CN105693837A

CN105693837A - 一种水稻小穗发育调控蛋白、其编码基因ms1及应用

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Publication number: CN105693837A
Application number: CN201610266040.XA
Authority: CN
Inventors: 任德勇; 余海平; 钱前; 郭龙彪; 曾大力; 吴立文; 徐乾坤; 邱振南; 李自壮
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2016-04-26
Publication date: 2016-06-22

Abstract

本发明公开了一种水稻小穗发育调控蛋白，如(A)Seq ID No：2所示的氨基酸序列；或(B)在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有调控水稻小穗发育功能的由(A)衍生的蛋白质。本发明还公开了编码上述蛋白质的基因，如SEQ ID No：1、SEQ ID No：3所示等，还公开了含有该基因的重组载体、转化体，以及利用该基因转化细胞调控禾本科植物小穗发育的方法、以及上述蛋白、基因、重组载体、转化体在改良禾本科植物产量、品质中的应用。本发明利用图位克隆技术分离了一个水稻影响小穗发育MS1基因，并利用转基因互补实验鉴定该基因的功能，可利用该基因研究水稻颖壳和种子大小的分子机制用以提高禾本科植物的产量和品质。

Description

一种水稻小穗发育调控蛋白、其编码基因MS1及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，涉及一种水稻小穗发育调控蛋白、其编码基因MS1(MALFORMEDSPIKELET1)及应用。

背景技术

水稻(OryzasativaL.)是世界上重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式植物。与双子叶模式植物相比，水稻花序具有禾本科植物独有的结构单元--小穗，深入研究水稻生殖发育过程，不仅有助于深入理解水稻小穗或小花的形成机制，而且对丰富植物发育生物学知识和提高水稻产量和品质都具有非常重要的意义。随着耕地面积的不断减少，提高水稻产量乃当务之急。稻谷籽粒形状不仅是影响水稻产量的重要指标之一，也是影响稻米的外观品质和加工品质的重要因素。随着分子标记和分子生物学的发展，人们逐渐克隆了一些控制粒型的基因，并开始分析粒型的分子遗传机理。目前，国内外已被报道并克隆的粒型基因有GS2、GW2、GW8、GL7/GW7、GLW7和DSG1等。GW2和GW8主要通过影响颖壳横向细胞数目的多少来控制粒宽；GLW7和DSG1主要通过影响颖壳细胞的长度来控制谷粒的大小；GS2和GL7同时控制颖壳细胞的大小和数目，从而影响其产量。因此，利用已克隆的颖壳发育相关基因，可实现稻米产量和相关品质的遗传改良。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能影响水稻小穗特有颖壳发育和籽粒大小的小穗发育调控蛋白质及其编码基因，以及由此获得的重组载体、转化体，和调控禾本科植物小穗发育的方法及应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种水稻发育调控蛋白，如(A)或(B)所示的序列：

(A)SeqIDNo：2或图10所示的氨基酸序列，其属于一类MADS-box转录因子；

(B)在(A)所限定的氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸且具有调控水稻小穗发育功能的由(A)衍生的蛋白质。

本发明还提供了一种编码上述蛋白质的基因。

进一步地，所述基因，如(a)或(b)所示的序列：

(a)SEQIDNo：1或图8所示的核苷酸序列；

(b)在(a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个核苷酸而生成的可编码具有相同功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物。

进一步地，所述基因的编码框序列如(a)或(b)所示的序列：

(a)SEQIDNO：3或图9所示的核苷酸序列；

(b)在(a)所限定的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的可编码具有相同功能的蛋白质的序列。

本发明还提供了一种含有上述基因的重组载体，载体为pCAMBIA1301，该载体可以有效地表达由上述基因编码的蛋白质或其同源类似物。

本发明还提供了一种含有上述基因的转化体，该转化体的宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明还提供了一种调控禾本科植物小穗发育的方法，包括用上述基因转化禾本科植物细胞，再将转化后的禾本科植物细胞培育成植株。

本发明还提供了上述蛋白、基因、重组载体或转化体在改良禾本科植物产量、品质中的应用。

进一步地，上述基因通过转基因或分子标记辅助选择育种方法来改良禾本科植物产量、品质。

进一步地，所述禾本科植物为水稻。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、突变体ms1的分离和遗传分析：

本发明的水稻小穗颖壳和籽粒异常突变体ms1来自粳稻品种中花11(Japonica)EMS(EthylMethylSulfonate)诱变产生的突变。通过与野生型的正反交实验，证明该突变体受隐性单基因控制，如图1和图4所示。

二、突变体ms1与野生型小穗颖壳和籽粒的比较：

突变体ms1小穗的副护颖和护颖伸长，在大小和结构上类似于外稃或者内稃(图1、图2和图3所示)。

突变体ms1花序二次枝梗上的籽粒的粒长和千粒重显著降低(如图4所示)。

三、MS1基因的图位克隆：

1)MS1基因的初步定位：

为了分离MS1基因，本发明首先构建了一个定位群体，由ms1与籼稻品种NJ06杂交组配成F₂定位群体，再通过图位克隆的方法，利用多种分子标记对MS1位点进行初步定位，将其初步定位在第3染色体上，并介于M7与M29标记之间(图5所示)。

2)MS1基因的精细定位：

通过对M7与M29两个标记之间的序列进行分析，发展新的多态性标记将MS1基因精确定位在OJ112_G08的BACP上，介于S8和S21标记之间，大约78kb范围之内(图5所示)，通过分析此区段开放阅读框(ORF)预测候选基因。

3)MS1基因的鉴定和功能分析：

通过转基因技术，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图7)，证明了本发明正确克隆了MS1基因，氨基酸序列分析表明MS1编码一个具有MADS-box结构域的蛋白(图10)。

综上所述，本发明利用小穗异常的突变体，通过图位克隆技术首先克隆到了MS1基因，该基因编码一个MADS-box结构域蛋白(OsMADS34)，影响了副护颖和护颖的特征，首次提出了副护颖、护颖和外稃是同源器官的假说，同时还通过影响颖壳细胞的大小控制了水稻籽粒大小。MS1基因的克隆和深入的功能解读，进一步阐明了水稻小穗颖壳和籽粒发育的遗传机制及其作用机理，为生产实践打下了基础。随着我国人口的不断增长、耕地面积持续减少形势下，高产育种一直是水稻研究的主题。粒型包括粒长、粒宽和长宽比是水稻产量和品质的重要组成部分，也是当前超高产水稻育种关注的重点。因而，本发明对水稻的产量和品质的改良具有重要的意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是野生型和ms1突变体抽穗期小穗的表型对比图；

图2是野生型和ms1突变体早期小穗的表型对比图；

图3是野生型和ms1突变体颖壳的表面结构对比图；

图4是野生型和ms1突变体籽粒的表型对比图；

图5是MS1基因的定位图；

图6是pCAMBIA1301(S65T)-MS1载体图谱；

图7是功能互补实验转基因水稻与野生型、突变体籽粒的表型对比图；

图8是MS1基因的DNA序列；

图9是MS1基因的编码框序列；

图10是MS1基因编码的氨基酸序列。

具体实施方式

实施例1：

1、水稻材料：

水稻(OryzasativaL.)突变体ms1(malformedspikelet1)，原始野生型材料为粳稻品种“中花11”。ms1突变体来自中花11的EMS(EthylMethylSulfonate)诱变产生的突变(如图1所示)。

2、分析和定位群体：

通过ms1突变体与“中花11”的正反交实验，表明该突变体受隐性单基因控制。纯合的ms1突变体和籼稻品种NJ06号进行杂交，F₁代自交，并从F₂群体中挑选出962株同时具有颖壳异常和小粒表型的个体作为定位群体。在抽穗期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。

3、DNA提取

采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.3g水稻叶片，经液氮速冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于500μl超纯水中。每一个PCR反应用1μlDNA样品。

4、MS1基因的初步定位

从ms1突变体与NJ06号杂交组合的F₂群体962个隐性个体中随机选取160个隐性个体，组成的小群体进行多态性分析，根据本实验室均匀分布于12条染色体上的引物，按照已知的反应条件进行PCR扩增进行连锁分析。PCR扩增条件如下：PCR反应总体系为10μl：其中100ng/μl水稻基因组DNA1μl，10×PCRBuffer1μl,，2mMdNTP1μl，10uM引物2μl，5U/μlrTaq0.05μl，ddH₂O4.95μl。PCR扩增条件具体为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环，经4％琼脂糖凝胶电泳分离和Gelred核酸染料染色，检测PCR产物的多态性，将MS1基因初步定位在第3号染色体上M7和M29标记之间。

5、MS1基因的精细定位

利用ms1突变体与NJ06号组合的F₂群体中剩余的802株隐性个体，在初定位的基础上继续设计分子标记，最终将MS1基因精确定位在标记S8和S21之间大约78kb的区间内。引物序列如表1所示：

表1MS1基因的定位标记序列

6、基因预测和比较分析：

根据精细定位的结果，在78kb范围内根据RiceGenomeAnnotationProjecthttp://rice.plantbiology.msu.edu/)的预测，发现在此区间内共有10个候选基因。通过设计测序引物，采用PCR方法分别从ms1突变体和野生型品种中花11基因组中扩增候选基因进行测序分析。最终发现ms1突变体在LOC_Os03g54170基因组上发生了1014bp碱基的缺少，导致氨基酸翻译的提前终止。将这些结果分别重复验证3次，都得到相同结果，证明了其准确性。根据BAC克隆OJ1112_G08序列的基因注释信息(NCBI)，预测此基因编码了一个MADS-box蛋白(OsMADS34)，该基因与其它物种的MADS-box家族基因有很高的同源性。该MS1基因具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。PCR反应体系为：100ng/μl水稻基因组DNA2μl，GXLBuffer10μl，2.5mMdNTP4μl，10μM引物4μl，GXLDNAPolymerase4μl，ddH₂O26μl，总体系为50μl。PCR扩增条件具体为：94℃预变性2分钟；98℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸70秒，30个循环，经1％的琼脂糖凝胶电泳后切胶回收转入大肠杆菌后挑选阳性单克隆测序。MS1基因测序引物如下：M34CX-1F:CACAGCTTGAGCAGATCAGC(SEQIDNO：20)和M34CX-1R:CGGTACCATATCACGCACC(SEQIDNO：21)。

实施例2

植物转化：

利用同源重组和PCR技术将SalI酶切位点引入到扩增引物中，扩增引物为：M34ORF-1F：ATGGGGCGAGGCAAGGTGGTG(SEQIDNO：22)，M34ORF-1R：CTAGGCCATCCACTCAGGAGG(SEQIDNO：23)，退火温度为60℃。其中前后引物含有SalI酶切位点。用该引物PCR扩增中花11的cDNA，电泳后回收纯化720bp的片段，同时也用SalI单酶切35S-GFP(S65T)-NOS(pCA1301)载体，再将回收纯化的片段大小正确的产物连接到酶切后的载体上进行大肠杆菌转化，挑选阳性单克隆测序。获得正确转化载体pCA1301-35S-MS1ORF(如图6所示)，通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系LBA4404中转化水稻ms1突变体。我们利用突变体种子诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有重组质粒载体的LBA4404菌株侵染水稻愈伤，在黑暗和25℃条件下共培养3天后，在含有300mg/LG418的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有250mg/LG418预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照和25℃条件下培养。一个月左右获得到抗性转基因植株，再将其移植到大田中继续生长。在抽穗期和成熟期对植株进行表型鉴定和观察，发现异常的小穗和种子恢复正常。通过上述转基因的结果表明本发明获得了使ms1突变体恢复正常表型的转基因水稻(如图7所示)。

由上述实验结果可以确定，SEQIDNo：2所示的蛋白质序列具有调控水稻小穗颖壳发育和籽粒大小的功能。通过常规方法在上述氨基酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或几个氨基酸而得到的具有相同功能的由上述序列衍生的蛋白质，本领域技术人员可以合理预期其也属于本发明的保护范围。

上述蛋白质编码的基因可为如SEQIDNo：1所示的基因序列或如SEQIDNo：3所示的编码基因序列。通过常规方法在上述SEQIDNo：1或SEQIDNo：3所示的核苷酸序列中添加和/或取代和/或缺失一个或多个核苷酸而得到的可编码具有相同功能的蛋白质的突变基因、等位基因或衍生物，本领域技术人员可以合理预期其也属于本发明的保护范围。

上述实施例中仅列举了pCAMBIA1301作为重组载体的表达载体，以及以农杆菌株系LBA4404作为转化体的宿主细胞的优选实施例，实际上，上述表达载体可以选择现有较为成熟的pCAMBIA1300或其他衍生植物表达载体等。上述转化体的宿主细胞还可选择大肠杆菌细胞或植物细胞等。

在生产实践中，可将上述基因转化植物细胞，再将转化后的植物细胞培育成植株。通过该转基因方法，利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻小穗的发育，进而可以改良水稻或其他禾本科植物的产量、品质。

在生产实践中，还可将上述基因通过分子标记辅助选择育种方法来改良水稻或其他禾本科植物的产量、品质。

以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。有必要指出，本发明不局限于以上实施例，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种水稻小穗发育调控蛋白，其特征在于，如(A)或(B)所示的序列：

(A)SeqIDNo：2所示的氨基酸序列；

2.一种编码如权利要求1所述蛋白质的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，如(a)或(b)所示的序列：

(a)SEQIDNo：1所示的核苷酸序列；

4.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的编码框序列如(a)或(b)所示的序列：

(a)SEQIDNO：3所示的核苷酸序列；

5.一种含有权利要求2-4任一项所述基因的重组载体。

6.一种含有权利要求2-4任一项所述基因的转化体。

7.一种调控禾本科植物小穗发育的方法，其特征在于，包括用如权利要求2-4任一项所述的基因转化禾本科植物细胞，再将转化后的禾本科植物细胞培育成植株。

8.权利要求1所述蛋白、权利要求2、3或4所述基因、权利要求5所述重组载体或权利要求6所述转化体在改良禾本科植物产量、品质中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，权利要求2、3或4所述的基因通过转基因或分子标记辅助选择育种方法来改良禾本科植物产量、品质。

10.根据权利要求7所述的方法或权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述禾本科植物为水稻。