CN117305326B - 青花菜BoCENH3基因及其在单倍体诱导中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物分子育种技术领域，公开了一种与植物单倍体诱导有关的基因BoCENH3及应用。本发明从青花菜全长cDNA文库中克隆得到青花菜BoCENH3基因的CDS序列，并以此构建靶向BoCENH3基因的基因编辑载体pCas9‑BoCENH3，再将该质粒转化青花菜，得到BoCENH3的基因修饰植株，通过田间杂交授粉，分子标记鉴定和流式细胞仪分析，证明修饰BoCENH3后的青花菜材料具有诱导青花菜单倍体的能力。本发明不仅为揭示青花菜单倍体产生的遗传学和生物学机理奠定了重要的基础，而且为选育青花菜新型的单倍体诱导系，以及提高青花菜单倍体育种效率方面具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子育种技术领域，具体涉及一种与植物单倍体诱导有关的基因及应用。
背景技术
青花菜（学名：Brassica oleraceaL.var.italicaPlenck）是一种重要的十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）甘蓝种（Brassica oleracea）蔬菜，富含蛋白质、维生素C、矿物质等营养成分，以及萝卜硫素等抗癌和抗氧化功能成分。
双单倍体（DH，Doubled Haploid）育种技术是利用自然发生或人工诱导受体材料产生单倍体植株，再通过加倍获得二倍体纯合系的育种技术。相比于传统的通过连续自交/回交创制纯合育种材料的方法，双单倍体育种技术可在1-2代内获得100%纯合的材料，大大缩短育种年限。
青花菜的传统的单倍体获得依赖于小孢子培养，该方法技术复杂、成本较高，且严重受基因型的限制。通过体内单倍体诱导进行的单倍体创制是近年来兴起的一种革命性纯系育种方法。目前在玉米等植物中，突变MTL/NLD/ZmPLA1基因（编码一种精子特异性磷脂酶），可使植物具有体内单倍体诱导功能，但在青花菜等双子叶植物中没有其同源基因。挖掘适用于青花菜单倍体诱导相关的基因，能够突破基因型的限制，大大提高青花菜育种的效率。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种与植物单倍体诱导有关的基因BoCENH3及其应用。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
一种植物CENH3基因，其是如下任一所述的DNA分子：
(1)核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(3)来源于青花菜，核苷酸序列与(1)或(2)限定的DNA分子序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
一种制备植物单倍体诱导系的方法，包括如下步骤：沉默或抑制目的植物基因组中CENH3基因的表达或敲除CENH3基因或采用基因编辑技术对目的植物基因组中的CENH3基因进行修饰，得到基因编辑植株，即为植物单倍体诱导系，所述CENH3基因为上所述的植物CENH3基因；优选所述植物单倍体诱导系为CENH3基因结构修饰的突变体，而并非CENH3功能丧失的突变体。
一种制备植物单倍体的方法，包括如下步骤：
步骤(1)、沉默或抑制目的植物基因组中CENH3基因的表达或敲除CENH3基因或采用基因编辑技术对目的植物基因组中的CENH3基因进行修饰，得到基因编辑植株；所述CENH3基因为上述的植物CENH3基因；
步骤(2)、以步骤(1)所述基因编辑植株作为母本与其他植物材料杂交，得到杂交后代，从杂交后代筛选出植物单倍体。
上述任一项所述的方法，其中所述沉默或抑制目的植物基因组中CENH3基因的表达是指使目的植物基因组中CENH3基因表达量降低；所述敲除CENH3基因是指使目的植物基因组中CENH3基因发生修饰，但并非功能完全丧失；
所述采用基因编辑技术对目的植物基因组中的CENH3基因进行修饰得到的基因编辑植株BoCENH3deta3，其基因组中CENH3基因的CDS序列自5’端的第407-409位碱基发生框内缺失突变，CENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.4所示。
在上述方法技术方案中，所述突变是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现的；所述CRISPR/Cas9的靶序列如SEQIDNo.6所示。
在上述方法技术方案中，
所述从杂交后代中筛选出植物单倍体通过如下方法实现：杂交后代单株进行单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定；
所述分子标记为InDel标记，鉴定方法具体为：如果杂交后代单株具有父本特异性分子标记且不具有母本特异性分子标记，该杂交后代单株为候选的植物单倍体。
在上述方法技术方案中，所述分子标记鉴定采用的引物如下表所示：
| InDel标记名称 | 正向引物 (5′-3′) | 反向引物 (5′-3′) |
| ZC1-3 | ATGGGAGCCTCTTGTTCCTC | ACCAGAGGAAGTGAAGGCAA |
| ZC2-24 | CGTACGCGGGAGAAAATCTT | ACACCAAGACCACTCTCTCC |
| BAC3-9 | CCGGAGAAGAAGAGGACGAG | TCCCTCGGCTCAGCATTAAT |
| ZC4-14 | ATCACACTGTAAACGGGCCT | TCAGGTGGTGTTGAGATGGT |
| ZC5-7 | AGACATGATGACTCCACCGC | AAACTCTCTTTTGCCCGCC |
| ZC6-2 | AGATCGAGCTCCACCATTAATTG | GGAGGTCATGATACTTGGGC |
| ZC7-2 | ACATTGTGAGGCTTGTCGTG | GGAGGTCATGATACTTGGGC |
| ZC8-28 | GGTCATCTCAGCGAGTGGAT | AACGCATTTGGTCTTAGGCC |
| ZC9-3 | TGTTGGGTCCTACAGTCACC | GGAGTGGAGAACATCGAGCT |
；
叶片倍性鉴定具体可为：采用流式细胞仪检测，如果杂交后代单株的叶片细胞核具有单倍体细胞核信号峰，该杂交后代单株为候选的植物单倍体；
单倍体性状鉴定具体可为：如果杂交后代单株具有植株矮小、叶片狭长的表型，该杂交后代单株为候选的植物单倍体；
所述的方法中，所述植物为如下任一所述的植物：
(1)双子叶植物或单子叶植物；(2)甘蓝种植物；或(3)青花菜。
本发明还提供了一种用于对植物的CENH3基因进行CRISPR-Cas9基因编辑的载体，所述CRISPR/Cas9的靶序列如SEQIDNo.6所示。
本发明还提供了一种含有上述载体的宿主细胞或组织。
本发明还提供了上述的植物CENH3基因在制备单倍体诱导系或者诱导植物单倍体中的应用，包括将基因编辑载体导入植物材料，获得具有单倍体诱导能力的植物，具体步骤为：
(1)将上述的基因编辑载体导入植物宿主细胞；
(2)以(1)所得的细胞培育转化植株；
(3)检测转化株中CENH3基因突变的阳性株，获得基因编辑植株，即为植物单倍体诱导系；优选基因编辑植株的基因组中CENH3基因的CDS序列自5’端的第407-409位碱基发生框内缺失突变，CENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.4所示；
(4)以(3)的阳性株作为母本，其他品系作为父本，进行杂交后获得父本遗传背景的植株，即植物单倍体。
本发明的有益效果是：
（1）本发明从青花菜全长cDNA文库中克隆得到青花菜BoCENH3基因的CDS序列，并以此构建靶向BoCENH3基因的基因编辑载体pCas9-BoCENH3，再将该质粒转化青花菜，得到BoCENH3的基因修饰植株，通过田间杂交授粉，分子标记鉴定和流式细胞仪分析，证明修饰BoCENH3后的青花菜材料具有诱导青花菜单倍体的能力；
（2）本发明不仅为揭示青花菜单倍体产生的遗传学和生物学机理奠定了重要的基础，而且为选育青花菜新型的单倍体诱导系，以及提高青花菜单倍体育种效率方面具有重要的意义。
附图说明
图1为氨基酸系统发育树图。
图2为青花菜不同部位的BoCENH3基因表达量分析结果。
图3为pCas9-BoCENH3载体结构示意图。
图4为青花菜BoCENH3突变植株测序部分结果图。
图5为分子鉴定结果。
图6为叶片倍性鉴定结果，即流式细胞仪分析结果。
图7为表型鉴定结果：左侧为二倍体亲本，右侧为单倍体。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明，需要说明的是，实施例仅用于解释本发明而不代表限制本发明的范围。本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可商购获得，或采用本领域常规方法配制而得；未特别说明的实验条件，均为本领域常规实验条件，可参考分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:alaboratory manual，2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例所涉植物材料如下：
以下实施例所使用的青花菜材料为B53、CX33，均为本实验室培育和保存的自交系，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验。
实施例1. 青花菜BoCENH3基因的克隆
一、BoCENH3基因的鉴定
着丝粒特异组蛋白H3(centromere specific histone H3,CENH3)广泛分布于真核生物的功能着丝粒区域，在着丝粒染色质的识别和保持中起着关键作用。
本实施例根据已知的甘蓝种CENH3基因序列设计青花菜CENH3基因扩增特异引物对：正向引物（BoCENH3-F，SEQ ID No.1）和反向引物（BoCENH3-R，SEQ ID No.2）。以青花菜幼嫩叶片为材料，采用改良CTAB法提取基因组DNA（Han et al., 2015），以该基因组DNA为模板，采用前述特异引物对进行PCR扩增，扩增产物送测序公司进行测序，测序得到BoCENH3基因的DNA序列SEQ ID No.3所示，全长1305bp，包含9个外显子和8个内含子。
PCR扩增用的正向引物和反向引物序列为：
BoCENH3-F（SEQ ID No.1）：5’-ATGGCGAGAACCAAACATTTC-3’；
BoCENH3-R（SEQ ID No.2）：5’-TCACAATGGTCTGCCTTTTCCT-3’。
将SEQ ID No.3所示的测序结果通过手工校对，序列拼接，并与已公布的拟南芥蛋白进行Protein Blast相似性比对，发现比对结果显示扩增得到的基因与拟南芥CENH3基因同源性最高，序列相似度达66%。通过氨基酸系统发育树的构建，如图1所示，系统发育树分析表明，青花菜BoCENH3基因与芸薹属其他种的CENH3基因相聚集，说明青花菜的BoCENH3基因与芸薹属其他种的CENH3基因高度同源，本实施例PCR扩增得到的片段为青花菜BoCENH3基因。
二、青花菜不同部位的BoCENH3基因表达量分析
提取青花菜根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊等各部分mRNA，逆转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR分析，结果如图2所示，发现BoCENH3基因在授粉后的雌蕊中表达量最高，在根、茎、叶中表达量低。
取大约1g的青花菜叶片样品，放入无RNA酶的研钵中，加入液氮研磨，使用TIANGEN公司植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取植物总mRNA，以此mRNA为模板，使用Vazyme公司转录试剂盒合成cDNA第一条链。随后以该cDNA第一条链为模板，采用前述的正向引物（BoCENH3-F）和反向引物（BoCENH3-R）进行PCR扩增，获得1个青花菜BoCENH3基因的CDS序列，克隆到pGEM-T载体（TA 克隆载体）。克隆的青花菜BoCENH3基因的CDS序列如SEQ IDNo.4所示，共558bp，其基因编码一个185个氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID No.5所示。
实施例2. 青花菜BoCENH3基因编辑载体pCas9-BoCENH3的构建
针对青花菜BoCENH3基因使用在线网站（http://crispor.tefor.net/）进行CRSPR-Cas9靶点预测，选取特异性位点SEQ ID No.6 (GGACTGCTGAAGCTCTTATGG)设计sgRNA，通过将设计的如Seq ID No.6所示的序列的gRNA靶点序列制备成Oligo二聚体gRNA；将所述Oligo二聚体构建至pBK2-Cas9-U6载体骨架即得到pCas9-BoCENH3载体，所述pBK2-Cas9-U6载体骨架购自武汉伯远生物科技有限公司（货号#REC44-I）；至此，通过PCR扩增、酶切后和连接将目标sgRNA连接到载体上。连接产物转化大肠杆菌感受态，筛选阳性克隆，构建得到青花菜BoCENH3编辑载体pCas9- BoCENH3，载体结构示意图如图3所示。
实施例3. 农杆菌介导法转化青花菜
在本实施例，以青花菜自交系CX33作为受体材料，通过农杆菌介导法转化青花菜下胚轴的的方法，得到含有pCas9-BoCENH3表达的转基因外植体，进而从中筛选出青花菜BoCENH3基因发生突变的植株。
（1）青花菜外植体的获得
选取成熟、饱满、无病斑的青花菜种子，使用75%酒精消毒3分钟，7%次氯酸钠溶液消毒10分钟，然后用灭菌水洗2-3次，灭菌后的种子在超净工作台中吸干多余的水，播种在萌发培养基上。在16h光照/8h黑暗条件下培养5-7天，将青花菜下胚轴切成约0.8cm长，作为农杆菌介导转化的受体。
（2）青花菜的遗传转化
将含有pCas9- BoCENH3质粒的农杆菌培养至OD600=0.4左右，用液体MS培养基重悬作为侵染液。将青花菜外植体侵染10分钟，置于共培养培养基中25℃暗培养36-48小时；随后将外植体转移到含10 mg/L Basta浓度的选择培养基上，在16h光照/8h黑暗条件下，每14天更换一次选择培养基。待抗性芽长到约2-3cm长度，切下抗性芽转到长苗培养基中，在16h光照/8h黑暗条件下培养20-30天，放入生根培养基中培养20天。根部生长发达的植株转入营养土中栽培。经Bar和Cas9基因PCR检测，共获得5个转基因植株。
Bar引物序列如下：
BarH-F(SEQ ID No.7): 5’-ATGAGCCCAGAACGACGCCCG-3’；
BarH-R(SEQ ID No.8): 5’-TCAAATCTCGGTGACGGGCAGG-3’；
Cas9引物序列如下：
Cas-F(SEQ ID No.9): 5’-GACAAGAAGTACTCGATCGGC-3’；
Cas-R(SEQ ID No.10): 5’-GTCAGATCCTGATGGTGCTC-3’。
（3）青花菜BoCENH3基因编辑植株的获得
提取已获得的5个转基因植株的基因组DNA，使用前述的如SEQ ID No.1、2所示的引物扩增青花菜BoCENH3基因并进行一代测序，检测在目标靶点存在突变的植株，共检测到4个BoCENH3基因的编辑植株为突变植株，将BoCENH3基因扩增产物连T载体（北京全式金生物技术股份有限公司，货号CT501-01）进行克隆测序，选取至少10个克隆进行一代测序。测序结果表明4个T0代基因编辑植株中（图4为青花菜BoCENH3突变植株测序部分结果图），有两个杂合体和两个嵌合体，如表1中所示，表1列出了每个突变相较于如SEQ ID No.4所示的CDS序列的突变位置。其中基因编辑植株#1、#3、#4均含有移码突变，植株均表现为叶面皱缩、植株偏小，#2基因编辑植株为框内缺失突变，植株生长正常，表型与野生型一致。
表1
移栽后3个月BoCENH3基因编辑植株开花，自交授粉后2个月后收获种子；对四个系的T1代植株进行筛选，结果如表2中所示，发现基因编辑植株#1、#3、#4的后代均为野生型或杂合突变类型，无法获得BoCENH3纯合移码突变的植株，说明BoCENH3功能完全丧失，可能会导致胚胎或植株致死。从#2的T1的植株中，可筛选出纯合的框内缺失突变（3bp），将该株系命名为BoCENH3deta3；该纯合突变体生长正常。
表2
实施例4.青花菜BoCENH3基因编辑植株单倍体诱导能力的鉴定
1.田间授粉，播种鉴定
以实施例3中得到的T1突变体分别作为母本，与青花菜材料B53杂交，获得杂交后代。T1突变体即青花菜BoCENH3deta3（#2-T1植株）纯合框内缺失突变体，#1-T1，#3-T1，#4-T1杂合移码突变体。将上述授粉组合所得后代，播种于穴盘。
2.分子标记鉴定
利用两个亲本（CX33与B53）之间的特异InDel标记（如表3）进行杂交后代的基因型鉴定。将杂交所得后代，播种于穴盘，取叶片提取DNA进行PCR扩增，并电泳检测扩增产物，所有#1-T1、#3-T1、#4-T1与B53杂交后代中，均未检测到与B53基因型一致植株；而在BoCENH3deta3与B53杂交后代中，604棵单株中，共有3株与B53基因型相同，初步判定为单倍体，结果如图5所示：图中泳道1-8分别是DNA marker；BoCENH3deta3；B53；BoCENH3deta3× B53真杂种；BoCENH3deta3× B53真杂种；B53单倍体；B53单倍体；B53单倍体。
所述InDel标记的引物序列如表3中所示：
表3
| InDel标记名称 | 正向引物 (5′-3′) | 反向引物 (5′-3′) |
| ZC1-3 | SEQ ID No.11：ATGGGAGCCTCTTGTTCCTC | SEQ ID No.12：ACCAGAGGAAGTGAAGGCAA |
| ZC2-24 | SEQ ID No.13：CGTACGCGGGAGAAAATCTT | SEQ ID No.14：ACACCAAGACCACTCTCTCC |
| BAC3-9 | SEQ ID No.15：CCGGAGAAGAAGAGGACGAG | SEQ ID No.16：TCCCTCGGCTCAGCATTAAT |
| ZC4-14 | SEQ ID No.17：ATCACACTGTAAACGGGCCT | SEQ ID No.18：TCAGGTGGTGTTGAGATGGT |
| ZC5-7 | SEQ ID No.19：AGACATGATGACTCCACCGC | SEQ ID No.20：AAACTCTCTTTTGCCCGCC |
| ZC6-2 | SEQ ID No.21：AGATCGAGCTCCACCATTAATTG | SEQ ID No.22：GGAGGTCATGATACTTGGGC |
| ZC7-2 | SEQ ID No.23：ACATTGTGAGGCTTGTCGTG | SEQ ID No.24：GGAGGTCATGATACTTGGGC |
| ZC8-28 | SEQ ID No.25：GGTCATCTCAGCGAGTGGAT | SEQ ID No.26：AACGCATTTGGTCTTAGGCC |
| ZC9-3 | SEQ ID No.27：TGTTGGGTCCTACAGTCACC | SEQ ID No.28：GGAGTGGAGAACATCGAGCT |
3.流式细胞仪鉴定倍性
将上述步骤2中鉴定初步获得的可能的单倍体植株进行流式细胞检测；方法如下：
取青花菜靠近生长点的幼嫩叶片0.5g，提取其细胞核，以二倍体青花菜叶片作为对照；再用流式细胞仪检测细胞核的荧光强度，首先检测二倍体对照，并将二倍体细胞核信号峰位设为200(由于在有丝分裂G1期，二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位理论上在100附近出现)；若待测植株的细胞核信号峰出现在200附近，则认为其是二倍体。若待测植株细胞核信号峰出现在100附近，则认为该待测植株为单倍体植株(图6)。
将经步骤3检测过的二倍体和单倍体移栽至花盆，观察表型。与二倍体相比，单倍体具有植株矮小，叶片狭长较窄等特征，二倍体叶片植株高大，叶片椭圆（图7）。
经过上述的分子标记鉴定、叶片倍性鉴定、单倍体性状鉴定，最终确认在BoCENH3deta3与B53杂交后代中，604棵单株中，共有3株B53单倍体，计算单倍体诱导率为0.5%，单倍体诱导率（%）=（实际单倍体株数/总株数）×100%。
综上所述，将青花菜基因组中的BoCENH3基因突变后获得的BoCENH3突变植株BoCENH3deta3可作为青花菜单倍体诱导系，该青花菜单倍体诱导系与其他青花菜材料杂交，可在后代中获得青花菜单倍体。
实施例中涉及的部分序列如下：
青花菜BoCENH3基因序列SEQ ID NO.3：
ATGGCGAGAACCAAACATTTCGCTTCCAGGGCACGAGATCGCAATCGAACTAGTTAGTACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGCCTTTTTTTTTATTTTTATATTTATTTTCTAGGTTAAACCCTAATTTGGCATCTGAAATTTGTAGATGCGACTGCTTCATCTTCGGCGGCGGCGGCGGAAGGTCCGAGTGCGGTAACGTCATCTTTTTTCTTTTCCGTTTTAGGTTTCGACGCAAATCTCGTTACTGTTTTTTTTTGACGAATCTATTGAAATGTTTTAGACCCCGACGAGAAGAGAAGGCAGCCAAGATGAAGGTGGTGAAGCTCAACAGAGTGGTGAGTCTTTCTGTTTCATTTTCTGAGATCCAATTAATCCTTTTCATCTCTCGTGTGTTGTGACATGAATCAATTGCAGCAGCAACTCCTACTACAACTCCATCAGCCGGTAGAAAAGTAAGTTAGATTTCCATTTCACACCATTCATTTGCTTCTTTATCAACAAACTGCTCTCTCATCTGTTTTTTTTTTGTTTTGTGAAGAAAGGAGGGACTAAGCGAACTAAACAAGCTATGCCTAAAAGTTAGTTACAGATTTTAAAATCAATCTCTCAGGACATGTCTATTTGCATTTGTTCTTATTATGTCTTTGTAGGTTCCAACAAGAAGAAGACATTCCGTTACAAGCCTGGAACCGTTGCCCTCAGAGAGATTCGCCATTTCCAGAAGACCACCAAACTCCTTATCCCTGCCGCTAGTTTCATCCGACAAGTTAGTAATGAACTTTGTTATTCATACATTCTGCTTACTTGTTTTCTTGTTTTCAATGACTCTGCAATTACTGATATAGAATTTAGAGCAACCATTATGGGGTGATTTCTCTAACTACAATTACTAATACTATCCCAGGTGAGAAGTGTCACCCAGATCTTTGCCCCTCCCGATGTTACCCGTTGGACTGCTGAAGCTCTTATGGCTATTCAAGAGGTGACACTCCCCTTCCCTCTTTCGTTTCCTATTTTCCACTTGATGTCTAATTTAAACTGACCGTTTTTTTAATTTCTTTTGGTGTGGTTGGGGGGGGGCAGGCGGCTGAAGATTTTTTAATTGGCTTGTTCTCTGATGCTATGCTTTGCGCTATCCATGCAAGGCGTGTTACTCTAAGTAAGTAGTACTCCCCAATATAAGGAAACCCATTTTATATAGAACATTGCCTCATCCATCTCTGCTTCTCTTCATATCAGTGAGAAAAGATTTTGAGCTTGCACGCCGTCTTGGAGGAAAAGGCAGACCATTGTGA。
青花菜BoCENH3基因CDS序列如SEQ ID No.4所示（共558bp）：
ATGGCGAGAACCAAACATTTCGCTTCCAGGGCACGAGATCGCAATCGAACTAATGCGACTGCTTCATCTTCGGCGGCGGCGGCGGAAGGTCCGAGTGCGACCCCGACGAGAAGAGAAGGCAGCCAAGATGAAGGTGGTGAAGCTCAACAGAGTGCAGCAACTCCTACTACAACTCCATCAGCCGGTAGAAAAAAAGGAGGGACTAAGCGAACTAAACAAGCTATGCCTAAAAGTTCCAACAAGAAGAAGACATTCCGTTACAAGCCTGGAACCGTTGCCCTCAGAGAGATTCGCCATTTCCAGAAGACCACCAAACTCCTTATCCCTGCCGCTAGTTTCATCCGACAAGTGAGAAGTGTCACCCAGATCTTTGCCCCTCCCGATGTTACCCGTTGGACTGCTGAAGCTCTTATGGCTATTCAAGAGGCGGCTGAAGATTTTTTAATTGGCTTGTTCTCTGATGCTATGCTTTGCGCTATCCATGCAAGGCGTGTTACTCTAATGAGAAAAGATTTTGAGCTTGCACGCCGTCTTGGAGGAAAAGGCAGACCATTGTGA。
如SEQ ID No.4所示的青花菜BoCENH3基因CDS序列编码的氨基酸序列SEQ IDNo.5：
MARTKHFASRARDRNRTNATASSSAAAAEGPSATPTRREGSQDEGGEAQQSAATPTTTPSAGRKKGGTKRTKQAMPKSSNKKKTFRYKPGTVALREIRHFQKTTKLLIPAASFIRQVRSVTQIFAPPDVTRWTAEALMAIQEAAEDFLIGLFSDAMLCAIHARRVTLMRKDFELARRLGGKGRPL。
Claims (6)
1.一种制备青花菜单倍体诱导系的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用基因编辑技术对目的青花菜基因组中的CENH3基因进行修饰，得到基因编辑植株，即为青花菜单倍体诱导系，所述CENH3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述采用基因编辑技术对目的青花菜基因组中的CENH3基因进行修饰得到的基因编辑植株BoCENH3deta3，其基因组中CENH3基因的CDS序列自5’端的第407-409位碱基发生框内缺失突变，CENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.4所示。
2.一种制备青花菜单倍体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)、采用基因编辑技术对目的青花菜基因组中的CENH3基因进行修饰，得到基因编辑植株；所述CENH3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述采用基因编辑技术对目的青花菜基因组中的CENH3基因进行修饰得到的基因编辑植株BoCENH3deta3，其基因组中CENH3基因的CDS序列自5’端的第407-409位碱基发生框内缺失突变，CENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.4所示；
步骤(2)、以步骤(1)所述基因编辑植株作为母本与其他青花菜材料杂交，得到杂交后代，从杂交后代筛选出青花菜单倍体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述从杂交后代中筛选出青花菜单倍体通过如下方法实现：杂交后代单株进行单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定；
所述分子标记为InDel标记，鉴定方法具体为：如果杂交后代单株具有父本特异性分子标记且不具有母本特异性分子标记，该杂交后代单株为候选的青花菜单倍体。
4.根据权利要求3所述的方法，所述分子标记鉴定采用的引物如下表所示：
；
叶片倍性鉴定具体为：采用流式细胞仪检测，如果杂交后代单株的叶片细胞核具有单倍体细胞核信号峰，该杂交后代单株为候选的青花菜单倍体；
单倍体性状鉴定具体为：如果杂交后代单株具有植株矮小、叶片狭长的表型，该杂交后代单株为候选的青花菜单倍体。
5.一种突变的青花菜CENH3基因，其特征在于：所述突变是指青花菜CENH3基因的CDS序列自5’端的第407-409位碱基发生框内缺失突变，青花菜CENH3基因的CDS序列如SEQ IDNo.4所示。
6.权利要求5所述的突变的青花菜CENH3基因在制备单倍体诱导系或者诱导青花菜单倍体中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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