CN110484543A

CN110484543A - 一种辣椒花药特异基因CaPL1及其应用

Info

Publication number: CN110484543A
Application number: CN201910770259.7A
Authority: CN
Inventors: 陈木溪; 杜冰梓; 陈坤豪; 陈如珠; 李树喜; 陈金俊; 李立斌; 郑汉藩
Original assignee: Guangdong Helinong Agricultural Research Institute Co Ltd; Guangdong Agricultural Seed Industry And Ltd By Share Ltd
Current assignee: Guangdong Helinong Agricultural Research Institute Co Ltd; Guangdong Agricultural Seed Industry And Ltd By Share Ltd
Priority date: 2019-08-20
Filing date: 2019-08-20
Publication date: 2019-11-22

Abstract

本发明公开了一种辣椒花药特异基因CaPL1及其应用。所述辣椒花药特异基因CaPL1全长1410bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；包含一个1191bp的最大开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。所述CaPL1只在可育株的第7，8级花蕾以及开放花中表达，且仅在花药组织中表达，是一个花药特异基因，与花药或花粉发育相关。使用烟草脆裂病毒作为载体，构建病毒诱导的基因沉默重组质粒，将质粒转入农杆菌后，感染辣椒植株，CaPL1在VIGS沉默植株花蕾中比空载体对照植株减少90％，相对于野生型和空载体对照植株，CaPL1沉默植株的花粉萌发率大幅降低。表明沉默辣椒植株花蕾中的CaPL1能够降低花粉的萌发率，可通过沉默CaPL1基因来创制辣椒雄性不育材料，为辣椒育种提供新的材料。

Description

一种辣椒花药特异基因CaPL1及其应用

技术领域

本发明涉及辣椒育种技术领域，更具体地，涉及一种辣椒花药特异基因CaPL1及其应用。

背景技术

辣椒(Capsicum annum L.)属于茄科(Solanaceae)茄亚族(Solaninae Dunal)辣椒属一年或多年生草本植物，是一种世界性的蔬菜和加工调味品目前我国辣椒杂交制种多采用蕾期人工去雄、授粉，不但制种成本高而且很难保证种子纯度，利用雄性不育系配制一代杂种，不仅可以简化制种程序，降低种子生产成本，而且可以提高杂种的纯度。因此，雄性不育的选育及其应用研究越来越受到人们的重视。花粉败育是植物雄性不育发生的表型体现，花粉发育的全过程和分子机理是研究植物雄性不育的基础和关键。近年来，利用雄性不育系进行雄蕊和花粉发育研究、育性基因表达调控研究成为植物育种领域的研究热点。目前，仅有少数关于辣椒花粉发育相关基因被报道，因此仍需研究开发更多关于辣椒花粉发育相关基因，以用于创制辣椒雄性不育材料，为辣椒育种提供新的材料。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种辣椒花药特异基因CaPL1。

本发明的另一目的在于提供所述CaPL1基因的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

在前期研究中，发明人以辣椒核雄性不育两用系AB114为材料，通过RNA-seq技术鉴定到一系列可育株特异表达基因。可育株与不育株花蕾的唯一区别是不育株没有花粉形成，可育株花粉布满整个花药，因此理论上，在可育株花蕾中表达而不在不育株花蕾中表达的基因都有可能与花粉的发育相关。在这些基因中，一个果胶裂解酶相关基因(CaPL1)被进一步研究。

一种辣椒花药特异基因CaPL1，全长1410bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；包含一个1191bp的最大开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

由所述辣椒花药特异基因CaPL1编码得到的辣椒花药特异蛋白CaPL1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明通过RT-PCR和qRT-PCR分析发现，CAPL1基因在花蕾的不同发育时期有不同的表达水平。在可育株的第1～6级花蕾中几乎见不到该基因的表达，从第7级花蕾才开始表达，在第8级花蕾中表达强烈，在开放花中表达量略下降，可见该基因在花粉发育的后期表达，可能与花粉壁的形成相关。而在不育株114A的各级花蕾中均看不到它的表达。另外，在对不同器官的表达情况进行分析后发现，CAPL1仅在可育株的花药中表达，而在其它部位如根、茎、叶、花萼、花瓣、雌蕊均不表达。在不育株中的所有的检测的部位该基因也都不表达，说明该基因可能与花药或花粉发育有关。进一步研究发现，在可育株中，CAPL1的表达只在可育株的第7，8级花蕾以及开放花中表达，在第8级花蕾表达量达到最高。而在可育系的第1～6级花蕾，以及不育株的第1～8等级均检测不到该基因的表达，表明CAPL1只在可育株的花药中表达，是一个花药特异基因。

本申请还提供所述CAPL1基因的特异性引物，包括上游引物和下游引物，其序列依次如SEQ ID NO：4～5所示；

F：5’-AAAGAGTCGTGAAGTAAGAAGCCATAA-3’(SEQ ID NO：4)，

R：5’AAATGGAACATATAATTGTGGCCTGTG-3’(SEQ ID NO：5)。

进一步地，使用烟草脆裂病毒(TRV2)作为载体，构建病毒诱导的基因沉默(VIGS)重组质粒，将质粒转入农杆菌后，感染辣椒植株，CaPL1表达水平在VIGS沉默植株花蕾中比空载体对照植株(pTRV2)减少90％。相对于野生型和空载体对照植株(pTRV2)，CaPL1沉默植株的花粉萌发率大幅降低。说明沉默辣椒植株花蕾中的CaPL1能够降低花粉的萌发率，推测CaPL1在辣椒花粉发育中起着一定的作用，沉默CaPL1基因有望创制辣椒雄性不育材料，为辣椒育种提供新的材料。

本发明还提供所述辣椒花粉发育相关基因CaPL1的重组载体；优选地，所述重组载体为CaPL1基因的沉默表达载体；更优选地，为CaPL1基因的烟草脆裂病毒(TRV2)载体。

本发明还提供所述含有所述重组载体的重组菌，所述重组菌为根癌农杆菌。

本发明还提供所述基因CaPL1或蛋白CaPL1在辣椒花粉败育中的应用。

本发明还提供所述基因CaPL1或所述蛋白CaPL1在创制雄性不育辣椒中的应用。

具体地，为降低、沉默或敲除CaPL1基因在辣椒中的表达，从而得到雄性不育辣椒品种。

具体地，为构建辣椒花药特异基因CaPL1的基因沉默重组质粒，并转化农杆菌，得到重组农杆菌，再用重组农杆菌转染辣椒外植体，经培养获得转化植株，筛选得到雄性不育辣椒。

优选地，用于构建CaPL1基因沉默表达载体的上游扩增引物和下游扩增引物分别如SEQ ID NO：6～7所示，用于扩增约350bp的干扰片段。

F：5’-cgtgagctcggtaccggatccAGACCATGTTGGGATGAGGACTG-3’(SEQ ID NO：6)；

R：5’-gtgagtaaggttaccgaattcTAATATGCATTTTCTTGTCTTCCGC-3’(SEQ ID NO：7)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的与辣椒花粉发育相关基因CaPL1，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2所示。通过表达分析发现，所述CaPL1仅在花药组织中表达，是一个花药特异基因，与花药或花粉发育相关。通过构建CaPL1基因的VIGS沉默植株，得到了花粉萌发率大幅降低的新材料，通过对该材料的改进与优化可进一步创制出辣椒雄性不育材料，对辣椒新品种的选育有重要价值。

附图说明

图1为CAPL1基因的cDNA全长序列与推导的氨基酸序列；画线部分为引物序列；起始密码子和终止密码子用黑体表示。

图2为推测的CAPL1蛋白的保守区域。

图3为用NJ法构建的CAPL1及其相似蛋白进化树。

图4为推导的CAPL1及其同源基因氨基酸序列多重比对单箭头区域内为Pec-lyase-c保守域。

图5为CAPL1在辣椒花蕾不同发育时期的表达情况；A为RT-PCR分析，Actin为内参基因；为qRT-PCR分析；F1～9代表可育株第1～8级花蕾以及刚开放的花；S1～9代表不育株第1～8级花蕾以及刚开放的花。

图6为CAPL1在辣椒不同组织部位的表达情况；A为RT-PCR分析，Actin为内参基因；为qRT-PCR分析；F1～7，S1～7分别为可育株和不育株根、茎、叶、花萼、花瓣、花药以及雌蕊。

图7为VIGS方法沉默CaPL1的辣椒沉默植株的情况；A为沉默植株中CaPL1的表达分析；B为VIGS植株与对照生长状况以及花器官形态比较；C为空载体植株和VIGS沉默植株的花粉萌发率比较。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

下列实施例中的供试材料来自华南农业大学园艺学院保存的辣椒核雄性不育两用系AB114。初花期鉴别可育株与不育株并挂牌编号，于盛花期选取长势基本一致的植株进行样品采集。将处于不同发育阶段的花蕾大致分为8个等级：1)心叶卷曲成条状，花萼紧裹花冠；2)心叶半展，花萼紧裹花冠；3)心叶展开，花萼紧裹花冠，花柄直立；4)花萼稍微裂开，微露花冠，花柄弯曲；5)花萼与花冠齐平；6)花冠伸出花萼部分约为花萼长的一半；7)花冠伸出花萼部分与花萼等长；8)次日将开的花。所有材料在田间用75％酒精擦拭干净后用锡纸包好，立即投入液氮固定，于-75℃保存备用。按照CN 105039353A公开的方法进行辣椒核雄性不育两用系RNA的提取及cDNA的合成。

实施例1电子克隆获得CaPL1基因全长

在前期研究中，我们以辣椒核雄性不育两用系AB114为材料，通过RNA-seq技术鉴定到一系列可育株特异表达基因。首先以得到的EST序列作为查询探针，利用NCBI中的Blast工具，搜索辣椒EST数据库，对得到的同源性较高的(>98％)辣椒EST序列进行拼接、延伸，并以新获得的重叠群(Contig)为新探针，继续搜索EST数据库，直到没有新的辣椒EST可供拼接为止。将拼接完成的新基因序列在非冗余数据库中进行BlastX比对搜索，确认是否已经得到目的基因全长。如果得到基因拼接全长的目的基因，就设计全长扩增引物进行实验验证，而如果没有得到全长的基因再设计引物进行侧翼序列的扩增。

以辣椒CaPL1的EST(GD094243.1)序列为探针，采用电子克隆手段，在NCBI的辣椒EST数据库中进行同源检索，发现两条来源于辣椒的EST(GD093968.1，BM068513.1和GD088387.1)序列与探针具有极高的同源性(>98％)，且均有大于50bp的重叠序列。经过拼接并去除冗余序列后，得到了CAPL1的cDNA序列1307bp，然而通过BlastX比对发现，并没有得到CAPL1的cDNA全长序列，在其5端可能还缺少100bp。

实施例2 RACE技术扩增基因侧翼序列

通过实施例1电子克隆没有得到CaPL1的最大开放阅读框，通过分析基因特点，确定目的基因的准切方向，并大致估计其5端缺少的序列长度，设计一对正向(S)和(或)一对反向(A)基因特异引物用于RACE扩增：

PL1-5’-1：TGTTGTTTGCCACTGCTGCCCCTA；

PL1-5’-2：ATGCGATGAATAACAGGACAACAAG。

以5'-RACE-Ready cDNA为模板，利用反向(A)基因特异引物与5’锚定引物组合再进行两轮半巢式PCR扩增，从而获得基因的5’末端。RACE扩增的反应体系为：cDNA模板2.5μL，10×cDNA PCR buffer 2.5μL，dNTP Mix(10mmol/L)0.5μL，锚定引物2.5μL，基因特异引物(10μmol/L)1.0μL，Advantage cDNA Polymerase Mix 0.25μL，ddH₂O 15.75μL，总体积25.0μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性40s，50～60℃退火30s，72℃延伸120s，32个循环后再72℃延伸5min，12℃下保存。回收PCR产物，并克隆测序。

通过两轮半巢式PCR，得到了一条约200bp的片断，回收测序表明，该片断长231bp，与原拼接序列有79bp的重复序列。去除冗余序列后，得到了CAPL1的cDNA全长序列1410bp，包含一个1191bp的最大开放阅读框。

实施例3 CaPL1目的基因全长克隆和序列分析

为了验证拼接验证电子克隆和拼接结果，并得到CaPL1的cDNA和DNA全长序列，根据所得的拼接序列设计特异扩增引物：

Upper(5’-3’)：AAAGAGTCGTGAAGTAAGAAGCCATAA；

Lower(5’-3’)：AAATGGAACATATAATTGTGGCCTGTG。

以可育株混合花蕾的cDNA和基因组DNA为模板，进行特异PCR。扩增的反应体系为：cDNA模板1μL，10×cDNA PCRbuffer 2.5μL，dNTP Mix(2.5mmol/L)2μL，上游引物1μL，下游引物(10μmol/L)1.0μL，rTaq酶0.25μL，ddH₂O 17.25μL，总体积25.0μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性50s，50～54℃退火40s，72℃延伸2min，35个循环后再72℃延伸5min，12℃下保存。回收PCR产物，并克隆测序。

经PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后，得到一条1400bp左右的条带。测序结果表明，CAPL1测序结果与拼接序列完全一致，验证了前面的电子克隆和5’RACE结果。

对推导的CAPL1编码氨基酸序列进行结构和功能域的分析表明，CAPL1编码396个氨基酸(图1)。编码的假定蛋白质的分子量为44.37kDa，等电点为9.22，包含碱性氨基酸(K，R)49个，酸性氨基酸(D，E)37个，疏水氨基酸(A，I，L，F，W，V)137个，极性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)97个。通过ProtParam工具疏水性预测发现CAPL1是亲水的，其总平均亲水性(GRAVY)为-0.261。其稳定指数为38.57，说明推导的蛋白是稳定的。其推导的氨基酸序列包含一个Pec-lyase-c基因家族保守域(图2)。

在NCBI数据库中进行同源搜索发现推测的CAPL1氨基酸序列与来自番茄果胶裂解酶(CAA33524)有78％的相似性，与来自烟草的果胶裂解酶(CAA47630)有79％的相似性。除此之外，还与来自杨树、葡萄、蓖麻和大豆的果胶裂解酶有70％以上的相似性，其结果如表1所示，这些相似蛋白的序列大小主要集中在390～440个氨基酸之间，与CAPL1类似。

表1 CAPL1在NCBI上Blast结果

用MEGA4软件对CAPL1和它的相似蛋白序列一起进行了聚类分析(图3)，发现参与分析的蛋白序列主要分为两枝。一枝是CAPL1与蕃茄和烟草的果胶裂解酶，除这三个以外的其它果胶裂解酶聚在另一枝上。CAPL1与6个其它果胶裂解酶比对分析发现，与CAPL1类似，这些蛋白都包含一个Pec-lyase-c保守域(图4)。

实施例4 CAPL1基因在辣椒花蕾不同发育时期和不同组织部位中表达分析

分别以不育株和可育株8个等级花蕾以及根、茎、叶、开放花、花萼、花瓣、花药以及雌蕊一链cDNA为模板，以Actin为内参进行半定量RT-PCR分析，检测CaPL1的表达情况。所用基因特异引物：

Upper(5’-3’)：AAAGAGTCGTGAAGTAAGAAGCCATAA，

Lower(5’-3’)：AAATGGAACATATAATTGTGGCCTGTG。

以及内参基因Actin的特异引物：

Actin-up：5’-CCTCTTCACTCTCTGCTCTCTCCTCA-3’，

Actin-dn：5’-GTCATTTTCTCTCTATTTGCCTTGGG-3’。

RT-PCR的反应体系为：cDNA模板1.0μL，10×PCR buffer2.0μL，上下游特异引物(10μM)各0.6μL，dNTPs(2.5mM)1.6μL，Taq DNApolymerase(5U/μL)0.2μL，补足ddH₂O至20μL。RT-PCR所用程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，50～55℃退火30s，72℃延伸60s，26～30个循环后再72℃延伸5min，10℃下保存。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，拍照，为保证结果的准确性，验证试验重复3次。

结果表明，CAPL1在花蕾的不同发育时期有不同的表达水平。在可育株的第1～6级花蕾中几乎见不到该基因的表达，从第7级花蕾才开始表达，在第8级花蕾中表达强烈，在开放花中表达量略下降，可见该基因在花粉发育的后期表达，可能与花粉壁的形成相关。而在不育株114A的各级花蕾中均看不到它的表达(图5A)。另外，在对不同器官的表达情况进行分析后发现，CAPL1仅在可育株的花药中表达，而在其它部位如根、茎、叶、花萼、花瓣、雌蕊均不表达。在不育株中的所有的检测的部位该基因也都不表达(图6A)，说明该基因可能与花药或花粉发育有关。

为了检测CAPL1在不同花蕾发育时期的准确表达趋势，验证RT-PCR的结果，对CAPL1基因进行了qRT-PCR分析。结果表明，在可育株中，CAPL1的表达只在可育株的第7，8级花蕾以及开放花中表达，在第8级花蕾表达量达到最高。而在可育系的第1～6级花蕾，以及不育株的第1～8等级均检测不到该基因的表达(图5B)。这一结果与前面的RT-PCR结果类似，验证了前面的结果。而在对CAPL1在不同器官中的表达情况进行分析时，qRT-PCR同样验证了前面RT-PCR的结果(图6B)，即CAPL1只在可育株的花药中表达，是一个花药特异基因。

实施例5 CAPL1基因VIGS重组载体构建及植物材料的侵染

1、VIGS重组载体构建

设计引物上游引物：

5’-cgtgagctcggtaccggatccAGACCATGTTGGGATGAGGACTG-3’，

下游引物：

5’-gtgagtaaggttaccgaattcTAATATGCATTTTCTTGTCTTCCGC-3’，用于扩增约350bp的干扰片段。

PCR扩增总体系为50μL：DNA5μL；Forward Primer(10μM)5μL；Reverse Primer(10μM)5μL；PCR Master Mix 25μL；ddH₂0 10μL；反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35cycles；72℃延伸5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的PCR产物切胶回收。

用两种限制性内切酶EcoRI、BamHI将TRV2载体双酶切后，回收酶切产物，并用T4连接酶将片断连接到TRV2载体的EcoRI-BamHI位点上(图1)。然后进行目的片段与载体的连接，并转化大肠杆菌，获得重组质粒后将其转入农杆菌GV3101。对基因片段PCR扩增结果进行电泳检测，琼脂糖凝胶电泳结果显示，条带清晰，与预期大小一致。通过双酶切,与载体连接、测序，成功克隆出CaPL1基因片段，可用于构建病毒载体。将基因片段连接到大肠杆菌感受态，并过夜接种，菌落PCR检测；然后将重组病毒载体质粒转化到农杆菌GV3101中，用细菌液检测PCR，得到阳性结果。

2、植物材料的侵染

植物材料的农杆菌侵染过程参照前人的方法(Chung et al,2004；Liu et al,2002)。将具有正常育性的辣椒种在营养钵中。然后在25℃、16h光照，8h黑暗交替的室内培养。具体做法为，首先，将步骤1得到的含有重组质粒的GV3101菌株振荡培养在28℃恒定的温度下含有三种抗生素的一个YEB培养基(卡那霉素50mg/mL，四环素5mg/mL，利福平50mg/mL)中。OD600值达到0.6时；菌液通过以3000rpm离心15分钟收集后，弃去上清液，并且将细胞悬浮于等体积的感染缓冲液(10mM MES，200μM As，10mM MgCl₂)；将悬浮液在室温下静置1个小时；然后，将pTRV1菌株与等体积的其他菌株混合，并接种5至6片真叶(播种后约35天)(张秋实，2010)。选择幼小的辣椒叶，用不带针头的2mL注射器从划伤的嫩叶背面将混合细菌注入辣椒叶。当叶面看起来为水渍状时即可停止，每株植物接种3片叶子。先在黑暗中在16℃和60％相对湿度下培养1天，然后将植物转移至25℃，16小时光照和8小时黑暗的原始培养条件。

3、基因沉默植株的形态与细胞学观察

观察并记录实验辣椒植株形态。观察植物的营养生长，花器官发育情况，包括花药的形态、花丝的长短和大小以及花粉有无及多少等。

在体外对花粉进行萌发实验。其半固体培养基的制备：5％蔗糖+100mg L^-1硼酸+5mg L^-1赤酶素+0.3％琼脂。收集花的时间是上午9时许。每个植株采集5朵刚开裂的花。收获后，将该花粉抖到硫酸纸上。充分混合后，花粉粒均匀(花粉不宜太密)散布在玻璃片上。无盖玻璃片的情况下，将载玻片在24℃下放置在覆盖有湿滤纸的培养皿，并置于黑暗恒温培养6个小时后，在显微镜下观察发芽率，花粉管的长度超过了花粉粒的直径的1/2是萌发花粉，观察3株基因沉默的辣椒植株和相应对照辣椒植株。用两张玻片进行单株制作。观察每个玻片五个或更多个不同的视野，总观察不低于150颗花粉发芽的情况。

4、辣椒VIGS沉默植株中CaPL基因表达分析(qRT-PCR)

设计CaPL1基因的特异引物：

F：5’-GACTGGGGATGAAGGTGATG-3’，

R：5’-AATGGTTGTAAGCCAAGGTA-3’，和内参基因Actin引物：

Actin2-F：5’-AAGAAGGAGAAGCAGTTAGAGAGC-3’，

Actin2-R：5’-GTCATTTTCTCTCTATTTGCCTTGGG-3’，辣椒自交系59的野生型，空载体(pTRV2)阴性对照和沉默CaPL1辣椒植株的第8级花芽cDNA用作qRT-PCR的反应中的模板。每个反应设置3次重复。所述的qRT-PCR反应体系如下：cDNA模板1.0μL，10μL的2×SYBRGreenIMIX，20μmolL^-1正向引物0.2μL，20μmolL^-1反向引物0.2μL，并加水至总体积20μL。PCR程序：94℃，2分钟；94℃10秒，56℃20秒，72℃25秒，40个循环。将产物通过熔解曲线分析，并用琼脂糖凝胶电泳证实。数据统计分析应用Microsoft Excel 2016(叶珊，2013)。CaPL1在不同辣椒材料之间的相对表达量用CT值的2^-△△CT法处理获得。

利用qRT-PCR的方法对野生型、空载体(pTRV2)对照和沉默CaPL1的辣椒植株的第8等级花蕾进行基因沉默效率分析。结果表明，CaPL1水平在TRV2:CaPL1沉默植株中比对照(pTRV2)减少90％以上(图7A)。最后选了4株CaPL1沉默植株作进一步的花粉形态和萌发率分析。

所有沉默植株均显示正常营养生长和生殖生长，植物形态并没有太大的差别(图7B)。相对于野生型和对照植株(pTRV2)来说，CaPL1沉默植株的花药开裂较迟，而且花药中的花粉较少(图7B)。然而，这些表型在CaPL1表达量较低的沉默植株中并不十分明显。为了进一步研究沉默CaPL1表达后对辣椒花粉发育的影响，我们在体外测试花粉的发芽率。结果表明，野生型的花粉萌发率为57.33％，对照植物的花粉萌发率(pTRV2)为52.15％，而CaPL1的沉默的植株仅为10.23％(图7C)。说明沉默辣椒植株花蕾中的CaPL1能够降低花粉的萌发率，推测CaPL1在辣椒花粉发育中起着一定的作用，沉默CaPL1基因有望创制辣椒雄性不育材料，为辣椒育种提供新的材料。

序列表

<110> 广东和利农种业股份有限公司

广东和利农农业研究院有限公司

<120> 一种辣椒花药特异基因CaPL1及其应用

<141> 2019-08-20

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213> 辣椒(Capsicum annum L.)

<400> 1

aaagagtcgt gaagtaagaa gccataatgc tatagggaat atcttgggtt tggtctacga 60

aaattagtca tcagccctac aaactttatc aagaccaaag accaaactct cgtttcccat 120

aaaaatacac aaaaagaaaa aaagaaaaga aaaaagaaga aaaataatta aaaaaagaaa 180

gaaaaaaact atgaatatct ccaaaacaaa aatgaacgga cttgttgtcc tgttattcat 240

cgcatttgtg agtgtagggg cagcagtggc aaacaacacc acgagaaggg ggttaggcgt 300

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<210> 2

<211> 1191

<212> DNA

<213> 辣椒(Capsicum annum L.)

<400> 2

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ggaccatgtg tgtcctctaa tcttattgac aaatgctgga gatgtgaccg tcgttgggct 180

gaatatcgcg aaaaatatgc tacatgtgcc ctcggttttg gccgcaatgc tcttggtgga 240

aaaggtggaa aggtttacgt tgttacagat aactctgatc acaacgtgga gaatcctcca 300

ccaggtaccc ttaggcatgc ggtgattcaa aaggagccct tgtggatcgt attcggcaaa 360

cacatgcata taaagctgac gagggaactg ctggtgcaaa gctacaaaac catcgatgcc 420

cgtggattca atatccatat cgaacatgga gctggaatta agatgcaaaa tgtgaacaac 480

gttatcatca gtaaccttca cattcacaac attcgagtta ctggtggtgg catgatcagg 540

gactcagtag accatgttgg gatgaggact ggggatgaag gtgatgccat cagcatcttc 600

gcgtctcgcg acatctggat agaccacgtg tccatgtcac gtgccgcaga tgggctcatc 660

gatgccgtcc aaggatcaac cggtatcacc atctccaact gtcacttcac tgatcacgat 720

aaagtaatgt tgtttggtgc aaatgatgaa tacgcggaag acaagaaaat gcatattacc 780

ttggcttaca accattttgg taagaggttg gatcaaagga tgcctaggtg caggctcgga 840

ttcttccatc ttgtcaacaa tgattacacc cattggatga ggtatgctat tggcggaagc 900

agtgaagcaa caattattag ccagggtaac cgttttatcg cacaacaaaa taatttaatt 960

aaagaggtga cacacaggga aaaggcagta gagtcagtgt ggaagcattg gacttggtta 1020

tcattggatg acgatatgcg aaatggtgca ttctttagaa cttctggtga tcaaacagca 1080

ctaaccaaat tacgacacct taatttgata ccggcagagc catcatacaa agttggaatt 1140

cttactaaat tctcaggatc acttgcttgc ttagtaggac gaccttgcta g 1191

<210> 3

<211> 396

<212> PRT

<213> 辣椒(Capsicum annum L.)

<400> 3

Met Asn Ile Ser Lys Thr Lys Met Asn Gly Leu Val Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Ile Ala Phe Val Ser Val Gly Ala Ala Val Ala Asn Asn Thr Thr Arg

20 25 30

Arg Gly Leu Gly Val Lys Tyr Arg Gly Pro Cys Val Ser Ser Asn Leu

35 40 45

Ile Asp Lys Cys Trp Arg Cys Asp Arg Arg Trp Ala Glu Tyr Arg Glu

50 55 60

Lys Tyr Ala Thr Cys Ala Leu Gly Phe Gly Arg Asn Ala Leu Gly Gly

65 70 75 80

Lys Gly Gly Lys Val Tyr Val Val Thr Asp Asn Ser Asp His Asn Val

85 90 95

Glu Asn Pro Pro Pro Gly Thr Leu Arg His Ala Val Ile Gln Lys Glu

100 105 110

Pro Leu Trp Ile Val Phe Gly Lys His Met His Ile Lys Leu Thr Arg

115 120 125

Glu Leu Leu Val Gln Ser Tyr Lys Thr Ile Asp Ala Arg Gly Phe Asn

130 135 140

Ile His Ile Glu His Gly Ala Gly Ile Lys Met Gln Asn Val Asn Asn

145 150 155 160

Val Ile Ile Ser Asn Leu His Ile His Asn Ile Arg Val Thr Gly Gly

165 170 175

Gly Met Ile Arg Asp Ser Val Asp His Val Gly Met Arg Thr Gly Asp

180 185 190

Glu Gly Asp Ala Ile Ser Ile Phe Ala Ser Arg Asp Ile Trp Ile Asp

195 200 205

His Val Ser Met Ser Arg Ala Ala Asp Gly Leu Ile Asp Ala Val Gln

210 215 220

Gly Ser Thr Gly Ile Thr Ile Ser Asn Cys His Phe Thr Asp His Asp

225 230 235 240

Lys Val Met Leu Phe Gly Ala Asn Asp Glu Tyr Ala Glu Asp Lys Lys

245 250 255

Met His Ile Thr Leu Ala Tyr Asn His Phe Gly Lys Arg Leu Asp Gln

260 265 270

Arg Met Pro Arg Cys Arg Leu Gly Phe Phe His Leu Val Asn Asn Asp

275 280 285

Tyr Thr His Trp Met Arg Tyr Ala Ile Gly Gly Ser Ser Glu Ala Thr

290 295 300

Ile Ile Ser Gln Gly Asn Arg Phe Ile Ala Gln Gln Asn Asn Leu Ile

305 310 315 320

Lys Glu Val Thr His Arg Glu Lys Ala Val Glu Ser Val Trp Lys His

325 330 335

Trp Thr Trp Leu Ser Leu Asp Asp Asp Met Arg Asn Gly Ala Phe Phe

340 345 350

Arg Thr Ser Gly Asp Gln Thr Ala Leu Thr Lys Leu Arg His Leu Asn

355 360 365

Leu Ile Pro Ala Glu Pro Ser Tyr Lys Val Gly Ile Leu Thr Lys Phe

370 375 380

Ser Gly Ser Leu Ala Cys Leu Val Gly Arg Pro Cys

385 390 395

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 辣椒(Capsicum annum L.)

<400> 4

aaagagtcgt gaagtaagaa gccataa 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 辣椒(Capsicum annum L.)

<400> 5

aaatggaaca tataattgtg gcctgtg 27

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 辣椒(Capsicum annum L.)

<400> 6

cgtgagctcg gtaccggatc cagaccatgt tgggatgagg actg 44

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 辣椒(Capsicum annum L.)

<400> 7

gtgagtaagg ttaccgaatt ctaatatgca ttttcttgtc ttccgc 46

Claims

1.辣椒花药特异基因CaPL1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

2.辣椒花药特异蛋白CaPL1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.含有权利要求1所述辣椒花粉发育相关基因CaPL1的重组载体。

4.含有权利要求3所述重组载体的重组菌。

5.权利要求1所述基因CaPL1或权利要求2所述蛋白CaPL1在辣椒花粉败育中的应用。

6.权利要求1所述基因CaPL1或权利要求2所述蛋白CaPL1在创制雄性不育辣椒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，降低、沉默或敲除CaPL1基因在辣椒中的表达，从而得到雄性不育辣椒品种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，构建辣椒花药特异基因CaPL1的基因沉默重组质粒，并转化到辣椒中，筛选出雄性不育的植株。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用于构建CaPL1基因沉默表达载体的上游扩增引物和下游扩增引物分别如SEQ ID NO：6～7所示。