CN108440658B - 水稻叶绿体核糖体蛋白编码基因OsWGL2及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻叶绿体核糖体蛋白编码基因OsWGL2编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。本发明还同时公开了编码上述蛋白质的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2所示。本发明还同时公开了上述基因的用途：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的叶片颜色得以改良。本发明可用于解决杂交稻育种过程中杂种剔除和提高光合效率等问题。

Description

水稻叶绿体核糖体蛋白编码基因OsWGL2及其用途

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻OsWGL2基因，以及利用转基因互补实验鉴定该基因的功能；同时还涉及利用该基因编码产物研究对水稻叶绿体发及叶绿体中核糖体发育的影响，可用于解决杂交稻育种过程中杂种剔除和提高光合效率等。

背景技术

核糖体(Ribosomes)是由3-4个大rRNA分子和50-80个小分子蛋白质组成，是蛋白质合成的细胞器，其功能是按照mRNA的指令高效且精确地合成多肽链。在植物细胞内存在三种不同类型的核糖体：细胞质核糖体、线粒体核糖体和质体核糖体。根据内共生起源学说，叶绿体源于进化早期真核细胞内共生的蓝藻。原核生物和叶绿体内的核糖体相似，都是由50S和30S两个亚基组成的。然而，在进化的过程中，叶绿体基因组中的许多编码叶绿体核糖体蛋白的基因转移至细胞核中，其核糖体30S小亚基的21种组成蛋白编码基因中的9个和50S大亚基的31种组成蛋白编码基因中的22个已经转移至细胞核。质体核糖体蛋白(Plastid Ribosme Proteins,PRPs)在叶绿体转录/翻译装置的建立过程中起到重要作用。光合作用为水稻的生长提供了物质来源和能量来源，叶绿体是进行光合作用的重要场所，同时也是光合色素的载体，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。现已证明，叶绿体蛋白由叶绿体基因和核基因共同编码完成，其中有一百多个蛋白是在叶绿体核糖体中合成。因此从分子水平上揭示质体核糖体对于叶绿体的发育及核糖体蛋白的组装互关系，不仅对于阐明光合作用光能转化机理具有重要理论意义，而且在通过提高光合效率，培育高产新品种方面具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻叶色变异相关的蛋白质及其基因，以及由此获得的转基因植物细胞，和利用所述基因对水稻叶片颜色进行改造的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻叶绿体核糖体蛋白编码基因OsWGL2编码的蛋白质，该蛋白质为SEQ ID No：3所示的氨基酸序列。

作为本发明的水稻叶绿体核糖体蛋白编码基因OsWGL2编码的蛋白质的改进，氨基酸序列还包括在SEQ ID No：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本发明还同时提供了一种编码上述蛋白质的基因，该基因具有SEQ ID No：1、SEQID No：2所示的核苷酸序列。

备注说明：SEQ ID NO：1为cDNA全长，SEQ ID NO：2为gDNA全长。

作为本发明的基因的改进：所述核苷酸序列还包括在SEQ ID No：1、2所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物。

本发明还同时提供了含有上述基因的质粒。

本发明还同时提供了含有上述基因的植物表达载体。

本发明还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述基因序列。细胞例如为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。

本发明还同时提供了上述基因的用途，其特征在于：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的叶片颜色得以改良(从而使该转基因水稻提高生长量和光合效率)。

本发明还同时提供了一种改良水稻叶片颜色、影响水稻叶绿体发育、提高光合效率的方法(即，改良水稻叶片颜色、影响水稻叶绿体及其他农艺性状的发育的方法)：包括用具有SEQ ID No：1、2所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。

进一步具体说明：本发明的目的是提供一种从水稻苗期白化后期逐渐复绿突变体(white green leaf 2,wgl2)中克隆的新基因OsWGL2，具有如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的DNA序列，也包括与SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的DNA序列至少有80％同源性的基因序列。本发明中的SEQ ID No：3所示的蛋白质属于质体核糖体蛋白，其中进行一个或几个替换，插入或缺失所获得的功能类似物。另外，也包括在SEQ ID No：1和SEQ ID No：2中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物，具有相同功能的序列也能达到本发明的目的。

本发明的另一个目的是提供一种用OsWGL2基因进行高效的植物转化的方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的序列的基因或基因部分片段的载体，其中，如图4所示的pCAMBIA1300-WGL2，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。

本发明还提供了一种利用植物表达载体转化植物细胞影响水稻叶色的方法。具体地是利用植物表达载体转化植物细胞以影响水稻叶色的方法。

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、水稻苗期白化后期逐渐复绿突变体wgl2的分离和遗传分析：

本发明的水稻苗期白化后期逐渐复绿突变体wgl2来自日本晴EMS(Ethyl MethylSulfonate)诱变产生的突变(图1)。wgl2通过与野生型水稻的反交实验，证明该突变体受隐性单基因控制。

二、图位克隆控制水稻苗期白化后期逐渐复绿性状的OsWGL2基因：

1)、OsWGL2基因的初步定位：

为了分离OsWGL2基因，本发明首先组建了一个定位群体，由wgl2与籼稻品种TN1(Indica)杂交组配成F₂定位群体，再通过图位克隆的方法，利用STS、SSR等分子标记对OsWGL2位点进行初步定位，将其初步定位在第3染色体的短臂端，并介于A3-10和A3-14两标记之间，见图2。

2)、OsWGL2基因的精细定位与预测：

通过对A3-10和A3-14两个标记之间的BAC序列分析，发展新的SSR、STS标记将OsWGL2精确定位于BAC OSJNBb0106M04上C3-3与C3-8标记之间99-kb范围之内(图3)，分析此区段开放阅读框(ORF)推测候选基因，对全定位区间序列测序明确候选基因的突变方式。测序结果表明LOC_Os03g55930的第1个外显子处发生1个碱基的替换突变，由G突变为T，造成氨基酸由甘氨酸突变为缬氨酸(图3)。

3)、OsWGL2基因的鉴定和功能分析：

为了验证候选基因功能，构建了如图4所示的互补载体，通过转基因技术，将互补载体转入到突变体wgl2中，结果表明本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)，证明本发明正确克隆了OsWGL2基因，氨基酸序列分析表明OsWGL2编码质体核糖体蛋白。此外，由于该基因编码蛋白对叶绿体的发育有影响，我们还构建了如图6所示亚细胞定位载体，通过水稻原生质体转化技术证明OsWGL2蛋白在细胞中定位于叶绿体。

本发明利用水稻苗期白化后期逐渐复绿突变体wgl2，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了OsWGL2基因，该基因编码质体核糖体蛋白，在水稻中影响叶绿体的发育；其它植物的同源基因均未被克隆，相关功能也未知。通过对OsWGL2基因的功能解读，不仅丰富了叶绿体发育及光合效率的分子调控机制，对于阐明光合作用光能转化机理也具有重要理论意义。

叶绿体是植物进行光合作用的重要场所，广泛分布在叶片绿色组织细胞中。白化突变典型特征是叶绿体发育异常，大部分白化突变体缺乏叶绿素，光合效率下降，植物白化突变产生机制非常复杂，涉及光合电子传递、核-质基因组互作、质体基因及基因与环境的互作等过程，目前对白化的分子机理研究大多还仅停留在叶绿素代谢的层面，更为复杂的调控模式还不清楚。本发明获得的苗期白化后期逐渐复绿突变体，其相关基因编码蛋白主要是通过改变叶绿体相关基因的表达及叶绿体中核糖体的组装，进而对叶绿体的发育产生影响。通过图位克隆技术本发明首次在水稻中克隆了相关基因OsWGL2，该基因编码质体核糖体蛋白，可能参与叶绿体基因编码蛋白的合成，影响水稻叶绿体的发育。通过对OsWGL2基因的功能解读，将为深入研究叶绿体发育机制，阐明植物光合系统作用的分子机理，进而为水稻高光合育种奠定基础。

综上所述，本发明利用水稻苗期白化后期逐渐复绿突变体wgl2，通过图位克隆技术首次在水稻中克隆到了OsWGL2基因，该基因编码质体核糖体蛋白，在水稻中影响叶绿体的发育，改变叶绿体内部结构。通过对OsWGL2基因的功能解读，进一步明确了OsWGL2对水稻叶绿体发育及光合效率的影响，同时为深入揭示光合作用光能转化机理奠定基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为水稻苗期白化后期逐渐复绿突变体wgl2与野生型苗期、分蘖期及成熟期表型；

A为苗期野生型和突变体表型；

B为分蘖期野生型和突变体表型；

C为成熟期野生型和突变体表型。

图2为OsWGL2基因在水稻第3染色体上的初步定位图。

图3为OsWGL2基因的精细定位及突变位点示意图；

(A)为OsWGL2基因的精细定位图；

(B)为OsWGL2基因定位区间候选基因分析及突变位点分析图；

(C)为OsWGL2基因在野生型和突变体中基因组及蛋白水平突变位点序列分析图。

图4为互补载体pCAMBIA1300-WGL2图谱。

图5为功能互补实验T1转基因水稻植株表型，从左至右分别为野生型，突变体及转化互补载体的突变体转基因株。

图6为OsWGL2亚细胞定位载体的构建及原生质体转化结果；

(A)为OsWGL2::GFP融合载体图；

(B)为OsWGL2在细胞中的亚细胞定位图；Brightfield为明场观察结果；GFP为绿色荧光观察结果；Chlorophyll为叶绿体自发荧光观察；Merged为绿色荧光与叶绿体自发荧光合并后的观察结果。

图7为突变体wgl2与对照日本晴色素含量。

图8为透射电镜分析突变体wgl2与对照日本晴叶绿体形态的变化。

具体实施方式

实施例1：

1、水稻材料：

水稻(Oryza sativa L.)突变体wgl2，原始野生材料为粳稻品种“日本晴(NPB)”。

水稻苗期白化后期逐渐复绿突变体wgl2来自日本晴EMS诱变产生的突变(如图1所示)，该突变体是在中国浙江省境内获得。与对照品种农艺性状比较如下：

**代表突变体与野生型间存在极显著差异，P<0.01。

该诱变方法具体为：用1.5％EMS浸泡水稻种子8h，清水冲洗后正常发芽；在M1代选择苗期白化后期逐渐复绿表型的突变体wgl2，经多代稳定遗传后用于群体构建和基因定位。

在wgl2突变的M2代群体中随机选择52个单株进行遗传分析，41株为野生型表型，11株为突变型表型，卡平方检测结果(χ2＝0.36<χ² 0.05＝3.84)，分离比符合3：1，说明该突变表型可能由单隐性核基因控制。以wgl2为母本，籼稻品种TN1为父本杂交，所得的F₁代植株全部表现为正常表型，F₂代种子播种四周后，随机选260个单株其中202株表现为野生型表型，58株表现为突变型表型。卡平方检测结果(χ2＝0.99<χ² 0.05＝3.84)，正常植株表型和突变体植株表型分离比符合3：1；进一步证明该突变表型受隐性单隐性核基因控制。

2、分析和定位群体：

纯合的wgl2突变体和野生型品种籼稻品种TN1进行杂交，F₁代自交，得到F₂群体。并从中选出1500株wgl2突变个体作为定位群体。在三叶期每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA。

3、SSR和STS标记定位OsWGL2基因

采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。取大约0.2g水稻叶片，经液氮冷冻，在直径5cm的小研钵中磨成粉状，转移到1.5ml离心管里提取DNA，获得的DNA沉淀溶解于150μl超纯水中。每一个PCR反应用2μl DNA样品。

OsWGL2基因的初步定位：在wgl2与TN1组合的F₂群体中选取21个隐性个体，根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，经5％琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙啶(EB)染色，检测PCR产物的多态性，将OsWGL2初步定位在第3号染色体短臂端A3-10和A3-14两STS标记之间(如图2所示)。

备注说明：上述21个隐性个体是包含在1500株突变体中的，本发明先用21株做初定位，然后放大群体至1500用于精细定位和基因克隆。

OsWGL2基因的精细定位：选取wgl2与TN1组合的F₂群体中共1500株隐性个体，在初定位的基础上进一步设计SSR和STS标记，最终将OsWGL2精确定位于精确定位于BAC号为OSJNBb0106M04上99-kb范围之内(图3A)，两边的分子标记为C3-3与C3-8引物序列为：

C3-3：F：GTTAAAATTTCCCCCCGTA，R：TCTCCACCGTCCGATCTC；

C3-8：F：TCAGAGAACAGCAAATCGGT，R：CCAGGGAGGAGAAGAATCAT；

备注：引物序列见表1。

表1、OsWGL2基因的定位标记序列

4、基因预测和比较分析：

根据精细定位的结果，在99-kb范围内根据Rice Automated Annotation System(http://RiceGAAS.dna.affrc.go.jp)的预测，发现在此区间内共有17个候选基因(图3B)。参考定位区间两测重组个数的多少，设计了各基因的测序引物，采用PCR方法分别从wgl2和野生型品种基因组中扩增出候选基因进行测序分析。发现wgl2突变体在LOC_Os03g55930的第1个外显子处发生1个碱基的替换突变，由G突变为T，造成氨基酸由甘氨酸突变为缬氨酸(图3C)。用不同的突变单株及群体中突变表型的单株，各重复验证三次，突变位点稳定存在(测序引物序列见表2)。根据BAC克隆OSJNBb0106M044序列的基因注释信息，预测此基因编码ribosomal protein,putative,expressed，该基因命名为OsWGL2，该基因全长1875bp，包含2个外显子和1个内含子，水稻中的OsWGL2基因与玉米蛋白的基因有80％的同源率。

该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表的SEQ ID No：3所示。

该基因的cDNA如SEQ ID NO：1所示，gDNA如SEQ ID NO：2所示。

表2、OSWGL2基因的测序引物序列

实施例2：

植物转化：

以粳稻品种“日本晴”基因组为模板，根据目的基因设计引物：

F-5’-gctcggtacccggggatcc GCCGCCATGTGTTCGCTC-3’

R-5’-aggtcgactctagaggatcc ATAAAAAATACTCCTACTCTGCATTCAGA-3’。

PCR扩增体系为：50μL的PCR反应体系：模板DNA 2μL；2×PCR buffer 25μL；2mmoldNTP(罗氏)10μL；KODFX(TOYOBO)酶1μL；10μM PrimerF 3μL；10μM PrimerR 3μL；ddH₂O 6μL；PCR扩增条件为：94℃预变性2min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸8min；共35个循环；68℃下延伸10min，15℃保温。

备注说明：以粳稻品种“日本晴”基因组为模板。

PCR扩增后进行电泳分离，回收得到约3935bp的DNA片段，用BamHI酶切pCAMBIA1300(p1300)后进行同源重组，获得了互补载体pCAMBIA1300-WGL2，该克隆覆盖了整个ORF的基因组区域(即包含了SEQ ID No：2所示的核苷酸序列)，还包括ATG上游2122-bp启动子序列和TGA下游281-bp终止子序列(如图4所示)。

这个质粒通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系EHA105中转化水稻。我们利用突变体成熟种子诱导愈伤组织，经过诱导培养基培养3周后，挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有双元质粒载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有300mg/L潮霉素的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有250mg/L潮霉素预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察发现，与同时期的突变体比较，转基因植株叶色恢复为正常绿色。

通过上述转基因技术，结果表明：本发明获得了使突变体恢复正常表型的转基因水稻(图5)。

说明：上文中所涉及的各种培养基的配方可参考Toki S.,Hara N.,Ono K.,Onodera H.,Tagiri A.,Oka S.,Tanaka H.(2006)Early infection of scutellumtissue with Agrobacterium allows high‐speed transformation of rice.The PlantJournal 47:969-976。

实施例3、

水稻原生质体的转化及OsWGL2绿色荧光融合蛋白的定位观察：

步骤一、OsWGL2绿色荧光融合载体的构建

1、目的片段的扩增

日本晴总RNA反转录的cDNA为扩增模板1μL，2×Kod FX DNA聚合酶buffer 25μL；2mM dNTP 8μL；Kod FX DNA聚合酶(Toyobo)1μL；10mM WGL2-GFPF(caagacccttcctctaATGGCGCTCTCCCTCACCAC)3μL；10mM WGL2-GFPR(agcttgccgtaggtgACGCTTTGAGAACTGCGGGC)3μL；无菌水9μL；最终体系50μL；混匀后，在PCR仪运行如下程序：

98℃10min；

98℃30s；60℃30s；72℃2min；35个循环；

72℃10min；4℃保存。1％琼脂糖胶分离后回收700bp的目的片段。

2、目的载体酶切

目的载体pCAMBIA1301-S65T用SalI(Takara)单酶切，酶切体系如下：10×Hbuffer 5μL；pCAMBIA1301-S65T载体10μL；SalI 2μL；无菌水33μL；最终体系50μL；37℃酶切2小时。1％琼脂糖胶分离，回收酶切产物。

3、OsWGL2绿色荧光融合载体构建

将上述步骤1回收的片段通过同源重组的方式，连入上述步骤2回收的目的载体，重组体系如下：PCR产物8μL；酶切回收的pCAMBIA1301-S65T载体2μL；5×CE II Buffer 4μL；

II 2μL；无菌水4μL；最终体系20μL；37℃连接1小时后。除目的片段及表达载体pCAMBIA1301-S65T外，其他试剂均购自南京诺唯赞公司(ClonExpress-II One StepCloning Kit)。

连接产物10μL加入到刚解冻的50μL DH5α感受态细胞中，轻微混匀，冰浴30分钟，42℃热激45秒，冰上静置2分钟，然后加入500μL无抗LB，置于37℃恒温摇床中，170转/min，复苏一小时后涂卡那抗性(Kan)的平板。挑5个白色菌落，用WGL2-GFPF/R为引物，菌落PCR鉴定阳性克隆，PCR产物大小700bp，选2个阳性克隆摇菌送测序，测序引物为s65t-1F：GAGGACAGGCTTCTTGAG和s65tR：GGTGGTGCAGATGAACTT，获得OsWGL2绿色荧光融合表达载体pCAMBIA1301-S65T WGL2(图6A)。pCAMBIA1301-S65T载体原始出处为：

Ren D,Li Y,Zhao F,Sang X,Shi J,Wang N,Guo S,Ling Y,Zhang C,Yang Z,HeG.MULTI-FLORET SPIKELET1,which encodes an AP2/ERF protein,determines spikeletmeristem fate and sterile lemma identity in rice.Plant Physiol.2013；162(2):872-884。

步骤二、水稻原生质体提取及载体转化：

(1)生长15天左右的水稻NIP幼苗用锋利的刀片在塑料培养皿板上切碎幼苗茎叶，移到200ml洗净的锥形瓶中(一般20ml酶解液每次60株左右；预先将酶解液倒入瓶中，根据瓶底大小合理分配酶解液)，每瓶不宜装太多。放入28℃摇床，60-80rpm，4-6小时。

(2)在酶解时间完成之前，配置PEG4000 40％溶液，置于65℃水浴锅中或室温溶解，65℃溶解，中间取出来振荡一次。

(3)酶解完成后，先向酶解完成的瓶中加入约15ml左右的W5。用300目(或400目)的钢制滤网将碎叶片过滤掉，用干净的塑料培养皿收集酶解后的原生质体。然后将原生质体缓慢倒入(或用去枪尖的枪头吸取)50ml离心管中，天平称重平衡后，放入水平离心机，150g，5min，充分收集原生质体，离心完成后，缓慢吸走上清。

(4)向原生质体沉淀中加入1ml W5溶液，缓慢轻轻倾斜混匀重悬，然后用去枪尖的枪头吸移到2ml离心管中。此时50ml离心管中可能还有少量未重悬的原生质体，可再加入1ml W5溶解，吸移到之前的2ml离心管中，150g，3min，移除上清液。

(5)用MMG重悬，具体加多少根据原生质体的量和要转的质粒个数来定，一般最后每个质粒中加入100ul稀释的原生质体。或者用显微镜稍微观察下产量和酶解后完整个体的数目比例，然后根据原生质体的状态来确定MMG用量。

(6)准备转化用质粒(pCAMBIA1301-S65T、pCAMBIA1301-S65T WGL2)10-15ug左右或10ul，于2ml离心管中。

(7)加入100ul的重悬好的原生质体，然后加入PEG 40％110ul，混匀。

(8)28度避光静置15min。

(9)加入足量的W5稀释，混匀，然后离心150g，3min，缓慢移除上清，再用W5洗一次(中间会有损失，但不影响结果)。最后得到的沉淀，用W5重悬(用2ml的管子装满)，轻轻混匀，移到细胞培养板中。用锡箔纸包裹，避光28度静置培养，14小时。

(10)培养时间完成后，将培养板各孔中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸移到2ml管中，然后离心150g，3min，去除上清，保留100ul左右上清液，重悬原生质体。

(11)共聚焦显微镜观察拍照。

结果显示阳性对照在细胞各个部位均有表达，说明实验的表达系统工作正常，OsWGL2GFP融合蛋白特异的在叶绿体中表达，其他部位未见表达，说明OsWGL2是定位于叶绿体中的蛋白(图6B)。

说明：上文中所涉及的各种溶液的配方可参考Zhang et al.A highly efficientrice green tissue protoplast system for transient gene expression andstudying light chloroplast-related processes.Plant Methods 2011,7:30。

实施例4、

光合色素含量测定：

我们在大田取样来测定苗期叶绿素及类胡萝卜素含量。分别取突变体和NPB叶片去掉主脉，剪成1cm左右的片段，称取0.2g浸泡于10ml 80％丙酮，26℃条件下暗培养48小时。取溶液在紫外分光光度计(DU800,BECKMAN COULTER)663nm、645nm和470nm三种波长下测定叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的光密度值。3次重复，然后根据Amon(1949)的方法计算出各检测叶片中的叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)的含量,按照Wellburn(1994)计算类胡萝卜素(Car)的含量，计算公式如下：

Chl a＝(12.7×OD₆₆₃－2.69×OD₆₄₅)×V/W

Chl b＝(22.9×OD₆₄₅－4.68×OD₆₆₃)×V/W

Car＝(1000×OD₄₇₀×V/W－3.27×Chl a－104×Chl b)/198

其中：V为提取液体积(10ml)，W为叶片质量0.2g，OD₆₆₃、OD₆₄₅及OD₄₇₀为在分光光度仪上读取的光密度值，单位：mg/g。

用德国WALS公司产的GFS-3000型光合测定仪测定抽穗期突变体与野生型剑叶净光合速率，每个单株测一个主分蘖，20次重复计算平均值，净光合速率单位umol.m^-2.s^-1。

结果显示，与野生型相比，突变体中苗期叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的含量极少，几乎检测不到，并且Chl a/b的比值也明显减少(图7)。由此推断，突变体的表型变化是由于叶绿素和类胡萝卜素缺失引起。

实施例5、

叶绿体透射电镜的制备和观察：

(1)样品：取突变体苗期叶片和对照野生型苗期叶片，切成0.5～1mm3左右的小块；

(2)固定：将切好的样品块放入2ml离心管中，加入2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.2)，在抽真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉。0.1M磷酸漂洗三次，每15min一次，然后加入1％锇酸固定2～3小时，直至样品变黑；

(3)脱水：先用50％、70％、和90％的乙醇溶液依次脱水，每个浓度处理20分钟，再用乙醇和丙酮(1：1)溶液处理20分钟，以上均在4度冰箱内进行，最后将样品用纯丙酮室温处理20分钟；

(4)渗透：将样品在无水丙酮和包埋剂(3：1)混合液中作用4小时，再在无水丙酮和包埋剂(1：1)混合液处理3小时，最后在纯的包埋剂中作用12小时；

(5)包埋：将上述步骤中的样品挑的包埋盒内，37℃过夜，45℃处理12小时最后60℃处理24小时，获得包埋样品；

(6)切片、拍照：将包埋样品用超薄切片机切成60-70nm左右的超薄片，然后将切片用柠檬酸铅溶液染色10分钟，再有醋酸铀溶液染色30分钟，双蒸水清洗三次后晾干，用Hitachi H-7650型透射电镜观察并且选择清晰地倍数拍照。

结果显示野生型叶片的叶肉细胞中叶绿体数目较多，叶绿体结构完整，叶绿体中基粒片层层次丰富，排列紧密。相比野生型，突变体中几乎不含完整结构的叶绿体，叶绿体中观察不到基粒片层，几乎全部都被椭圆形的囊泡所替代。(图8)。观察结果表明基因突变造成了突变体中叶绿体结构发育缺陷。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 水稻叶绿体核糖体蛋白编码基因OsWGL2及其用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 672

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggcgctct ccctcaccac cgccttctcc cacctctccc tcccctccac ctccaagttc 60

cacccgctcc ccctcctcca cctccgcttc ccctcctcct cctcctcccg ccgcgccgcg 120

cgcctcgcgc tcgccgcctc cgccgccgag gccgccgagc ctgtcgaggt ggaggaggcg 180

cccgccgagg acggggcgga tgaggtggtg gccgtggagg acgagctgtc cggaccggcg 240

ctgcgaaagt acgtgaagca gcggcttccc gggggcttcg cggcgcagcg gatcaccgcc 300

acgggccgcc gcaagacggc catcgcccgc gtcgtgctcc aggagggcac cggaagggtg 360

ttcatcaact tccgcgatgc caaggagtat ttgcaaggaa atccaatgtg gatggagtac 420

tgcaaggtac ccctggtgac cctagggttc gagaacagct acgacgtctt cgtcaaagtt 480

cacgggggtg gtctctcggg ccaagcccag gccatttgcc tcggcgtcgc ccgtgcactg 540

gtgaagatca gcaccgcaaa caaagttact ctgaggggag aaggtttgct gacaagagac 600

acccgtatag ttgaaaggaa gaaggctggt cttaagaagg cacgcaagcg cccgcagttc 660

tcaaagcgtt ag 672

<210> 2

<211> 1875

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atccctctcc catcgccgcg gcggcctatc catctctctc ccccgcacac gctctccctc 60

ccatggcgct ctccctcacc accgccttct cccacctctc cctcccctcc acctccaagt 120

tccacccgct ccccctcctc cacctccgct tcccctcctc ctcctcctcc cgccgcgccg 180

cgcgcctcgc gctcgccgcc tccgccgccg aggccgccga gcctgtcgag gtggaggagg 240

cgcccgccga ggacggggcg gatgaggtgg tggccgtgga ggacgagctg tccggaccgg 300

cgctgcgaaa gtacgtgaag cagcggcttc ccgggggctt cgcggcgcag cggatcaccg 360

ccacgggccg ccgcaagacg gccatcgccc gcgtcgtgct ccaggagggc accggaaggg 420

tgttcatcaa cttccgcgat gccaaggtgt gtgcccgtgc cctgcgcgct tactttccga 480

ttcgactcga gaaatgcgcg cttgctaatc tcgtaaaacc atcgcagcgg cattatcttg 540

ggctcgggga tgtagcctgt aggctctaat ttcatcctgc gtttggttga atgcacaatt 600

tatgcttcag aaatcgggta ttggatgcaa tgcaccaaaa ggagtaaaac ttcaccatag 660

agtaaaatgg agacttcaac taacaaaagt agacattgat gtttagcttt acacatgctt 720

gagggagatt gtggaaactg cttgttttgt cacacagatg atgtatcagg aaacttcaat 780

ataacagtga acataaagtt tagttttgcg tacttgatgg aggttgtgca aacttcttgt 840

tctgttactc agatgattaa tctagtcttg cactcttgca tgcttaggat gctctcaggg 900

tatgccttga ttggcaccat ttgcttcagt gcttcacatt gtcgaaaata acgaatactg 960

gttgtccact ccacatagag gttttaacga tgataatgca tatagtgtct ttgatcattt 1020

tatcgaggat taaactattc gatgatgcag atatattaac tacagtcaaa attgaatatt 1080

ctattaaaat aattagtctc ctaaactaca cctaacattg atattgatca aattacggtt 1140

ttgggcataa gttttaaatt attgtgaact atctataaat tgtggtcaca tagaccaaaa 1200

cactagcttt caagtttaca ctaatggcct ggaattggtg taatggtgtg cacaagcata 1260

caatatcttt tgtgaatctc tctgctcaaa cattaaaaat ccgcaggagt atttgcaagg 1320

aaatccaatg tggatggagt actgcaaggt acccctggtg accctagggt tcgagaacag 1380

ctacgacgtc ttcgtcaaag ttcacggggg tggtctctcg ggccaagccc aggccatttg 1440

cctcggcgtc gcccgtgcac tggtgaagat cagcaccgca aacaaagtta ctctgagggg 1500

agaaggtttg ctgacaagag acacccgtat agttgaaagg aagaaggctg gtcttaagaa 1560

ggcacgcaag cgcccgcagt tctcaaagcg ttagagtatg cacaaccttg ttgttagact 1620

catttaaaag ttttacattc cacagtttgt attggccctt ctctgttatt ttctgtgcaa 1680

attatgtgct cctcaccaca gacttgtaat cttcgttctc tgtaagcaat tttattgagg 1740

tcacaaaagg caattatctt gaaatcattc ctgatatctg atgagaacag ctgctcaact 1800

ttacatcctc atatagtcac ataagacaat tataaaggtc ttgaattctg aatgcagagt 1860

aggagtattt tttat 1875

<210> 3

<211> 223

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Ala Leu Ser Leu Thr Thr Ala Phe Ser His Leu Ser Leu Pro Ser

1 5 10 15

Thr Ser Lys Phe His Pro Leu Pro Leu Leu His Leu Arg Phe Pro Ser

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Arg Arg Ala Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala Ser Ala

35 40 45

Ala Glu Ala Ala Glu Pro Val Glu Val Glu Glu Ala Pro Ala Glu Asp

50 55 60

Gly Ala Asp Glu Val Val Ala Val Glu Asp Glu Leu Ser Gly Pro Ala

65 70 75 80

Leu Arg Lys Tyr Val Lys Gln Arg Leu Pro Gly Gly Phe Ala Ala Gln

85 90 95

Arg Ile Thr Ala Thr Gly Arg Arg Lys Thr Ala Ile Ala Arg Val Val

100 105 110

Leu Gln Glu Gly Thr Gly Arg Val Phe Ile Asn Phe Arg Asp Ala Lys

115 120 125

Glu Tyr Leu Gln Gly Asn Pro Met Trp Met Glu Tyr Cys Lys Val Pro

130 135 140

Leu Val Thr Leu Gly Phe Glu Asn Ser Tyr Asp Val Phe Val Lys Val

145 150 155 160

His Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gln Ala Gln Ala Ile Cys Leu Gly Val

165 170 175

Ala Arg Ala Leu Val Lys Ile Ser Thr Ala Asn Lys Val Thr Leu Arg

180 185 190

Gly Glu Gly Leu Leu Thr Arg Asp Thr Arg Ile Val Glu Arg Lys Lys

195 200 205

Ala Gly Leu Lys Lys Ala Arg Lys Arg Pro Gln Phe Ser Lys Arg

210 215 220

Claims (2)

1.水稻叶绿体核糖体蛋白编码基因OsWGL2的用途，其特征在于：用于构建转基因水稻，所述转基因水稻的叶片颜色得以改良；

该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2所示；

水稻叶绿体核糖体蛋白编码基因OsWGL2编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。

2.一种改良水稻叶片颜色、影响水稻叶绿体发育、提高光合效率的方法，其特征在于：包括用如SEQ ID No：1、2所示的核苷酸序列的基因转化水稻细胞，再将转化后的水稻细胞培育成植株。

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