CN113549617B - 编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9载体和应用 - Google Patents

编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9载体和应用，本发明设计了不结球白菜CENH3基因的sg RNA，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，将连接了目的DNA片段的CRISPR/Cas9载体转入不结球白菜基因组中，通过基因编辑实现对不结球白菜CENH3基因的定点突变。本发明使用花粉纳米磁转化技术结合CRISPR/Cas9技术对不结球白菜内源基因CENH3进行编辑，通过植株抗性筛选、PCR检测、基因测序筛选得到CENH3单倍体诱导系，为在不结球白菜双单倍体育种中利用CENH3介导的染色体消除机制获得单倍体奠定基础。

Description

编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9载体和 应用
技术领域
本发明涉及植物转基因技术领域和作物遗传育种领域，具体涉及编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9载体和应用。
背景技术
不结球白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)属异花授粉作物，其杂种优势显著，利用植物杂种优势的关键内容是选择基因型纯合、性状一致、遗传基础简单的纯合自交系，但在十字花科作物中，采用传统的育种方法获得纯合系需要连续自交7-8个世代。若获得单倍体植株，经过染色体加倍则可在一个世代就可以获得DH(doubled haploid)纯系，加快育种进程。目前不结球白菜的单倍体育种主要依赖植物组织培养技术诱导产生单倍体植株，再通过染色体组加倍得到双单倍体，但组织培养对于不结球白菜各个品种而言单倍体诱导效率低且周期长。
着丝粒特异组蛋白CENH3，真核生物的功能着丝粒中核小体组蛋白H3的变体，对着丝粒在染色体上的定位起重要作用。2010年，在拟南芥着丝粒组蛋白CENH3的研究中首次发现拟南芥cenh3无效突变体具有致死性，将经过遗传修饰的着丝粒特异性组蛋白编码基因CENH3导入该拟南芥突变体，可恢复植株的野生表型，转基因植株与野生型植株杂交可产生只含野生型基因组的单倍体。先正达公司将单倍体诱导与CRISPR/Cas9基因编辑技术结合，在两个世代内即可创造经基因编辑改良的双单倍体。由于CENH3组蛋白折叠结构域(HFD)非常保守，点突变造成的HFD单个氨基酸改变会降低CENH3的着丝粒结合功能，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对不结球白菜CENH3基因定点突变，是得到单倍体诱导系的一种快速可行的方法。
在棉花上，使用Fe3O4磁性纳米颗粒作为新材料，以静电吸附作用与带负电的外源质粒相结合，形成磁性纳米颗粒/DNA复合物，在磁场下使复合物通过花粉表面的孔穴进入花粉，再通过人工授粉实现外源基因的导入与转化，利用整体植株的生殖细胞进行转化，可直接收获转基因种子，并可针对性地对转基因植株的目标性状定向筛选，能够与转基因育种直接结合，从而提高目的基因的转导效率，缩短育种周期，这对于发展不结球白菜单倍体育种技术结合基因编辑技术、加速新种质材料的大规模制备和优良新品种的培育进程具有重要的参考价值。
发明内容
本发明的目的是提供利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其构建的CRISPR/Cas9载体。
本发明的另一目的是提供上述sgRNA及其构建的CRISPR/Cas9载体的应用。
本发明的又一目的是提供一种利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因获得单倍体诱导系的方法。
为了实现本发明目的，本发明选择不结球白菜CENH3基因为靶基因，提供利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因获得单倍体诱导系的方法，根据不结球白菜CENH3基因设计sgRNA，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，使用植物花粉纳米磁转化技术转化基因编辑载体的方法，将连接了目的DNA片段的CRISPR/Cas9载体通过磁性纳米颗粒/DNA复合物转入不结球白菜基因组中，通过基因编辑实现对不结球白菜CENH3基因的定点突变。
本发明使用花粉纳米磁转化技术结合CRISPR/Cas9技术对不结球白菜内源基因CENH3进行编辑，通过植株抗性筛选、DNA提取、PCR检测、基因测序筛选得到CENH3突变体，为在不结球白菜双单倍体育种中利用CENH3介导的染色体消除机制获得单倍体诱导系奠定基础。
利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA，核苷酸序列分别为sgRNA1：5'-AGAAGAGGAGGCAGCCAAGG-3'(SEQ ID NO.1)、sgRNA2：5'-GACTGCTTCATCTTCGGCGG-3'(SEQ ID NO.2)。
用于不结球白菜CENH3基因编辑的CRISPR/Cas9载体，所述的载体为插入编码所述的sgRNA编码序列的pYLCRISPR/Cas9P35S-B。
所述载体Brcenh3-Cas9的构建方法如下：
1)Brcenh3-sgRNA片段的构建
第一轮PCR以pYLgRNA-AtU6-1为模板，分别用引物sGAscI-F1/CENH3sG1R1、CENH3sG1F2/sGAscI-R2、sGAscI-F1/CENH3sG2R1、CENH3sG2F2/sGAscI-R2进行PCR扩增；将第一轮PCR产物进行凝胶电泳，并用胶回收试剂盒纯化，第二轮取1μL纯化目的片段进行融合PCR，扩增10个循环后再加入引物sGAscI-F1/sGAscI-R2进行扩增，即得含sgRNA1和sgRNA2的Brcenh3-sgRNA片段。
2)Brcenh3-Cas9载体的构建
将PYLCenh3-tailswap片段和与表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-B分别用AscI酶切并以T4连接酶连接，即构建得到Brcenh3-Cas9载体。
其中，步骤1)中使用的引物序列如下：
sGAscI-F1：5'-GATGGCGCGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTG-3'
CENH3sG1R1：
5'-GCTCTAAAACAGAAGAGGAGGCAGCCAAGGCAATCACTACTTCGACTCTAGCTG-3'
CENH3sG1F2：
5'-AGTAGTGATTGCCTTGGCTGCCTCCTCTTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3'
CENH3sG2R1：
5'-GCTCTAAAACGCTTCTCGTCGGGGTCGCACTCAATCACTACTTCGACTCTAGCTG-3'
CENH3sG2F2：
5'-AGTAGTGATTGAGTGCGACCCCGACGAGAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3'
sGAsc-IR2：5'-GATGGCGCGCCGCCATTTGTCTGCAGAATTGGC-3'
本发明所述的sgRNA在构建不结球白菜CENH3基因获得的单倍体诱导系中的应用。
本发明所述的CRISPR/Cas9载体在构建不结球白菜单倍体诱导系中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的单倍体诱导系为不结球白菜CENH3基因突变株。
一种利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因获得单倍体诱导系的方法，基于不结球白菜CENH3基因设计所述的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，利用植物花粉纳米磁转化技术转化不结球白菜，得到不结球白菜CENH3基因的定点突变植株。
作为本发明的一种优选，所述的方法包括以下步骤：
(1)提取含有外源目的基因的质粒；将测序结果正确的质粒进行摇菌扩繁，用试剂盒大量提取后检测质粒质量和浓度备用。
(2)收集不结球白菜花粉在花粉培养基中与质粒DNA、纳米磁珠混合后置于强磁板上进行磁转化处理，得到磁转化花粉；
(3)将磁转化花粉晾干后，进行人工授粉，授于提前剥蕾处理的柱头上；
(4)收取转化种子后，催芽后播种，苗期喷施草铵膦除草剂筛选抗性植株。
(5)根据sg RNA编辑位点的核苷酸序列设计引物，提取除草剂抗性植株的DNA，通过PCR法以及测序鉴定不结球白菜植株CENH3基因的突变位点。
所述步骤(2)，具体操作为:提取的质粒与磁性纳米载体各取1μg，分别用花粉培养基稀释到50μL，再混合形成100μL体系，体系中磁性纳米颗粒和质粒DNA质量比为1:1，室温静置连接30min，得到磁性纳米颗粒/DNA复合物，将花粉0.1～0.2g与花粉培养基0.3～0.5mL混合均匀后,加入磁性纳米颗粒/DNA复合物，在强磁下转化处理30min。
所述步骤(2)，优选的收集花粉条件为，晴朗天气，上午气温上升时，花粉散粉数量多，花粉活力最好。优选的花粉培养基的配方为：每100mL花粉培养基包括15g蔗糖、10mgH3B03、5.3mgKN03、10.3mgCa(N03)2、51.7mgMnS04、10.3mgMgS04·7H20和3mgGA3，ddH2O定容后pH调至6.5。
所述步骤(3),具体操作为：转化完成后，用移液枪吸去除花粉培养基上清液，将花粉放置于滤纸上，并在30℃～35℃环境下烘干或晾干10min，避免阳光暴晒；干燥后的花粉立即进行授粉，授粉时间在上午11点左右。
所述步骤(4),具体操作为：种子播种出苗后，在长出第4片真叶时进行除草剂抗性鉴定，除草剂有效成分草铵膦的使用浓度为100mg/L。
步骤(5)的引物序列如下：CENH3-F:SEQ ID NO.11、CENH3-R：SEQ ID NO.12。
有益效果：
与现有的技术相比，本发明易于操作，提供利用CRISPR/Cas9技术定点突变不结球白菜CENH3基因的方法，根据不结球白菜CENH3基因设计sg RNA，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，使用植物花粉纳米磁转化技术转化基因编辑载体的方法，将连接了目的DNA片段的CRISPR/Cas9载体转入不结球白菜基因组中，通过基因编辑实现对不结球白菜CENH3基因的定点突变。该方法实验周期短、操作简便，不涉及组织培养技术得到目的基因定点突变植株，可进一步将CENH3介导的染色体消除诱导单倍体机制应用于不结球白菜中，在不结球白菜双单倍体育种进程中具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中Cas9阳性植株PCR琼脂糖电泳检测图；M为标准DNA分子量2000bp Marker，条带大小由下至上分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。目的片段大小为1030bp，+表示Brcenh3-Cas9质粒的阳性对照，-表示无DNA模板ddH2O负对照，24表示CENH3转基因植株中第24棵苗T0代植株。
图2为本发明实施例1中不结球白菜植株在喷施除草剂之后的生长状况对比图，其中图a为不抗除草剂不结球白菜植株，图b为抗除草剂不结球白菜植株，图c为另一基因编辑不结球白菜植株。
图3为本发明实施例1中不结球白菜CENH3基因sg RNA编辑位点PCR检测测序峰图，其中图a为24-11号单菌落，图b为24-24号单菌落，黑色框中为PAM序列。
图4为本发明实施例1中不结球白菜CENH3基因编辑位点序列比对图，黑色框中为PAM序列。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，结合以下具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件及按照制造厂商说明书建议的条件下操作。
实施例1
供试材料为不结球白菜品种‘四九菜心’
1、sg RNA的设计与载体Brcenh3-Cas9的构建
1.1不结球白菜CENH3基因中sgRNA的设计与筛选
用CRISPR-p2.0(http://crispr.hzau.edu.cn)在线软件对NCBI上下载的不结球白菜CENH3(NC_024803.2)基因序列进行靶位点分析，优选选位于外显子上、GC含量不低于50％、靠近基因编码区5'端的序列作为靶位点；将候选的sg RNA与白菜的基因组序列进行比对，尽量减少sg RNA与预测的脱靶位点序列的配对碱基数，最后选择的sg RNA核苷酸序列分别为：
sgRNA1：5'-AGAAGAGGAGGCAGCCAAGG-3'(SEQ ID NO.1)
sgRNA2：5'-GACTGCTTCATCTTCGGCGG-3'(SEQ ID NO.2)
1.2 Brcenh3-sgRNA片段的构建
第一轮PCR以pYLgRNA-AtU6-1(曾栋昌,马兴亮,谢先荣,等.植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法[J].中国科学:生命科学,2018,048(007):783-794.)为模板，分别用引物sGAscI-F1/CENH3sG1R1、CENH3sG1F2/sGAscIR2、sGAscI-F1/CENH3sG2R1、CENH3sG2F2/sGAscIR2进行PCR扩增；第二轮先将第一轮PCR产物进行凝胶电泳，并用凝胶纯化回收试剂盒纯化，纯化目的片段并各取1μL进行融合PCR，不加引物扩增，10个循环后再加入引物sGAscIF1/sGAscIR2进行扩增，即得含sgRNA1和sgRNA2的Brcenh3-sgRNA片段；
1.3Brcenh3-Cas9载体的构建
将Brcenh3-sgRNA片段和与表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-B(曾栋昌,马兴亮,谢先荣,等.植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法[J].中国科学:生命科学,2018,048(007):783-794.)分别用AscI酶切并以T4连接酶连接，融合PCR产物与载体的融合体系为：载体：90ng，双链DNA片段：100ng，T4连接酶：1μL，5xT4连接酶Buffer：1μL，加ddH2O至10μL。PCR程序为：16℃10h。连接产物用化学法转化大肠杆菌，在含有卡那霉素(100ug/mL)的LB平板37℃静置过夜培养，从中挑取出明显的单菌落，进行PCR鉴定，同时进行测序验证，从而获得阳性菌落，即构建得到Brcenh3-Cas9载体。
其中，步骤1.2中使用的引物序列如下：
sGAscI-F1：5'-GATGGCGCGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTG-3'(SEQ ID NO.3)
CENH3sG1R1：
5'-GCTCTAAAACAGAAGAGGAGGCAGCCAAGGCAATCACTACTTCGACTCTAGCTG-3'(SEQ IDNO.4)
CENH3sG1F2：
5'-AGTAGTGATTGCCTTGGCTGCCTCCTCTTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3'(SEQ IDNO.5)
CENH3sG2R1：
5'-GCTCTAAAACGACTGCTTCATCTTCGGCGGCAATCACTACTTCGACTCTAGCTG-3'(SEQ IDNO.6)
CENH3sG2F2：
5'-AGTAGTGATTGCCGCCGAAGATGAAGCAGTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3'(SEQ IDNO.7)
sGAscIR2：5'-GATGGCGCGCCGCCATTTGTCTGCAGAATTGGC-3'(SEQ ID NO.8)
1.4单酶切及胶回收
AscI单酶切反应体系中，AscI内切酶体积1.0μL，质粒载体体积根据其质粒浓度不同而改变，约10.0μL，NEB Buffer2.1 5.0μL，加入ddH2O至50μL。37℃酶切5h，150V、1.5％琼脂凝胶电泳检测后，切胶并且进行胶回收，使用翊圣公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，具体操作过程按照其说明书进行实验。
1.5 T4连接反应
T4连接反应10μL体系如下：胶回收片段4μL、胶回收质粒载体1.0μL、T4 ligasebuffer1.0μL、T4 ligase 1.0μL、ddH2O 3.0μL，16℃孵化12-14h。
1.6连接产物转化到大肠杆菌
取DH5α感受态细胞50μL进行冰浴融化7-10min，加入100ng的连接产物，冰浴中放置min；42℃水浴45s，迅速置于冰上放置2min；将500μL无抗生素LB液体培养基加入到菌液中，37℃、200r/min摇菌活化1h；4500rpm/min离心5min，吸去上清液，用移液枪将100-200μL菌液吸打重悬，将菌液快速均匀的涂布到含Kan的LB平板上，倒置放于37℃培养箱12-16h过夜，
1.7阳性单克隆检测
取出过夜培养的LB平板，挑取呈白色的单克隆菌落，重悬于有10μL ddH2O的小离心管中，吸取菌液1μL，进行PCR检测；将有条带的阳性克隆菌液加到3ml含Kan的LB液体培养基中继续扩繁，37℃、200r/min摇菌过夜；从摇过夜的菌液中吸出500μL，送至公司进行测序，另外500μL菌液加入等量的灭菌40％甘油，混匀后放置在-80℃冰箱保存待用。
1.8质粒提取
将阳性克隆菌进行摇菌扩繁，质粒提取步骤按照天根生化科技(北京)有限公司质粒提取试剂盒说明书进行，提取后的质粒浓度需检质量和浓度，备用。
2、花粉纳米磁转化介导的不结球白菜转化
2.1花蕾处理和花粉收集
选取花序上饱满的花蕾进行人工去雄操作，去雄时间为花粉转化前，去雄后使用硫酸纸带套住柱头止其他花粉污染。用镊子夹取花药收集不结球白菜花粉于培养孔中，在晴朗天气，早晨十点左右花粉散粉数量多，活力最好。
2.2基因-磁性纳米载体复合物的制备
吸取1μL磁性纳米磁珠(1μg/μL)，提取的质粒根据浓度吸取1μg，分别用花粉培养基稀释到50μL，再混合形成100μL体系，体系中磁性纳米颗粒和质粒DNA质量比为1:1，混匀后室温静置连接30min，得到基因-磁性纳米载体复合物；花粉培养基的配方为：每100mL花粉培养基包括15g蔗糖、10mgH3B03、5.3mgKN03、10.3mgCa(N03)2、51.7mgMnS04、10.3mgMgS04·7H20和3mgGA3，ddH2O定容，pH调至6.5。
2.3花粉磁转化处理
用0.5mL花粉培养基悬浮0.2g花粉，加入上述基因—磁性纳米载体复合物，混合均匀后，在Magneto FACTOR plate 24强磁板下静置转化30min。转化完成后，用移液枪吸去除花粉培养基上清液，将下层花粉全部放置于滤纸上，并在30℃～35℃环境下烘干或晾干10min；干燥后的花粉立即进行授粉，严格套袋留种。
2.4转化植株的筛选
收取转化种子后，催芽播种，待植株长出第4片真叶时，喷施草铵膦除草剂筛选抗性植株，草铵膦浓度为100mg/L，14d后筛选长势正常的植株待进一步检测,结果见图2。
3、CENH3编辑效果检测
用TPC法提取除草剂抗性植株总DNA，根据载体序列设计Cas9引物，用Taq酶对待检测植株DNA进行PCR扩增，鉴定Cas9的引物序列如下，片段大小1030bp。有清晰明亮条带的植株则为Cas9阳性植株，在CENH基因sgRNA靶位点上下游各选取序列设计引物，再用高保真酶对Cas9阳性植株DNA进行PCR扩增，扩增片段送测序，测序结果通过峰图判断靶位点是否发生突变。鉴定CENH3突变效果的引物序列如下，片段大小641bp。
Cas9-F：5'-TGAGAACACTCAGCTCCAGA-3'(SEQ ID NO.9)
Cas9-R：5'-CCGTGGCTTACTCTGTTCTC-3'(SEQ ID NO.10)
CENH3-F：5'-GCGTTGGTGTGAAAGAAAGC-3'(SEQ ID NO.11)
CENH3-R：5'-TGGTTGCTGGTGGAGTTGCT-3'(SEQ ID NO.12)
扩增结果见图1。
将上述扩增CENH3的PCR原液送测序，测序引物为CENH3-F，24号植株(T0代)测序结果在sgRNA位点双峰，将PCR产物用凝胶提取试剂盒纯化目的基因目的片段，回收产物与T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取25个单克隆进行菌落PCR鉴定，测序，结果表明有2个菌落测序结果在CENH3的PAM(即NGG序列)位点附近出现突变，24号植株两个突变单菌落的测序峰图见图3。
将测序结果导入DNAMAN软件中，与目的片段序列和sgRNA比对分析突变结果，结果见图4，图4a为24-11，图4b为24-24，由此可知24号植株中CENH3的sgRNA1处的碱基有插入和替换。24-11的测序结果在sgRNA1的PAM位点上及sg RNA1上均发生了碱基替换，24-24的在sgRNA1上发生碱基的替换和插入，确认该植株为成功编辑不结球白菜CENH3基因所得的阳性植株。
对比例1
试材料为不结球白菜品种‘四九菜心’
1、sg RNA的设计与载体Brcenh3-Cas9的构建
1.1不结球白菜CENH3基因中sgRNA的设计与筛选
用CRISPR-p2.0(http://crispr.hzau.edu.cn)在线软件对NCBI上下载的不结球白菜CENH3(NC_024803.2)基因序列进行靶位点分析，优选选位于外显子上、GC含量不低于50％、靠近基因编码区5'端的序列作为靶位点；将候选的sg RNA与白菜的基因组序列进行比对，尽量减少sg RNA与预测的脱靶位点序列的配对碱基数，最后选择的sg RNA核苷酸序列分别为：
sgRNA3：5'-TGCGACTGCTTCATCTTCGG-3'
sgRNA4：5'-GCTTCTCGTCGGGGTCGCACT-3'
1.2Brcenh3-sgRNA片段的构建
第一轮PCR以pYLgRNA-AtU6-1为模板，分别用引物sGAscI-F1/CENH3sG3R3、CENH3sG3F4/sGAscIR2、sGAscI-F1/CENH3sG4R3、CENH3sG4F4/sGAscIR2进行PCR扩增；第二轮先将第一轮PCR产物进行凝胶电泳，并用凝胶纯化回收试剂盒纯化，纯化目的片段并各取1μL进行融合PCR，不加引物扩增，10个循环后再加入引物sGAscIF1/sGAscIR2进行扩增，即得含sgRNA3和sgRNA4的Brcenh3’-sgRNA片段；
其中，步骤1.2中使用的引物序列如下：
sGAscI-F1：5'-GATGGCGCGCCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTG-3'(SEQ ID NO.3)
CENH3sG3R3：
5'-GCTCTAAAACTGCGACTGCTTCATCTTCGGCAATCACTACTTCGACTCTAGCTG-3'
CENH3sG3F4：
5'-AGTAGTGATTGCCGAAGATGAAGCAGTCGCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3'CENH3sG4R3：
5'-GCTCTAAAACGCTTCTCGTCGGGGTCGCACTCAATCACTACTTCGACTCTAGCTG-3'
CENH3sG4F4：
5'-AGTAGTGATTGAGTGCGACCCCGACGAGAAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3'
sGAscIR2：5'-GATGGCGCGCCGCCATTTGTCTGCAGAATTGGC-3'(SEQ ID NO.8)
1.3 Brcenh3’-Cas9载体的构建
将Brcenh3’-sgRNA片段和与表达载体pYLCRISPR/Cas9P35S-B分别用AscI酶切并以T4连接酶连接，融合PCR产物与载体的融合体系为：载体：90ng，双链DNA片段：100ng，T4连接酶：1μL，5xT4连接酶Buffer：1μL，加ddH2O至10μL。PCR程序为：16℃10h。连接产物用化学法转化大肠杆菌，在含有卡那霉素(100μg/mL)的LB平板37℃静置过夜培养，从中挑取出明显的单菌落，进行PCR鉴定，同时进行测序验证，从而获得阳性菌落，即构建得到Brcenh3’-Cas9载体。
1.4单酶切及胶回收
AscI单酶切反应体系中，AscI内切酶体积1.0μL，质粒载体体积根据其质粒浓度不同而改变，约10.0μL，NEB Buffer2.1 5.0μL，加入ddH2O至50μL。37℃酶切5h，150V、1.5％琼脂凝胶电泳检测后，切胶并且进行胶回收，使用翊圣公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，具体操作过程按照其说明书进行实验。
1.5T4连接反应
T4连接反应10μL体系如下：胶回收片段4μL、胶回收质粒载体1.0μL、T4 ligasebuffer1.0μL、T4 ligase 1.0μL、ddH2O 3.0μL，16℃孵化12-14h。
1.6连接产物转化到大肠杆菌
取DH5α感受态细胞50μL进行冰浴融化7-10min，加入100ng的连接产物，冰浴中放置min；42℃水浴45s，迅速置于冰上放置2min；将500μL无抗生素LB液体培养基加入到菌液中，37℃、200r/min摇菌活化1h；4500rpm/min离心5min，吸去上清液，用移液枪将100-200μL菌液吸打重悬，将菌液快速均匀的涂布到含Kan的LB平板上，倒置放于37℃培养箱12-16h过夜，
1.7阳性单克隆检测
取出过夜培养的LB平板，挑取呈白色的单克隆菌落，重悬于有10μL ddH2O的小离心管中，吸取菌液1μL，进行PCR检测；将有条带的阳性克隆菌液加到3mL含Kan的LB液体培养基中继续扩繁，37℃、200r/min摇菌过夜；从摇过夜的菌液中吸出500μL，送至公司进行测序，另外500μL菌液加入等量的灭菌40％甘油，混匀后放置在-80℃冰箱保存待用。
1.8质粒提取
将阳性克隆菌进行摇菌扩繁，质粒提取步骤按照天根生化科技(北京)有限公司质粒提取试剂盒说明书进行，提取后的质粒浓度需检质量和浓度，备用。
2、花粉纳米磁转化介导的不结球白菜转化
2.1花蕾处理和花粉收集
选取花序上饱满的花蕾进行人工去雄操作，去雄时间为花粉转化前，去雄后使用硫酸纸带套住柱头止其他花粉污染。用镊子夹取花药收集不结球白菜花粉于培养孔中，在晴朗天气，早晨十点左右花粉散粉数量多，活力最好。
2.2基因-磁性纳米载体复合物的制备
吸取1μL磁性纳米磁珠(1μg/μL)，提取的质粒根据浓度吸取1μg，分别用花粉培养基稀释到50μL，再混合形成100μL体系，体系中磁性纳米颗粒和质粒DNA质量比为1:1，混匀后室温静置连接30min，得到基因-磁性纳米载体复合物；花粉培养基的配方为：每100mL花粉培养基包括15g蔗糖、10mgH3B03、5.3mgKN03、10.3mgCa(N03)2、51.7mgMnS04、10.3mgMgS04·7H20和3mgGA3，ddH2O定容，pH调至6.5。
2.3花粉磁转化处理
用0.5mL花粉培养基悬浮0.2g花粉，加入上述基因—磁性纳米载体复合物，混合均匀后，在Magneto FACTOR plate 24强磁板下静置转化30min。转化完成后，用移液枪吸去除花粉培养基上清液，将下层花粉全部放置于滤纸上，并在30℃～35℃环境下烘干或晾干10min；干燥后的花粉立即进行授粉，严格套袋留种。
2.4转化植株的筛选
收取转化种子后，催芽播种，待植株长出第4片真叶时，喷施草铵膦除草剂筛选抗性植株，草铵膦浓度为100mg/L，14d后叶片出现缺水黄化皱缩现象，见附图2c，没有筛选出长势正常的草铵膦除草剂抗性植株。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA及其CRISPR/Cas9载体和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaagaggag gcagccaagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactgcttca tcttcggcgg 20
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatggcgcgc ccattcggag tttttgtatc ttg 33
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctctaaaac agaagaggag gcagccaagg caatcactac ttcgactcta gctg 54
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtagtgatt gccttggctg cctcctcttc gttttagagc tagaaatagc aagt 54
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctctaaaac gactgcttca tcttcggcgg caatcactac ttcgactcta gctg 54
<210> 6
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtagtgatt gccgccgaag atgaagcagt ccgttttaga gctagaaata gcaagt 56
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatggcgcgc cgccatttgt ctgcagaatt ggc 33
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgagaacact cagctccaga 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgtggctta ctctgttctc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgttggtgt gaaagaaagc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggttgctgg tggagttgct 20

Claims (9)

1.利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因的sgRNA，其特征在于核苷酸序列分别为sgRNA1：SEQ ID NO.1、sgRNA2：SEQ ID NO.2。
2.用于不结球白菜CENH3基因编辑的CRISPR/Cas9载体，其特征在于所述的载体为插入权利要求1所述的sgRNA核苷酸序列的pYLCRISPR/Cas9-DB载体。
3.权利要求1所述的sgRNA在构建不结球白菜CENH3基因获得的单倍体诱导系中的应用。
4.权利要求2所述的CRISPR/Cas9载体在构建不结球白菜单倍体诱导系中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的单倍体诱导系为不结球白菜CENH3基因突变株。
6.一种利用CRISPR/Cas9技术编辑不结球白菜CENH3基因获得单倍体诱导系的方法，其特征在于，基于不结球白菜CENH3基因设计权利要求1所述的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，利用植物花粉纳米磁转化技术转化不结球白菜，得到不结球白菜CENH3基因的定点突变植株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)基于不结球白菜CENH3基因设计如权利要求1所示的sgRNA，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，构建以除草剂基因为植株筛选抗性基因的转化载体Brcenh3-Cas9；
(2)利用植物花粉纳米磁转化技术转化不结球白菜，将质粒DNA连接纳米磁珠得到基因-磁性纳米载体复合物，在花粉培养基中于不结球白菜花粉混合后进行磁转处理，得到磁转化花粉；
(3)将磁转化花粉晾干后，进行蕾期人工授粉，套袋留种；
(4)收取转化种子后，播种后对植株进行除草剂抗性鉴定；
(5)提取植株的 DNA 进行 PCR 检测，确定Cas9阳性转基因植株，并根据sgRNA编辑位点的核苷酸序列设计引物对突变区域进行克隆，测序鉴定不结球白菜植株CENH3突变位点。
8.根据权利要求6所述的 方法，其特征在于，所述的携带CRISPR/Cas9的载体为pYLCRISPR/Cas9P35S-B载体。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(5)的引物序列如下：CENH3-F: SEQID NO.11、CENH3-R：SEQ ID NO.12。
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