CN105039353B - 一种辣椒花粉发育相关基因CaMS1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于辣椒育种技术领域，具体公开了一种辣椒花粉发育相关基因CaMS1及其应用。所述基因CaMS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示，该基因CaMS1编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，且该基因可有效应用于花粉败育或制备雄性不育辣椒材料中。本发明提供了一种新的辣椒花粉发育相关基因CaMS1，通过RT‑PCR和qRT‑PCR表达分析，确定该基因是一个花粉发育早期表达花药特异基因，并且，通过对该基因的干扰沉默，制备了花粉活力降低的材料。通过对该材料的改进与优化可进一步创制出辣椒雄性不育材料，对辣椒新品种的选育有重要价值。

Description

一种辣椒花粉发育相关基因CaMS1及其应用

技术领域

本发明属于辣椒育种技术领域，具体地，涉及一种辣椒花粉发育相关基因CaMS1及其应用。

背景技术

辣椒（Capsicum annum）属于茄科（Solanaceae）辣椒属一年或多年生草本植物，其果实是一种世界性的蔬菜和加工调味品。辣椒为常异花授粉植物，杂种优势非常明显，优良杂种一代比常规品种可增产30％~50％。杂种优势的利用，已成为辣椒生产上提高产量和增加经济效益的重要手段。但目前我国杂交制种多采用蕾期人工去雄、授粉，不但制种成本高而且很难保证种子纯度。利用雄性不育系配制一代杂种，不仅可以简化制种程序，降低种子生产成本，而且可以提高杂种的纯度。因此，雄性不育系的选育及其应用研究越来越受到人们的重视。

花粉败育是植物雄性不育发生的表型体现，弄清花粉发育的全过程和分子机理是研究植物雄性不育的基础和关键所在。花粉发育涉及众多基因的表达调控，对花粉发育相关基因的研究不仅可以了解花粉发育的分子机制，还可以为人工创制雄性不育提供理论基础。这些基因的敲除能导致植物部分或完全不育，然而在辣椒中对花粉发育相关基因的研究甚少。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种辣椒花粉发育相关基因CaMS1。

本发明的另一目的在于提供上述基因CaMS1编码的蛋白。

本发明的另一目的在于提供含有上述基因CaMS1的重组载体。

本发明的另一目的在于提供上述重组载体转化的重组菌。

本发明的另一目的在于提供RT-PCR和qRT-PCR分析上述基因CaMS1的特异引物对。

本发明的另一目的在于提供扩增上述基因CaMS1的RNAi正、反义片段的引物对。

本发明的另一目的在于提供所述基因CaMS1的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种辣椒花粉发育相关基因CaMS1，所述基因CaMS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2 所示。其中，所述基因CaMS1的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，长1919bp；所述基因CaMS1的开放阅读框序列如SEQ ID NO:2所示，长1758bp。

本发明还提供所述辣椒花粉发育相关基因CaMS1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO:3 所示，含585个氨基酸序列。

本发明还提供含有所述辣椒花粉发育相关基因CaMS1的重组载体。所述重组载体可以是重组真核表达载体、重组原核表达载体或RNAi干扰载体。

所述重组载体为RNAi干扰载体时，优选地，将所述基因CaMS1的RNAi正、反义片段与大肠杆菌pFGC5941质粒连接。

本发明还提供所述重组载体转化的重组菌。所述菌可以是大肠杆菌或农杆菌。

本发明还提供RT-PCR分析所述基因CaMS1的特异引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO:4~5所示。利用RT-PCR分析上述基因CaMS1的表达特性，其上游特异引物为：5’ -AAATCTTCCCTCAGGAGTCAATCAG -3’；下游特异引物为：5’ -AATCACAAGTCCTTCGGAAAGAAAA -3’。

本发明还提供qRT-PCR分析所述基因CaMS1的特异引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO:6~7所示。利用qRT-PCR分析上述基因CaMS1的表达特性，其上游特异引物为：5’-ATGATGGCGAAAGAGGTTGACG-3’；下游特异引物为：5’ -CCATTTACATACGCTGTGGATACTTG-3’。

本发明还提供扩增所述基因CaMS1的RNAi正、反义片段的引物对，正义序列的引物对如SEQ ID NO:8~9所示，反义序列的引物对如SEQ ID NO:10~11所示。正、反义序列的引物对分别为：

UP-SP4-1：5′-CGGATTTAAATAGTCAGTGGAGCAAGCAA-3′，

UP-SP4-2：5′- CGCGGATCCAGTCAGTGGAGCAAGCAA-3′；

DW-SP4-1：5′-CATGCCATGGTTAGCCCTGGAATGTGGA-3′，

DW-SP4-2：5′-TCCCCCGGGTTAGCCCTGGAATGTGGA-3′。

本发明还提供所述基因CaMS1在花粉败育中的应用。

本发明还提供所述基因CaMS1在制备雄性不育辣椒中的应用。

优选地，在制备雄性不育辣椒时，将上述的重组载体转化到辣椒中，并筛选出雄性不育的植株。

优选地，采用农杆菌介导的遗传转化方法将所述基因CaMS1导入辣椒中。经过2~3代筛选，获得抗性辣椒，T₀代转基因阳性率达39.6%，T₁代转基因阳性率达29.2%。T₀代CaMS1干扰植株的花粉萌发率为21.84%，而野生型对照为52.63%，说明转基因植株有一定的雄性不育性。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：本发明提供了一种新的辣椒花粉发育相关基因，命名为CaMS1。通过RT-PCR和qRT-PCR表达分析，确定该基因是一个花粉发育早期表达花药特异基因，并且，本发明通过对该基因的干扰沉默，制备了花粉活力降低的材料。通过对该材料的改进与优化可进一步创制出辣椒雄性不育材料，对辣椒新品种的选育有重要价值。

附图说明

图1为提取的辣椒可育株或不育株八个等级混合花蕾RNA普通琼脂糖凝胶电泳图；其中，F为可育株，S为不育株。

图2为CaMS1的cDNA全长和推导的氨基酸序列；起始密码子和终止密码子用黑体表示；双画线部分为FAR-N-SDR-e保守域；单下划线部分为STERILE保守域。

图3为CaMS1在辣椒花蕾不同发育时期的表达；a. RT-PCR 分析，Actin 为内参基因；b. qRT-PCR分析；F1~8，S1~8分别为可育株和不育株1~8级花蕾。

图4为CaMS1在辣椒不同组织部位的表达分析；a. RT-PCR 分析，Actin为内参基因；b. qRT-PCR分析；F1~8，S1~8分别为可育株和不育株根、茎、叶、开放花、花萼、花瓣、花药以及雌蕊。

图5为CaMS1正、反义片段PCR电泳图；M：DL2000 Marker；1-正义片段；2-反义片段。

图6为CaMS1的正义片段测序结果。

图7为CaMS1的反义片段测序结果。

图8为CaMS1的目的片段测序blastn比对结果。

图9为CaMS1 pFGC5941-B质粒的酶切电泳图（BamHⅠ、SmaⅠ）；M：DL2000；1～5为重组质粒。

图10为CaMS1的RNAi载体转化农杆菌的菌液PCR电泳图；M：DL2000；CK：阴性对照：1～13为CaMS1 pFGC5941-B菌液。

图11为CaMS1 T₀代转化植株的PCR检测（Bar基因引物）；M：DL2000 Marker；1-阳性对照；2-空白对照；3-阴性对照；4~24为CaMS1 T₀代抗性植株。

图12为CaMS1 T₀代转化植株的PCR检测（35S启动子引物）；M：DL2000 Marker；1-阳性对照；2-空白对照；3-阴性对照；4~24为CaMS1 T₀代抗性植株

图13为转基因植株扩增片段序列比对结果。

图14为转基因植株与对照生长状况。

图15为CaMS1干扰植株与对照花器官形态。

图16为花粉离体萌发显微视图；A-CaMS1沉默植株；B-野生型。

图17为CaMS1 T0代转化植株的PCR检测（35S启动子引物）；M：DL2000；1-阴性对照；2-阳性对照；3～9为CaMS1 T₁代转基因植株。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1 辣椒核雄性不育两用系RNA的提取及cDNA的合成

以辣椒核雄性不育两用系AB114为材料，采用Trizol 法分别提取该材料可育株和不育株的共8个等级花蕾（分别为：1心叶卷曲成条状，花萼紧裹花冠；2心叶半展，花萼紧裹花冠；3心叶展开，花萼紧裹花冠，花柄直立；4花萼稍微裂开，微露花冠，花柄弯曲；5花萼与花冠齐平；6花冠伸出花萼部分约为花萼长的一半；7花冠伸出花萼部分与花萼等长；8次日将开的花）以及根、茎、叶、开放花、花萼、花瓣、花药以及雌蕊的总RNA，具体步骤如下：

S1. 向2.0 mL 离心管中加入1 mL Trizol提取液，称取0.1 g材料于液氮中迅速研磨成粉末状后转移到装有提取液的离心管中，振荡混匀，冰上静置5 min；

S2. 加入0.25 mL 氯仿，剧烈振荡30 s，冰上静置5 min；

S3. 4℃下，13000 rpm 离心15 min；

S4. 重复步骤S2、S3一次；

S5. 将上清液转移到另一新的离心管，加入2/3体积异丙醇，振荡混匀，冰上静置10 min，4℃下，12000 rpm 离心10 min；

S6. 弃上清，用 75%乙醇洗涤沉淀2~3次；

S7. 10000 rpm 离心5 min 收集沉淀，彻底去除75%乙醇，稍干燥后用适量RNase-free 水溶解RNA，-75℃保存备用。

取经过DNase I（RNase Free）处理和纯化的辣椒可育株或不育株八个等级混合花蕾总RNA样品，进行琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，见图1。

将辣椒花蕾总RNA样品用TE溶液适当稀释之后，用核酸蛋白仪测得A260/A280 比值在2.0 左右，A260/A230 比值大于2.0，表明RNA 纯度高，完整性良好，具体结果见表1。

表1 辣椒可育株或不育株八个等级混合花蕾的RNA吸光度值测定

接着，以提取的RNA为模板，采用市售试剂盒完成辣椒各组织部位cDNA的合成，得到不育株和可育株8个等级花蕾以及根、茎、叶、开放花、花萼、花瓣、花药以及雌蕊的cDNA。

实施例2 CaMS1基因的合成及测序

利用RNA-Seq方法对辣椒可育株和不育株的八个等级混合花蕾进行RNA表达差异分析，发现一个983bp的EST序列只在可育株中表达，以该序列为探针在NCBI中比对分析表明，该EST与许多雄性不育相关蛋白2（male sterility 2）有较高的相似性（约75％），这些male sterility 2在花粉发育过程中起着重要的作用，推测该基因可能与花粉发育相关。将该基因通过电子克隆、3’RACE和5’RACE扩增，得到cDNA拼接序列全长，命名为CaMS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。

为了验证推测，设计了一对特异引物：

上游(5’-3’): CTATAATCTTTCCTTCCATTCCCTTTG

下游(5’-3’): AATCACAAGTCCTTCGGAAAGAAAA

以可育株辣椒八个等级混合混合花蕾的cDNA为模板，利用上述引物进行特异PCR。扩增的反应体系为：cDNA 模板1 μL，10×cDNA PCRbuffer 2.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物 1 μL，下游引物（10 μmol/L）1.0 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH₂O 17.25 μL，总体积25.0 μL。PCR 扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性50 s，50~54℃退火40 s，72℃延伸2 min，35个循环后再72℃延伸5 min。回收PCR产物，并克隆测序。

上述PCR得到了一条约2000bp的条带，回收该条带，并克隆测序，得到了CaMS1的cDNA序列全长1919bp，包含一个1758bp的最大开放阅读框，如图2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。经分析，发现该序列正确，并验证了拼接结果。

实施例3 RT-PCR和qRT-PCR分析CaMS1基因的时空表达特性

RT-PCR分析：

分别以实施例1获得的不育株和可育株8个等级花蕾以及根、茎、叶、开放花、花萼、花瓣、花药以及雌蕊一链cDNA为模板，以Actin为内参进行半定量RT-PCR分析，检测各花粉发育相关基因的表达情况。

CaMS1基因特异引物：

上游：5’ -AAATCTTCCCTCAGGAGTCAATCAG-3’；

下游：5’ -AATCACAAGTCCTTCGGAAAGAAAA-3’

以及Actin特异引物：

上游：5’-CCTCTTCACTCTCTGCTCTCTCCTCA-3’；

下游：5’ -GTCATTTTCTCTCTATTTGCCTTGGG-3’

RT-PCR的反应体系为：cDNA模板1.0 μL，10×PCR buffer2.0 μL，上下游特异引物（10μM）各0.6 μL，dNTPs (2.5 mM) 1.6 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.2 μL，补足ddH₂O 至20 μL。RT-PCR所用程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，50~55℃退火30 s，72℃延伸60 s，26~30个循环后再72℃延伸5 min，10℃下保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，拍照。

以Actin为内参基因，用CaMS1基因特异引物对CaMS1进行了花蕾发育不同时期和不同组织部位的RT-PCR表达分析，结果表明，CaMS1在花蕾的不同发育时期有不同的表达水平。在可育株的第1~4级花蕾中几乎见不到该基因的表达。在第5级花蕾时突然表达强烈，而在第6级花蕾及其以后等级的花蕾检测不到其表达情况。在不育株的各级花蕾中均检测不到它的表达（图3a）。这说明CaMS1在辣椒花蕾发育的中期表达，推测CaMS1可能参与了绒毡层的发育。另外，在对不同器官的表达情况进行分析后发现，CaMS1仅在可育株的花药中表达，而在其它部位，如根、茎、叶、花萼、花瓣、雌蕊均不表达。在不育株中的所有的检测的部位该基因都不表达（图4a），也说明该基因可能与花药发育有关。

分析：

为了进一步验证RT-PCR的结果，本研究对该基因进行了qRT-PCR分析。首先以辣椒各级花蕾的cDNA为模板进行qRT-PCR，然后再以辣椒的根、茎、叶、开放花、花萼、花瓣、花药、雌蕊的cDNA为模板，进行qRT-PCR反应，每个反应设3次重复。

CaMS1基因特异引物：

上游：5’ -ATGATGGCGAAAGAGGTTGACG-3’；

下游：5’ -CCATTTACATACGCTGTGGATACTTG-3’

以及Actin特异引物：

上游：5’ -AATCAATCCCTCCACCTCTTCACTC-3’；

下游：5’ -CATCACCAGCAAATCCAGCCTT-3’

qRT-PCR反应体系如下：cDNA模板 1.0 μL、10 μL 2×SYBR GreenI MIX、15 μmolL^-1正向引物0.2 μL、15 μmol L^-1反向引物 0.2 μL，加水至总体积达到20 μL。PCR程序：94℃ 2 min；94℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 35 s，40个循环；产物用融解曲线分析，并用琼脂糖凝胶电泳验证。BIO-RAD 公司的IQ5软件收集数据。各基因在不同材料之间的相对表达量用CT值的2^-△△CT法处理获得（Livak et al,2001）。

结果表明，在可育株中，CaMS1的表达首先在第4级的花蕾中检测到微弱的表达，在第5级表达量达到最大值，而在第6级花蕾中也仅有微弱的表达。在可育系的第7、8等级，以及不育株的第1~8等级均检测不到该基因的表达（图3b）。这一结果与前面的RT-PCR结果类似，验证了前面的结果。在对CaMS1在不同器官中的表达情况进行分析时，qRT-PCR同样验证了前面RT-PCR的结果（图4b），即CaMS1只在可育株的花药中表达，是一个花药特异的基因。

实施例4 构建CaMS1基因的RNAi 干扰载体

1. CaMS1基因RNAi正、反义片段的克隆

根据实施例2中CaMS1基因全长的测序结果，通过Blast比对，分别选取基因中间一段含有内含子的序列设计2对特异引物，在正义片段的两端引入SwaI和NcoI限制性内切酶切位点，在反义片段的两端引入SmaI和BamHI限制性内切酶切位点，以辣椒八个等级混合混合花蕾cDNA为模板，PCR扩增出正义、反义基因片段，其目的片段大小约为200bp。

正、反义序列的引物是：

UP-SP4-1：5′-CGGATTTAAATAGTCAGTGGAGCAAGCAA-3′，

UP-SP4-2：5′- CGCGGATCCAGTCAGTGGAGCAAGCAA-3′；

DW-SP4-1：5′-CATGCCATGGTTAGCCCTGGAATGTGGA-3′，

DW-SP4-2：5′-TCCCCCGGGTTAGCCCTGGAATGTGGA-3′。

（1）扩增体系：

（2）反应条件

94℃，5 min；94℃，1min，54℃，1 min，72℃，2 min，30个循环；72℃，10 min；16℃保存。

PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒回收。取20μL PCR回收产物送测序公司测序。

上述CaMS1目的片段的PCR扩增，扩增出大小约210bp的正、反义片段（图5），连接到pMD19-T载体上，测序结果分别是为215bp、212 bp（图6，图7），经Blast分析表明扩增片段正确（图8）。

2. 正义片段的插入

（1）pFGC5941空质粒和正义片段的双酶切

采用碱裂解法提取大肠杆菌中的pFGC5941空质粒，然后分别都用SwaI和NcoI双酶切pFGC5941空质粒和回收得到的正义片段，37℃酶切过夜。双酶切体系如下：10×buffer（K）4μL，BSA 4μL，质粒DNA 10 μL，SwaI 1μL，NcoI 1μL，加ddH₂O至40 μL，混匀。

（2）pFGC5941空质粒和正义片段的连接

先取双酶切产物回收大片段和正义片段，然后用Takara的T₄DNA连接酶16℃连接过夜。连接反应体系如下：T₄ buffer 2.5 μL，正义片段10 μL，质粒载体2 μL，T₄ DNA连接酶1 μL，加ddH₂O 至25 μL，混匀。

（3）连接产物转化大肠杆菌

制备DH5α感受态细胞，将连接产物转化DH5α感受态，Km 100mg/L LB平板37℃培养过夜。第二天挑取单菌落用含Km 100 mg/L LB液体37℃摇菌过夜，菌液提取质粒。质粒用NcoI和SwaI双酶切检测。插入正义片段的载体命名为pFGC5941-A。

3. 反义片段的插入

（1）pFGC5941-A质粒和反义片段的双酶切

用碱裂解法提取大肠杆菌中的pFGC5941-A质粒，然后分别都用BamHI和SmaI双酶切pFGC5941-A质粒和回收的反义片段，30℃酶切过夜。双酶切体系如下：10×buffer（T）2μL，BSA 4μL，质粒DNA 10 μL，BamHI 1μL，SmaI 1μL，加ddH₂O至40 μL，混匀。

（2）pFGC5941-A质粒和反义片段的连接

先取双酶切产物回收大片段和反义片段，然后用Takara的T₄DNA连接酶16℃连接过夜。连接反应体系同前述pFGC5941空质粒和正义片段的连接反应体系。

（3）连接产物转化大肠杆菌

pFGC5941-A质粒和反义片段的连接产物转化大肠杆菌以及质粒的提取参照前述连接产物转化大肠杆菌的方法。同一质粒分别用BamHI、SmaI和SwaI、NcoI两套双酶切检测，结果切出预期大小为200bp的目的条带（图9），说明目的基因已成功插入到植物表达载体pFGC5941中，将其命名为pFGC5941-B。

4. 重组质粒转化农杆菌

（1）转化农杆菌感受态细胞

1）取新鲜制备的或-70℃保存的200μL农杆菌感受态细胞，置冰上，完全解冻后轻轻将细胞悬浮；

2）加入5μL CaMS1 pFGC5941-B质粒混匀后冰上放置30 min；

3）将离心管放入液氮中速冻5 min，37℃水浴中热激1 min，迅速将转至冰上，冰浴2 min；

4）加入1 mL YEP液体培养基，28℃振荡培养1 h；

5）4000 rpm离心5 min，留100 μL YEP培养液悬浮细胞；

6）将菌液涂布于含有Km 100 mg/L＋Str 100 mg/L 的YEP平板上，28 ℃培养24-48 h。

（2）重组子鉴定

挑取长出的农杆菌菌落用Km 100 mg/L＋Str 100 mg/L 的YEP液体28℃摇菌24h，提取质粒，再用质粒进行PCR检测，能够得到目的片段（图10），说明植物表达载体已成功转入农杆菌中，表达载体构建成功，为以后的遗传转化创造了条件。

实施例5 农杆菌介导的PFGC5941-CaMS1的辣椒遗传转化

（1）辣椒无菌苗的获得

首先挑选饱满、粒大的辣椒种子用无菌水冲洗2-3次，去除杂质，然后用75%酒精消毒1min，无菌水冲洗2～3遍，然后用2%次氯酸钠溶液消毒12 min（期间不断摇动），用无菌水洗3次，倒去无菌水，再用无菌水浸泡10 min～15 min，最后倒去无菌水，用灭菌滤纸吸去种子表面残留水分，播种在1/2 MS培养基中，置于人工培养室培养。置于25～28℃黑暗条件下培养，5～6d既可以观察到下胚轴冒出，然后把种子取出放到温度27℃左右、光照2000 lx14 h/d培养条件下培养，待辣椒小苗长出两片子叶并且生长点即将露出时即可制取外植体，从种子播种到可以制备外植体大约需要14 d左右。

（2）预培养

将弗莱明高比尔（Flamingo-bill）外外植体放入分化培养基，于人工培养室27℃黑暗预培养2～3 d。所述Flamingo-bill外植体即是：将培养的无菌苗的一侧子叶从叶柄基部连同顶芽及周围分生组织全部切去，只留一侧子叶。

（3）农杆菌侵染及共培养

侵染前4d取出保存于-80℃的超低温冰箱中的含有表达载体的农杆菌，于YEP固体培养基上（Str 100 mg/L，Km 100 mg/L）划平板，28℃恒温培养24～48h。挑取单菌落置于10mL含Str 100mg/L、Km 100mg/L和AS 200mg/L的YEP液体培养基中，28℃下200rpm振荡过夜，次日转至50mL YEP液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.4~0.8。

辣椒外植体预培养2d后，在超净工作台上用准备好的农杆菌菌液浸染12 min，期间不时摇动，然后放于经高温高压灭菌的报纸上至半干，再接种到同一分化培养基中，每瓶接种15个左右的外植体，并在(25±1)℃条件下恒温黑暗培养2~3d。

（4）抑菌培养

将共培养2d的Flamingo-bill外植体接种于抑菌培养基中，放在人工培养室27 ℃培养4～5d。

（5）筛选培养

外植体抑菌培养之后，接种于筛选培养基上，每两周继代一次，继代2～3次。直到只有少许外植体能在筛选培养基上长出抗性芽，而大部分外植体在含PPT的筛选培养基上褪绿，变黄焦化为止。

本实验用PPT进行筛选，由于PPT对植物毒害作用较大，找到适合辣椒的筛选压很重要。实验中分两组共设置了11个浓度梯度（表3），结果表明：当PPT浓度大于3 mg/L时，辣椒Flamingo-bill外植体不定芽的分化受到强烈抑制，大部分褐化枯死；当PPT浓度小于1.5mg/L时，辣椒Flamingo-bill外植体不定芽的分化较好，但假阳性较多，因此采用的筛选浓度是2 mg/L，并且顺利得到抗性植株。

表3 Flamingo-bill外植体对PPT的敏感性实验

（6）生根培养

当分化的不定芽伸长至1.5～2.5 cm时，将其自基部切下，接种于生根培养基中诱导其生根。当根长至1.5 cm左右，数量达到5根以上后，大约30d左右，开瓶盖炼苗2～3 d，然后移至装有高压灭菌的珍珠岩和泥炭土混合营养钵或花盆中，最终获得48株抗性苗。30株是辣椒612品种，18株是辣椒59品种。

实施例6 CaMS1基因干扰植株的分子与植物学鉴定

1. T₀代转基因植株的PCR检测

（1）引物序列

1）根据Bar基因引物序列（臧宁等，2008）

bar-UP：5′-ATGAGCCCAGAACGACGC-3′

bar-DW：5′-TCTCAAATCTCGGTGACG-3′

2) 根据CaMV35S启动子引物序列

S1-UP：5′-GAGGACCTAACAGAACTCG-3′

S2-DW：5′-GTCTTGCGAAGGATAGTGG-3′

（2）PCR扩增反应体系

DNA 模板1 μL，10×DNA PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10μmol/L）1 μL，下游引物（10μmol/L）1 μL，rTaq酶 0.25 μL，ddH₂O 17.25 μL，总体积25.0 μL。

（3）PCR扩增反应程序

94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环；72℃延伸5 min；12℃保存。

（4）PCR阳性率及转化率数据统计方法

提取实施例5转化植株的基因组DNA，分别用Bar基因和CaMV 35S启动子的两对引物对48株转CaMS1基因的抗性辣椒（30株是辣椒612品种，18株是辣椒59品种）进行PCR检测，结果有19株能够扩增出约为550bp目的条带（图11，图12），PCR阳性率分别为39.6%，初步证明RNAi载体已经转入辣椒。

选取转CaMS1基因3株，进行PCR扩增，将得到的亮带切胶回收（CaMV35S启动子引物），连接到pMD19-T载体上，经过转化、蓝白斑筛选，选取白斑进行摇菌和质粒抽提。将重组子送往测序公司测序，测出了全部基因序列，与预期相同（图13），确定为转基因植株。

2. T₀代转基因植株的花粉活力检测（琼胶离体萌芽测定法）

培养基的配制：10%蔗糖、100mg/kg硼酸(HB0₃)、5mg/kg赤霉素、100mg/kg硝酸钙(Ca(NO₃)₂·4H₂O)、0.8%的琼脂。

花粉的采集：分3天收集花朵，作为3次重复，采集时间在上午10时左右。采集花朵的标准为已开花但尚未散粉，采花后将花粉抖落在硫酸纸上，并充分混匀。

具体操作：将培养基加热熔化后倒人培养皿中，凝成约0.5cm厚的均匀薄层，配成固体培养基。用解剖针将花粉均匀涂于培养基上，盖好放入培养箱中培养。将培养基放在黑暗、恒温(25士l)℃条件下培养3小时，然后在光学显微镜下观测萌发率。培养基均设3个重复，每个重复观测3个互不重叠的视野，统计200个以上花粉粒的萌发情况，以花粉管长度超过l/2花粉直径作为萌发标准。

花粉萌发率=(已萌发的花粉粒数/总花粉粒数)×100%。

通过观察发现所有的转基因辣椒都表现出正常的营养生长和生殖生长（图14）。相对于野生型和对照来说，CaMS1被抑制的转基因植株的花药开裂较迟，花粉管要比野生型的短，而且花药中的花粉较少（图15）。最后选取PCR条带较亮且亮度差不多的3株CaMS1 RNAi转基因植株进行离体培养检测其花粉活力，结果是干扰植株的花粉萌发率为21.84%，而野生型是52.63%（图16）。

3、T₁代转基因植株的PCR检测

按照Ezup柱式植物基因组提取试剂盒提取T₁代转基因辣椒的DNA，用CaMV 35S启动子的引物对24株辣椒进行PCR检测，结果有7株T₁代转基因辣椒能够扩增出约为550bp目的条带（图17），分离比例为17：7，阳性率为29.2%。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种辣椒花粉发育相关基因CaMS1及其应用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1919

<212> DNA

<213> 基因CaMS1的cDNA序列

<400> 1

ctataatctt tccttccatt ccctttgaac ttttttctcc cttgtttctc tttgcatcta 60

tggcggctat gggtagtcta tgttcttcct cttgtatatc aaaaactgtg atgaaattgt 120

ctaagaattg gagatggtgc cctcccaaga aggtatattg tcaaactagt ggtacaaagt 180

ctggtaatgt ttcttctgtt gtaacagaga gatcatcggt gattagctcg gaaactttag 240

gaagtttggt tttgagtcca aatgccgaaa tcaaagtcaa ggatttggtg ccttatggtc 300

agtcaaggca tgatgatggt ataggcatta ccaagtttct gagagggaaa gcatttctca 360

ttactggtgc aactggtttt ctgggaaaag ttctaattga gaagatctta aggacagcac 420

ctgatgtgaa caaaatattc atcttgatca aggcaaagaa caaagaagtt gctatgcaga 480

gattgaagaa tgaaatcctc aatgctgata tattcaactg cctcaaacaa gttcatggga 540

aatcctatca gactttcatg ttgagcaagt tggtacctct gttaggaaat gtttgtgaag 600

ctaaccttgg aattgatgaa gacacagcca acatgatggc gaaagaggtt gacgtaattg 660

taaattctgc tgcgaatacc actttcgatg aaaggtacga tatttcactt gatataaata 720

ctgaaggacc tagccgcctt atgaactttg caaaacaatg tcgcaacctt aaactctttc 780

ttcaagtatc cacagcgtat gtaaatggac agcgacaagg tagaattatg gaaaaggcat 840

tcggcattgg agacagtata gcaagggaaa atcttccctc aggagtcaat cagagctcct 900

ccccctcttt gaatgttgaa gatgagataa agttagtttt ggagtccaaa caaggtttag 960

aagataattc agtggctcag aaaatgaaag agattggttt aaggagagct aacaaatttg 1020

gatggcaaga cacttacgta ttcacaaagg caatgggaga gatgatgata gacagcatga 1080

gaggtgatat tccggtagta attattcgac caagtgttat tgagagcacc tacaaggaac 1140

catttcctgg atggatggaa gggagcagga tgatggatcc aatcatcttg tactatggta 1200

aaggacagct cacagggttt ctcgtagacc ctaatggagt tcttgatgtg gttccagctg 1260

acatggttgt gaatgcaacc ttggcagcca tggcaaaaca tgggacagaa ggaaaaccag 1320

gaagtagcag tgtttaccag gttgcttcat ctgctgtaaa tccattagtc ttcaaggacc 1380

tggccagaat gctatttgag cacttcaatc gttcacccta tattgattcc aaaggaagac 1440

caattcatgt tccaaaaatg tcgctgctca gatccatgga ggacttatca tcccatctat 1500

ggcgagacgc cattaacaga agtggcctaa cagatttgac agatccaaat gggaagttgt 1560

ccaggaaact tgagaatatc tgtaggaagt cagtggagca agcaaagtac cttgctaata 1620

tttatgaacc gtacactttt tatggaggaa gatttgacaa cagcaatacc cagaggttga 1680

tggaatgcat gtctaaagaa gaaagatggc aatttggatt tgatgtagaa agcatagatt 1740

ggaaagatta catctctaat gtccacattc cagggctaag gaagcatgtg atgaaaggaa 1800

gaggatcatg cagttaatgc cagtctgtcc tttatgtttc tgcatcttat cttaactgta 1860

atacaagtat acgaccgctg gttttattta tactttttct ttccgaagga cttgtgatt 1919

<210> 2

<211> 1758

<212> DNA

<213> 基因CaMS1的开放阅读框序列

<400> 2

atggcggcta tgggtagtct atgttcttcc tcttgtatat caaaaactgt gatgaaattg 60

tctaagaatt ggagatggtg ccctcccaag aaggtatatt gtcaaactag tggtacaaag 120

tctggtaatg tttcttctgt tgtaacagag agatcatcgg tgattagctc ggaaacttta 180

ggaagtttgg ttttgagtcc aaatgccgaa atcaaagtca aggatttggt gccttatggt 240

cagtcaaggc atgatgatgg tataggcatt accaagtttc tgagagggaa agcatttctc 300

attactggtg caactggttt tctgggaaaa gttctaattg agaagatctt aaggacagca 360

cctgatgtga acaaaatatt catcttgatc aaggcaaaga acaaagaagt tgctatgcag 420

agattgaaga atgaaatcct caatgctgat atattcaact gcctcaaaca agttcatggg 480

aaatcctatc agactttcat gttgagcaag ttggtacctc tgttaggaaa tgtttgtgaa 540

gctaaccttg gaattgatga agacacagcc aacatgatgg cgaaagaggt tgacgtaatt 600

gtaaattctg ctgcgaatac cactttcgat gaaaggtacg atatttcact tgatataaat 660

actgaaggac ctagccgcct tatgaacttt gcaaaacaat gtcgcaacct taaactcttt 720

cttcaagtat ccacagcgta tgtaaatgga cagcgacaag gtagaattat ggaaaaggca 780

ttcggcattg gagacagtat agcaagggaa aatcttccct caggagtcaa tcagagctcc 840

tccccctctt tgaatgttga agatgagata aagttagttt tggagtccaa acaaggttta 900

gaagataatt cagtggctca gaaaatgaaa gagattggtt taaggagagc taacaaattt 960

ggatggcaag acacttacgt attcacaaag gcaatgggag agatgatgat agacagcatg 1020

agaggtgata ttccggtagt aattattcga ccaagtgtta ttgagagcac ctacaaggaa 1080

ccatttcctg gatggatgga agggagcagg atgatggatc caatcatctt gtactatggt 1140

aaaggacagc tcacagggtt tctcgtagac cctaatggag ttcttgatgt ggttccagct 1200

gacatggttg tgaatgcaac cttggcagcc atggcaaaac atgggacaga aggaaaacca 1260

ggaagtagca gtgtttacca ggttgcttca tctgctgtaa atccattagt cttcaaggac 1320

ctggccagaa tgctatttga gcacttcaat cgttcaccct atattgattc caaaggaaga 1380

ccaattcatg ttccaaaaat gtcgctgctc agatccatgg aggacttatc atcccatcta 1440

tggcgagacg ccattaacag aagtggccta acagatttga cagatccaaa tgggaagttg 1500

tccaggaaac ttgagaatat ctgtaggaag tcagtggagc aagcaaagta ccttgctaat 1560

atttatgaac cgtacacttt ttatggagga agatttgaca acagcaatac ccagaggttg 1620

atggaatgca tgtctaaaga agaaagatgg caatttggat ttgatgtaga aagcatagat 1680

tggaaagatt acatctctaa tgtccacatt ccagggctaa ggaagcatgt gatgaaagga 1740

agaggatcat gcagttaa 1758

<210> 3

<211> 585

<212> PRT

<213> 基因CaMS1编码的蛋白

<400> 3

Met Ala Ala Met Gly Ser Leu Cys Ser Ser Ser Cys Ile Ser Lys Thr

1 5 10 15

Val Met Lys Leu Ser Lys Asn Trp Arg Trp Cys Pro Pro Lys Lys Val

20 25 30

Tyr Cys Gln Thr Ser Gly Thr Lys Ser Gly Asn Val Ser Ser Val Val

35 40 45

Thr Glu Arg Ser Ser Val Ile Ser Ser Glu Thr Leu Gly Ser Leu Val

50 55 60

Leu Ser Pro Asn Ala Glu Ile Lys Val Lys Asp Leu Val Pro Tyr Gly

65 70 75 80

Gln Ser Arg His Asp Asp Gly Ile Gly Ile Thr Lys Phe Leu Arg Gly

85 90 95

Lys Ala Phe Leu Ile Thr Gly Ala Thr Gly Phe Leu Gly Lys Val Leu

100 105 110

Ile Glu Lys Ile Leu Arg Thr Ala Pro Asp Val Asn Lys Ile Phe Ile

115 120 125

Leu Ile Lys Ala Lys Asn Lys Glu Val Ala Met Gln Arg Leu Lys Asn

130 135 140

Glu Ile Leu Asn Ala Asp Ile Phe Asn Cys Leu Lys Gln Val His Gly

145 150 155 160

Lys Ser Tyr Gln Thr Phe Met Leu Ser Lys Leu Val Pro Leu Leu Gly

165 170 175

Asn Val Cys Glu Ala Asn Leu Gly Ile Asp Glu Asp Thr Ala Asn Met

180 185 190

Met Ala Lys Glu Val Asp Val Ile Val Asn Ser Ala Ala Asn Thr Thr

195 200 205

Phe Asp Glu Arg Tyr Asp Ile Ser Leu Asp Ile Asn Thr Glu Gly Pro

210 215 220

Ser Arg Leu Met Asn Phe Ala Lys Gln Cys Arg Asn Leu Lys Leu Phe

225 230 235 240

Leu Gln Val Ser Thr Ala Tyr Val Asn Gly Gln Arg Gln Gly Arg Ile

245 250 255

Met Glu Lys Ala Phe Gly Ile Gly Asp Ser Ile Ala Arg Glu Asn Leu

260 265 270

Pro Ser Gly Val Asn Gln Ser Ser Ser Pro Ser Leu Asn Val Glu Asp

275 280 285

Glu Ile Lys Leu Val Leu Glu Ser Lys Gln Gly Leu Glu Asp Asn Ser

290 295 300

Val Ala Gln Lys Met Lys Glu Ile Gly Leu Arg Arg Ala Asn Lys Phe

305 310 315 320

Gly Trp Gln Asp Thr Tyr Val Phe Thr Lys Ala Met Gly Glu Met Met

325 330 335

Ile Asp Ser Met Arg Gly Asp Ile Pro Val Val Ile Ile Arg Pro Ser

340 345 350

Val Ile Glu Ser Thr Tyr Lys Glu Pro Phe Pro Gly Trp Met Glu Gly

355 360 365

Ser Arg Met Met Asp Pro Ile Ile Leu Tyr Tyr Gly Lys Gly Gln Leu

370 375 380

Thr Gly Phe Leu Val Asp Pro Asn Gly Val Leu Asp Val Val Pro Ala

385 390 395 400

Asp Met Val Val Asn Ala Thr Leu Ala Ala Met Ala Lys His Gly Thr

405 410 415

Glu Gly Lys Pro Gly Ser Ser Ser Val Tyr Gln Val Ala Ser Ser Ala

420 425 430

Val Asn Pro Leu Val Phe Lys Asp Leu Ala Arg Met Leu Phe Glu His

435 440 445

Phe Asn Arg Ser Pro Tyr Ile Asp Ser Lys Gly Arg Pro Ile His Val

450 455 460

Pro Lys Met Ser Leu Leu Arg Ser Met Glu Asp Leu Ser Ser His Leu

465 470 475 480

Trp Arg Asp Ala Ile Asn Arg Ser Gly Leu Thr Asp Leu Thr Asp Pro

485 490 495

Asn Gly Lys Leu Ser Arg Lys Leu Glu Asn Ile Cys Arg Lys Ser Val

500 505 510

Glu Gln Ala Lys Tyr Leu Ala Asn Ile Tyr Glu Pro Tyr Thr Phe Tyr

515 520 525

Gly Gly Arg Phe Asp Asn Ser Asn Thr Gln Arg Leu Met Glu Cys Met

530 535 540

Ser Lys Glu Glu Arg Trp Gln Phe Gly Phe Asp Val Glu Ser Ile Asp

545 550 555 560

Trp Lys Asp Tyr Ile Ser Asn Val His Ile Pro Gly Leu Arg Lys His

565 570 575

Val Met Lys Gly Arg Gly Ser Cys Ser

580 585

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> RT-PCR分析基因CaMS1的上游引物

<400> 4

aaatcttccc tcaggagtca atcag 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> RT-PCR分析基因CaMS1的下游引物

<400> 5

aatcacaagt ccttcggaaa gaaaa 25

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> qRT-PCR分析基因CaMS1的上游引物

<400> 6

atgatggcga aagaggttga cg 22

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> qRT-PCR分析基因CaMS1的下游引物

<400> 7

ccatttacat acgctgtgga tacttg 26

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> UP-SP4-1

<400> 8

cggatttaaa tagtcagtgg agcaagcaa 29

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> UP-SP4-2

<400> 9

cgcggatcca gtcagtggag caagcaa 27

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> DW-SP4-1

<400> 10

catgccatgg ttagccctgg aatgtgga 28

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> DW-SP4-2

<400> 11

tcccccgggt tagccctgga atgtgga 27

Claims (7)

1.一种辣椒花粉发育相关基因CaMS1，其特征在于，所述基因CaMS1的核苷酸序列如SEQID NO:1或2所示。

2.权利要求1所述的辣椒花粉发育相关基因CaMS1编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.RT-PCR分析权利要求1所述基因CaMS1的特异引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4～5所示。

4.qRT-PCR分析权利要求1所述基因CaMS1的特异引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6～7所示。

5.扩增权利要求1所述基因CaMS1的RNAi正、反义片段的引物对，其特征在于，正义序列的引物对如SEQ ID NO:8～9所示，反义序列的引物对如SEQ ID NO:10～11所示。

6.权利要求1所述基因CaMS1在制备雄性不育辣椒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述的基因转化到辣椒中，并筛选出雄性不育的植株。