CN109988754A

CN109988754A - 一种水稻蜡质合成相关的蛋白质及其编码基因wsl5与应用

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Publication number: CN109988754A
Application number: CN201910323100.0A
Authority: CN
Inventors: 徐杰; 周大虎; 贺浩华; 李婷; 林小丽; 姜志树; 朱昌兰; 傅军如; 彭小松; 陈小荣; 欧阳林娟
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2019-07-09

Abstract

本发明公开了一种水稻蜡质合成相关的蛋白质及其编码基因WSL5与其在水稻育种中的应用。本发明提供了一种水稻蜡质合成相关的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还提供了一种编码权利上述蛋白质的基因WSL5，所述基因WSL5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。上述基因WSL5在在改良水稻蜡质含量以及水稻抗生物和非生物胁迫中的应用。本发明分离并克隆鉴定了控制水稻蜡质合成基因WSL5，并通过互补实验进行基因功能验证。图位克隆的结果表明，该基因编码了一个氧化还原酶。本发明为培育蜡质含量丰富、抗胁迫的新品种，对于解决目前水稻品种易出现后期早衰、生产受环境影响等问题具有广阔的应用前景。

Description

一种水稻蜡质合成相关的蛋白质及其编码基因WSL5与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻WSL5(Wax Crystal-Sparse Leaf 5)基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因对水稻叶片衰老的调控，用于改良水稻品种以提高产量。

背景技术

蜡质是植物抵御来自外来环境侵害的第一道防护层，也是植物表面重要的防水层，对陆生植物防止非气孔类的水分蒸发起到重要作用。蜡质还能保护植物免受来自各种生物和逆境胁迫，比如，紫外线、强辐射、细菌、真菌、害虫以及高温或者冷冻害。水稻是我国最重要的粮食作物之一，提高其抗逆性是保障水稻安全生产、国家粮食安全的重要手段。因此，对不同蜡质合成突变体的研究是揭示水稻叶片蜡质的合成和调控机理，为利用生物技术手段重建水稻的蜡质层来增强作物抗逆能力，对提高水稻在逆境条件下的产量提供新途径具有重要意义。

蜡质的主要成分是各种可溶解于有机物的脂类物质，主要是C20-C34的超长链脂肪酸及其相应的醇类、酯类、醛类、烷类以及酮类衍生物。水稻的叶片和叶鞘蜡质主要成分是伯醇、醛类以及脂肪酸，而烷类含量则不到蜡质总量的15％。而水稻花药表面蜡质的主要成分则是烷类和烯烃类，大约占总量的90％。植物表皮蜡质的合成是在表皮细胞内完成的，合成过程主要包括：脂肪酸在质体中从头合成C16和C18脂肪酸，随后转运到内质网上延伸为C20-C36的超长链脂肪酸(very long-chain fatty acid,VLCFA)，进一步通过醇合成途径和烷烃合成途径合成不同的蜡质组分。

随着一些蜡质缺失突变体的发现，在水稻中已经克隆出13个蜡质相关基因。Wax-Dificient Anther1(WDA1)基因是水稻中第一个被克隆的蜡质相关基因，在花药表皮细胞中特异表达，wda1突变体花药表面蜡质晶体减少，小孢子发育受阻，花粉外壁发育异常，导致雄性不育；而Crystal-Spares Leaf1(wsl1)突变体叶片表面蜡质减少，还表现生长迟缓、育性下降、叶片融合以及抗旱能力降低，表明WSL1基因还可能参与了水稻生长和发育相关脂类合成。ONION1和ONION2基因参与超长链脂肪酸的合成，在茎顶端分生组织和发育中的侧器官的最外层中特异表达。两个突变体外层表皮细胞发育异常，生长迟缓，最终死亡；gl1-2突变体表皮层变薄，表面蜡质晶体减少，耐旱能力下降。DWA1主要参与干旱胁迫下的蜡质合成。过表达DWA1的植株超长链脂肪酸含量上升；dwa1在干旱处理后表面蜡质含量下降，许多与蜡质相关基因表达受到抑制，对干旱更为敏感。wax synthesis regulatorygene 1(WR1)和WR2是两个蜡质调控类基因。WR1基因的表达受到干旱、ABA和盐胁迫的诱导，过表达WR1植株表面蜡质含量增加，RNAi干扰植株则下降，进一步研究表明，WR1基因能够结合到蜡质相关基因OsLACS1和OsFAE1-L启动子上，调控基因表达，影响水稻表面的蜡质合成代谢。而过表达WR2同样调控叶片表面蜡质以及角质含量，并能增强水稻的抗旱能力。WSL4编码β-ketoacyl-CoA合酶(KCS)，参与长链脂肪酸合成的第一步，WSL3基因编码β-ketoacyl-CoA还原酶(KCR)，催化脂肪酸链延长的第二步反应。WSL3和WSL4在水稻所有组织中均有表达，并都定位于内质网膜。wsl3和wsl4突变体叶片表面蜡质层变薄，脂肪酸组分发生变化(Gan et al.,2016；Wang et al.,2017)。

虽然已有的水稻蜡质合成突变体和基因对蜡质合成和调控分子机理的揭示起到了重要的作用，但是其分子机理有待进一步研究。本发明通过图位克隆技术分离并克隆到蜡质合成基因WSL5，该基因编码一个氧化还原酶(3-oxoacyl-reductase)，细胞学和生物化学分析表明，该基因影响水稻叶片表面的蜡质分布和含量，转基因功能互补实验鉴定了该基因的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻蜡质合成相关的蛋白质及其编码基因WSL5与其在水稻育种中的应用。

本发明提供了一种水稻蜡质合成相关的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该蛋白质还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本发明还提供了一种编码权利上述蛋白质的基因WSL5，所述基因WSL5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该基因WSL5还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

上述基因WSL5在改良水稻蜡质含量以及水稻抗生物和非生物胁迫中的应用。作为本发明的基因WSL5的应用的改进：用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。

本发明的水稻脆秆突变体是由粳稻品种中花11的EMS诱变体库中筛选得到的。该突变体除了叶片表面蜡质分布稀，蜡质组分含量低，还表现出叶片早衰的现象。通过将突变体与正常水稻杂交，观察F₂后代的分离确定该表型是一个基因引起；本发明采用图位克隆的方法克隆分离了水稻控制茎秆强度的基WSL5。WSL5基因是由LOC_Os04g30760基因发生了单碱基突变而来的，即序列SEQ ID NO.1的第760位核苷酸G突变为A，导致编码的氨基酸发生了改变，生物信息学分析显示WSL5编码了蜡质合成途径中一个氧化还原酶(3-oxoacyl-reductase)。

通过转基因技术，进行功能互补的转基因研究，结果表明本发明获得了使突变体wsl5的表型得以恢复为野生型的转基因水稻，证明了本发明正确克隆了WSL5基因。

综上所述，本发明分离并克隆鉴定了控制水稻蜡质合成基因WSL5，并通过互补实验进行基因功能验证。图位克隆的结果表明，该基因编码了一个氧化还原酶。本发明为培育蜡质含量丰富、抗胁迫的新品种，对于解决目前水稻品种易出现后期早衰、生产受环境影响等问题具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是野生型和wsl5突变体表型以及叶片水珠特性。

图2是野生型和wsl5突变体叶片表面蜡质分布情况。

图3是WSL5基因精细定位图。

图4是功能互补实验转基因水稻表型以及叶片表面蜡质分布。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定，以下实施例中的若未特别说明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、突变体材料的获得与表型分析

通过EMS化学诱变粳稻品种中花11，筛选到一份蜡质合成减少的突变体wsl5，该突变体的性状经过多代自交已稳定遗传。该突变体表现为叶片表面沾水，水在野生型叶片凝聚成水珠，而突变体则为弥散表型，为典型的蜡质减少表型。通过扫描电镜检测发现wsl5叶片表面蜡质分布明显比野生型稀。在大田条件下与野生型相比，突变体还出现叶片早衰的现象。所有水稻材料种植于江西省南昌市江西农业大学试验田，常规管理。

上述EMS化学诱变方法具体为：将中花11种子浸没于浓度在0.05～0.5mol/L的甲基磺酸乙酯30min，之后将种子发芽种植到大田，经过多代自交。

实施例2、群体构建和遗传分析

将突变体wsl5和常用品种Nip、TN1和9311进行杂交配组，F₁植株均表现出正常野生型表型，说明wsl5受隐性核基因控制。统计F₂分离群体分离比(表1)，结果表明，正常表型的植株和突变体表型的植株的分离比经过卡方检验接近3:1分离，这表明wsl5的蜡质减少和早衰表型是由一对单隐性核基因控制。

表1水稻脆秆突变体wsl5的遗传分析

实施例3、WSL5基因的精细定位

我们选用突变体与TN₁杂交的F₂群体作为定位群体。利用本实验室保存的均匀分布于水稻12条染色体的SSR引物对突变体与TN₁进行多态性筛选。然后用21个wsl5/TN₁中F₂中蜡质减少单株(早衰单株)进行连锁分析，初步确认目标基因所在的染色体位置。基因组DNA采用CTAB法提取。具体步骤如下：

①、称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入600μL的CTAB溶液(2％(m/V)CTAB，100mmol/L Tris-Cl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl；pH8.0)配制的DNA提取缓冲液，65℃水浴40min。再加600μL的氯仿:异戊醇(24:1的体积比)，并混匀。10000rpm离心5min，将上清液转移到新的离心管中。

②、在上述步骤①离心后所得的上清液中加2/3～1倍体积预冷(至4℃)的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。13000rpm离心8min，倒出上清液。

③、再用70(体积浓度)的已醇200μL洗涤上述步骤②所得的DNA沉淀物。

④、将上述洗涤后的DNA晾干并溶于100μL TE缓冲液或纯水中。

⑤、紫外分光光度法检测上述步骤④所得的DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。完整合适的DNA用于PCR扩增，不完整的DNA则重新提取，直至获得完整的DNA。

PCR反应体系采用10μL体系：DNA模板1μL，10×PCR缓冲液1μL，正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，dNTPs 1μL，rTaq酶0.2μL，加ddH₂O补足10μL。PCR扩增程序如下：94℃下预变性4min；94℃下变性30s，55℃～60℃下退火30s(温度因引物不同而异)，72℃下延伸30s，40个循环；最后72℃下延伸10min。PCR产物用4％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像仪拍照并读胶。利用上述筛选的186对SSR引物进行基因连锁分析，发现WSL5初步定位于在第3号染色体，在连锁标记上下游设计新的Indel标记，用96个单株将目的基因区间锁定在分子标记M3与M4之间。

在此区间再次设计新的分子标记，用共1224个F₂单株最终将该基因定位在C4和C7之间大约52kb的区间内。引物序列见表2。

表2精细定位所用分子标记

根据水稻基因组数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)数据信息，发现共有7个开放阅读框(ORF)。我们将ZH11和wsl5这7个基因的全基因(包括启动子和内含子)全部测序并对比分析，LOC_Os04g30760第9外显子上发生G→A的单碱基突变，第254位氨基酸由Ala变成Thr。

该WSL5基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

实施例4、植物转化

扩增野生型水稻ZH11中WSL5基因的5’-UTR至3’-UTR的基因组DNA片段，全长8311bp，通过重组的方法连入到双源载体pCAMBIA1300中。

这个质粒通过液氮冻融法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中转化至突变体水稻。我们利用突变体成熟胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基培养2周后，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体(pCAMBIA1300-WSL5)的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有50mg/L Hygromycin的筛选培养基上光照培养14天左右(光照强度为13200LX，温度为32℃)。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下(光照强度为13200LX，温度为32℃)培养一个月左右得到抗性转基因植株。对互补苗植株进行表型鉴定，与同时期的野生型以及突变体对比，发现转基因植株早衰表型已恢复，叶片表面蜡质分布也变多，与野生型无明显差异。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。

序列表

<110> 江西农业大学

<120> 一种水稻蜡质合成相关的蛋白质及其编码基因WSL5与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atggcgacct ccgcgaccgc aggggcagca gcagcagtgg cctccccggc ggtggccccg 60

cgcggcgccg ccgtcgcggc ggtggcgcgg cgagggttcg tctcgttcgg cgcggcggcg 120

gccgcgcgct cgcgcgcggt gcggtccggc ggcttctccg gcgtgcagac ccatgttgca 180

gctgttgagc aagcacttgt gcaagatgct acaaagttgg aagctccagt tgttattgtg 240

accggtgcct ccagggggat tggaaaggcg actgcattgg ctcttggaaa agctgggtgc 300

aaggtcctgg tgaactatgc ccgatcctca aaagaggctg aagaagtctc caaagagatc 360

gaagcatgtg gtggtcaggc tattaccttc gggggagatg tttcaaaaga agccgatgtg 420

gattctatga tgaaagcagc tcttgataaa tggggaacaa ttgatgtgct ggtaaacaat 480

gcaggaatta cccgagacac attattaatg aggatgaaga aatcacaatg gcaagacgta 540

attgacctga atcttactgg tgttttcctc tgtacacaag ctgctacaaa aataatgatg 600

aagaagaaaa agggaaaaat catcaacata gcatcagttg ttggtcttgt tggtaatatt 660

ggccaagcta attacagtgc tgccaaggct ggggttattg gtttgacgaa aacagtagct 720

agggaatatg caagcagaaa tatcaatgtg aatgcaattg cacctggttt cattgcatct 780

gacatgactg ctgaacttgg agaggatctt gagaagaaaa tcttgtcaac catcccatta 840

gggagatatg gcaaaccaga ggaggttgct ggcttggttg agtttttggc tctcaatcct 900

gcggccaact acatcacggg acaggttctt accatcgatg gagggatggt gatgtag 957

<210> 2

<211> 318

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2

Met Ala Thr Ser Ala Thr Ala Gly Ala Ala Ala Ala Val Ala Ser Pro

1 5 10 15

Ala Val Ala Pro Arg Gly Ala Ala Val Ala Ala Val Ala Arg Arg Gly

20 25 30

Phe Val Ser Phe Gly Ala Ala Ala Ala Ala Arg Ser Arg Ala Val Arg

35 40 45

Ser Gly Gly Phe Ser Gly Val Gln Thr His Val Ala Ala Val Glu Gln

50 55 60

Ala Leu Val Gln Asp Ala Thr Lys Leu Glu Ala Pro Val Val Ile Val

65 70 75 80

Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Leu Ala Leu Gly

85 90 95

Lys Ala Gly Cys Lys Val Leu Val Asn Tyr Ala Arg Ser Ser Lys Glu

100 105 110

Ala Glu Glu Val Ser Lys Glu Ile Glu Ala Cys Gly Gly Gln Ala Ile

115 120 125

Thr Phe Gly Gly Asp Val Ser Lys Glu Ala Asp Val Asp Ser Met Met

130 135 140

Lys Ala Ala Leu Asp Lys Trp Gly Thr Ile Asp Val Leu Val Asn Asn

145 150 155 160

Ala Gly Ile Thr Arg Asp Thr Leu Leu Met Arg Met Lys Lys Ser Gln

165 170 175

Trp Gln Asp Val Ile Asp Leu Asn Leu Thr Gly Val Phe Leu Cys Thr

180 185 190

Gln Ala Ala Thr Lys Ile Met Met Lys Lys Lys Lys Gly Lys Ile Ile

195 200 205

Asn Ile Ala Ser Val Val Gly Leu Val Gly Asn Ile Gly Gln Ala Asn

210 215 220

Tyr Ser Ala Ala Lys Ala Gly Val Ile Gly Leu Thr Lys Thr Val Ala

225 230 235 240

Arg Glu Tyr Ala Ser Arg Asn Ile Asn Val Asn Ala Ile Ala Pro Gly

245 250 255

Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ala Glu Leu Gly Glu Asp Leu Glu Lys

260 265 270

Lys Ile Leu Ser Thr Ile Pro Leu Gly Arg Tyr Gly Lys Pro Glu Glu

275 280 285

Val Ala Gly Leu Val Glu Phe Leu Ala Leu Asn Pro Ala Ala Asn Tyr

290 295 300

Ile Thr Gly Gln Val Leu Thr Ile Asp Gly Gly Met Val Met

305 310 315

Claims

1.一种水稻蜡质合成相关的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的水稻蜡质合成相关的蛋白质，其特征在于，所述氨基酸序列还包括在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

3.一种编码权利要求1或2所述的水稻蜡质合成相关的蛋白质的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述核苷酸序列还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

5.根据权利要求3所述的基因在改良水稻蜡质含量以及水稻抗生物和非生物胁迫中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，用具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。