CN117737078A

CN117737078A - MADS-box基因RhAGL6及其在调节月季花器官发育中的应用

Info

Publication number: CN117737078A
Application number: CN202311657687.1A
Authority: CN
Inventors: 景维坤; 马男; 张颢; 周晓锋; 晏慧君; 王潇雨; 李永红; 王其刚; 邱显钦; 蹇洪英; 王丹
Original assignee: Flower Research Institute of YAAS
Current assignee: Flower Research Institute of YAAS
Priority date: 2023-08-24
Filing date: 2023-12-05
Publication date: 2024-03-22

Abstract

本发明涉及MADS‑box基因RhAGL6于调节月季花器官发育中的应用。本申请以低温敏感的月季品种‘蜜桃雪山’(Rosa hybrida cv.Peach Avalanche)为材料，进行全基因组DNA甲基化测序和转录组测序，并通过多组学联合分析筛选到一个MADS‑box关键基因RhAGL6；通过DNA甲基化测序分析，发现低温诱导了RhAGL6启动子的高度甲基化；同时，本申请还发现低温条件下RhAGL6启动子的组蛋白H3K27me3的修饰水平升高，由此表明，低温诱导RhAGL6启动子高度甲基化和组蛋白H3K27me3的水平升高，从而抑制了RhAGL6的转录。本申请利用基因瞬时沉默技术对RhAGL6进行基因沉默，导致月季花托发育畸形，与低温引起的月季花托畸形相似。因此，本申请明确了低温通过介导RhAGL6的表达来调控月季花托发育的分子机制。

Description

MADS-box基因RhAGL6及其在调节月季花器官发育中的应用

技术领域

本发明涉及分子育种技术领域，尤其涉及低温介导MADS-box基因RhAGL6调节月季花器官的发育。

背景技术

月季(Rosa hybrida)是蔷薇科蔷薇属多年生木本花卉，具有极高的经济价值和观赏价值，广泛应用于鲜切花、盆花、园林绿化及庭院美化等方面。据统计，2020年我国切花月季的种植面积、销售量和销售额均占全国切花总量的三分之一左右，为我国第一大切花。

花形、花色和花香等方面是判断月季切花品质的主要因素，其中花形是基本要素。高品质的切花要求具备品种的典型花朵形状及特征，并且花朵饱满，形状优美，无机械损伤以及病虫害等，而花瓣的排列方式和花器官数量等因素决定了花形。

MADS-box基因家族是一个参与花器官发育的基因家族。

Coen等人提出的花器官发育的‘ABC’模型假说是目前花器官发育中最经典的模型假说。在此模型中，花器官的发育由A型、B型、C型三类基因调控。在花器官发育的早期，这些基因特异地在花原基不同的区域表达，使花原基从外到内形成四轮对应不同花器官的分化组织原基。花发育模型中，A、B、C、D、E五大类基因具有共同保守区域，是拥有不同功能的同源异型基因。这些基因在不同植物中陆续被发现并克隆，且基本功能都是参与植物花器官发育的调控，因此把这些基因命名为MADS-box基因家族。

A类基因在外围的第一、二区域内表达，并抑制C型基因在这两个区域内表达；B型基因在第二、三区域内表达；C型基因在第三、四区域内表达，并抑制A型基因在这两个区域内表达。A、B两类基因可以相互重叠，B、C两类基因可相互重叠，A、C两类基因则相互拮抗。通过三类基因的作用，第一区域发育为萼片，第二区发育为花瓣，第三区域发育为雌蕊，第四区域发育为雄蕊。后随着更加深入的探索，研究者发现了和C类基因部分功能重叠的D类基因以及具有激活A、B、C类基因功能的E类基因。

B类和C类基因是使花朵出现重瓣化表型的重要基因类别，该类基因的突变或者过表达都可能导致重瓣花的形成。例如：AG基因是调控雄蕊和雌蕊发育的转录调控因子，是拟南芥中最早克隆出的、唯一具有C类基因功能的基因。目前已有研究证明，拟南芥AG基因的强突变体ag-1/2/3的花器官出现只有萼片和花瓣、雌蕊雄蕊不正常发育的情况。B类基因在花器官的第二、三轮表达，控制花瓣和雄蕊的分化。在拟南芥中，B类基因由AP3和PI代表，它们在花发育的第三、第四区域表达，控制花瓣和雄蕊的发育。B类基因突变体在第二轮中发育萼片而不是花瓣，在第三轮中发育为雌蕊而不是雄蕊。当B类基因在四轮区域内全部过表达时，花器官在每一轮的发育顺序为花瓣、花瓣、雄蕊、雄蕊。AP3参与了花瓣原基和雄蕊原基的形成，在花发育过程中，AP3在这两部分的表达保持不变。

此外，除了典型的B类、C类基因，MADS-box基因家族的其他基因在花发育过程中也起重要作用。E类基因在花器官的正常发育中也起到重要作用。在拟南芥中，典型的E类基因为SEP1、SEP2、SEP3，这三个基因的三突变体在B、C类基因表达量没有变化的情况下，会使花器官出现每轮均只有萼片的现象。在矮牵牛、水稻和玉米上，通过相关研究发现了参与花发育的E类功能基因AGL6，AGL6参与花分生组织的调控，与花器官、胚珠(珠被)和种子的发育相关，在雌雄生殖系和配子体发育中都可能发挥作用。AGL8在拟南芥中受到AP1的负调控，在茎和茎叶的花序发育过程中和花发育的后期表达(仅限于第四轮器官原基出现的区域)过程中，可能在维持花原基顶端分生能力的不定性方面发挥作用。AGL2又命名为SEP1，发挥E类基因的功能，是花发育的重要调控因子。花分生组织的早期发育、四个花器官的初步建立和形态分化的持续发育以及胚珠、种子和胚胎的发育都需要AGL2，其基因产物作为转录因子发挥作用，可能与其他花或种子特异性调节蛋白相关。在非洲菊中，AGL2同源基因GRCD1的表达下调会使C类基因表达量下调，改变第三轮花器官的分化。AGL1是一个心皮特异的基因，在所有心皮内的特定区域表达，其表达产物是一种转录因子，与其他MADS结构域蛋白形成异二聚体，调控雌蕊和胚珠的生长发育。

“四聚体模型”解释A、B、C、D、E类基因之间的相互作用。控制花器官特异性发育的不同基因通过在不同的区域内表达并相互作用，使其蛋白质产物在不同的区域内形成不同的蛋白质四聚体，以复合物的形式控制花器官的特异性分化，这也是植物花朵正常发育的必要条件。

温度会通过影响花器官的发育来影响花芽发育的进程，从而造成花朵畸形，其也是影响花器官发育的重要条件。花芽分化由外向内划分为5个时期，依次为萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化及分化完成期。已有研究表明，低温条件会导致月季花芽分化的整个持续时间延长，雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期的时间也比适宜温度下的分化时间长。低温条件下月季花芽的花瓣原基数量较正常温度下的月季花芽花瓣原基数量更多，花芽体积更大，并且在一定的低温范围内，温度越低，花瓣数量越多，月季重瓣现象更明显。

在其他观赏植物中，目前也有研究说明低温会导致花器官数量的增加。例如：当温度低于13℃时，石竹科的红粉雪轮花会出现雄蕊数量减少，花瓣数量增多的现象；紫罗兰的花发育期间，在不影响植株正常生长的情况下，若给予适度的低温条件，会形成台阁花，具体表现为花的中心生长出萼片和花瓣；而与此相反，若对重瓣的香雪兰在花发育期间给予适当高温，往往会使重瓣花变为单瓣花。

花器官是从叶状结构中分化而来的，由叶片向花器官的转变是由花同源异型蛋白介导的。在拟南芥中，花同源蛋白参与抑制拟南芥生殖花器官上分枝毛的形成，分枝毛是叶发育的标志，而AG调节细胞分裂素反应，并与器官极性基因KANADI1相互作用，抑制雌蕊腺毛的形成。在凤仙花的花器官发育过程中，去叶处理会导致花瓣数量增加，其原因可能是由于叶起源信号数量被限制，A、B、C类基因表达时间延长，B、C类基因表达时间延迟造成。

除了以上遗传因素的调控外，DNA甲基化和组蛋白修饰也参与调控了花器官的发育。水稻中，OsFDML1(DNA METHYLATION LIKE 1)参与RNA介导的DNA甲基化调控花发育，OsMADS6(AGAMOUS-LIKE6(AGL6)-like)通过直接结合OsFDML1启动子的CArG元件，进而激活OsFDML1的表达，最终影响了水稻小穗的发育。osfdml和osmads6突变体都会引起花器官缺陷。同时，AG表达也受表观遗传修饰的调节。拟南芥中，组蛋白甲基转移酶ArabidopsisHomolog of Trithorax(ATX1)基因功能缺失可以引起AG位点H3K4me3修饰的减少，导致AG基因的错误表达以及花器官发育异常。LFY能招募SWI/SNF染色质重塑因子SPLAYED(SYD)和BRAHMA(BRM)到AG的第二个内含子上，去除H3K27me3修饰，并激活AG的表达。H3K27甲基转移酶CURLY LEAF(CLF)能够形成CLF-PRC2复合体并抑制营养器官中AG的表达。此外，低温诱导月季品种‘芬得拉’的AG基因(RhAG)启动子的DNA甲基化水平升高，促进雄蕊发生瓣化，进而导致花瓣数量增多而引起花朵畸形。

此外，MADS-box基因FLOWERING LOCUS C(FLC)是被广泛报导的受表观调控的基因。在拟南芥的春化过程中，低温促使FLC的组蛋白H3K27me3修饰水平升高，从而表达量下降，进一步导致FLOWERING LOCUS T(FT)表达量升高，最终促进了花芽分化。H3K27me3修饰通过抑制MADS-box(DAM)基因DAM1和DAM3的表达从而调控了芽的休眠。在梨中，与休眠相关的组蛋白修饰和信号级联通过调控MADS-box基因的表达进而调控了芽的自然休眠。以上研究表明，表观遗传可通过介导MADS-box基因的表达来参与调控植物花器官发育。

月季作为切花使用时，其价值以及需求量受时期及节假日变化的影响很大。在周年生产中，以冬季情人节的市场价值最大，需求量最高。云南作为我国最大最重要的切花月季生产地，在周年栽培生产中，冬季的低温常导致月季发育畸形，尤其在雪山系列中畸形尤为严重，当夜温低于10℃时，就可能出现畸形，影响其经济价值。

这也可以看出，月季育种过程中，抗逆能力之一耐寒是使全年培育月季的目的达到的关键性因素。

目前已有研究报道，低温会通过影响花瓣和雄蕊等花器官的发育影响花芽分化的进程，并导致花朵畸形，是影响植物成花的重要要素。1971年，Moe研究认为，月季花芽分化早期是对温度的敏感时期，低温可能会导致月季花发育畸形，引起部分月季品种的花瓣数增加。因此，揭示低温影响月季花发育的分子机理成为亟待解决的问题。

冬季低温导致切花月季花朵畸形，严重降低了切花品质和经济价值，是我国月季切花生产中亟待解决的重要产业问题。

此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本发明时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本发明不具备这些现有技术的特征，相反本发明已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在背景技术中增加相关现有技术之权利。

发明内容

本申请以雪山系列中的‘蜜桃雪山’品种为试验材料展开研究，发现畸形花常表现为花蕾膨大，雌雄蕊数量变多，雄蕊瓣化，雌蕊萼片化，子房明显突出，不能正常开放，且在冬季的畸形率高达60％以上，极大影响了其经济价值，损害花农的利益。

本发明涉及月季MADS-box基因RhAGL6，其中，RhAGL6的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明涉及一种调控月季花托形态和雄蕊数量的基因序列。基因序列包含以下核苷酸序列中的一种或多种：

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过一个或几个核苷酸的取代、缺失、或添加衍生产生的核苷酸序列；

与SEQ ID NO.1具有至少80％同源性的核苷酸序列。

本发明涉及RhAGL6在用于构建表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌中的应用。

本发明涉及RhAGL6于月季育种中的应用。

本发明涉及RhAGL6于构建转基因月季中的应用。

根据实施例1中所涉及的相关试验，可知RhAGL6在常温下生长的月季中表达量较高，而在低温诱导下生成的畸形月季中表达量显著下降。通过对常温和低温处理条件下的月季表型的分析，发现月季畸形主要体现在月季花器官发育畸形。因此，本发明提供MADS-box基因RhAGL6于调节月季花器官发育中的应用。

与常温条件下的正常花相比，低温导致月季花更加扁平且畸形。将所有花瓣去除后，发现常温下月季的花托顶部与花梗顶部齐平，但低温下月季花托明显发生‘上位现象’，明显超出花梗顶部，雄蕊群着生在畸形花托顶部。低温下月季的雌雄蕊数量明显多于常温下的雌雄蕊数量。

根据实施例1中所涉及的相关试验，可知低温诱导下的RhAGL6表达量异常的月季花托畸形。因此，本发明另一方面提供MADS-box基因RhAGL6于调节月季花托发育中的应用。

根据实施例1中所涉及的相关试验，可知低温诱导下的RhAGL6表达量异常的月季花序或花朵发育异常。因此，本发明另一方面提供MADS-box基因RhAGL6于调节月季花芽分化中的应用。发育成花和花序的芽即花芽。

本发明另一方面提供MADS-box基因RhAGL6启动子于调节月季花器官发育中的应用。优选地，MADS-box基因RhAGL6启动子的扩增引物为：

proRhAGL6-pGUS-F：

5’-TGTTGGGCCCGGCGCGCCAAGCTTCTCTGTCACATTATCTCAATTTGCAA-3’，

proRhAGL6-pGUS-R：

5’-GTGGACTCCTCTTAGAATTCATCAATAACAATACTGACCGCTTTTCC-3’。

根据一种优选实施方式，调节月季花器官发育是通过调控RhAGL6启动子的DNA甲基化水平实现的。调控RhAGL6启动子的DNA甲基化水平以提高月季花器官中RhAGL6的表达量。

根据一种优选实施方式，调节月季花托发育是通过调控RhAGL6启动子的DNA甲基化水平的方式以提高月季花托中RhAGL6的表达量实现的。优选地，RhAGL6的表达量的提高方法包含通过基因工程编辑RhAGL6基因的表达方式。优选地，方法包含过表达RhAGL6基因。

本发明另一方面提供一种用于调控月季抗低温胁迫的氨基酸序列。氨基酸序列为由本申请所涉及的RhAGL6基因序列编码的氨基酸序列。

一种提高月季抗低温胁迫的方法，步骤如下：

将本申请所涉及的调控月季花托形态和雄蕊数量的基因序列与过表达工程质粒进行连接；

将重组载体转入农杆菌中，再通过农杆菌侵染目标植物；

对目标植物进行培养获得抗低温胁迫提高的月季。

本发明另一方面提供一种增强月季抗逆性的方法。通过提高月季中的RhAGL6的表达量增强月季抗逆性。优选地，抗逆性指抗低温胁迫能力。

根据一种优选实施方式，提高月季中RhAGL6的表达量包含以下方法中的一种：过表达RhAGL6；减少RhAGL6启动子的甲基化；降低RhAGL6启动子的组蛋白H3K27me3的修饰水平。

本发明另一方面提供一种调节月季花器官发育的方法。方法为：降低RhAGL6启动子的DNA甲基化的水平，和/或降低RhAGL6启动子的组蛋白修饰水平。

本发明另一方面提供一种调节月季花托发育的方法。方法为：降低RhAGL6启动子远端、中间和近端的CpG、CHH甲基化水平。优选地，RhAGL6启动子近端具体为-200～+500bp。优选地，RhAGL6启动子中端具体为-200～-1000bp。优选地，RhAGL6的启动子远端具体为-1000～-2000bp。

本发明另一方面提供一种调节月季花托发育的方法。方法为：降低RhAGL6启动子的组蛋白H3K27me3的修饰水平。

本发明另一方面提供一种调节月季花托发育的方法。方法为：降低RhAGL6启动子的P1和P3段的组蛋白H3K27me3的修饰水平。优选地，RhAGL6启动子的P1段具体为-1435～-1306bp。优选地，RhAGL6启动子的P3段具体为-925～-789bp。

本发明另一方面提供一种调节月季花托发育的方法。方法为：降低DNA甲基化的关键酶基因的表达量，其中，关键酶基因为Domains rearranged methyltransferase 2、chromomethylase 2、chromomethylase 3中的一种或多种。

本发明的有益效果：

环境温度对花发育的各个进程起着至关重要的作用，包括花芽分化、花芽转变和花器官的形成以及花的品质等方面。在月季品种‘Baccara’中，冬季低温常会引起‘牛头花’(‘Bullhead’malformed flowers)现象，这种畸形花常伴随着‘花中花’现象，并因花瓣和雄蕊数量过多而无法正常开放，这种现象严重降低其品质和经济价值。低温还会导致月季品种‘芬得拉’出现‘双心’和‘雄蕊瓣化’现象，主要是由于低温通过提升RhAG启动子的DNA甲基化水平，从而降低了RhAG的表达量造成的畸形现象。相比之下，高温会促进月季品种‘Motrea’形成‘叶状体’的花朵。在香石竹中，低温会促进次生花的形成。研究发现，低温会引起‘蜜桃雪山’的花托发育畸形，花型变得扁平，雄蕊数增加。植物成花以及花朵的正常开放都有适宜的温度范围，温度过低或温度过高都会抑制花的正常分化与发育。月季的最适生长温度为18至30℃，当夜温低于10℃时，就会导致畸形花的出现，不能正常开放，严重影响切花商品的品质。综上表明，环境温度对花器官的发育发挥着重要作用。

基于此，本申请所提供RhAGL6基因能够在低温诱导下影响月季花器官发育。本申请提出的通过促进RhAGL6基因的发育能够有效降低月季花朵畸形的技术方案能够在低温环境下延缓月季花器官发育畸形。

除了遗传因素的影响之外，花发育和花器官的特性还受DNA甲基化、组蛋白修饰、植物激素和环境因素的影响。本申请发现，低温促使RhAGL6启动子的远端、中间和近端发生高度甲基化修饰，进而引起RhAGL6表达量降低，最后导致月季花托发育畸形。此外，冷胁迫还会通过促进NtGPDL基因发生去甲基化而提高其表达量。

本申请的研究结果中发现低温下RhAGL6启动子的P1和P3区域的H3K27me3修饰水平显著高于常温，也进一步表明组蛋白修饰对RhAGL6的表达发挥着重要作用。总之，低温介导的表观调控，主要是DNA甲基化修饰和组蛋白修饰，对植物花发育和花器官的特性具有重要的意义。

根据上述实验结果可知，RhAGL6的启动子上发生DNA甲基化修饰水平升高，进而引起其表达量下降，使得月季花器官在低温环境中出现花器官畸形(花托“上位”、雄蕊增多)的现象。

基于此，本申请提供一种提高月季抗低温胁迫的方法，方法包含通过调控RhAGL6的启动子来改变RhAGL6的表达量。调控方法能够包含增强RhAGL6启动子表达。

本申请所涉及的技术方案能够通过调控RhAGL6基因的表达解决冬季或低温环境中培育月季时月季花器官畸形的问题。

附图说明

图1是本发明提供的常温和低温条件下月季‘蜜桃雪山’花朵的表型的结果图；

图2是本发明提供的常温和低温下月季花瓣的表型的结果图；

图3是本发明提供的差异基因的GO富集分析结果；

图4是本发明提供的差异基因的KEGG富集分析结果；

图5是本发明提供的全基因组的DMRs可视化分析结果；

图6是本发明提供的转录组与DNA甲基化组的联合分析结果；

图7是本发明提供的差异基因的表达谱分析结果；

图8是本发明提供的蛋白进化树分析结果；

图9是本发明提供的RhAGL6的蛋白特性分析和亚细胞定位结果；

图10是本发明提供的RhAGL6的表达特性分析结果；

图11是本发明提供的低温诱导了RhAGL6启动子发生高度甲基化修饰和降低了RhAGL6的表达结果；

图12是本发明提供的常温和低温条件下RhAGL6启动子的组蛋白H3K9ac和H3K27me3修饰的检测结果；

图13是本发明提供的RhAGL6在月季花器官发育中的生物学功能的分析结果；

图14是本发明提供的常温和低温条件下月季花托中RhAGL13的表达量的结果图。

具体实施方式

下面结合附图进行详细说明。

本申请前期通过多组学测序和组学联合分析的方法，挖掘到DNA甲基化修饰水平和基因表达量均发生显著变化的关键MADS-box基因RhAGL6，并且发现低温导致RhAGL6启动子的甲基化水平和H3K27me3水平升高。利用VIGS将RhAGL6沉默后发现月季花托发育畸形。因此，本申请揭示了低温介导RhAGL6来调控月季花托发育的分子机制，从而为改善和保障冬季我国月季切花的品质奠定理论依据，为利用植物激素进行切花品质改良奠定实践依据，为培育花器官发育对冬季低温不敏感的月季新品种提供新的思路和基因储备，并为研发避免低温危害的月季栽培措施提供理论依据。本实施例提供RhAGL6_CDS的具体序列，如表6所示，RhAGL6_CDS的具体序列在本申请中表示为SEQ ID NO.1。

根据实施例1中所涉及的相关试验，可知低温诱导下的RhAGL6表达量降低引起了月季花序或花朵发育异常。根据RhAGL6敲除实验可知，当RhAGL6基因沉默(不表达)时，即使在常温下，月季依然出现了花托“上位”、雄蕊数量增多的现象，可知RhAGL6基因能够直接影响月季花托和雄蕊的发育。而在低温诱导情况下，RhAGL6的启动子上发生DNA甲基化修饰水平升高，进而引起其表达量下降，最终影响了月季花托和雄蕊的发育。

根据上述结论可知，低温环境下，提高RhAGL6基因的表达量能够避免月季花托和雄蕊发育畸形。

基于此，本申请提出了通过调控RhAGL6基因的表达量来调控月季花器官(花托和雄蕊)发育的方法。本申请另一方面涉及了RhAGL6基因于月季抗低温胁迫中的应用。具体地，本申请提出一种避免月季在低温环境中出现花器官(花托和雄蕊)发育畸形的方法，方法为提高RhAGL6基因的表达量。

本申请中月季花的采收级别的评估依据为Junping Gao等人于《Journal ofExperimental Botany》中发表的文章“Petal senescence:a hormone view”。

表1为本申请提供的缩略词表。

表1

实施例1

1.植物材料

1.1月季‘蜜桃雪山’

‘蜜桃雪山’枝条采自深圳职业技术学院种质资源圃，采收后立即浸入水中运回试验室，并在去离子水中再次修剪，保留2-3片复叶，平衡2h后，进行脱毒和组织培养。

1.2‘蜜桃雪山’组培苗

取切花月季品种‘蜜桃雪山’当年生粗壮枝条，除去叶片后剪取4-5cm的单芽茎段，经过洗涤剂清洗后在自来水下冲洗1-2h，然后于超净工作台中处理(75％乙醇，灭菌30s；0.1％升汞，消毒10min；灭菌水清洗4-5次)，再用高温灭菌的剪刀将茎段两端剪出新切口(保持剪口平滑)，接种到月季快繁培养基中(MS+30g/L蔗糖+3mg/L GA₃+0.05mg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+6.5g/L Agar，pH＝5.8)。大约一个月左右(腋芽长至5-6cm)，可转接到月季生根培养基中(1/2MS+30g/L蔗糖+0.1mg/L NAA+6.5g/L Agar，pH＝5.8)。

选取生根后的健壮且长势一致的组培苗，经炼苗后用于VIGS试验。

组培苗种植基质(进口草炭土：蛭石＝1：1)。

培养条件：温度为21±0.5℃，相对湿度为50-60％，光周期为16h/8h。

1.3烟草

试验采用本生烟(Nicotiana benthamiana)。

播种方法：将种子散播于湿润的营养基质中(同月季组培苗种植基质)，并覆膜。

培养条件：温度为21±0.5℃，相对湿度为60-65％，光周期为16h/8h。

1.4菌株与载体

试验采用大肠杆菌、根癌农杆菌菌株、克隆载体和VIGS载体，其中，

大肠杆菌为购自庄盟生物有限公司的DH5α；

根癌农杆菌菌株为GV3101；

克隆载体为分别购自艾德莱与Takara生物公司的ZT-4、18-T；

VIGS载体为购自HonorGene(奥诺基因)的pTRV1、pTRV2，pTRV1的产品货号为pTRV1/HG-VRW0365，pTRV2的产品货号为Ptrv2/HG-VRW0366。

2.研究方法

2.1低温处理

1年生的‘蜜桃雪山’苗子修剪到统一高度后，置于培养箱(Thermoline，TPG-6000-TH)进行常温和低温处理，

常温条件：25/15℃；

低温条件：15/5℃。

两种处理的相对湿度为50-60％，光周期为16h/8h。每个处理有40株月季。

2.2表型统计

在月季花朵的采收级别达到9级时，对常温下的正常花和低温下的畸形花进行形态解剖，并对不同的花器官组织(花型、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、花托)进行形态和数量统计。每个处理有5个生物学重复，用平均值±标准差表示。

2.3载体构建

沉默载体：

取RhAGL6基因5’UTR和ORF区域的408bp的特异性片段作为沉默片段，并用添加酶切位点Xba I和Smal I的引物扩增后，利用同源重组构建到pTRV2载体中。所用引物序列见表6。

2.4植物DNA提取

(1)先用65℃预热CTAB溶液(1000μL CTAB提取液加入5μLβ-硫基乙醇)；

(2)将研磨好的样品放入2mL离心管中，加入800μL预热的CTAB溶液，涡旋混匀，65℃水浴30min(期间每隔10min混匀一次)；

(3)加入800μL氯仿异戊醇(v/v，24：1)，颠倒混匀直至有机相呈深绿色，13000rpm离心10min，转移上清，加入等体积的氯仿异戊醇，颠倒混匀后13000rpm离心10min，转移上清，加入等体积的氯仿，颠倒混匀后13000rpm离心10min；

(4)转移上清至2mL离心管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇，置于-20℃条件沉淀1h以上；

(5)4℃13000rpm离心10min，小心倒掉上清，加入1mL预冷的75％的乙醇洗涤沉淀；

(6)4℃13000rpm离心5min，弃上清，通风橱中吹干，加入100mL ddH₂O溶解。

2.5植物总RNA提取

(1)取0.2g鲜样品，液氮中迅速研磨成粉状，移至2mL RNA-free离心管；

(2)加入1mL预冷的pBIOZOL试剂，充分振荡混匀；

(3)静置5min后离心(12000rpm，4℃，10min)，小心转移上清到新的2mL离心管中；

(4)加入0.2mL的5M NaCl和0.6mL氯仿，振荡混匀；

(5)离心(12000rpm，4℃，10min)，转移上清至新的2mL离心管中；

(6)重复步骤(5)；

(7)加入与该上清等体积的酚/氯仿/异戊醇(v/v/v：25/24/1)，振荡混匀，离心(12000rpm，4℃，10min)，转移上清至新的2mL离心管中；

(8)加入与该上清等体积的氯仿，振荡混匀，离心(12000rpm，4℃，10min)，并将上清转移至新的1.5mL离心管中；

(9)加入与该上清等体积的异丙醇，轻轻混匀后置于-20℃冰箱沉淀2～4h；

(10)离心(12000rpm，4℃，30min)，弃去上清；

(11)向离心管中加入1mL 75％乙醇，离心(12000rpm，4℃，5min)，弃去液体，瞬离后用移液器小心吸取弃去残液；

(12)加入10-30μL DEPC-H₂O溶解RNA，-80℃保存备用。

2.6cDNA的合成

反转录采用IIQRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(购自Vazyme公司)。

(1)去除基因组DNA

在无RNase的离心管中配制如下：

表2为去除基因组DNA的反应体系。

表2

组分	体积
		RNase-free ddH₂O	to 8μL
4×gDNA wiper Mix	2μL
		模板RNA	Total RNA：500ng

轻弹混合液使混合液混匀，离心，42℃反应10min。

(2)配制反转录反应体系

在(1)反应的混合液中直接加入5×HiScript II QRT SuperMix II(2μL)，轻弹将混合液混匀并离心，进行如下扩增反应。

扩增反应条件：25℃(10min)→50℃(30min)→85℃(5min)。

产物可直接用于PCR反应，也可放置于-20℃长期保存。

2.7PCR产物的回收和纯化

利用DNA纯化回收试剂盒(购自Axygen生物技术有限公司)，对PCR产物进行液体或者凝胶回收。方法如下：

用1-2％的琼脂糖凝胶分离PCR产物后，加入3倍体积的溶胶液Buffer A，55℃水浴加速溶解，加入1/2Buffer A体积的Buffer B，混匀后12000rpm离心30s，再依次用W1和W2缓冲液洗脱，离心(12000rpm，30s)，去废液后，将吸附柱放回收集管中空管离心(12000rpm，2min)，加入ddH₂O后，室温静置2min，离心(12000rpm，30s)，重复洗脱一次，测定浓度后备用。

2.8载体与PCR产物连接及大肠杆菌转化

用ZT4 Simple-Blunt快速克隆试剂盒(购自庄盟生物科技有限公司)，将PCR回收产物连接到T载体上，连接体系如下：

表3示出了T载体连接体系。

表3

用移液枪轻轻吸打混匀后，室温下反应5min，转入DH5α大肠杆菌感受态中，冰浴30min，42℃水浴热击90s，冰浴5min，加入500μL的LB液体培养基，37℃200rpm振荡培养1h，离心(5000rpm，5min)，涂布于相应抗生素的LB培养基上，37℃恒温过夜培养，挑取单克隆进行菌落PCR检测、跑胶，将条带正确的菌液送公司测序。

2.9实时荧光定量(qRT-PCR)

采用ABIPRISM Step ONE Plus Real-time PCR仪器进行qRT-PCR反应。

定量试剂为KAPA^TM SYBRR FAST quantitative PCR kits(Kapa Biosystems)。对反转录的cDNA用ddH₂O稀释至三倍后按照以下体系进行：

(1)在200μL的离心管中配制如下混合液：

表4示出了qRT-PCR反应体系。

表4

试剂(reagent)	体积(volume)
		2×Kit Mix(KAPA)	10.0μL
Primer-F	0.4μL
		Primer-R	0.4μL
cDNA模板	2.0μL
		ddH₂O	7.2μL

表5示出了qRT-PCR反应条件。

表5

Stage	Program	Cycles
			预变性	95℃(10min)	1
PCR反应	95℃(20s)→60℃(30s)	40

循环结束后65℃～95℃间每隔0.2℃作溶解曲线，采用双ΔΔT方法计算各个基因的相对表达变化。

2.10病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)

以月季组培苗或者扦插苗为试验材料，侵染体系参照实验室已建立的组培苗沉默体系进行。

方法包含以下步骤：

(1)VIGS系统是由pTRV1和pTRV2两个载体构成，需把沉默目的基因构建到TRV2载体上，沉默片段一般选取5’-UTR或者3’-UTR区域，片段长度一般为300-500bp，将pTRV1、pTRV2和pTRV2重组质粒分别转入农杆菌中；

(2)2-3天后选取单克隆接种到含有Kan和Rif的500μL LB液体培养基中(Kan-50μg/mL，Rif-50μg/mL)，培养条件：28℃200rpm，过夜振荡培养16h，进行PCR检测；

(3)将检测正确的菌液按照1：50或1：100的稀释比例添加到150mL Kan+Rif的LB培养基中(每1L LB中加入1mL 50μg/mL Kan，1mL50μg/mL Rif)，培养条件为28℃/200rpm，过夜培养至OD₆₀₀值约为1.5；

(4)在室温条件下离心(5000rpm，8min)收集菌体，用侵染液(每1L侵染液中加入10mL 1M MES，4mL 0.05M MAS，10mL 1M MgCl₂)重悬菌体并将OD₆₀₀值调至约为1.5左右，然后将pTRV1分别与pTRV2和pTRV2重组质粒的菌液按照1：1的比例混匀，室温避光静置3-5h；

(5)将植物材料随机均匀分成两份，完全浸没在菌液中，利用真空泵进行真空抽吸，第一次真空抽至0.7个大气压后保压5min，缓慢放气20min，第二次真空抽至0.8个大气压，保压和放气时间同上，抽吸两次后，用自来水冲洗3次，洗去多余菌液，再用去离子水漂洗1次；

(6)将抽完真空的植物材料放入8℃人工培养箱中暗培养3天后，种植到基质中，并覆膜保证空气湿度，置于培养室中培养。

2.11全基因组的DNA甲基化测序(WGBS)

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，在调控基因表达和染色质构象等方面发挥着重要作用。DNA甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶(5mC)、少量的N6-甲基嘌呤(N6-mA)及7-甲基鸟嘌呤(7-mG)。通常地，甲基化DNA主要指5-甲基胞嘧啶。哺乳动物细胞中甲基化主要发生在CG二核苷酸的胞嘧啶上，植物细胞中则存在很大比例的non-CG(CHH、CHG，H代表A、C、T)甲基化。5-甲基胞嘧啶由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase，DNMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。

全基因组甲基化测序(whole-genome bisulphite sequencing，WGBS)结合亚硫酸氢盐转化(bisulfite conversion)方法与二代测序技术，可在单碱基分辨率水平上高效地检测全基因组DNA甲基化状态。亚硫酸氢盐处理可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。对PCR产物进行高通量测序，与参考序列比对，即可判断CpG/CHG/CHH位点是否发生甲基化。全基因组甲基化测序可全面、精确地检测全基因组DNA甲基化状态，为更深入的表观遗传调控分析奠定基础。

DNA提取完成后，经片段打断、DNA片段末端修复、3’端加A碱基、测序接头连接、亚硫酸盐转化、扩增等构建文库，随后采用150PE上机策略进行HiSeq测序。

2.12烟草亚细胞定位

烟草亚细胞定位利用绿色荧光蛋白(GFP)在烟草叶片中的荧光部位判断目的基因在细胞内何处表达。将目的基因的CDS序列构建到经改造后的pSuper1300-C-GFP载体中，利用Xma I和Kpn I作为酶切位点。

pSuper：NF-YA4-mCherry作为核定位信号使用。

重组质粒转入农杆菌感受肽GV3101后，注射烟草叶片，3天后利用confocal荧光显微镜(Olympus FluoView FV1000)进行观察烟草叶片表皮细胞。所用引物序列在表6中。

2.13Western blot

(1)将常温和低温条件下的月季花托组织置于液氮中，经研磨粉碎后，称取0.1g的样品至1.5mL离心管中；

(2)加入200μL的烟草总蛋白提取缓冲液后迅速涡旋振荡混匀，离心5min(4℃，12000rpm)，将上清液转移到新的1.5mL离心管中；

(3)加入等体积的2×SDS loading buffer(0.1M Tris-HCl，pH＝6.8；0.2M DTT；4％ SDS；0.2％溴酚蓝；20％甘油；5％β-巯基乙醇)，在100℃下煮沸5min，离心5min(12000rpm)，在冰上冷却后置于-20℃保存备用；

(4)制备凝胶，然后进行120V稳定电压电泳约1h，根据条带大小选择合适的电泳分离时间，确保条带清晰分离；

(5)转膜后，将膜取出浸没于5％的脱脂奶粉溶液中，缓慢摇荡1h或4℃过夜封闭；

(6)结合一抗和二抗，洗脱后，加入显影液进行发光鉴定。

2.14 Chromatin immunoprecipitation quantitative polymerase chainreaction assays(ChIP-qPCR)

CHIP-qPCR试验按照之前的方法进行。取3.0g月季花托组织，用1％的甲醛溶液交联后，提取核蛋白，然后经超声破碎成500bp左右的片段，并用组蛋白修饰抗体和beads公共孵育。免疫沉淀的DNA片段用qRT-PCR进行定量分析。所用引物见表6。

表6

/>

2.15启动子活性分析(GUS染色)

将已克隆RhAGL6基因启动子的1500bp连接到35Smini-GUS载体上形成ProRhAGL6-GUS重组质粒，进行农杆菌转化后，侵染月季花瓣5天后进行GUS染色24h，将染好色的材料转入70％酒精脱色3-5次，直至阴性对照的材料接近白色。所用引物序列见表6。

2.16蛋白保守域分析和进化分析

根据参考基因组Rosa chinensis cv.Old Blush(GenBank ID 8255808)对RhAGL6的ORF进行克隆得到741bp的序列，并在NCBI上获得其他AGL6同源蛋白的序列(AtAGL6-NP_182089.1，SlAGL6-NP_001348459.1，MdAGL6-XP_028963662.1，OsMADS6-NP_001390595.1，CcAGL6-Accession No.XP_006445200.1，BrAGL6 XP_009143157.1)。利用ClustalW软件(https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw)比对以上AGL6同源蛋白进行比对，并利用MEGA-X(https：//www.megasoftware.net/)进行进化树分析。

2.17数据统计

每个数据至少有三个生物学重复，用平均值±标准差表示。数据统计用GraphPadPrism 8.0.2软件(GraphPad Software Inc.，USA；http：//www.graphpad.com/)进行分析。两组之间的显著性差异采用two-sided Student’s t-tests(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；ns，代表无显著性差异)。

本申请的试验所涉及的主要仪器包含：

PCR仪包括ABI 2720型PCR仪；ABI verity 96well型PCR仪；ABI proflex型PCR仪；ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪；Bio-rad MyCycler梯度PCR仪；ATTO printgraph 2M凝胶成像系统；Thermo常温、低温离心机；Nanodrop 2000微量分光光度计；SANYO超低温冰箱；SANYO高压灭菌锅；华龙实验仪器厂HZQ-F160全温振荡培养箱；培英公司HZD-100恒温振荡培养箱；上海福玛实验仪器有限公司恒温培养箱；上海雷磁公司生产离子渗透率测定仪；Mettler Toledo pH计；IKA磁力加热搅拌器；Startorius分析天平；Eppendorf移液枪；Milli-Q纯水仪。

3试验结果

3.1常温和低温处理条件下的月季表型分析

花朵畸形在月季栽培中非常常见，尤其是在冬季，严重影响了月季的观赏价值和商业价值。为了阐明冬季低温引起的月季花朵畸形潜在的分子机制，本申请筛选到一个低温敏感的月季品种‘蜜桃雪山’。在月季花朵的采收级别为2级时，本申请观察统计了常温(25/15℃，白/昼)和低温(15/5℃，白/昼)条件下的花器官形态和数量。

图1为常温和低温条件下月季‘蜜桃雪山’花朵的表型的试验结果。图1A-B为常温和低温条件下月季花蕾及生长中心形态的侧视图和俯视图。图1C-G为常温和低温条件下的月季子房的形态，花瓣(图1E)，雄蕊(图1F)，雌蕊(图1G)。图1H为常温和低温条件下花朵的高/宽的比值。图1I-图1K为常温和低温条件下月季花器官的数量，分别为花瓣(图1I)、雄蕊(图1J)和雌蕊(图1K)。

差异显著采用Student’s t-test进行分析(**，P≤0.01；***，P≤0.001)，每个数据至少有三个生物学重复，用平均值±标准差表示。

与常温条件下的正常花相比，低温导致月季花更加扁平且畸形(图1A，图1H)。去掉外轮花瓣后，低温下的花瓣包裹紧实且花瓣变皱，花托明显高于花梗最顶部(图1B)。将所有花瓣去除后，发现常温下月季的花托顶部与花梗顶部齐平，但低温下月季花托明显发生‘上位现象’，明显超出花梗顶部，雄蕊群着生在畸形花托顶部(图1C)。通过进一步解剖发现，畸形花托的体积比正常花托更大(图1D)。通过观察常温和低温条件的萼片，本申请发现畸形萼片具有显著的‘叶片化’形态(图1E)。如图1F和图1J所示，常温状态下的雄蕊数量为165.6±10.7，而低温诱导下的雄蕊数量为261.8±41.3。如图1G和图1K所示，常温状态下的雌蕊数量为129.6±19.2，而低温诱导下的雌蕊数量为256.0±36.5。本申请发现低温下月季的雌雄蕊数量明显多于常温下的雌雄蕊数量(图1F，图1G，图1J，图1K)。此外，本申请还发现，低温下月季的花瓣数量为74.0±5.0，明显多于常温下的花瓣数量48.4±7.2(图1I，图2)。图2为常温和低温下月季花瓣的表型结果。以上结果表明，低温导致月季各个花器官发育畸形。

3.2正常和畸形花托的RNA-seq分析

本申请对正常和畸形花托进行转录组(RNA-seq)分析，通过对差异基因进行筛选(筛选参数：fold change≥2或fold change≤0.5；p-value＜0.05)，筛选到1238个显著上调表达基因(up-regulated genes)和1045个显著下调表达基因(down-regulated genes)。为了更好挖掘潜在的分子作用机制，利用GO功能富集分析(图3)，本申请发现差异基因主要富集在‘extracellular region’，‘response to clod’，‘cell wall biogenesis’，‘response to water stress’，‘response to jasmonic acid’，‘response tooxidative’等功能。

KEGG功能富集分析(图4)，本申请发现差异基因主要富集在‘circadian rhythm’，‘plant signaling transduction’，‘photosynthesis’，‘zeatin biosynthesis’和‘starch and sucrose metabolism’等通路。结果表明，低温下畸形花的调控可能给涉及多个生物进程的综合调控。

3.3正常和畸形花托的全基因组的DNA甲基化(WGBS)分析

很多研究表明，表观修饰对植物的生长发育具有重要的调控作用。本申请进行了正常和畸形花托的WGBS分析，差异显著性分析发现3918个高度甲基化差异区域(hyper-methylated different methylated region)和3923个低度甲基化差异区域(hypo-methylated different methylated region)。结果表明，DNA甲基化参与调控了低温介导的花器官发育(图5)。

3.4WGBS和RNA-seq联合分析

为进一步筛选参与低温介导的花器官调控关键基因，本申请进行了WGBS和RNA-seq数据的联合分析(图6)。

图6A为高度甲基化的DMRs与转录组下调表达的基因进行温恩图分析。图6B为低度甲基化的DMRs与转录组上调表达的基因进行维恩图分析。图6C是对A和B种的重叠的243个基因进行GO富集分析。

筛选DNA甲基化差异变化和转录组差异表达的参数：差异倍数≥2，p-values≤0.05。通过维恩图分析，DNA高度甲基化且下调表达的基因有115个，DNA低度甲基化且上调表达的基因有128个(图6A和图6B)，并在将这243个基因进行GO富集分析后，发现这些基因主要富集在‘metabolic processes’，‘cellular processes’，‘single/multi-organismprocesses’，‘biological regulation’，‘reproductive processes’和‘organ growth’。由此表明，这243个基因可能对于花器官的发育发挥着重要作用。

3.5RhAGL6基因的鉴定

本申请将筛选出来的243个差异基因进行heatmap分析(筛选了一些表达量较高的差异基因)，如图7所示，一个MADS-box家族RchiOBHmChr1g0351671引起我们的关注。进一步分析表明RchiOBHmChr1g0351671低温下发生DNA高度甲基化，且常温下表达量较高，但低温下表达量显著下降。因此本申请将RchiOBHmChr1g0351671作为候选基因进行后续分析。

与拟南芥的MADS-box家族蛋白进行进化树分析表明，RchiOBHmChr1g0351671与拟南芥AGL6亲缘关系最近，因此本申请将RchiOBHmChr1g0351671命名为RhAGL6。

图8为RhAGL6蛋白与拟南芥MADS家族蛋白系统进化分析。拟南芥的MADS家族蛋白氨基酸序列从TAIR网站上下载。利用MEGA-X构建进化树。进化树标尺为0.50。

图9为RhAGL6蛋白特性分析和亚细胞定位。图9A为AGL6同源蛋白序列比对分析，红线框代表MADS_MEF2 domain，蓝线框代表K-box domain。图9B是在35S启动子的驱动下，在烟草中瞬时过表达RhAGL6的ORF序列，并用GFP作为标签蛋白，检测其蛋白定位，空GFP载体作为负对照。标尺为0.2μm。

本申请克隆了RhAGL6的ORF序列(741bp)，编码246个氨基酸。将RhAGL6蛋白序列与其他物种的AGL6蛋白序列进行比对分析，发现RhAGL6蛋白含有典型的MADS_MEF2_likedomain和K-box domain的保守域(图9A)，进一步表明RhAGL6蛋白的进化保守性。本申请通过构建pSuper：RhAGL6-GFP载体，经农杆菌转化后侵染烟草(N.benthamiana)叶片，confocal荧光显微观察表明RhAGL6蛋白定位在细胞核内(图9B)。

为了更好理解RhAGL6的表达特性，本申请利用实时荧光定量(RT-qPCR)确定了RhAGL6在不同月季组织和花发育阶段的相对表达量。如图10所示。

图10为RhAGL6的表达特性分析结果，图10左为RhAGL6在不同月季组织中的表达量分析，RhUBI2作为内参基因。图10右为RhAGL6在不同发育阶段的表达量，RhUBI2作为内参基因。

Ste：茎；Rt：根；YL：幼叶；ML：成熟叶片；Re：花托；Pe：花瓣；Se：萼片；St：雄蕊；Pi：雌蕊。

Stage 1：营养分生组织阶段；Stage 2：花分化起始阶段；Stage 3：萼片原基起始阶段；Stage 4：花瓣原基其实阶段；Stage 5：雄蕊原基起始阶段；Stage 6：雌蕊原基起始阶段；Stage 7：花芽分化完成阶段；Stage 8：花托开始下陷阶段；Stage 9：外侧花瓣松散阶段。差异显著采用Student’s t-test进行分析(**，P≤0.01；***，P≤0.001)，每个数据至少有三个生物学重复，用平均值±标准差表示。

RhAGL6在月季花托中表达量最高，其次是雌蕊、萼片、茎和雄蕊中，表明RhAGL6对于月季花托发育具有重要的作用。RhAGL6表达量在花芽分化前表达量很低。Stage 5到Stage 7期间，RhAGL6表达量呈不断升高的趋势。这也暗示着，RhAGL6对月季的花芽分化和花器官的发育发挥着重要作用。

3.6低温诱导RhAGL6启动子的甲基化水平升高

本申请利用RT-qPCR分析低温处理下RhAGL6表达量，发现低温处理12小时和24小时导致RhAGL6表达量显著下降(图11A)。低温下RhAGL6启动子远端、中间和近端的CpG、CHH甲基化水平都显著高于常温；低温下CHH甲基化修饰水平的升高主要发生在启动子的近端和远端(图11B-D)。

图11为低温诱导了RhAGL6启动子发生高度甲基化修饰和降低了RhAGL6的表达的结果。

具体地，图11A为常温和低温条件下RhAGL6在月季花托中的表达量，RhUBI2作为内参基因。平均值±方差值表示有三个生物学重复。*代表利用Student’s t-test进行显著性差异分析(*，P<0.05；**，P<0.01)。

具体地，图11B-D为常温和低温条件下RhAGL6启动子远端、中间、近端的CpG、CHG、CHH位点的甲基化修饰百分比。

具体地，图11E-H为常温和低温下花托中调控DNA甲基化的标记基因的表达量检测。差异显著采用Student’s t-test进行分析(*，P<0.05；**，P<0.001；***，P<0.0001；ns，无明显差异)，每个数据至少有三个生物学重复，用平均值±标准差表示。

此外，本申请还检测了DNA甲基化的关键酶基因[Domains rearrangedmethyltransferase 2(RhDRM2)，DNA methyltransferase 1(RhMET1)，chromomethylase 2and 3(RhCMT2 and RhCMT3)]的表达量，如图11E-H，低温下RhDRM2，RhCMT2和RhCMT3的表达量都显著高于常温，但是RhMET1的表达量在常温和低温条件下并没有显著的变化。

以上结果进一步表明，低温诱导RhAGL6的启动子上发生DNA甲基化修饰水平升高，进而引起其表达量下降，最终影响了月季花托的发育。

3.7低温诱导RhAGL6启动子的H3K27me3修饰水平升高

过往研究表明，组蛋白修饰(如H3K9ac，H3K27me3)和DNA甲基化密切相关，共同参与调控了基因的表达，特别是一些与花发育相关的基因。因此，本申请首先利用westernblot分析了常温和低温下花托蛋白的组蛋白修饰水平(图12A)，图12为常温和低温条件下RhAGL6启动子的组蛋白H3K9ac和H3K27me3修饰的检测的结果。

具体地，图12A为月季花托蛋白的H3、H3K27me3和H3K9ac的western blot检测。

具体地，图12B为RhAGL6启动子的结构示意图。

具体地，图12C和图12D示出了常温和低温下RhAGL6启动子不同区域的H3K27me3富集(图12C)和H3K9ac富集(图12D)。该试验进行了两次生物学重复，取得了相似的结果，其中一组结果在图中展示。差异显著采用Student’s t-test进行分析(*，P<0.05；**，P<0.001；***，P<0.0001；ns，无明显差异)，每个数据至少有三个生物学重复，用平均值±标准差表示。

结果表明，商业化的组蛋白抗体(anti-H3，anti-H3K9ac，anti-H3K27me3)在月季中具体特异性。并且，与常温相比，低温下H3K27me3修饰水平明显升高，而H3K9ac修饰水平有略微下降。

随后，将RhAGL6启动子短截成6段(P1，P2，P3，P4，P5和P6)(图12B)，RhAGL6的启动子的P1段具体为-1435～-1306bp。RhAGL6的启动子的P2段具体为-1169～-1033bp。RhAGL6的启动子的P3段具体为-925～-789bp。RhAGL6的启动子的P4段具体为-641～-479bp。RhAGL6的启动子的P5段具体为-433～-314bp。RhAGL6的启动子的P6段具体为-155～-1bp。

利用CHIP-qPCR对RhAGL6启动子进行富集分析。结果表明低温下RhAGL6启动子的P1和P3段的H3K27me3富集水平显著升高(图12C)，而其他区域并没有显著差异。同时，本申请还检测了H3K9ac的富集水平，但常温和低温下RhAGL6启动子的H3K9ac并没有明显差异。

3.8RhAGL6在月季花托发育中的生物学功能

前述研究表明，低温通过表观方式抑制了RhAGL6的表达，从而导致月季花托发育畸形。本申请利用VIGS对RhAGL6进行基因沉默来进一步验证其在月季中的生物学功能，图13为RhAGL6在月季花器官发育中的生物学功能的结果、TRV和TRV-RhAGL6的花瓣形态和数量的结果。图14为常温和低温条件下月季花托中RhAGL13的表达量的结果。

具体地，图13A-D为TRV和TRV-RhAGL6植株中的花器官形态。

具体地，图13A为花朵整体形态。

具体地，图13B和C为花瓣去除后，花托部位的形态图。

具体地，图13D为萼片形态。

具体地，图13E为RhAGL6的沉默检测，RhUBI2作为内参基因。

具体地，图13F为花蕾的高/宽比值。

具体地，图13G-I为TRV和TRV-RhAGL6的花瓣、雄蕊和雌蕊数量。差异显著采用Student’s t-test进行分析(*，P<0.05；**，P<0.001；***，P<0.0001；ns，无明显差异)，每个数据至少有四个生物学重复，用平均值±标准差表示。

如图13A、E和F所示，野生型和突变体的月季的花型并未发生改变，说明RhAGL6沉默并不能引起月季花型的改变。

如图13B和C所示，将花瓣去除和解剖后，发现TRV-RhAGL6的花托也有明显的‘上位’现象。

如图13D所示，TRV和TRV-RhAGL6的萼片形态并没有明显的差异。结果表明低温引起的萼片‘叶片化’可能与RhAGL6并不相关。

如图13G和图14所示，TRV和TRV-RhAGL6的花瓣数量也没有明显的差异(TRV-RhAGL6，59.6±4.4vs TRV，55.0±6.4)。

如图13H所示，RhAGL6沉默株系的雄蕊数量明显多于对照TRV(TRV-RhAGL6，119.0±15.1vs TRV，92.2±13.6)。

如图13I所示，TRV和TRV-RhAGL6的雌蕊数量没有明显的差异(TRV-RhAGL6，108.2±12.9vs TRV，94.8±7.4)。

此外，在拟南芥中AGL6和AGL13在调控花发育的过程中具有功能冗余性，因此，本申请检测了常温和低温下的RhAGL13的表达量，发现其在常温和低温条件下表达量并无显著差异(图14)，本申请推测RhAGL13可能不参与低温介导的月季花托生长发育进程。综上所述，在低温条件下，RhAGL6通过整合DNA甲基化和组蛋白修饰(H3K27me3)来调控月季花托的生长发育。

需要注意的是，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。本发明说明书包含多项发明构思，诸如“优选地”“根据一个优选实施方式”或“可选地”均表示相应段落公开了一个独立的构思，申请人保留根据每项发明构思提出分案申请的权利。在全文中，“优选地”所引导的特征仅为一种可选方式，不应理解为必须设置，故此申请人保留随时放弃或删除相关优选特征之权利。

Claims

1.月季MADS-box基因RhAGL6，其特征在于，所述RhAGL6的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的RhAGL6于月季育种中的应用。

3.MADS-box基因RhAGL6于调节月季花托发育中的应用。

4.MADS-box基因RhAGL6于调节月季花芽分化中的应用。

5.MADS-box基因RhAGL6启动子于调节月季花器官发育中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述调节月季花器官发育是通过调控RhAGL6基因的启动子的DNA甲基化水平以提高月季花器官中RhAGL6的表达量实现的。

7.一种增强月季抗逆性的方法，其特征在于，提高月季中RhAGL6的表达量。

8.根据权利要求7所述的增强月季抗逆性的方法，其特征在于，提高月季中RhAGL6的表达量包含以下方法中的一种：

过表达RhAGL6；

减少RhAGL6启动子的甲基化；

降低RhAGL6启动子的组蛋白H3K27me3的修饰水平。

9.一种调节月季花器官发育的方法，其特征在于，

降低RhAGL6的启动子的DNA甲基化的水平，和/或

降低RhAGL6的启动子的组蛋白修饰水平。

10.一种调节月季花托发育的方法，其特征在于，降低DNA甲基化的关键酶基因的表达量，其中，所述关键酶基因为Domains rearranged methyltransferase 2、chromomethylase 2、chromomethylase 3中的一种或多种。