CN109722446A - 一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法及其应用 - Google Patents

一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种辣椒CRISPR/Cas9基因编辑方法及应用，属于基因编辑技术领域。首先设计sgRNA引物MMD1CaCRISPR‑Cas9‑F和MMD1CaCRISPR‑Cas9‑R，构建辣椒基因编辑载体；利用植物花粉纳米磁转化技术介导转化，实现对辣椒的基因编辑。本发明首次在辣椒中使用植物花粉纳米磁转化技术作为基因编辑的转化方法，并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得单基因敲除突变植株，突变率达到60％；为后续多基因敲除，基因片段插入、替换等奠定技术基础。

Description

一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法及其应用。
背景技术
转基因技术在培育植物新品种中发挥着非常重要的作用，传统植物新品中培育均需经过繁琐、长周期的组织培养过程，严重影响了遗传转化过程。
基因组定点编辑(site-specific genome editing)技术是指可以在基因组水平上对DNA序列进行定点改造的遗传操作技术。它在基因组改造、基因功能研究和转基因新品种培育等方面都具有重大的应用价值。然而基因组定点编辑技术的发展一直进展缓慢，直到21世纪，随着蛋白质结构和功能领域研究的新突破和人工核酸内切酶(engineeredendonuclease，EEN)技术出现，将特异识别与结合DNA的蛋白质结构域和EEN结构域融合，创造出了能特异切割DNA的序列特异性核酸酶(sequence-specific nucleases，SSNs)，从而真正上实现了简单、快速、高效和精确地对基因组特定位点进行靶向编辑的目的。
CRISPR/Ca9编辑系统自1987年发现至今，已形成了开发利用CRISPR的研究热潮，如今CRISPR研究已经风靡科学界。随着CRISPR/Cas9系统的成型，以及具有的低成本、构建简单和高效等优点，使其广泛地应用于人类、动物、植物等生物体的基因组编辑上。在植物基因组定点编辑方面，CRISPR/Cas9系统也迅速地被应用到拟南芥、烟草等双子叶植物和水稻、高粱、小麦、玉米等单子叶植物中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株；但是对于辣椒的基因编辑方法未见报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法。本发明的另一目的是一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法在辣椒基因编辑中的应用。本发明首次在辣椒中使用植物花粉纳米磁转化技术作为基因编辑的转化方法，并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得单基因敲除突变植株，突变率达到60％；为后续多基因敲除，基因片段插入、替换等奠定技术基础。
技术方案：为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，首先设计sgRNA引物MMD1CaCRISPR-Cas9-F和MMD1CaCRISPR-Cas9-R，构建辣椒基因编辑载体；利用植物花粉纳米磁转化技术介导转化，实现对辣椒的基因编辑。包括以下步骤：
(1)构建辣椒基因花粉纳米磁转化介导转化载体MMD1CaCRISPR-Cas9载体；
(2)将载体质粒DNA、纳米磁珠、花粉培养基、辣椒花粉混合后进行磁转化，得到磁转化花粉；
(3)将磁转化花粉晾干后，进行人工授粉；
(4)收取转化种子后，播种进行鉴定。
优选的，融合后的产物转化大肠杆菌，转化步骤为：取连接产物10μL，加入到50μLDH5α感受态细胞中，轻弹混匀后，置于冰上30min，42℃热激90s，冰上静置2min，然后加入500μL无抗性LB，置于37℃恒温摇床中，复苏1h后，涂抹在含有卡纳抗性的平板。
优选的，所述步骤(1)，设计sgRNA引物MMD1CaCRISPR-Cas9-F和MMD1CaCRISPR-Cas9-R，引物序列分别为：
MMD1CaCRISPR-Cas9-F：5’-GTCTTC-GGATGTCCGATTACACTAAT
MMD1CaCRISPR-Cas9-R：5’-CAGAAG-ATTAGTGTAATCGGACATCC
将引物进行退火后，用BbsI限制性内切酶酶切载体pCAS9-TPC，并与退火后的引物连接，融合后的产物转化大肠杆菌，提取质粒，即为辣椒基因编辑载体。
优选的，所述步骤(2)，具体操作为：首先将纳米磁珠与质粒DNA按照质量比例为1∶1室温复合30min；再将花粉0.2g、花粉培养基0.5mL混合均匀后，在强磁下转化30min。
优选的，所述步骤(2)，花粉培养基的配方为：每100mL花粉培养基包括15％蔗糖、10mg H3BO3、5.3mg KNO3、10.3mg Ca(NO3)2、51.7mg MnSO4、10.3mg MgSO4·7H2O和3mg GA3。
优选的，所述步骤(2)，纳米磁珠与质粒DNA质量比例为1∶1。
优选的，所述步骤(3)，具体操作为：将磁转化花粉，去除上清液后，将花粉放置于滤纸上，并在35℃烘箱中烘10min；烘干的花粉立即进行授粉，授粉时间在上午11点左右，并于下午2点-3点对上午人工授粉的辣椒再授粉一次，授粉间隔期间，磁转化花粉放置于4℃冰箱，干燥保存。
优选的，所述步骤(4)，具体操作为：种子播种出苗后，在长出第4片真叶时进行除草剂草铵膦鉴定；除草剂草铵膦的使用浓度为0.2％；喷施除草剂草铵膦每10天喷一次，共计喷施3次。
上述一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法在辣椒基因编辑中的应用。
有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：
本发明首次在辣椒中使用植物花粉纳米磁转化技术作为基因编辑的转化方法，并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得单基因敲除突变植株，根据抗草铵膦植株数量统计，转化率达到60％左右；为后续多基因敲除，基因片段插入、替换等奠定技术基础。
附图说明
图1为转化植株PCR检测图；
图2为实验组和对照组辣椒植株在喷施除草剂之后的生长状况对比图，其中图a为非转基因辣椒植株，图b为转基因辣椒植株。
图3为MMD1基因编辑辣椒PCR检测测序图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1
一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，包括以下步骤：
(1)构建辣椒基因花粉纳米磁转化介导转化载体MMD1CaCRISPR-Cas9载体；设计sgRNA引物MMD1CaCRISPR-Cas9-F和MMD1CaCRISPR-Cas9-R，引物序列分别为：
MMD1CaCRISPR-Cas9-F：5’-GTCTTC-GGATGTCCGATTACACTAAT
MMD1CaCRISPR-Cas9-R：5’-CAGAAG-ATTAGTGTAATCGGACATCC
将引物进行退火，退火步骤为95℃3min，然后将引物离心管放置在95℃水中，冷却至室温，然后16℃5min。用BbsI限制性内切酶酶切载体pCAS9-TPC，并与退火后的引物连接，反应条件为16℃2h。融合后的产物转化大肠杆菌，转化步骤为：取连接产物10μL，加入到50μLDH5α感受态细胞中，轻弹混匀后，置于冰上30min，42℃热激90s，冰上静置2min，然后加入500μL无抗性LB，置于37℃恒温摇床中，复苏1h后，涂抹在含有卡纳抗性的平板。挑去阳性菌落培养后提取质粒，即为辣椒基因编辑载体；
(2)将载体质粒DNA、纳米磁珠、花粉培养基、辣椒花粉混合后进行磁转化，得到磁转化花粉；具体操作为：首先将纳米磁珠与质粒DNA按照质量比例为1∶1室温复合30min；再将花粉0.2g、花粉培养基0.5mL混合均匀后，在强磁下转化30min；花粉培养基的配方为：每100mL花粉培养基包括15％蔗糖、10mg H3BO3、5.3mg KNO3、10.3mg Ca(NO3)2、51.7mg MnSO4、10.3mg MgSO4·7H2O和3mg GA3；纳米磁珠与质粒DNA质量比例为1∶1。
(3)将磁转化花粉晾干后，进行人工授粉；具体操作为：将磁转化花粉，去除上清液后，将花粉放置于滤纸上，并在35℃烘箱中烘10min；烘干的花粉立即进行授粉，授粉时间在上午10点左右，并于下午2点-3点对上午人工授粉的辣椒再授粉一次，授粉间隔期间，磁转化花粉放置于4℃冰箱，干燥保存。
(4)收取转化种子后，播种进行鉴定，具体操作为：设置对照组和实验组，对照组(a)为非转基因辣椒，实验组(b)为转基因辣椒；对两组进行同样的操作，种子播种出苗后，在长出第4片真叶时进行草铵膦鉴定；草铵膦的使用浓度为0.2％；喷施除草剂草铵膦每10天喷一次，共计喷施3次，辣椒生长状况如图2所示。如图2所示，对照组(a)非转基因辣椒在喷施除草剂草铵膦后出现辣椒苗枯萎甚至死苗现象，而实验组(b)转基因辣椒的生长不受除草剂草铵膦的影响，生长良好，具有良好的抗药性，说明辣椒种子转化成功并且效果明显。
图1为转化植株PCR检测图，用pCAS9-TPC特异引物检测具有草铵膦抗性植株，其中1-3为pCAS9-TPC载体为模板，4-17为具有草铵膦抗性的转化植株为模板的结果，说明具有草铵膦抗性的转化植株中含有pCAS9-TPC载体序列。
(5)将具有抗草铵膦抗性植株提取DNA后为模板，用MMD1特异引物进行克隆，引物序列为F：GAAGATTACAAGAAGAAGAAGAA，R：TAACCGAGCTCTTCACATTCT，送测序公司测序，检测测序结果如图3，结果显示在PAM序列后具有双峰，表明Crispr/Cas9系统已经按照预想位置进行定向基因编辑。
本发明首次在辣椒中使用植物花粉纳米磁转化技术作为基因编辑的转化方法，并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得单基因敲除突变植株，突变率达到60％；为后续多基因敲除，基因片段插入、替换等奠定技术基础。

Claims (10)

1.一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，其特征在于，首先设计sgRNA引物MMD1CaCRISPR-Cas9-F和MMD1CaCRISPR-Cas9-R，构建辣椒基因编辑载体；利用植物花粉纳米磁转化技术介导转化，实现对辣椒的基因编辑。
2.根据权利要求1所述的一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建辣椒基因花粉纳米磁转化介导转化载体MMD1CaCRISPR-Cas9载体；
(2)将载体质粒DNA、纳米磁珠、花粉培养基、辣椒花粉混合后进行磁转化，得到磁转化花粉；
(3)将磁转化花粉晾干后，进行人工授粉；
(4)收取转化种子后，播种进行鉴定。
3.根据权利要求1或2所述的一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述步骤(1)，设计sgRNA引物MMD1CaCRISPR-Cas9-F和MMD1CaCRISPR-Cas9-R，引物序列分别为：
MMD1CaCRISPR-Cas9-F：5’-GTCTTC-GGATGTCCGATTACACTAAT
MMD1CaCRISPR-Cas9-R：5’-CAGAAG-ATTAGTGTAATCGGACATCC
将引物进行退火后，用BbsI限制性内切酶酶切载体pCAS9-TPC，并与退火后的引物连接，融合后的产物转化大肠杆菌，提取质粒，即为辣椒基因编辑载体。
4.根据权利要求3所述的一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，其特征在于，融合后的产物转化大肠杆菌，转化步骤为：取连接产物10μL，加入到50μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀后，置于冰上30min，42℃热激90s，冰上静置2min，然后加入500μL无抗性LB，置于37℃恒温摇床中，复苏1h后，涂抹在含有卡纳抗性的平板。
5.根据权利要求2所述的一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述步骤(2)，具体操作为：首先将纳米磁珠与质粒DNA按照质量比例为1∶1室温复合30min；再将花粉0.2g、花粉培养基0.5mL混合均匀后，在强磁下转化30min。
6.根据权利要求2所述的一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述步骤(2)，花粉培养基的配方为：每100mL花粉培养基包括15％蔗糖、10mg H3BO3、5.3mg KNO3、10.3mg Ca(NO3)2、51.7mg MnSO4、10.3mg MgSO4·7H2O和3mg GA3。
7.根据权利要求2所述的一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述步骤(2)，纳米磁珠与质粒DNA质量比例为1∶1。
8.根据权利要求2所述的一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述步骤(3)，具体操作为：将磁转化花粉，去除上清液后，将花粉放置于滤纸上，并在35℃烘箱中烘10min；烘干的花粉立即进行授粉，授粉时间在上午11点左右，并于下午2点-3点对上午人工授粉的辣椒再授粉一次，授粉间隔期间，磁转化花粉放置于4℃冰箱，干燥保存。
9.根据权利要求2所述的一种辣椒CRISPR-Cas9基因编辑方法，其特征在于，所述步骤(4)，具体操作为：种子播种出苗后，在长出第4片真叶时进行除草剂草铵膦鉴定；除草剂草铵膦的使用浓度为0.2％；喷施除草剂草铵膦每10天喷一次，共计喷施3次。
10.权利要求1-9中任一所述的方法在辣椒基因编辑中的应用。
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