. Plant Physiol,(2007):1508–1519；Livak等，Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCRand the 2^-ΔΔCT method.Methods,(2001):402–408)检测LIP1的表达谱表明LIP1主要在在茎和不同发 育阶段的穗中优势表达。进一步采用原位杂交技术(见De Block等，RNA-RNAin situ hybridization using digoxigenin-labeled probes:The use of high-molecular-weight polyvinyl alcohol in the alkaline phosphatase indoxyl-nitroblue tetrazolium reaction.Anal.Biochem.(1993):86–89)表明LIP1基因主要在穗侧生分生组织 中特异表达(见实施例1的第3部分)。

2.LIP1影响侧生小穗的形成

为了解LIP1在穗侧生分生组织发育中的功能，本发明通过创建LIP1的超量表达材料和家族同源基因 的功能缺失突变体进行遗传分析。利用PCR技术获得LIP1的FL-cDNA(Full Length-cDNA)，连接到超量 表达载体pU1301上(见Li等，Rice APOPTOSISINHIBITOR5 coupled with two DEAD-box adenosine 5'-triphosphate-dependent RNAhelicases regulates tapetum degeneration.Plant Cell,(2011):1416–1434)，构建 超量表达载体pU1301-LIP1。通过农杆菌介导遗传转化(见Wu等，Development of enhancertrap lines for functional analysis of the rice genome,Plant J,(2003):418–427)获得转基因植株。采用定量RT-PCR检测转 基因植株LIP1表达量并考察穗部表型，结果表明LIP1超量表达会导致穗分枝缺失的表型(见实施例2的 第1部分)。通过检索水稻RMD突变体库(http://rmd.ncpgr.cn/)，获得一份T-DNA插入突变体，系统编号 为01Z11AR91，经过对侧翼序列进行Blastn分析发现，该T-DNA插入到LIP1基因ATG上游的4,321bp 处，共分离检测表明T-DNA插入位点的基因型与穗分枝缺失表型共分离，定量RT-PCR检测LIP1表达量 表明突变体中LIP1表达量升高(见实施例2的第2部分)，该结果表明T-DNA插入到LIP1基因启动子引 起其表达量上调进而导致穗分枝缺失表型，进一步佐证超量表达LIP1会影响穗侧生分生组织的发育。进 一步采用CRISPR/Cas9技术(见Ma等，A robust CRISPR/Cas9system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot anddicot plants,Mol.Plant,(2015):1274–1284)创建LIP1和PCF5的双突变体， 在LIP1基因座位选取2个靶位点，在PCF5基因座位选取1个靶位点，将三靶点构建到CRISPR/Cas9双 元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(见Ma等，A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants,Mol.Plant,(2015):1274–1284)中，通过农杆菌介导遗 传转化获得转基因植株，并Sanger测序鉴定靶位点突变情况，获得lip1pcf5双突变体，lip1pcf5双突变体 呈现出矮化，穗小及穗分枝减少的表型(见实施例2的第3部分)，该结果表明LIP1与PCF5功能冗余地 调控穗侧生分生组织的发育。

3.LIP1通过限定LAX1的活性范围调控侧生小穗形成

本发明采用体内转录活性实验(见Zhang等，An intrinsic microRNA timerregulates progressive decline in shoot regenerative capacity in plants.PlantCell,(2015):349–360)分析LIP1对LAX1的分子调控机制，结果 表明LAX1在体内表现转录激活活性，但LIP1与LAX1共同存在时，LIP1会抑制LAX1的转录激活活性 (见实施例3的第1部分)。LAX1 mRNA特异在顶端分生组织和将要形成侧生分生组织的边界区域表达， LAX1蛋白在该边界处形成，随后特异移动到即将发育的侧生分生组织中启动穗侧生分生组织的发育(见 Komatsu等，LAX and SPA:Major regulator of shoot branching inrice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2003): 11765–11770；Oikawa等，Two-step regulationof LAX PANICLE1 protein accumulation in axillary meristem formation inrice.Plant Cell,(2009):1095–1108)。LIP1蛋白与LAX1互作并且抑制LAX1的转录激活活性， 为分析LIP1对LAX1发挥功能的具体时期及部位，通过免疫组化技术(见Paciorek等，Immunocytochemical technique for protein localization in sections of planttissues.Nat.Protoc,(2006):104–107)进行检测，结果表 明LAX1和LIP1蛋白共定位(见实施例3的第2部分)；由此表明LIP1在侧生分生组织后期中抑制LAX1 的转录活性，对LAX1的功能进行限定。为进一步验证发育完成中穗侧生分生组织中LAX1需要被抑制， 通过创建LAX1超量表达材料进行验证。利用PCR技术获得LAX1的CDS，连接到超量表达载体pU1301上，构建超量表达载体pU1301-LAX1。通过农杆菌介导遗传转化方法获得转基因植株，采用定量RT-PCR 检测转基因植株LAX1表达量并考察穗部表型，结果表明LAX1超量表达导致穗分枝减少的表型(见实施 例3的第3部分)。LAX1在侧生分生组织发育中需要被精细调控，已形成的穗侧生分生组织中LAX1活性 没有抑制将影响穗分枝的形成进而影响产量。根据以上内容提出LIP1与LAX1协同调控水稻穗侧生分生组 织发育的工作模式。即在花序分生组织中，LAX1 mRNA在花序分生组织和即将形成的侧生分生组织边界 区域表达，随后LAX1蛋白特异地移动到即将发育的侧生分生组织中并激活下游靶基因的表达，起始侧生 分生组织的发育。在已形成的侧生分生组织中，LIP1基因开始在侧生分生组织中表达，LIP1蛋白与LAX1 互作，LIP1抑制LAX1的转录激活活性，进而抑制LAX1下游靶基因的表达，保障穗分枝和小穗的形成(见 实施例3的第4部分)。

下面结合附图对理解本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明作限定。

附图说明

图1：LIP1蛋白与LAX1蛋白的互作。附图标记说明：图1中的A图：酵母双杂交实验验证LIP1与 LAX1的bHLH结构域互作。图1中的B图：pull-down实验验证LIP1与LAX1的互作关系。

图2：LIP1家族基因的系统进化树及氨基酸序列比对分析。附图标记说明：图2中的A图：LIP1家 族蛋白的系统进化树分析。图2中的B图：LIP1与PCF5蛋白的氨基酸序列比对分析。红色下划线表示 EAR motif所在的位置。

图3：LIP1基因的表达模式。附图标记说明：图3中的A图：LIP1基因在水稻“中花11”各组织器 官中的表达谱。图3中的B图：RNA原位杂交检测LIP1在一次枝梗原基中的表达。标尺为100μm。图3 中的C图：LIP1正义链探针在一次枝梗发育时期检测结果。标尺为50μm。

图4：超量表达LIP1转基因植株的表型鉴定。附图标记说明：图4中的A图：定量RT-PCR检测野生 型和pU1301-LIP1 T0代转基因植株(#16，#33)中LIP1的表达量。图4中的B图：野生型和超表达植株(#16， #33)的穗型和一次枝梗表型。图4中的C图：T1代转基因阳性植株和阴性植株的株型。图4中的D图： T1代转基因阳性植株和阴性植株的穗型。图4中的E图：T1代转基因阳性植株和阴性植株的一次枝梗。

图4中的F图：定量RT-PCR检测17棵T1代植株中LIP1基因表达量。图4中的G图：17棵T1植株的 每穗粒数统计结果

图5：LIP1超量表达突变体的分子鉴定及表型鉴定。附图标记说明：图5中的A图：LIP1基因的结 构和T-DNA插入位点分析图。灰色方框表示LIP1基因，T-DNA插入在ATG前4,321bp；LB和RB分别 代表插入突变体T-DNA的左边界和右边界。图5中的B图：根据插入位点设计PCR引物检测共分离示意 图。其中P1，P2，P3分别表示用来检测共分离的引物。M代表T-DNA插入位点纯合植株，H代表T-DNA 插入位点杂合植株，W代表野生型植株。图5中的C图：定量RT-PCR检测野生型、杂合突变体和纯合突 变体幼穗中LIP1的表达量。图5中的D图：野生型和lip1-D突变体的株型。图5中的E图：野生型和lip1-D 突变体的穗型。图5中的F图：野生型、杂合突变体和纯合突变体的每穗小穗数统计结果。图5中的G图： 野生型、杂合突变体和纯合突变体的每穗上的一次枝梗数统计结果。图5中的H图：野生型、杂合突变体 和纯合突变体的每穗上的二次枝梗数统计结果。图5中的I图：野生型、杂合突变体和纯合突变体的每穗 所有着生在一次枝梗上的小穗数统计结果。图5中的J图：野生型、杂合突变体和纯合突变体的每穗所有 着生在二次枝梗上的小穗数统计结果。

图6：LIP1和PCF5双突变体的创制及表型鉴定。附图标记说明：图5中的A图：sgRNA在LIP1基 因和PCF5基因座位识别位置示意图。图5中的B图：lip1pcf5双突变体(#1和#207)在LIP1基因座位上 的突变情况。图5中的C图：lip1pcf5双突变体(#1和#207)在PCF5基因座位上的突变情况。图5中的D 图：野生型与lip1pcf5双突变体(#1和#207)的株型。图5中的E图：野生型与lip1pcf5双突变体(#1和#207) 的穗型以及一次枝梗形态。图5中的F图：野生型与lip1pcf5双突变体在二次枝梗发育时期的幼穗形态观 察。图5中的G图：定量统计野生型和lip1pcf5双突变体(#1和#207)每穗上的一次枝梗数。图5中的H图： 定量统计野生型和lip1pcf5双突变体(#1和#207)每穗上的二次枝梗数。图5中的I图：定量统计野生型和lip1pcf5双突变体(#1和#207)着生在一次枝梗上的小穗数。图5中的J图：定量统计野生型和lip1pcf5双 突变体(#1和#207)着生在二次枝梗上的小穗数。

图7：LIP1抑制LAX1的转录激活活性。附图标记说明：图7中的A图：烟草中证实LIP1抑制LAX1 的转录激活活性。图7中的B图：定量分析A图中LUC活性结果。

图8：LAX1，LIP1蛋白的表达模式。附图标记说明：图8中的A图：免疫组化检测LAX1蛋白在一 次枝梗发育时期的连续切片中的表达情况(标尺为50μm)。图8中的B图：免疫组化检测LIP1蛋白在一 次枝梗发育时期的连续切片中的表达情况(标尺为50μm)。图8中的C图：图A中的LAX1蛋白表达部 位放大图。蓝色箭头代表LAX1的表达部位。图8中的D图：图8中的B中的LIP1蛋白表达部位放大图。 箭头代表LIP1的表达部位。

图9：超量表达LAX1转基因植株的表型鉴定。附图标记说明：图9中的A图：定量RT-PCR检测野 生型和pU1301-LAX1 T0代转基因植株(#13，#36)中LAX1的表达量。图9中的B图：野生型和超表达植株 (#13，#36)的株型。图9中的C图：野生型和超表达植株(#13，#36)的穗型。图9中的D图：定量统计野 生型和超表达植株(#13，#36)每穗上的一次枝梗数。图9中的E图：定量统计野生型和超表达植株(#13， #36)每穗上的二次枝梗数。图9中的F图：定量统计野生型和超表达植株(#13，#36)着生在一次枝梗上的 小穗数。图9中的G图：定量统计野生型和超表达植株(#13，#36)着生在二次枝梗上的小穗数。图9中的 H图：定量统计野生型和超表达植株(#13，#36)每穗粒数。

图10：LIP1协同LAX1调控侧生小穗形成的工作模式。附图标记说明：图10中的A图：LAX1，LIP1 在侧生分生组织发育中的表达模式图。图10中的B图：在侧生分生组织正在发育阶段，LAX1激活下游 基因表达促进侧生分生组织发育的分子模型。图10中的C图：在侧生分生组织已发育完成阶段，LIP1与 LAX1互作并抑制LAX1的转录激活活性维持侧生分生组织正常发育的分子模型。

图11：TA克隆空载体pEASY-T3图谱(见http://www.transgen.com.cn/)

图12：酵母空载体pGBK-T7图谱(见https://www.takarabio.com/)

图13：酵母空载体pGAD-T7图谱(见https://www.takarabio.com/)

图14：GST标签空载体pGEX-4T-1图谱(见http://www3.gehealthcare.cn/zh-CN)

图15：本发明构建的GST-LIP1载体图谱

图16：MBP标签空载体pMAL-c2x图谱(见Walker等，Mutations in maltose-binding protein that alter affinity and solubility properties.Appl MicrobiolBiotechnol,(2010):187–197)

图17：本发明构建的MBP-LAX1载体图谱

图18：pU1301空载体图谱(见Li等，Rice APOPTOSIS INHIBITOR5 coupled withtwo DEAD-box adenosine 5'-triphosphate-dependent RNA helicases regulatestapetum degeneration.Plant Cell,(2011): 1416–1434)

图19：本发明构建的pU1301-LIP1载体图谱

图20：CRISPR/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H空载体图谱(见Ma等，Arobust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genomeediting in monocot and dicot plants,Mol.Plant,(2015): 1274–1284)

图21：本发明构建的pU1301-LAX1载体图谱

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的LIP1基因组的核苷酸序列，序列长度为813bp。

序列表SEQ ID NO：2是LIP1基因编码的蛋白质序列，编码270个氨基酸。

实施例1：LIP1基因的鉴定

1、LIP1是LAX1的互作蛋白

本发明采用酵母双杂交技术鉴定到一个与LAX1互作的蛋白，将其命名为LAX1Interacting Protein1(简 称LIP1)。本发明构建5个酵母载体，分别为pGBK-LAX1(1-159aa)，pGBK-LAX1(1-40aa)， pGBK-LAX1(31-99aa)，pGBK-LAX1(△bHLH)和pGAD-LIP1。其中pGBK-LAX1(1-159aa)， pGBK-LAX1(1-40aa)，pGBK-LAX1(31-99aa)；pGAD-LIP1 4个酵母载体的构建方法如下：设计引物 BK-LAX1-1F/BK-LAX1-159R，BK-LAX1-1F/BK-LAX1-40R，BK-LAX1-31F/BK-LAX1-99R； AD-LIP1-F/AD-LIP1-R(引物序列见表1)，以野生型“中花11号”品种(中国农业科学院作物科学研 究所培育的常规水稻品种，简称ZH11)幼穗(2mm-5mm)cDNA为模板，扩增出目的片段，TA克隆到 pEASY-T3(见图11，购自北京全式金生物技术有限公司)上并测序验证；选取序列正确的pEASY-T3用 EcoRI-BamHI(购自宝生物工程大连有限公司公司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶(购自Promega 公司)连接到相同酶处理的pGBK-T7(见图12)和pGAD-T7(见图13)载体上，酶切正确后载体命名为 pGBK-LAX1(1-159aa)，pGBK-LAX1(1-40aa)，pGBK-LAX1(31-99aa)；pGAD-LIP1。pGBK-LAX1(△bHLH) 载体的构建方法如下：设计引物BK-△bHLH-F和BK-△bHLH-R(引物序列见表1)，采用BK-LAX1-1F/BK- △bHLH-R，BK-△bHLH-F/BK-LAX1-159R两对引物分别以ZH11幼穗(2mm-5mm)cDNA为模板，扩增出 目的片段，将两份PCR产物混合在一起作为模板，以BK-LAX1-1F/BK-LAX1-159R引物PCR扩增出目的 片段，TA克隆到pEASY-T3(见图11，购自北京全式金生物技术有限公司)上并测序验证；选取序列正 确的pEASY-T3用EcoRI-BamHI(购自宝生物工程大连有限公司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶 (购自Promega公司)连接到相同酶处理的pGBK-T7(见图12)载体上，酶切正确后载体命名为 pGBK-LAX1(△bHLH)。将相应组合的质粒经酵母快速转化方法转化酵母菌株AH109(配自Clontech公 司)，转化子涂布SD/-Trp-Leu平板(配方见Clontech公司，yeast protocols handbook, http://www.clontech.com/)，30℃倒置培养3-5天。将生长出的克隆在无菌水中进行稀释后并同时接种于 SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-Ade-His固体培养基中培养过夜，30℃倒置培养2-3天后观察酵母生长情况，结 果显示LIP1可与LAX1(1-159aa)和LAX1(31-99aa)互作但不与LAX1(1-40aa)和LAX1(△bHLH)互作(见图 1中的A图)，表明LIP1与LAX1的bHLH结构域存在互作关系。

本发明进一步采用体外pull-down技术验证LIP1与LAX1的互作关系。本发明构建了2个原核诱导表 达融合载体分别为GST-LIP1和MBP-LAX1。融合载体GST-LIP1构建方法如下：设计引物 GST-LIP1-F/GST-LIP1-R(引物序列见表1)，以ZH11幼穗(2mm-5mm)cDNA为模板，扩增出目的片段， TA克隆到pEASY-T3(见图11，购自北京全式金生物技术有限公司)上并测序验证；选取序列正确的 pEASY-T3用EcoRI-NotI(购自宝生物工程大连有限公司公司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶连接 到相同酶处理的pGEX-4T-1(见图14)载体上，酶切正确后载体命名为GST-LIP1(见图15)。融合载体 MBP-LAX1构建方法如下：设计引物MBP-LAX1-F/MBP-LAX1-R(引物序列见表1)，以ZH11幼穗 (2mm-5mm)cDNA为模板，扩增出目的片段，TA克隆到pEASY-T3(见图11，购自北京全式金生物技术 有限公司)上并测序验证；选取序列正确的pEASY-T3用EcoRI-BamHI(购自宝生物工程大连有限公司公 司)消化获得目的外源片段、用T4连接酶连接到相同酶处理的pMAL-C2X(见图16)载体上，酶切正确 后载体命名为MBP-LAX1(见图17)。将pGEX-4T-1，pMAL-C2X，GST-LIP1和MBP-LAX1质粒通过热 激法转入到大肠杆菌表达菌株BL21中(购自Transgen公司)。挑取单克隆在含50mg/L氨苄霉素的LB培 养基中培养至OD(600nm)值为0.5-0.6时，在温度为16℃，转速为160rpm，TPTG浓度为0.1mM条件下诱 导表达10小时，收集菌体并超声破碎获得上清。体外pull-down实验具体步骤参考Xia等的实验方法进行 (Xia等，The ubiquitin receptor DA1 interacts withthe E3 ubiquitin ligase DA2 to regulate seed and organ size in Arabidopsis,Plant Cell,(2013):3347-3359)。Pull-down结果表明只有在GST-LIP1和MBP-LAX1共同存在 的情况下利用MBP beads亲和纯化复合物，用anti-GST抗体才能检测到GST-LIP1(见图1中的B图)，说 明LIP1蛋白与LAX1蛋白存在直接互作关系。

2、LIP1基因家族分析

通过生物信息学网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)分析，LIP1基因的登录号为 LOC_Os01g55100，对应日本晴参考基因组的位置为Chr1：31699450–31701494，仅有一个外显子，编码区 长度为813bp。结构域分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)表明LIP1编码271个氨基酸组成的表达蛋白。

为了解LIP1可能参与的调控过程，对LIP1基因家族成员及其同源基因进行进化树分析。将LIP1蛋 白的氨基酸序列在NCBI蛋白数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中作BLASTp检索得到LIP1 的同源蛋白，虽然分析表明LIP1不具有已知的功能结构域，但同源蛋白比对发现LIP1与TCP家族成员同 源，选取11个TCP家族基因与LIP1进行系统进化树的分析，具体为将得到的蛋白序列用ClustalW2软件 进行比对，采用邻近相连法(neighbor-joining)并利用MEGA5.1构建水稻中LIP1蛋白的进化树，构建进化 树的参数分别是：poisson correction model,pairwise deletion,和bootstrap 1000次重复。结果发现LIP1与 PCF5具有非常近的同源关系(见图2中的A图)。通过比对PCF5与LIP1的氨基酸序列，二者蛋白序列 的一致性较高，并且PCF5在267aa-271aa位置同样存在保守的EAR motif(LRLSL)(见图2中的B图)， 由此表明LIP1及其同源蛋白PCF5可能功能冗余地发挥相同的生物学功能。

3、LIP1基因的表达模式

为分析LIP1基因的时空表达模式，采用定量RT-PCR技术检测LIP1基因在ZH11各组织器官中的表 达模式。具体为：武汉正季种植中花11，对根，茎，叶，叶鞘和不同长度的穗器官进行取样，总RNA样 抽提、反转录和定量RT-PCR实验具体步骤参照Huang等的实验方法进行(Huang等，Down-regulation of a SILENT INFORMATION REGULATOR2-related histonedeacetylase gene,OsSRT1,induces DNA fragmentation and cell death inrice.Plant Physiol,(2007):1508–1519)。设计QRT-LIP1-L/QRT-LIP1-R(引物序列见表1)特异引物用于检测LIP1基因表达量，设计QRT-Ubq-L/QRT-Ubq-R(引物序列见表1)引物用于检测内参 基因(Ubiquitin5)表达量。定量RT-PCR结果表明LIP1基因在茎和不同发育阶段的穗中优势表达，在根， 叶和叶鞘中微弱表达(见图3中的A图)，该结果表明LIP1基因可能在穗发育过程发挥功能。

为明确LIP1基因在穗发育过程中的具体表达部位，采用原位杂交技术检测LIP1基因在穗侧生分生组 织中的表达模式。具体为：设计引物insitu-LIP1-L/insitu-LIP1-R(引物序列见表1)，扩增出目的片段，经 转录标记dUTP后，碱水解纯化获得LIP1的反义链探针和正义链探针，对中花11幼穗进行组织切片，采 用正义链和反义链探针分别杂交，经洗脱，抗体杂交，显色、固定封片后观察。与对照组(LIP1正义链探 针)相比，LIP1反义链探针杂交结果表明LIP1基因主要在穗侧生分生组织中特异表达(见图3中的B图 和C图)。LIP1基因的表达模式表明其可能在穗侧生分生组织发育过程中发挥功能。

表1本发明实施例1中所用的引物

实施例2：LIP1调控水稻穗分枝和小穗的形成

1、超量表达LIP1导致侧生小穗减少

为分析LIP1基因在穗侧生分生组织发育过程中功能，通过创制超量表达LIP1材料进行遗传分析。设 计引物LIP1(FL-cDNA)-OX-F/LIP1(FL-cDNA)-OX-R(引物序列见表2)，以ZH11幼穗(2mm-5mm)cDNA 为模板扩增得到LIP1的全长cDNA片段，TA克隆到pEASY-T3(见图11，购自北京全式金生物技术有限 公司)上并测序验证；选取序列正确的pEASY-T3用KpnI(购自宝生物工程大连有限公司公司)消化获得LIP1(FL-cDNA)外源片段、用T4连接酶连接到相同酶处理的并经CIAP(购自宝生物工程大连有限公司公 司)去磷酸化的超表达载体pU1301(见图18)上，将酶切正确的载体命名为pU1301-LIP1(见图19)，并 电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中。采用农杆菌介导的遗传转化方法将超表达载 体导入ZH11的愈伤组织，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有HYG(购自北京原平皓生物技术有限公 司)抗性的愈伤组织、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方见 已公开专利：水稻木质素合成基因FC1及应用，申请号：200610018105.5；公开号：CN1995346)。通过定 量RT-PCR检测转基因植株中LIP1的表达量，发现与野生型相比转基因单株#16、#33中LIP1的表达量显 著上升(见图4中A图)，并且都表现出明显的稀穗表型，其穗部表型为二次枝梗和侧生小穗的缺失(见 图4中B图)。为进一步验证该稀穗表型是否稳定遗传，选取#16单株后代在T1代进行验证，T1代共获得 17棵单株，并且出现正常表型和稀穗表型的分离(见图4中C图-E图)，采用定量RT-PCR检测T1代各 单株中LIP1的表达量并同时对每穗粒数进行考察，发现LIP1表达量与稀穗表型共分离(见图4中F图和 G图)。以上结果表明，超量表达LIP1会导致穗分枝和侧生小穗的减少。

2、LIP1超量表达突变体也表现为侧生小穗减少

通过检索水稻RMD突变体库(http://rmd.ncpgr.cn/)，获得一份T-DNA插入突变体，系统编号为 01Z11AR91，突变体T-DNA插入位点的侧翼序列如下：

ACGGGCGAATCGAAGCTCGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTA GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAA ATACTTCTATCAATAAGATTTCAGCACGTGTAAACTAGCTCGATCGGATTCTTCCATTTCGCAAAAAGA ATACGGTTTTGCTATAATTATATCGCCATAAATATTCTCTGATTAAAGTTCAGTTTGTTAGCTCTCCAATT TCCTTATAGATTTTGTGCAGGACTGCTTTGCCATCGTGCGTGCAAACACTAGTTTGTACTTATGCATGC ACGCGTGCTTAGTTCGTACTCCTTGCTGTGATACTGATCAGTATCGTTTTCTTTTGCGTTTTCTTTTCAT GCAATTGTGCTGCTTGCTGTGATTTTTTCTTTACATATGTAATTTTGGGACTTACATTGTAAATGCATTTA AATTATATATATAATTTAAAAACTTACAATATAAATACAAGCTGACTATTTATTTTAGTGAAAAATATGGT ATTATAAATATAACTACACACAATGAAATAACTCGAAAACGGAGCCAAAA

经过对侧翼序列进行Blastn分析发现，该T-DNA插入到LIP1基因ATG上游的4,321bp处(见图5中的A 图)。根据T-DNA插入位点的侧翼序列以及与水稻基因组的匹配情况，设计引物进行基因型检测。具体为 在插入位点的两边设计一对引物：P1和P2(引物序列见表2)，以及在T-DNA上设计一条引物P3(引物序列 见表2，见图5中的A图)。T-DNA插入位点纯合时只有P2和P3配对可以扩增出目标产物，因为P1与P2在插 入的T-DNA区段两侧，导致P1与P2配对的扩增产物太大(大于10kb)无法得到扩增片段；没有T-DNA插入 的野生型植株由于没有T-DNA的插入，所以P2和P3配对扩增没有产物，但可以利用引物P1与P2配对得到目标产物；而T-DNA插入位点杂合的植株则P1和P2配对以及P2和P3配对时都可以扩增得到产物。实验结果显 示，24棵T1代单株中，T-DNA插入位点纯合基因型植株共有6棵，表现为强稀穗表型；T-DNA插入位点杂 合基因型植株共有12棵，表现为弱稀穗表型；剩下6棵检测无T-DNA插入，穗部表现为野生型(见图5中 的B图)，以上结果表明T-DNA插入位点的基因型与稀穗表型共分离。进一步通过定量RT-PCR检测野生型、 杂合型和突变体幼穗中LIP1的表达量，表明与野生型相比在杂合型、纯合型突变体幼穗中LIP1的表达量呈 现逐步升高的趋势(见图5中的C图)。该结果表明T-DNA插入到LIP1基因启动子引起其表达量上调进而导 致稀穗表型，因此将该突变体命名为lip1-D。进一步对lip1-D稀穗表型进行鉴定，并对野生型、杂合型和突 变体的穗分枝进行统计，结果表明与野生型相比lip1-D纯合突变体穗部仅有几个顶端小穗，大部分枝梗不 能正常发育成小穗，并且枝梗数也明显下降(见图5中的D图和E图)，导致lip1-D的每穗粒数相比于野生型 也明显下降(见图5中的F图)。统计分析表明在一次枝梗数目上lip1-D与野生型相比稍有下降(见图5中的G 图)，但二次枝梗的数目明显下降(见图5中的H图)；由于侧生小穗是由高级分枝发育而来，因此进一步统 计着生在一次枝梗数或二次枝梗数上的小穗数，发现与野生型相比，lip1-D的高级分枝数明显下降(见图5 中的I图和J图)。该结果与超量表达LIP1出现的穗分枝和侧生小穗减少表型一致，表明LIP1表达量上调会影 响穗分枝和小穗的形成。

3、LIP1基因家族突变体影响侧生分生组织发育

为分析LIP1及其同源基因PCF5功能缺失后对穗侧生分生组织发育的影响，采用CRISPR/Cas9技术 创建LIP1和PCF5的双突变体。具体操作如下：在靠近LIP1 ATG的区域设计了两个gRNA靶位点(见图 6中的A图)，分别为U3-LIP1-L/U3-LIP1-R(引物序列见表2)；U6a-LIP1-L/U6a-LIP1-R(引物序列见表2)， 在靠近PCF5 ATG的区域设计了一个gRNA靶位点(见图6中的A图)，U6a-PCF5-L/U6a-PCF5-R(引物 序列见表2)，将三靶点构建到CRISPR/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(见图20)中，通过农杆 菌将构建好的载体遗传转化到ZH11的愈伤组织，获得转基因植株。为检测T0代植株在LIP1和PCF5基 因座位的突变情况，在LIP1靶位点附近设计引物JCLIP1-L/JCLIP1-R(引物序列见表2)，在PCF5靶位点 附近设计引物JCPCF5-L/JCPCF5-R(引物序列见表2)，PCR扩增并测序鉴定编辑情况。在T0代获得了2 株lip1pcf5纯合双突变体(#1，#207)。#1单株在LIP1基因区段缺失101bp，在PCF5基因区段缺失11bp(见 图6中的B图和C图)；#207单株在LIP1基因区段缺失101bp，在PCF5基因区段存在复等位突变，即在 正义链上缺失4bp和在反义链上缺失24bp(见图6中的B图和C图)。通过表型鉴定发现与野生型相比 lip1pcf5纯合双突变体(#1，#207)呈现出矮化，穗小及穗分枝减少的表型(见图6中的D图和E图)。通 过细胞学观察发现纯合双突变体的一次枝梗原基数目以及二次枝梗原基的数目与野生型相比明显减少(见 图6中的F图)，统计分析表明纯合双突变体的穗部表现出一次枝梗和二次枝梗的数目减少(见图6中的 G图和H图)，一次枝梗和二次枝梗上侧生小穗数目减少(见图6中的I图和J图)，进而导致每穗粒数减 少的表型(见图6中的K图)。该结果表明LIP1与PCF5功能冗余地调控穗侧生分生组织的发育。

表2本发明实施例2中所用的引物

实施例3：LIP1通过限定LAX1的活性区域调控穗侧生分生组织的形成

1、LIP1抑制LAX1转录活性

为探究LIP1对LAX1的分子调控机制，本发明开展体内转录活性实验进行分析。具体为：设计引物 GFP-Protein-F/GFP-Protein-R(引物序列见表3)和LAX1-Protein-F/LAX1-Protein-R(引物序列见表3)，以 GFP基因和LAX1基因的CDS为模板，扩增出目的片段，TA克隆到pEASY-T3(见图11，购自北京全式 金生物技术有限公司)并测序正确后经KpnI-XbaI(购自宝生物工程大连有限公司公司)酶切，连接到相 同酶处理的1301S-GAL4BD载体上，酶切正确后的载体分别命名为GAL4BD-GFP和GAL4BD-LAX1。设 计引物LIP1-Protein-F/LIP1-Protein-R(引物序列见表3)，以LIP1基因的CDS为模板，扩增出目的片段， TA克隆到pEASY-T3(见图11，购自北京全式金生物技术有限公司)并测序正确后经KpnI-XbaI(购自宝生物工程大连有限公司公司)酶切，连接到相同酶处理的1301S-GFP载体上，酶切正确后命名为 1301S-GFP-LIP1(融合终止密码子，不驱动GFP的表达)。以6xUSA-LUC为报告系统，分别将载体组合 GAL4BD-GFP、GAL4BD-LAX1、GAL4BD-LAX1/1301S-GFP-LIP1经农杆菌转化到烟草叶片，室温培养2 天，将整个叶片注射1mM的荧光素酶底物(购自Promega公司)，天能5200成像系统收集光子并经伪彩 处理，结果表明G4DBD-LAX1表达时的萤光信号比阴性对照G4DBD-GFP明显增强(见图7中A图)， 说明LAX1发挥转录激活活性；但当G4DBD-LAX1与LIP1共转化时可见萤光信号明显下降(见图7中A 图)，经统计萤光值与G4DBD-LAX1相比，下降到65％(见图7中A图和B图)；该结果表明LIP1抑制 LAX1的转录激活活性。

2、LIP1限定LAX1发挥活性的区域

LAX1 mRNA特异在顶端分生组织和将要形成侧生分生组织的边界区域表达，LAX1蛋白在该边界处 形成，随后特异移动到即将发育的侧生分生组织中启动侧生分生组织的发育(见Komatsu等，LAX and SPA: Major regulator of shoot branching inrice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2003):11765–11770；Oikawa等， Two-step regulationof LAX PANICLE1 protein accumulation in axillary meristem formation inrice.Plant Cell, (2009):1095–1108)。LIP1蛋白与LAX1互作并且抑制LAX1的转录激活活性，为探究LIP1对LAX1发挥 功能的具体时期及部位，通过免疫组化技术分别检测LAX1和LIP1蛋白在幼穗中的分布。免疫组化具体 操作请查考Paciorek等(见Paciorek等，Immunocytochemical technique for protein localization in sections of planttissues.Nat.Protoc,(2006):104–107)，LAX1抗体杂交浓度为1:50(体积比)，LIP1抗体杂交浓度为1:100(体积比)。结果显示，在即将形成的侧生分生组织中观察到LAX1的信号(见图8中A图和C图)， 但同一时期未观察到LIP1的信号(见图8中B图和D图)；随着侧生分生组织的发育，可以同时检测到 LAX1的信号和LIP1的信号(见图8中A图-D图)，该结果表明LIP1在发育后期的侧生分生组织中对LAX1 的功能进行限定。

3、超量表达LAX1影响水稻产量

为验证LAX1在穗侧生分生组织发育后期抑制其转录活性是必须的，通过创建LAX1超量表达植株进 行分析。设计引物LAX1(CDS)-OX-F/LAX1(CDS)-OX-R(引物序列见表3)，以中花11(ZH11)幼穗 (2mm-5mm)cDNA为模板扩增得到LAX1全长CDS的片段，用TA克隆到pEASY-T3(见图11，购自北京 全式金生物技术有限公司)上并测序验证；选取序列正确的pEASY-T3用KpnI-BamHI(购自宝生物工程 大连有限公司)消化获得LAX1 CDS外源片段连接到相同酶处理的超表达载体pU1301(见图18)上，将 构建好载体命名为pU1301-LAX1(见图21)。遗传转化受体为ZH11种子诱导的愈伤组织(愈伤组织的诱 导采用常规方法)，获得ZH11背景下LAX1超量表达植株。在T0代进行基因表达分析表明，与野生型(即 非转基因)相比，#13和#36植株中LAX1的表达量被显著上调(见图9中A图)，表型鉴定发现#13和#36 植株在株型上呈现出矮化表型(见图9中B图)，在穗部表现出穗小、穗分枝减少的突变表型(见图9中 C图)。统计表明#13和#36植株会导致一次枝梗，二次枝梗以及侧生小穗的数目减少(见图9中D图-G 图)，进而导致每穗粒数降低(见图9中H图)，降低水稻产量，该结果表明LAX1的表达时空性在穗侧生 分生组织发育中需要被精细调控，否则会影响穗分枝的发育进而影响产量。

表3本发明实施例3中所用的引物

4、LIP1协同LAX1调控水稻产量的分子模型

综合以上实施例的研究结果表明LIP1在侧生小穗分生组织发育后期表达，通过与LAX1互作抑制 LAX1蛋白转录活性，LIP1功能缺失或时空异位表达以及LAX1的异位表达，都将改变LAX1蛋白的时空 活性，影响水稻小穗的形成；以及已发表的LAX1研究成果(见Komatsu等，LAX and SPA:Major regulator of shoot branching inrice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(2003):11765–11770；Oikawa等，Two-step regulationof LAX PANICLE1 protein accumulation in axillary meristem formation inrice.Plant Cell,(2009):1095–1108)； 提出一个LIP1与LAX1协同调控水稻穗侧生分生组织发育的工作模式。

在花序分生组织中，LAX1 mRNA在花序分生组织和即将形成的侧生分生组织边界区域表达，随后 LAX1蛋白特异地移动到即将发育的侧生分生组织中并激活下游靶基因的表达，起始侧生分生组织的发育 (见图10中A图和B图)。在侧生分生组织发育后期，LIP1基因在侧生分生组织中表达，LIP1蛋白与LAX1 互作，LIP1抑制LAX1的转录激活活性，进而抑制下游靶基因的表达，维持侧生分生组织的继续发育，从 而形成穗分枝和小穗(见图10中A图和C图)。已报道LAX1是影响水稻产量的QTL，来自水稻品种9311 背景的LAX1单倍型能增强LAX1的转录活性，增加穗分枝和侧生小穗数目，提高水稻产量(见Gao等， Dissectingyield-associated loci in super hybrid rice by resequencing recombinant inbredlines and improving parental genome sequences.Proc Natl Acad Sci U S A,(2013):14492-14497)；Huang等，Genomic architecture of heterosis for yieldtraits in rice.Nature,(2016):629-633)；由此表明提高LAX1的转录活性能提高水稻的产量。 LIP1在侧生小穗分生组织发育后期表达，通过与LAX1互作抑制LAX1蛋白转录活性；LIP1功能缺失或 时空异位表达，以及LAX1的异位表达都将改变LAX1蛋白的时空活性，影响水稻小穗的形成；表明LIP1 的时空表达界定了LAX1在小穗侧生分生组织中活性作用的范围，保障水稻侧生小穗的形成。因此，实施 本发明的方法可通过基因操作手段来调控LIP1的时空表达或蛋白活性，并适度减弱LIP1对LAX1转录活 性的抑制作用，改变LAX1的时空活性，从而达到促进穗分枝和侧生小穗的发育，以达到增加水稻产量的 目的。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种转录抑制因子LIP1调控水稻产量的功能及应用

<141> 2019-10-28

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(813)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(813)

<400> 1

atg cgc aac gcc aag gcc gcc atc gac gag ctc ccc gac cgc gcc gag 48

Met Arg Asn Ala Lys Ala Ala Ile Asp Glu Leu Pro Asp Arg Ala Glu

1 5 10 15

gcc ccg ccg ccg ccc gcc gcg gcg tcg acg gag cag ccc gag gcc acc 96

Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Ser Thr Glu Gln Pro Glu Ala Thr

20 25 30

gag cag gcg acc tcg acg tcc tac ggg ttc ggc aac act acc ggc ggc 144

Glu Gln Ala Thr Ser Thr Ser Tyr Gly Phe Gly Asn Thr Thr Gly Gly

35 40 45

acc atg acc agc gcc gcg tcg gcc gct gct ggc tcc ttc ctt cca cat 192

Thr Met Thr Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ser Phe Leu Pro His

50 55 60

tcg ctg ggg gca gat cga gtc tcc gac agc gtc aag tcc ctg ttc ccc 240

Ser Leu Gly Ala Asp Arg Val Ser Asp Ser Val Lys Ser Leu Phe Pro

65 70 75 80

tcc tcg tcc aca gcc agc ggc gcc gcc tcc gcc gga cac gac gag tac 288

Ser Ser Ser Thr Ala Ser Gly Ala Ala Ser Ala Gly His Asp Glu Tyr

85 90 95

agg gga tcc ccg ccg gac ctc ctg tcg cgc acg aca agc aac cag cag 336

Arg Gly Ser Pro Pro Asp Leu Leu Ser Arg Thr Thr Ser Asn Gln Gln

100 105 110

ccg cag gag ctg tgc ctc acc cta cag tcg aac cag cac cag atc ttc 384

Pro Gln Glu Leu Cys Leu Thr Leu Gln Ser Asn Gln His Gln Ile Phe

115 120 125

agc cat gtc tcg tcg aac cac cac ggt atg atc tcg agt gca ggc gtt 432

Ser His Val Ser Ser Asn His His Gly Met Ile Ser Ser Ala Gly Val

130 135 140

cca ggt tgg ccc gac cac agc cag aga atg cag gca tgg cat gcc ccg 480

Pro Gly Trp Pro Asp His Ser Gln Arg Met Gln Ala Trp His Ala Pro

145 150 155 160

gag aac agc aca gga gac ggc cgc ggc ggc ggc aat ggc gac ggc tac 528

Glu Asn Ser Thr Gly Asp Gly Arg Gly Gly Gly Asn Gly Asp Gly Tyr

165 170 175

atg ttc gcc atg ccg tcg cgg caa ggg ctg gac cag agc cag ctc ttc 576

Met Phe Ala Met Pro Ser Arg Gln Gly Leu Asp Gln Ser Gln Leu Phe

180 185 190

tcg cat ggg gaa ccc ctt cag tcc agc ggt cgc ggg tgg gcg tca gcc 624

Ser His Gly Glu Pro Leu Gln Ser Ser Gly Arg Gly Trp Ala Ser Ala

195 200 205

cgc gca tgg cta gac ccc ctc gca gtc gca gcc atc cac cac cag ccg 672

Arg Ala Trp Leu Asp Pro Leu Ala Val Ala Ala Ile His His Gln Pro

210 215 220

tcg aca atg gct gcc gga cag gtc ggc ttc ggc cat ctc gtt ggc ggc 720

Ser Thr Met Ala Ala Gly Gln Val Gly Phe Gly His Leu Val Gly Gly

225 230 235 240

gcc ggt ggc ggc ggc ggg ttt atg ggg ttt ctc gcg ccg gcg gcg cag 768

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Phe Met Gly Phe Leu Ala Pro Ala Ala Gln

245 250 255

cgg ctt gag ggc gag gag gag cac gga agt gag gtg atc agg tga 813

Arg Leu Glu Gly Glu Glu Glu His Gly Ser Glu Val Ile Arg

260 265 270

<210> 2

<211> 270

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Arg Asn Ala Lys Ala Ala Ile Asp Glu Leu Pro Asp Arg Ala Glu

1 5 10 15

Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Ser Thr Glu Gln Pro Glu Ala Thr

20 25 30

Glu Gln Ala Thr Ser Thr Ser Tyr Gly Phe Gly Asn Thr Thr Gly Gly

35 40 45

Thr Met Thr Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ser Phe Leu Pro His

50 55 60

Ser Leu Gly Ala Asp Arg Val Ser Asp Ser Val Lys Ser Leu Phe Pro

65 70 75 80

Ser Ser Ser Thr Ala Ser Gly Ala Ala Ser Ala Gly His Asp Glu Tyr

85 90 95

Arg Gly Ser Pro Pro Asp Leu Leu Ser Arg Thr Thr Ser Asn Gln Gln

100 105 110

Pro Gln Glu Leu Cys Leu Thr Leu Gln Ser Asn Gln His Gln Ile Phe

115 120 125

Ser His Val Ser Ser Asn His His Gly Met Ile Ser Ser Ala Gly Val

130 135 140

Pro Gly Trp Pro Asp His Ser Gln Arg Met Gln Ala Trp His Ala Pro

145 150 155 160

Glu Asn Ser Thr Gly Asp Gly Arg Gly Gly Gly Asn Gly Asp Gly Tyr

165 170 175

Met Phe Ala Met Pro Ser Arg Gln Gly Leu Asp Gln Ser Gln Leu Phe

180 185 190

Ser His Gly Glu Pro Leu Gln Ser Ser Gly Arg Gly Trp Ala Ser Ala

195 200 205

Arg Ala Trp Leu Asp Pro Leu Ala Val Ala Ala Ile His His Gln Pro

210 215 220

Ser Thr Met Ala Ala Gly Gln Val Gly Phe Gly His Leu Val Gly Gly

225 230 235 240

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Phe Met Gly Phe Leu Ala Pro Ala Ala Gln

245 250 255

Arg Leu Glu Gly Glu Glu Glu His Gly Ser Glu Val Ile Arg

260 265 270

Claims (3)

1.一种调控水稻小穗形成及产量性状的基因LIP1，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：1所示。

2.一种调控水稻小穗形成及产量性状的基因LIP1，该基因编码的蛋白质序列如SEQ IDNO：2所示。

3.一种调控水稻小穗形成及产量性状的基因操作方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的基因进行遗传操作，以改变该基因的表达量或表达模式，调控水稻产量性状。

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