CN109234286B - 一种水稻叶片衰老调控基因els6及其编码的蛋白质和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻叶片衰老调控基因ELS6及其编码的蛋白质和应用。一种水稻叶片衰老调控基因，命名为ELS6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明调控水稻叶片衰老的基因ELS6及其编码的蛋白质可以应用于作物遗传改良，过表达ELS6后水稻植株表现出叶绿素含量增高，对创制水稻持绿品种、提高作物产量具有重要意义，为创建水稻新种质打下基础。

Description

一种水稻叶片衰老调控基因ELS6及其编码的蛋白质和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种水稻叶片衰老调控基因ELS6及其编码的蛋白质和应用。

背景技术

水稻是中国乃至世界上最重要的粮食作物，是人们赖以生存的宝贵资源。解决全世界人口的温饱问题一直以来是各国的头等问题。据世界粮农组织预测，到2050年，世界粮食作物的产量至少要提高60％以上，甚至一倍以上，才能基本解决世界人口的温饱问题。然而病虫害、逆境和早衰等因素持续造成水稻等粮食作物减产。因而，如何提高水稻产量，是科学家们迫切需要解决的问题，水稻的高产稳产对保障我国粮食安全具有极其重要的意义。

叶片是植物进行光合作用的主要场所，对于物质积累有重要影响，水稻过早启动衰老进程会对植株正常的营养利用和发育产生不良影响，进而影响水稻的产量和品质。水稻早衰突变体表型明显，易于观察，已广泛应用于生产实践和科学研究中。理论上推算，水稻叶片推迟1天衰老，增产2％左右，实际实验结果表明也可增产1％左右。研究水稻早衰分子机制并通过分子手段培育高产优质水稻品种，无疑具有重要意义。因此，揭示水稻衰老的分子调控机制受到极大的关注。

植物叶片衰老过程中，有很多的基因表达发生显著变化，如衰老相关基因，叶绿素退化相关基因等。叶片衰老最显著的特征是黄化表型，是大分子降解的可见标记。叶绿素降解途径是植物中大分子降解途径中最具特色之一。水稻(Oryza sativa)中的NYC1基因可以诱导叶绿素降解。最近已在高等植物中确定了定位在叶绿体中的高度保守的常绿基因(SGR)。目前，水稻已克隆了在衰老过程中上调表达的衰老相关基因，其功能主要涉及与氨基酸代谢(Osh36、OsI55、OsI20等)、脂肪酸代谢(OsI57、OsI85)、蛋白质的降解(OsI295)、胁迫应答(Osl43、Osh70)等代谢反应应答，而有些已克隆衰老相关基因(Osh69、Osh67、OsI139)的功能目前还不清楚。而在这些基因里面，有的是只有在自然衰老的情况下会高水平或者低水平表达的基因，如OsI85、Osh67，有的则是只有在黑暗诱导衰老的情况下才会表达，如OsI43、Osh70。

影响叶片衰老的诸多因素是一个极为复杂的交叉网络，不同调控因子之间相互作用的机理目前也仍未清楚。因此，需要我们分离鉴定更多与水稻叶片衰老/持绿相关的基因，筛选出生产上有利用价值的叶片持绿基因，以阐明调控水稻叶片衰老的分子网络，对水稻高产育种具有重要的意义。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种调控水稻叶片衰老的基因及其编码的蛋白质，以及利用所述基因调控植物叶片衰老和对叶片衰老进行改造的方法。

本发明通过EMS诱变分离得到了一个叶片早衰突变体，该突变体叶片在生长70-80天后叶片迅速衰老枯萎，严重影响水稻的产量。运用图位克隆技术，克隆了ELS6(EarlyLeaf Senescence 6)基因，该基因编码ALF4蛋白(aberrant root formation protein 4)，与根的生长发育相关。然而，在本发明中我们发现该基因与衰老相关，并通过基因功能互补实验鉴定了该基因的功能。

一种水稻叶片衰老调控基因，命名为ELS6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明又提供了所述水稻叶片衰老调控基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明又提供了一种包含所述水稻叶片衰老调控基因的重组表达载体。优选的，所述的重组表达载体，载体为pCAMBIA1300。

本发明还提供了一种包含所述重组表达载体的转化体。

所述转化体的宿主细胞可以是大肠杆菌、农杆菌、植物细胞等，优选的，所述转化体的宿主细胞为农杆菌。

本发明还提供了一种转基因水稻，该转基因水稻过表达所述的水稻叶片衰老调控基因。通过过表达ELS6基因，获得的转基因水稻叶片能够延迟衰老，与野生型相比转基因叶绿素含量显著提高，有助于提高产量。

本发明还提供了一种调控水稻叶片衰老的方法，包含以下步骤：

使用所述的转化体转化水稻细胞，然后将转化后的水稻细胞培育成植株。

本发明还提供了所述的水稻叶片衰老调控基因在调控植物叶片衰老中的应用。

优选的，所述植物为水稻。

本发明调控水稻叶片衰老的基因ELS6及其编码的蛋白质可以应用于作物遗传改良，对创制水稻持绿品种、提高作物产量具有重要意义，为创建水稻新种质打下基础。

附图说明

图1为野生型(WT)和突变体(els6)对比图，其中，A、生长7天的野生型和突变体；B、生长40天的野生型和突变体；C、生长70天的野生型和突变体；D、生长100天的野生型和突变体；E、生长70天的野生型和突变体叶绿素含量；F、生长70天的野生型和突变体叶片中衰老相关基因表达量。

图2为ELS6基因克隆以及转基因功能互补研究结果图，其中，A、ELS6基因图位克隆；B、野生型、突变体和转基因植株表型图；C、野生型、突变体和转基因叶片ELS6表达量分析；D、野生型、突变体和转基因叶片中衰老相关基因表达量。

图3为ELS6的亚细胞定位分析结果图，其中，A、明场；B、GFP(绿光)；C、细胞核标记(红光)；D、明场、GFP和细胞核标记重叠。

图4为ELS6在不同组织部位的定量分析结果图，其中，A、转录组水平根、茎、叶、叶鞘、穗和花药等组织器官中ELS6表达量分析；B、蛋白质组水平茎、叶、叶鞘和穗等组织器官中ELS6表达量分析。

图5为野生型(WT)和突变体(els6)叶片组织化学染色分析结果图，其中，A、DAB染色；B、NBT染色。

图6为酵母双杂交技术分析ELS6和RBX1蛋白质互作结果图，其中，A、ELS6和LOC_Os02g47870(RBX1)基因所表达的蛋白互作分析；B、ELS6和LOC_Os01g01700(RBX1)基因所表达的蛋白互作分析。

图7为双荧光素酶分析ELS6和RBX1蛋白质互作结果图，其中，A、ELS6和LOC_Os02g47870(RBX1)基因所表达的蛋白互作分析；B、ELS6和LOC_Os01g01700(RBX1)基因所表达的蛋白互作分析。

图8为ELS6过表达转基因植株中ELS6转录组水平表达分析结果图。

图9为ELS6过表达转基因植株分析图，A、野生型和ELS6过表达转基因植株表型图；B、野生型和ELS6过表达转基因植株叶片叶绿素含量测定。

具体实施方式

实施例1：

1、水稻材料

水稻(Oryza sativa L.)els6突变体植株(ELS6基因突变)是由籼稻蜀恢527品种(购自中国农科院作物品种资源库)经过EMS(甲基磺酸乙酯)诱变处理得到的。els6突变体植株具有早衰的特性(图1)。els6突变体还表现出叶绿素含量下降(图1E)(叶绿素检测方法可参照Lichtenthaler,Methods in Enzymology,1987,148:350-382)，突变体叶片中衰老相关基因表达量上升(图1F)等特性。

2、分析和定位群体

F₂定位群体是通过纯合的els6突变体和粳稻品种“日本晴”(Oryza sativasubsp.japonicacv.Nipponbare)杂交产生F₁代，F₁代自交得到F₂群体。从F2群体中筛选出1186株叶片早衰表型明显的els6突变个体用于图位克隆。

3、通过SSR，STS标记定位ELS6基因

基因组DNA的提取：采用改良的CTAB法提取水稻叶片(即步骤2筛选的886株表型明显的黄叶els6突变个体)基因组DNA。具体方法为：取约0.2g新鲜的水稻叶片于2.0ml离心管中，经液氮冷冻，利用组织研磨仪(QIAGEN)将叶片磨成粉末状，加入CTAB提取液提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于200μL超纯水中。

ELS6基因的初定位：随机选取20个F2定位群体中分离的隐性突变单株，将其DNA混合组成混池，选取近似均匀分布于水稻12条染色体上的SSR(简单重复序列)标记和STS(序列标签位点)标记，进行PCR扩增，经5％的琼脂糖凝胶电泳分析，检测PCR产物的多态性，将ELS6基因初步定位到水稻8号染色体(图2)。PCR反应体系(20μL)：DNA模板2μL，2×Specific^TM Taq Master Mix 10μL，上、下游引物各1μL，超纯水补足至20μL。PCR反应条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，32循环；72℃延伸5min。

ELS6基因的精细定位：利用已知的水稻基因组BAC序列，通过籼、粳稻之间的序列差异比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，在初定位区间内设计新的STS标记，利用STS标记对F2群体中分离的隐性突变单株进行标记连锁分析，最终将ELS6基因精细定位于8号染色体上P7和P8之间(图2)。

4、基因预测和序列分析

通过Rice Genome Annotation Database分析预测，我们设计基因的测序引物通过用PCR方法(反应体系和条件同上)从野生型和突变型植株扩增出候选基因并进行测序分析。结果显示(图2)，els6突变体在基因LOC_Os08g19320的第5外显子与内含子的剪切位点处发生1个单碱基突变(基因组序列的第1724位)，推测可能会导致第五段内含子不能正确剪切。在剪切位点两侧的外显子上设计合适的引物，分别扩增野生型与els6突变体的cDNA，发现突变体中ELS6有两种转录方式，一种是与野生型相同的正确的剪切方式，另一种转录本的内含子不能被剪切，且第二本转录本的转录丰度更高。

该基因全长5339bp，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，CDS区域核苷酸序列如SEQID No.1所示，该基因编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2

1、功能互补转基因植株转化：

根据目的基因(LOC_Os08g19320)设计引物：

PCELS6-F1(5’-gagctcTCCTGCTGCTGCTGCTGC-3’)；

PCELS6-R1(5’-GTTGAGGAGGTCGGAGA-3’)；

PCELS6-F2(5’-CTAGGATCTCCTTCTGCTC-3’)；

PCELS6-R2(5’-GCTCCTCATGAGTAGTGAC-3’)；

PCELS6-F3(5’-CCTCCTTGTCTTCCTGATC-3’)；

pCELS6-R3(5’-cccgggGTCCTAGGATATGTCAAATCCG-3’)。

以粳稻品种日本晴基因组DNA为模板，分别以pCELS6-F1和pCELS6-R1，pCELS6-F2和pCELS6-R2，pCELS6-F3和pCELS6-R3为引物，利用NEB公司Q5高保真酶体系进行PCR扩增，反应体系为(20μL)：DNA模板2μL，2×Master Mix 10μL，上、下游引物各1μL，超纯水补足至20μL。PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸3min 30s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经电泳后，回收目标片段，以回收的三段片段为模板，以pCELS6-F1和pCELS6-R3为引物，再次PCR，回收目标片段接入T5-zero载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，经测序验证后，克隆到双元载体pCAMBIA1300(中国科学院遗传所)中，获得了用于转化的质粒pCAMBIA1300-ELS6。质粒通过电击的方法转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105(中国科学院遗传所)中，并转化水稻(方法可参照Toki等,Plant J,2006,47(6):969-976)，具体如下：将实施例1获得的els6突变体种子脱壳，用10％的NaClO表面灭菌15min，无菌水冲洗后接种到诱导愈伤组织的培养基中，32℃持续光照培养5-7天，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有双元质粒pCAMBIA1300-ELS6的EHA105菌株侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，在含有50mg/L潮霉素和400mg/L羧苄的选择培养基上筛选抗性愈伤组织，并接种于50mg/L潮霉素和250mg/L羧苄的分化培养基上，32℃持续光照培养2周，分化出的幼苗经移至生根培养基诱导生根，然后移栽到水田，结实后收种进行表型鉴定。结果显示，与同时期的突变体植株比较，els6::pCAMBIA1300-ELS6互补转基因植株早衰表型恢复正常，ELS6及衰老相关基因表达量均恢复到野生型水平，说明本发明获得了使突变体叶片早衰表型恢复正常的转基因水稻(图2)。

实施例3

1、ELS6蛋白的亚细胞定位

构建ELS6全长的亚细胞定位载体，探究ELS6在水稻中的亚细胞定位情况。质粒构建方法同实施例2中所述：根据目的基因(LOC_Os08g19320)设计引物

PCELS6-F4(5’-caccATGGGCCTCGTGTCCACAG-3’)；

pCELS6-R4(5’-GAAACCTTTCATCTTTTCCTCTG-3’)，

片段包含所述基因CDS序列全长，以粳稻品种日本晴cDNA为模板，利用NEB公司Q5高保真酶体系进行PCR扩增，反应体系和条件同实施例2。PCR产物经电泳后，回收目标片段并接入pENTR/D-TOPO载体，经测序验证后，重组到PGWB405中，获得了用于转化的质粒35S::ELS6-GFP。用PEG转化法将亚细胞定位载体转到新鲜制备的水稻原生质体(粳稻品种日本晴)中，在激光共聚焦显微镜下观察水稻原生质体，可以明显的观察到融合蛋白GFP信号出现在细胞核上，绿色荧光信号与细胞核Mark始终重叠在一起，如图3所示。以上结果表明，ELS6蛋白定位在水稻的细胞核中。

2、ELS6基因表达分析

利用TRIzol(购自Invitrogen公司)法，分别提取野生型籼稻品种蜀恢527的根、茎、叶、叶鞘和花药的总RNA，采用TOYOBO反转录试剂盒(ReverTra

qPCR RT MasterMix with gDNA Remover)反转录成cDNA，然后利用CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad)进行荧光定量PCR检测，qPCR反应使用SYBR Green Supermix(Bio-Rad)试剂盒，所有试剂盒涉及的方法均根据相关说明书操作。结果如图4A所示，ELS6基因在叶和叶鞘中表达量最高，其次是茎，在根、孕穗中表达量较低。此外，对不同组织器官(根、茎、叶和叶鞘)进行总蛋白质提取，利用兔来源的anti-ELS6蛋白抗体(武汉金开瑞生物工程有限公司)对其进行Western blot实验，在蛋白质水平检测ELS6的表达，结果如图4B所示，ELS6蛋白在叶和叶鞘中表达量最高，其次是茎和根，该结果与转录组水平的结果相符。

3、组织化学染色分析

为了研究ELS6基因突变对水稻叶片的影响。我们通过DAB和NBT分析了水稻叶片过氧化氢(H₂O₂)和超氧阴离子(O₂ ^-)含量。与野生型相比，突变体中积累较多的H₂O₂(棕色)以及O₂ ^-(蓝色)(图5)。说明ELS6功能缺失导致H₂O₂和O₂ ^-积累。

4、ELS6蛋白与RBX1蛋白互作研究

以往的研究表明Glomulin(GLMN)蛋白通过结合RING BOX(RBX1)抑制culin-RINGE3ligases(CRLs)，进而影响结合泛素缀合酶，影响生长发育。序列比对发现拟南芥ALF4与GLMN同源，为了深入分析ELS6的分子机理，通过酵母双杂交方法验证ELS6的互作蛋白。质粒构建采用实施例2中所述方法，首先通过PCR扩增ELS6基因和编码RBX1亚基基因(LOC_Os01g01700和LOC_Os02g47870)的CDS全长，测序验证后ELS6基因片段克隆至pGAKT7载体，RBX1(LOC_Os01g01700和LOC_Os02g47870)等基因则分别克隆至pGADT7载体。酵母双杂交的实验采用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System(购自Clontech)，参照说明书方法操作。蛋白互作结果如图6所示，ELS6基因与RBX1基因共转化的酵母细胞能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+X-gal的培养基上生长而且能都变蓝，而与其他几个基因共转化均不能生长，说明ELS6与RBX1在体外具有相互作用。此外，通过双分子荧光互补(BiFC,bimolecularfluorescence complementationn；方法可参照Waadt等,Plant J,2008,56:505-516)实验分析进一步验证了在烟草叶片中RBX1与ELS6也发生相互作用(图7)。

实施例4

1、过表达植株转化

根据目的基因(LOC_Os08g19320)设计引物：

PCELS6-F2(5’-gggcccATGGGCCTCGTGTCCACAG-3’)；

pCELS6-R2(5’-tctagaGAAACCTTTCATCTTTTCCTCTG-3’)

根据实施例2所述，将该克隆产物克隆到AHLG过表达载体中，以实施例1获得的els6突变体种子为实验材料，进行遗传转化。结果显示，与野生型相比，在转录水平，过表达转基因植株ELS6的表达量显著上调(图8，qPCR检测方法参照实施例3)，此外，过表达植株早衰表型恢复正常，与野生型相似但比同时期的野生型更绿一些，通过叶绿素含量测定发现过表达植株叶片叶绿素含量高于野生型，说明本发明获得了叶片延迟衰老/持绿的转基因水稻(图9)。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种水稻叶片衰老调控基因ELS6及其编码的蛋白质和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1884

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgggcctcg tgtccacaga agcaacacca caccaccacg cacgcctccg ccgccgctcc 60

atggacgccg gcgacacatc cgccgccgcc gctgtagccc ctaccccggc gcggctgcgg 120

gaagcgctcg ccgccctctc caaggcgttc gagtccgggg attgctccga tggatccgcc 180

gcggcggccg tctccgacct cctcaacgcc gccgccgatg cagctgatgc ggaggccgac 240

gccgaagacg aggcggcggc cggggtcgtc gaggagatgc tccgggaggt gcacgcgttc 300

ctctcgtccc cgtcctcgaa tcagttggcc atagatgctc tctcactaga gctggtaaaa 360

cctgtggcga agctgggggc actgatgagg aattgctggg acattgccaa cgctatcatt 420

gaattcttcg tgtcaaactg caacccgagg gacatgctct ccatcctatg tgaggcagta 480

gatgcaccat tggcatcaaa tggctcagtg tactttgttc ttctattcaa ggagctagcc 540

aaagtgcttg ttttgattca gaggaggcat actgagcaag taaaagtcac acttcctgct 600

gtccttcgag ttatgaatgc tgttatacca gaatgtgacg aggaacatgg aaagatcatc 660

gttgatatgt acaatgcagc acttagaatt ggcaatgcca ttcaagaaat gtgcaaaaaa 720

atggtaaacc agacgaatga agaactctgt tctgtactta gtctatactc ccttcagaac 780

atagctcttg tatcaagatg caaacaacag catattctct ctgcttgtgg ttcagttgtt 840

cttcagcatt caaaaattct gacattttgt gggttcactt atttgggtct tttgactggt 900

aatgatgtca cctcagccac cgataagatt tcaaaagatg aagatgcgga tttgctcgag 960

tgcttttctt ttgcaatgaa tggtgcaaat cttgcagtta tctggaccta tatggatgat 1020

gaaatctcaa aatatgctgg cgctgagctg gaatcagcgc tgaaagatgt taagggcaac 1080

catacgagga tgtggcaagc aattaacatt cttagatatg tgttgtcttc aactcattac 1140

ccatgggtaa taaaatccca cagtttggac ttactgctga ctatagctaa tgaaagtcgt 1200

attgaggaaa tcaatgatca tgtagatgtt tcatcttctg gtcctcaaat ttttgcaaca 1260

ctcaaggcca ttgaaagtgt catgatttcc gccccagatg cattaatgcg gaagaaagct 1320

tttgctactt tgaaacaggt tatttcaatg gtgccatcct ctcagagatt caacatctta 1380

caggctctta taaagaacag catcttccct tcattgactg cacttctcct agatctggtg 1440

aaggatgaag tttcgagaga gattcgtcga gctgatcagg atattgttga atcggatcaa 1500

ttacaagatg gtggcgaatg gccaccacct tggttttctc atgcacttga gttggtggag 1560

ctgatcttga agcctccaga aggtggccct ccttgtcttc ctgatcatgg tgagcaggta 1620

ttatcagctt tgaatttgct gcgatttgtt ctgataatag attcaagagg atcaagatca 1680

agaaaaatgt ttggggaaga gactatgagg aaggtgtact cagagtggct gatgccatta 1740

agaccaattg ttgcaggaat tcaatcagaa agtgaagagg atggtagcga cgttgcaaat 1800

catatcatgt gctcgttaaa tcctgttcaa ttagtattgt accgctgcat tgagctggca 1860

gaggaaaaga tgaaaggttt ctaa 1884

<210> 2

<211> 627

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Gly Leu Val Ser Thr Glu Ala Thr Pro His His His Ala Arg Leu

1 5 10 15

Arg Arg Arg Ser Met Asp Ala Gly Asp Thr Ser Ala Ala Ala Ala Val

20 25 30

Ala Pro Thr Pro Ala Arg Leu Arg Glu Ala Leu Ala Ala Leu Ser Lys

35 40 45

Ala Phe Glu Ser Gly Asp Cys Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Ala Val

50 55 60

Ser Asp Leu Leu Asn Ala Ala Ala Asp Ala Ala Asp Ala Glu Ala Asp

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Ala Ala Gly Val Val Glu Glu Met Leu Arg Glu

85 90 95

Val His Ala Phe Leu Ser Ser Pro Ser Ser Asn Gln Leu Ala Ile Asp

100 105 110

Ala Leu Ser Leu Glu Leu Val Lys Pro Val Ala Lys Leu Gly Ala Leu

115 120 125

Met Arg Asn Cys Trp Asp Ile Ala Asn Ala Ile Ile Glu Phe Phe Val

130 135 140

Ser Asn Cys Asn Pro Arg Asp Met Leu Ser Ile Leu Cys Glu Ala Val

145 150 155 160

Asp Ala Pro Leu Ala Ser Asn Gly Ser Val Tyr Phe Val Leu Leu Phe

165 170 175

Lys Glu Leu Ala Lys Val Leu Val Leu Ile Gln Arg Arg His Thr Glu

180 185 190

Gln Val Lys Val Thr Leu Pro Ala Val Leu Arg Val Met Asn Ala Val

195 200 205

Ile Pro Glu Cys Asp Glu Glu His Gly Lys Ile Ile Val Asp Met Tyr

210 215 220

Asn Ala Ala Leu Arg Ile Gly Asn Ala Ile Gln Glu Met Cys Lys Lys

225 230 235 240

Met Val Asn Gln Thr Asn Glu Glu Leu Cys Ser Val Leu Ser Leu Tyr

245 250 255

Ser Leu Gln Asn Ile Ala Leu Val Ser Arg Cys Lys Gln Gln His Ile

260 265 270

Leu Ser Ala Cys Gly Ser Val Val Leu Gln His Ser Lys Ile Leu Thr

275 280 285

Phe Cys Gly Phe Thr Tyr Leu Gly Leu Leu Thr Gly Asn Asp Val Thr

290 295 300

Ser Ala Thr Asp Lys Ile Ser Lys Asp Glu Asp Ala Asp Leu Leu Glu

305 310 315 320

Cys Phe Ser Phe Ala Met Asn Gly Ala Asn Leu Ala Val Ile Trp Thr

325 330 335

Tyr Met Asp Asp Glu Ile Ser Lys Tyr Ala Gly Ala Glu Leu Glu Ser

340 345 350

Ala Leu Lys Asp Val Lys Gly Asn His Thr Arg Met Trp Gln Ala Ile

355 360 365

Asn Ile Leu Arg Tyr Val Leu Ser Ser Thr His Tyr Pro Trp Val Ile

370 375 380

Lys Ser His Ser Leu Asp Leu Leu Leu Thr Ile Ala Asn Glu Ser Arg

385 390 395 400

Ile Glu Glu Ile Asn Asp His Val Asp Val Ser Ser Ser Gly Pro Gln

405 410 415

Ile Phe Ala Thr Leu Lys Ala Ile Glu Ser Val Met Ile Ser Ala Pro

420 425 430

Asp Ala Leu Met Arg Lys Lys Ala Phe Ala Thr Leu Lys Gln Val Ile

435 440 445

Ser Met Val Pro Ser Ser Gln Arg Phe Asn Ile Leu Gln Ala Leu Ile

450 455 460

Lys Asn Ser Ile Phe Pro Ser Leu Thr Ala Leu Leu Leu Asp Leu Val

465 470 475 480

Lys Asp Glu Val Ser Arg Glu Ile Arg Arg Ala Asp Gln Asp Ile Val

485 490 495

Glu Ser Asp Gln Leu Gln Asp Gly Gly Glu Trp Pro Pro Pro Trp Phe

500 505 510

Ser His Ala Leu Glu Leu Val Glu Leu Ile Leu Lys Pro Pro Glu Gly

515 520 525

Gly Pro Pro Cys Leu Pro Asp His Gly Glu Gln Val Leu Ser Ala Leu

530 535 540

Asn Leu Leu Arg Phe Val Leu Ile Ile Asp Ser Arg Gly Ser Arg Ser

545 550 555 560

Arg Lys Met Phe Gly Glu Glu Thr Met Arg Lys Val Tyr Ser Glu Trp

565 570 575

Leu Met Pro Leu Arg Pro Ile Val Ala Gly Ile Gln Ser Glu Ser Glu

580 585 590

Glu Asp Gly Ser Asp Val Ala Asn His Ile Met Cys Ser Leu Asn Pro

595 600 605

Val Gln Leu Val Leu Tyr Arg Cys Ile Glu Leu Ala Glu Glu Lys Met

610 615 620

Lys Gly Phe

625

<210> 3

<211> 5339

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

atgggctacc ggcccaaaag tacgcgtcca ctttagtatg ggcctcgtgt ccacagaagc 60

aacaccacac caccacgcac gcctccgccg ccgctccatg gacgccggcg acacatccgc 120

cgccgccgct gtagccccta ccccggcgcg gctgcgggaa gcgctcgccg ccctctccaa 180

ggtaatcgcg caagctgagc cctaggatct ccttctgccg tgtaccctag ctaaacccta 240

ggatctcctt ctgctccagg cgttcgagtc cggggattgc tccgatggat ccgccgcggc 300

ggccgtctcc gacctcctca acgccgccgc cgatgcagct gatgcggagg ccgacgccga 360

agacgaggcg gcggccgggg tcgtcgagga gatgctccgg gaggtgcacg cgttcctctc 420

gtccccgtcc tcgaatcagg ttcgatatcc tgtgcttgcg tgtgattggt ctctccgcgt 480

ggtgtttcat gttgcgattc gcggggtggg acgggagtaa ttttggtgat ctcctgacat 540

tgttgccgtc tcgtaatagt tggccataga tgctctctca ctagagctgg taaaacctgt 600

ggcgaagctg ggggcactga tgaggaattg ctgggacatt gccaacgcta tcattgaatt 660

cttcgtgtca aactgcaacc cgagggacat gctctccatc ctatgtgagg tcagtcacgc 720

gtgcgtttat tcttgataaa tcctggcatt tggctttaca gttgcgtctt gcaatgttga 780

tgaaattcag aatatagacc catacagagg taacctgtgt ctcctttaac tctgaaagat 840

cctgtgattg gaaagagttc tggtttttat tttattgagg gatgaaggaa aaagtccatt 900

tacaagactg aactatcatc aaaatctgaa attcaactcg gaactttgaa atgtgacact 960

attctttacc ctttcaaata gatctggata agttttatag ttttttaaat atgaactgat 1020

gttccattgt ttatttgttg catccagtcc aaacttgcac aatgccaggg cactggaatg 1080

tccattcata attgagcata ttttcatttt gcattcaata tttccagacg acaatatatc 1140

tctacctcct tccctcgctt ctgctctctg ggttcctatg gtatattgct cacctttttg 1200

tcatgacatt atgttgcttt aatacaggca gtagatgcac cattggcatc aaatggctca 1260

gtgtactttg ttcttctatt caaggagcta gccaaaggta tatgttttta tatgaagatt 1320

tccacagcca tctctctgct catcgtttgg aaattttggt ttctaatgga tgaatttcca 1380

gataggaatt gagatactta atgctctatg cctatatata tataagttta gatatattcg 1440

cttgacatat gttacacacc ttgtgtgaat attaactggt taacatttgt attattaaat 1500

atgttttttt tctattcttc ctagctaatt gtgctttggg ctagtgcttg ttttgattca 1560

gaggaggcat actgagcaag taaaagtcac acttcctgct gtccttcgag ttatgaatgc 1620

tgttatacca gaatgtgacg aggaacatgg aaagatcatc gttgatatgt acaatgcagc 1680

acttagaatt ggcaatgcca ttcaagaaat gtgcaaaaaa atggtttgtt gagttaaaat 1740

gccattcaag ttgaccctgt gtcctaaaca atatgcggtc gccttttcat ttgtcttttc 1800

tgattaattt tgcattattg tttccatcac caaaaggtaa accagacgaa tgaagaactc 1860

tgttctgtac ttagtctata ctcccttcag aacatagtaa gtacaaaact gtgttattta 1920

tatatgttat tttcaattag atttagaaag atttattttc ttaatatgtt attaattatt 1980

atacactcct atcttgcagg ctcttgtatc aagatgcaaa caacagcata ttctctctgc 2040

ttgtggttca gttgttcttc agcattcaaa aattctgaca ttttgtgggt tcacttattt 2100

gggtcttttg actggtaatg atgtcacctc agccaccgat aagatttcaa aaggtgttta 2160

acttttccaa attatttttc acttggaaat attgtattct gtttgcttga ttgtcaactg 2220

atgcatttgt ttgcaaagtg atgtagatga agatgcggat ttgctcgagt gcttttcttt 2280

tgcaatgaat ggtgcaaatc ttgcaggttt gatgatcatt ttgactacac tttcattgga 2340

caatgcatgt tgtttagata ccacttggtc acatgcttga gctttttgca gttatctgga 2400

cctatatgga tgatgaaatc tcaaaatatg ctggcgctga gctggaatca gcgctgaaag 2460

atgttaaggg caaccatacg aggatgtggc aagcaattaa cattcttaga tatgtgttgt 2520

cttcaactca ttacccatgg gtaataaaat cccacagttt ggacttactg ctgactatag 2580

ctaatgaaag tcgtattgag gaaatcaatg atcatgtaga tgtttcatct tctggtcctc 2640

aaatttttgc aacactcaag gtaatgttac gctttactta tatatttaaa aatatgtccc 2700

aatctactat atcaacaatt taagaacatt cacaggccat tgaaagtgtc atgatttccg 2760

ccccagatgc attaatgcgg aagaaagctt ttgctacttt gaaacaggca agtatcatat 2820

atactgttgg gttttttctt tctctttgtt ttaacaattg tcatgaatat atttttgact 2880

tgtgtttgta tatgtctgta agataatatg ggcaggatgg taacatgttc cttcttcagt 2940

ctgtactgtg gcatttcttc tttttcattt tgaatgtcac ttctttataa cgctgaaatt 3000

ttatcaggtt atttcaatgg tgccatcctc tcagagattc aacatcttac aggctcttat 3060

aaagaacagc atcttccctt cattggtaag aactaagaac acaatctctg catgcagttt 3120

aaatggtatt ctctctatcc caaaatatag caaccaagta ctagattaga tgtctcgtag 3180

cactagtggt gtctaatctt gtactaggtt gctatatttt gggacggatg gagcaagtaa 3240

gagcatcctg ttgatgccca atatacatat agggaaagaa aggaccatac aatggatctc 3300

agattttcag ttaccgccac ctaacatttt ctggtgtatg atgtgcttgg attgatagaa 3360

acatgcagtt ttatgatttt taacttcatt tttcaactcc atcctttaaa tcgtgaatta 3420

tgttttttct tctagactgc acttctccta gatctggtga aggatgaagt ttcgagagag 3480

attcgtcgag ctgatcagga tattgttgaa tcggatcaat tacaagatgg tggcgaatgg 3540

ccaccacctt ggttttctca tgcacttgag ttggtggagc tgatcttgaa gcctccagaa 3600

ggtggccctc cttgtcttcc tgatcatggt gaacaggtac cctcttttta tgtcactact 3660

catgaggagc ataaatatct gttggaagaa ctcaggcaac agcaacatag atggaatagc 3720

attagttgat acaagatgcc tgtttccgta ttaaaataaa aggaggatga ctgttgggca 3780

ggaatagatc tagataagac agacatgaac ttggagactt gtctaaatcc acagaaggac 3840

gtcaaggact aggagagttc tgttcatctt taccttatta aatctcagtg aaccagctgt 3900

gtcatcttag gctcttgaga aattagcgaa tgattataac aaatggcttc aatacttata 3960

aagatactct taacaactga ataaaatata gaataattaa agtctcaact ccaatccaaa 4020

acattgaata tcgatctatc atttttcctt tttcttttcg acttaatttg tcagactctc 4080

gtaatctcat ttttgtaact tttaacattg aatgaattta tactagtaaa ttgagatgag 4140

aaatgcatgt aaattttgtg ggaatatttc atgttaaatt tgatgtataa atcaaagctg 4200

gattgcgtga atatctggat tcaccttata tgttgcccac ttgtgttgtg cttcgttatt 4260

cttatgtgtc ctgctaaagt ggtaattttg ttttacatca ttttatggct tatgcctaga 4320

aaataatctg ccatggttca ctttttttta tttgtatgca ggtattatca gctttgaatt 4380

tgctgcgatt tgttctgata atagattcaa gaggtaatct acaaaaaacc tgtgcttaaa 4440

attatatgta cttaactgaa ctgtaacaat aattgcatgg atttgctatt gcaaaactaa 4500

tgctacatga tcacaccatc tataagacta taatctgcaa gtttctctgt ggctctcgaa 4560

gcttaatgtt ttcataaatt aaatatttga ttaaacataa ttttggttat caacgtgctg 4620

gtgcatggtt ctaatgttca tttatctaac caatagttgt ctaaaacact ttcttctttt 4680

tcattcttcc aaatgtcctt taataaagag ctgtaacatt gaaactctgt taatgtgaac 4740

ctatatagtg tactaatccc aagtaatgtg ttgaaaaaat tgcatatgtc ctttttagtt 4800

tccaagcttg taaacccata gaatcaaaga tggctcgaga cataaaaaga agtggttgca 4860

tcttatttga acaaaagatg catggtgttc gacttcatga atggattaag gctcatgtga 4920

tttagtcctg ggattaatgt gaatcgtcag tttgatatat ttttcccatt ttgtccagga 4980

tcaagatcaa gaaaaatgtt tggggaagag actatgagga aggtgtactc agagtggctg 5040

atgccattaa gaccaattgt tgcaggaatt caatcagaaa gtgaagagga tggtagcgac 5100

gttgcaaatc atatcatgtg ctcgttaaat cctgttcaat tagtattgta ccgctgcatt 5160

gagctggcag aggaaaagat gaaaggtttc taacgttttc agttcactgg tttttgtaca 5220

atatactgct gtctcgaggc aaaacatgaa caagttgtga atattatccc aatgatttga 5280

agttgcgttt ttttatgttg tacagtgata ctgtcgtcct tcataattca ttttgctgg 5339

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagctctcct gctgctgctg ctgc 24

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccggggtcc taggatatgt caaatccg 28

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggcccatgg gcctcgtgtc cacag 25

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tctagagaaa cctttcatct tttcctctg 29

Claims (2)

1.一种用于延迟水稻叶片衰老的方法，其特征在于，包含以下步骤：

将转化体导入宿主细胞后转化水稻细胞，然后将转化后的水稻细胞培育成植株，

所述的转化体为包含水稻叶片衰老调控基因的重组表达载体，

所述水稻叶片衰老调控基因，命名为ELS6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，

所述的重组表达载体，载体为pCAMBIA1300，

所述转化体的宿主细胞为农杆菌。

2.一种水稻叶片衰老调控基因在延迟植物叶片衰老中的应用，所述水稻叶片衰老调控基因，命名为ELS6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述植物为水稻。

Images