CN117925633A - 甘蓝BoCENH3基因及其在单倍体诱导中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物分子育种技术领域，公开了甘蓝BoCENH3基因及其在单倍体诱导中的应用。本发明从甘蓝全长cDNA文库中克隆得到甘蓝BoCENH3基因的CDS序列，并以此构建靶向BoCENH3基因的基因编辑载体pCas9‑BoCENH3及pCas9‑BoCENH3‑syn，再将该质粒转化甘蓝，得到BoCENH3的基因编辑植株，通过实验证明编辑BoCENH3基因后的甘蓝植株bocenh3，以及编辑BoCENH3基因且同时转入同义突变SynCENH3的植株bocenh3+SynCENH3具有诱导单倍体的能力；本发明在创制甘蓝新型的单倍体诱导系、提高甘蓝单倍体育种效率方面具有重要的意义。

Description

甘蓝BoCENH3基因及其在单倍体诱导中的应用
技术领域
本发明涉及植物分子育种技术领域，具体涉及甘蓝BoCENH3基因及其在单倍体诱导中的应用。
背景技术
甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)类作物属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)甘蓝种(Brassica oleracea)，在世界各地广泛种植，包括多种经济作物，如结球甘蓝、青花菜、花椰菜、羽衣甘蓝和抱子甘蓝。这些植物不仅可用作蔬菜，为人类提供丰富的营养物质，如类胡萝卜素、矿物质、维生素A和C、膳食纤维以及硫甙等有益化合物，还可用作观赏植物、调味品、油料和畜禽饲料等。
单倍体指具有配子染色体数目的孢子体植物，经染色体加倍后可迅速获得基因型纯合、性状一致的双单倍体(DH，Doubled Haploid)系，相比连续自交6-7代获取纯系的传统育种方式，双单倍体育种技术可在1-2代内获得100％纯合的材料，大大缩短育种年限。
单倍体可通过体外技术或体内技术获得，但人工体外诱导局限性较大，例如传统的甘蓝单倍体的获得依赖于离体花药/小孢子培养方法，不仅技术复杂，而且受到植物基因型的高度限制，这在很大程度上制约了单倍体的开发应用。目前在玉米中，通过突变MTL/NLD/ZmPLA1基因(编码一种精子特异性磷脂酶)，可使植物具有体内单倍体诱导功能，此前在甘蓝中也发现了一个单倍诱导基因BoDMP，然而其只有自交或作为母本时具有诱导能力，作为父本时不具备诱导能力，限制了其诱导单倍体的效率。若能够利用某些特定的甘蓝基因，创制基于种子的体内父本和母本单倍体诱导系，则能大大提高甘蓝单倍体育种的效率。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种甘蓝BoCENH3基因及其在单倍体诱导中的应用。
本发明为了实现其目的，提供了如下技术方案：
本发明第一方面提供了一种植物BoCENH3基因，其是如下任一所述的DNA分子
(1)核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(3)来源于甘蓝，核苷酸序列与(1)或(2)限定的DNA分子序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
本发明第二方面提供了一种制备植物单倍体诱导系的方法，基于对BoCENH3基因的遗传操作和/或修饰，所述方法为以下两种方法中的任意一种：
(1)沉默或抑制目的植物基因组中BoCENH3基因的表达或编辑BoCENH3基因，得到基因编辑植株，即为植物单倍体诱导系；
(2)沉默或抑制目的植物基因组中BoCENH3基因的表达或编辑BoCENH3基因，与此同时转入同义突变的BoCENH3基因的CDS序列使目的植物基因组中BoCENH3基因发生修饰，获得单倍体诱导系；优选所述同义突变的BoCENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.8所示；
所述BoCENH3基因为上述的植物BoCENH3基因。
本发明第三方面提供了一种制备植物单倍体的方法，包括如下步骤：
首先采用上述的方法获得单倍体诱导系，然后将获得的单倍体诱导系作为母本或者父本与其他植物材料杂交，得到杂交后代，从杂交后代筛选出植物单倍体。
在上述制备植物单倍体诱导系的方法或者制备植物单倍体的方法中，其中所述沉默或抑制目的植物基因组中BoCENH3基因的表达是指使目的植物基因组中BoCENH3基因表达量降低；
所述单倍体诱导系为含有以下任一突变的突变株：
(1)基因组中的BoCENH3基因的CDS序列自5’端的第31位碱基后插入1个碱基A；
(2)基因组中的BoCENH3基因的CDS序列自5’端的第1位至第52位的碱基发生缺失突变，且第106位碱基后插入1个碱基T；
(3)基因组中的BoCENH3基因的CDS序列自5’端的第19位碱基至第31位碱基发生缺失突变，且第106位碱基后插入1个碱基T；
(4)基因组中的BoCENH3基因的CDS序列自5’端的第33位碱基至第107位碱基发生缺失突变；
上述突变中，BoCENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.4所示。
在上述的方法技术方案中，所述突变是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现的；
对于突变(1)，所述CRISPR/Cas9的靶序列为两个，分别如SEQ ID No.6及SEQ IDNo.7所示；
对于突变(2)、(3)、(4)，对BoCENH3基因进行编辑并同时转入同义突变的BoCENH3基因的CDS序列，基因编辑的CRISPR/Cas9的靶序列为两个，分别如SEQ ID No.6及SEQ IDNo.7所示；所述同义突变的BoCENH3基因的CDS序列如SEQ ID NO.8所示。
在上述的制备植物单倍体的方法技术方案中，所述从杂交后代中筛选出植物单倍体通过如下方法实现：杂交后代单株进行单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定；
所述分子标记为InDel标记，鉴定方法具体为：将获得的单倍体诱导系作为母本或者父本与其他植物材料杂交，如果杂交后代单株具有所述其他材料的特异性分子标记且不具有单倍体诱导系的特异性分子标记，该杂交后代单株为候选的植物单倍体。
优选地，叶片倍性鉴定具体为：采用流式细胞仪检测，如果杂交后代单株的叶片细胞核具有单倍体细胞核信号峰，该杂交后代单株为候选的植物单倍体；
单倍体性状鉴定具体为：如果杂交后代单株具有植株矮小、叶片狭长的表型，该杂交后代单株为候选的植物单倍体；
所述的方法中，所述植物为如下任一所述的植物：
(1)双子叶植物或单子叶植物；(2)甘蓝种植物；或(3)甘蓝。
本发明第四方面提供了一种用于对植物的BoCENH3基因进行CRISPR/Cas9基因编辑的载体，所述载体为以下两种载体中的任一种：
(1)所述载体对上述的BoCENH3基因进行编辑，所述CRISPR/Cas9的靶序列有两个，如SEQ ID No.6和7所示；
(2)所述载体对上述的BoCENH3基因进行编辑并同时转入同义突变的BoCENH3基因的CDS序列，所述CRISPR/Cas9的靶序列有两个，如SEQ ID No.6和7所示；所述同义突变的BoCENH3基因的CDS序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明第五方面提供了一种含有上述载体的宿主细胞或组织。
本发明最后一方面提供了上述的植物BoCENH3基因在制备单倍体诱导系或者诱导植物单倍体中的应用，包括将基因编辑载体导入植物材料，获得具有单倍体诱导能力的植物，具体步骤为：
(1)将上述的基因编辑载体导入植物宿主细胞；
(2)以(1)所得的细胞培育转化植株；
(3)检测转化株中BoCENH3基因突变的阳性株，获得基因编辑植株，即为植物单倍体诱导系；
(4)以(3)的阳性株作为母本或者父本，与其他品系杂交，在后代中获得的仅具有所述其他品系的遗传背景的植株，即单倍体。
母本单倍体诱导是指的以单倍体诱导系为父本，其它材料为母本，诱导得到具有母本遗传背景的单倍体；父本单倍体诱导是指的以单倍体诱导系为母本，其它材料为父本，诱导得到具有父本遗传背景的单倍体。本发明中采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对甘蓝BoCENH3基因进行编辑，或对甘蓝BoCENH3基因进行编辑的同时转入同义突变的SynCENH3，两种途径得到的阳性株系bocenh3和bocenh3+SynCENH3均有单倍体诱导能力，既可以用于母本单倍体诱导，也可以用于父本单倍体诱导。
本发明的有益效果是：
(1)本发明从甘蓝全长cDNA文库中克隆得到甘蓝BoCENH3基因的CDS序列，并以此构建靶向BoCENH3基因的基因编辑载体pCas9-BoCENH3及pCas9-BoCENH3-syn，再将该质粒转化甘蓝，得到BoCENH3的基因编辑植株，通过田间杂交授粉，杂交后代田间表型鉴定、分子标记鉴定和流式细胞仪分析，证明编辑BoCENH3基因后的甘蓝植株bocenh3，以及编辑BoCENH3基因且同时转入同义突变SynCENH3的植株bocenh3+SynCENH3具有诱导单倍体的能力；
(2)本发明不仅为揭示甘蓝父本和母本单倍体产生的遗传学和生物学机理奠定了重要的基础，而且在创制甘蓝新型的单倍体诱导系、提高甘蓝单倍体育种效率方面具有重要的意义。
附图说明
图1为氨基酸系统发育树。
图2为甘蓝不同部位的BoCENH3基因表达量分析结果。
图3为载体骨架pHSbdcas9i的结构示意图。
图4为pCas9-BoCENH3及pCas9-BoCENH3-syn载体结构示意图。
图5为甘蓝野生型、BoCENH3基因编辑植株、BoCENH3基因编辑并同时转入同义突变的SynCENH3植株测序结果示意图。
图6是获得的BoCENH3基因突变株相对于野生型的BoCENH3基因突变比较图。
图7为分子鉴定结果。
图8为叶片倍性鉴定结果，即流式细胞仪分析结果。
图9为植株表型鉴定结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明，需要说明的是，实施例仅用于解释本发明而不代表限制本发明的范围。本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可商购获得，或采用本领域常规方法配制而得；未特别说明的实验条件，均为本领域常规实验条件，可参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:alaboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例所涉植物材料如下：
以下实施例所使用的甘蓝材料为自交系DE、自交系19Z2053、不育系BK2019，均为本实验室培育和保存甘蓝材料，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证试验。
实施例1甘蓝BoCENH3基因的克隆
一、甘蓝BoCENH3基因的鉴定
着丝粒特异组蛋白H3(centromere specific histone H3,CENH3)广泛分布于真核生物的功能着丝粒区域，在着丝粒染色质的识别和保持中起着关键作用。
本实施例根据已知的甘蓝种BoCENH3基因序列设计甘蓝BoCENH3基因扩增特异引物对：如SEQ ID No.1所示的正向引物和如SEQ ID No.2所示的反向引物。
以甘蓝幼嫩叶片为材料，采用改良CTAB法提取基因组DNA(Han et al.,2015)，以该基因组DNA为模板，正向引物(SEQ ID No.1)和反向引物(SEQ ID No.2)进行PCR扩增，获得甘蓝BoCENH3的基因组片段，甘蓝BoCENH3基因的DNA序列SEQ ID No.3所示，全长1308bp，包含9个外显子，8个内含子。
PCR扩增用的正向引物和反向引物序列为：
正向引物(SEQ ID No.1)：5’-ATACCGGATTGAGTGGCTAA-3’；
反向引物(SEQ ID No.2)：5’-AAGCAGATATGTTTCGTG-3’。
将SEQ ID No.3所示的测序结果通过手工校对，序列拼接，并与已公布的拟南芥蛋白进行Protein Blast相似性比对，发现比对结果显示扩增得到的基因与拟南芥CENH3基因同源性最高，序列相似度达80％。通过氨基酸系统发育树的构建，如图1所示，系统发育树分析表明，甘蓝BoCENH3基因与芸薹属其他种的CENH3基因相聚集，说明甘蓝的BoCENH3基因与芸薹属其他种的CENH3基因高度同源，本实施例PCR扩增得到的片段为甘蓝BoCENH3基因。
二、甘蓝不同部位的BoCENH3基因表达量分析
提取甘蓝根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊等各部分mRNA，逆转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR分析，结果如图2所示，发现BoCENH3基因在花粉中表达量最高，在根、茎、叶中几乎不表达。
取大约1g的甘蓝叶片样品，放入无RNA酶的研钵中，加入液氮研磨，使用TIANGEN公司植物总RNA提取试剂盒(DP432)提取植物总mRNA，以此mRNA为模板，使用Vazyme公司转录试剂盒合成cDNA第一条链。随后以该cDNA第一条链为模板，采用前述的正向引物(SEQ IDNo.1)和反向引物(SEQ ID No.2)进行PCR扩增，获得1个甘蓝BoCENH3基因的CDS序列，克隆到pGEM-T载体(TA克隆载体)。克隆的甘蓝BoCENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.4所示，共546bp，编码一个181个氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID No.5所示。
实施例2.甘蓝BoCENH3基因编辑载体pCas9-BoCENH3及pCas9-BoCENH3-syn的构建
针对甘蓝BoCENH3基因使用在线网站(http://crispor.tefor.net/)进行CRSPR-Cas9靶点预测，选取特异性位点SEQ ID NO.6(CCAGGGCACGAGATCGCAATCGA)和SEQ ID NO.7(CCCCGACGAGAAGAGAAGGCAGC)设计sgRNA。
构建潮霉素抗性的基因编辑载体，基于SEQ ID NO.6、7所示的靶标构建基因编辑载体pCas9-BoCENH3及pCas9-BoCENH3-syn。采用的原始载体骨架pHSbdcas9i的结构如图3所示，pHSbdcas9i是双子叶基因编辑载体，gRNA scaffold结构前留有酶切位点，采用一步法连入设计好的靶序列。
pCas9-BoCENH3构建过程：将设计的如SEQ ID No.6及SEQ ID NO.7所示的序列的gRNA靶点序列制备成Oligo二聚体gRNA；将所述Oligo二聚体构建至pHSbdcas9i载体骨架即得到pCas9-BoCENH3载体；至此，通过PCR扩增、酶切后和连接将目标sgRNA连接到载体上。连接产物转化大肠杆菌感受态，筛选阳性克隆，构建得到甘蓝BoCENH3编辑载体pCas9-BoCENH3。
pCas9-BoCENH3-syn的构建方法是：针对甘蓝BoCENH3基因使用在线网站(http://crispor.tefor.net/)进行CRSPR-Cas9靶点预测，选取特异性位点SEQ ID NO.6(CCAGGGCACGAGATCGCAATCGA)和SEQ ID NO.7(CCCCGACGAGAAGAGAAGGCAGC)设计sgRNA，将设计的如SEQ ID No.6及SEQ ID NO.7所示的序列的gRNA靶点序列制备成Oligo二聚体gRNA。合成BoCENH3基因同义突变的CDS序列(如SEQ ID NO.8所示)：即如SEQ ID No.4所示的BoCENH3基因CDS序列编码的蛋白序列的Ser9(即如SEQ ID No.4所示的序列编码的氨基酸序列中的第九个氨基酸，为Ser，其余突变以此类推)的密码子由TCC突变为TCA；Arg10的密码子由AGG突变为AGA；Ala11的密码子由GCA突变为GCG；Thr34的密码子由ACC变为ACA；Pro35的密码子由CCG突变为CCA；Thr36的密码子由ACG突变为ACA。将SEQ ID NO.8所示的序列与tNOS(胭脂碱合成酶基因终止子)进行连接。最后将SEQ ID NO.8及tNOS，Oligo二聚体构建至pHSbdcas9i载体骨架上，至此，通过PCR扩增、酶切后和连接将目标sgRNA和同义突变连接到载体上。连接产物转化大肠杆菌感受态，筛选阳性克隆，构建得到甘蓝BoCENH3编辑载体pCas9-BoCENH3-syn。
CRISPR/Cas9基因编辑载体pCas9-BoCENH3和pCas9-BoCENH3-syn的结构示意图如图4所示。
实施例3.根癌农杆菌介导法转化甘蓝
在本实施例，以甘蓝自交系DE作为受体材料，通过根癌农杆菌介导法转化甘蓝下胚轴的的方法，分别得到含有pCas9-BoCENH3和pCas9-BoCENH3-syn表达的转基因外植体，进而从中筛选出甘蓝BoCENH3基因发生突变的阳性株系。
(1)甘蓝外植体的获得
选取成熟、饱满圆润、无发霉病斑的甘蓝种子，使用75％酒精消毒3分钟，8-10％次氯酸钠溶液消毒8-10分钟，然后用灭菌水洗3次，灭菌后的种子使用无菌滤纸，在超净工作台中吸干多余的水，均匀摆放在固体MS培养基上。在16h光照/8h黑暗条件下培养5-7天，将甘蓝下胚轴切成0.8-1cm长，作为农杆菌介导转化的受体。
(2)甘蓝的遗传转化
将含有pCas9-BoCENH3质粒的农杆菌分别培养至OD600＝0.4-0.6，6000rpm离心10分钟之后，用液体MS培养基重悬作为侵染液。将甘蓝外植体侵染8-10分钟，置于共培养培养基中25℃暗培养36-48小时；随后将外植体转移到含10mg/L Basta浓度的选择培养基上，在16h光照/8h黑暗条件下，每两周更换一次选择培养。待抗性芽长到约2-3cm长度，切下抗性芽转到含有特美汀的长苗培养基中，在16h光照/8h黑暗条件下培养20-30天，放入生根培养基中培养20天。将根部生长发达的植株转入蛭石中炼苗7天，再移栽到营养土中。利用Bar引物和Cas9引物PCR扩增后，经1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，共获得6个BoCENH3基因编辑植株。
Bar引物序列如下：
BarH-F(SEQ ID No.9):5’-ATGAGCCCAGAACGACGCCCG-3’；
BarH-R(SEQ ID No.10):5’-TCAAATCTCGGTGACGGGCAGG-3’；
Cas9引物序列如下：
Cas-F(SEQ ID No.11):5’-GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT-3’；
Cas-R(SEQ ID No.12):5’-GGTCGCGGAGGCTATGGATGC-3’。
对含有pCas9-BoCENH3-syn质粒的农杆菌采取同样的方法处理，侵染甘蓝外植体，最终获得3个BoCENH3基因编辑并同时转入同义突变SynCENH3的植株。
(3)阳性植株的分子检测
提取通过转化pCas9-BoCENH3获得的甘蓝BoCENH3基因编辑的6个转基因植株的基因组DNA，扩增甘蓝BoCENH3基因并进行sanger测序，检测目标靶点处是否存在突变，典型的突变特征为插入、缺失或双峰。经检测，其中2个BoCENH3的编辑植株存在突变，均为杂合编辑，得到2个T0代基因编辑株系，命名为bocenh3。
采取同样的方法对通过转化pCas9-BoCENH3-syn获得的3个BoCENH3基因编辑并同时转入同义突变的SynCENH3植株进行sanger测序，经检测3个植株均存在突变，均为杂合编辑，得到3个T0代基因编辑并同时转入同义突变SynCENH3的株系，命名为bocenh3+SynCENH3。
BoCENH3基因编辑植株bocenh3、BoCENH3基因编辑并同时转入同义突变的SynCENH3植株bocenh3+SynCENH3的测序结果示意图如图5所示，表1列出了每个突变的突变位置(图6)。
表1
将得到的株系移栽到温室，开花期进行自交和杂交授粉，2个月后收获种子。
实施例4.甘蓝bocenh3与bocenh3+SynCENH3株系单倍体诱导能力的鉴定
将实施例3中的突变株bocenh3-1、bocenh3+SynCENH3-1,2,3用于本实施例。
1.田间播种自交/杂交
将甘蓝bocenh3-1株系田间种植自交，获得自交后代。将bocenh3-1 T0代植株的花粉授予纯绿不育羽衣甘蓝材料BK2019，获得杂交后代。
将甘蓝bocenh3+SynCENH-1,2,3株系田间种植自交，获得自交后代。将甘蓝bocenh3+SynCENH3-1,3株系分别作为父本与纯绿不育羽衣甘蓝材料BK2019杂交，获得杂交后代。将甘蓝自交系材料19Z2053作为父本分别与bocenh3+SynCENH3-1,2,3株系杂交。
将甘蓝自交系材料DE(BoCENH3基因未突变)作为父本，BK2019为母本，进行杂交，作为对照。不育材料作为母本，防止授粉过程中母本发生自交即避免生物学混杂。
将上述授粉组合所得后代，播种于田间。
2.田间鉴定
利用甘蓝BoCENH3的杂合突变株系与纯绿羽衣甘蓝BK2019杂交后，播种10天后，观察子叶颜色，子叶、下胚轴及真叶颜色表现为纯绿即为单倍体，而二倍体子叶颜色为深绿，下胚轴为紫色，真叶为深绿色。将bocenh3-1与BK2019杂交的后代播种于穴盘，后代共615单株，1株呈现出纯绿。同时将bocenh3+SynCENH3-1,3与BK2019杂交的后代播种于穴盘，bocenh3+SynCENH3-3与BK2019后代共128单株，1株表现为纯绿；bocenh3+SynCENH3-1与BK2019后代共263单株，没有单株表现为纯绿。假定所得两株纯绿植株为单倍体。
3.分子标记鉴定
利用两个亲本(上述DE突变体材料与19Z2053)之间的特异InDel标记(DH-4)进行基因型鉴定。将19Z2053与bocenh3+SynCENH3-1,2,3杂交后代，分别播种于穴盘，通过InDel标记分子鉴定(图7)，结果表明：在bocenh3+SynCENH3-1与19Z2053杂交后代共866棵单株中，有1棵单株与19Z2053的基因型相同；bocenh3+SynCENH3-2与19Z2053杂交后代共1244棵单株中，有2棵单株与19Z2053的基因型相同；bocenh3+SynCENH3-3与19Z2053杂交后代共73棵单株中，没有与19Z2053的基因型相同的单株。假定所得三株为单倍体。
所述InDel标记的引物序列如下：
LY-1F(SEQ ID No.13)：5’-TGTTTTGTGGTTACTTGCTTGC-3’，
LY-1R(SEQ ID No.14)：5’-GGTACCCCTCTGATCATCGG-3’。
4.流式细胞仪鉴定倍性
将上述步骤2和3中鉴定初步获得的假定单倍体植株进行流式细胞检测，检测方法如下：
取甘蓝靠近生长点的幼嫩叶片0.5g，提取其细胞核，以二倍体甘蓝叶片作为对照；再用流式细胞仪检测细胞核的荧光强度，首先检测二倍体对照，并将二倍体细胞核信号峰位设为200(由于在有丝分裂G1期，二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位理论上在100附近出现；若待测植株的细胞核信号峰出现在200附近，则认为其是二倍体。若待测植株细胞核信号峰出现在100附近，则认为该待测植株为单倍体植株(图8)。
流式细胞检测结果表明，所有的假定单倍体植株均为单倍体。
将经步骤2和3检测过的二倍体和单倍体移栽至花盆，观察表型。与二倍体相比，单倍体具有植株矮小，叶片狭长较窄等特征，二倍体叶片植株高大，叶片椭圆(图9)。
每个授粉组合的统计结果如表2所示：
bocenh3-1自交后代中，136个后代中，无单倍体；
bocenh3+SynCENH3-1自交后代中，43个后代中，无单倍体；
甘蓝bocenh3-1株系与BK2019进行杂交，615个后代中，有1株单倍体；
甘蓝bocenh3+SynCENH3-1株系与BK2019进行杂交，263个后代中，无单倍体；
甘蓝bocenh3+SynCENH3-3株系与BK2019进行杂交，128个后代中，有1株单倍体；
甘蓝19Z2053与bocenh3+SynCENH3-1株系进行杂交，866个后代中，有1株单倍体；
甘蓝19Z2053与bocenh3+SynCENH3-2株系进行杂交，1244个后代中，有2株单倍体；
甘蓝19Z2053与bocenh3+SynCENH3-3株系进行杂交，73个后代中，无单倍体。
因此，甘蓝转基因突变株系杂交获得的后代单株中，若按照上述田间表型鉴定、分子鉴定方法任一种方法鉴定为单倍体，且经过流式细胞仪验证为单倍体，则该植株为或候选为甘蓝父本/母本单倍体；若流式细胞仪鉴定结果不为单倍体，则该植株不为或不候选为甘蓝父本/母本单倍体。
根据每个组合获得的单倍体数量计算其单倍体诱导率，单倍体诱导率(％)＝(单倍体数/测验总株数)×100％。统计结果如表2所示。
综上所述，甘蓝基因组中的BoCENH3基因突变后获得的植株可作为甘蓝父本/母本单倍体诱导系，该甘蓝父本/母本单倍体诱导系与其他甘蓝材料杂交，可在后代中获得甘蓝父本或母本单倍体。
表2、转基因甘蓝BoCENH3基因突变株系自交及与其它材料杂交后代中的单倍体植株
实施例中涉及的部分序列如下：
甘蓝BoCENH3基因序列SEQ ID NO.3：
ATGGCGAGAACCAAACATTTCGCTTCCAGGGCACGAGATCGCAATCGAACTAGTTAGTACTCTCTCTCTCTCTGCCTTTTTTTTGATATTTATTTTCTAGGTTAAACCCTAATTTGGCATCTGAAATTTGTAGATGCGACTGCTTCATCTTCGGCGGCGGCGGCGGAAGGTCCGAGTGCGGTACGTCATCTATTTTCTTTTCCCGTTTTAGGTTTTTACGCAAATCTCGTTACTGTTTTTTTGACGAATCGATTGAAATGTGTAGACCCCGACGAGAAGAGAAGGCAGCCAAGGAGAAGCTCAACAGAGTGAGTCTTTCTATTTCATTTTCTGAGATCCATGAATCCTTTTCATCTCTCGTGTGTTGTGACATGAATCAATTGCAGCAGCAACTCCTACTACGACTCCACCAGCCGGTAGAAAAGTAAGTTACATTTCCATTTCACACCATTCATTTGCTTCTTTATCAACAAACTGCTCTCTCATCTGTTTTTTTTGTTTTGTTTTGGTTTTGTGAAGAAAGGAGGGACTAAGCGAACTAAACAAGCTATGCCTAAAAGTTAGTGACAGATTTTAAAATCTCTATTTTGGATCATCATTCTCTCAGGACATGTCTATTTGCATTTGTTCTTATTATGTCTGTCTGTCTGTCTTTGTCCCCCTTGTAGGTTCCAACAAGAAGAAGACATTCCGTTACAAGCCTGGAACCGTTGCCCTCAGAGAGATTCGCCATTTCCAGAAGACCACCAAACTTCTTATCCCTGCCGCTAGTTTCATCCGAGAAGTTAGTAATGAACTTTGTTATTCATACATTCCCGCTTACTTGTTTTCAATGACTCTGCAATTACTGATATAGAATTTGGAGCAACCATTATGGGGTGATTTCTCTAACTACAAATTACTAATACTATCCCAGGTGAGAAGTGTCACCCAGATCTTTGCCCCTCCCGATGTTACCCGTTGGACTGCTGAAGCTCTTATGGCTATTCAAGAGGTACGTGTACTCCTTCCCTCTTTTGTTTCCTATTTTCCACTTGATGTCTAATTTAAACTGATCGTTTTTTTTTTATATTTCTTTTGGTGTGGGGCGGGGCAGGCGGCTGAAGATTTTTTAATTGGCTTGTTCTCTGATGCTATGCTTTGCGCTATCCATGCAAGGCGTGTTACTCTAAGTAAGTAGTACTCCCCAAAATAAGGAAACCCATTTTATATACAACATTGCCTCATCCATGTCTGCTTCTCTTCATATCAGTGAGAAAAGATTTTGAGCTTGCACGCCGTCTTGGAGGAAAAGGCAGACCATTGTGA。
甘蓝BoCENH3基因的CDS序列(SEQ ID No.4)：
ATGGCGAGAACCAAACATTTCGCTTCCAGGGCACGAGATCGCAATCGAACTAATGCGACTGCTTCATCTTCGGCGGCGGCGGCGGAAGGTCCGAGTGCGACCCCGACGAGAAGAGAAGGCAGCCAAGGAGAAGCTCAACAGACAGCAACTCCTACTACGACTCCACCAGCCGGTAGAAAAAAAGGAGGGACTAAGCGAACTAAACAAGCTATGCCTAAAAGTTCCAACAAGAAGAAGACATTCCGTTACAAGCCTGGAACCGTTGCCCTCAGAGAGATTCGCCATTTCCAGAAGACCACCAAACTTCTTATCCCTGCCGCTAGTTTCATCCGAGAAGTGAGAAGTGTCACCCAGATCTTTGCCCCTCCCGATGTTACCCGTTGGACTGCTGAAGCTCTTATGGCTATTCAAGAGGCGGCTGAAGATTTTTTAATTGGCTTGTTCTCTGATGCTATGCTTTGCGCTATCCATGCAAGGCGTGTTACTCTAATGAGAAAAGATTTTGAGCTTGCACGCCGTCTTGGAGGAAAAGGCAGACCATTGTGA。
如SEQ ID No.4所示的甘蓝BoCENH3基因CDS序列编码的氨基酸序列SEQ ID No.5：MARTKHFASRARDRNRTNATASSSAAAAEGPSATPTRREGSQGEAQQTATPTTTPPAGRKKGGTKRTKQAMPKSSNKKKTFRYKPGTVALREIRHFQKTTKLLIPAASFIREVRSVTQIFAPPDVTRWTAEALMAIQEAAEDFLIGLFSDAMLCAIHARRVTLMRKDFELARRLGGKGRPL。
SEQ ID No.8：
ATGGCGAGAACCAAACATTTCGCTTCAAGAGCGCGAGATCGCAATCGAACTAATG
CGACTGCTTCATCTTCGGCGGCGGCGGCGGAAGGTCCGAGTGCGACACCAACAAG
AAGAGAAGGCAGCCAAGGAGAAGCTCAACAGACAGCAACTCCTACTACGACTCCA
CCAGCCGGTAGAAAAAAAGGAGGGACTAAGCGAACTAAACAAGCTATGCCTAAAA
GTTCCAACAAGAAGAAGACATTCCGTTACAAGCCTGGAACCGTTGCCCTCAGAGA
GATTCGCCATTTCCAGAAGACCACCAAACTTCTTATCCCTGCCGCTAGTTTCATCCG
AGAAGTGAGAAGTGTCACCCAGATCTTTGCCCCTCCCGATGTTACCCGTTGGACTG
CTGAAGCTCTTATGGCTATTCAAGAGGCGGCTGAAGATTTTTTAATTGGCTTGTTCT
CTGATGCTATGCTTTGCGCTATCCATGCAAGGCGTGTTACTCTAATGAGAAAAGATTTTGAGCTTGCACGCCGTCTTGGAGGAAAAGGCAGACCATTGTGA。

Claims (10)

1.一种植物BoCENH3基因，其特征在于，其是如下任一所述的DNA分子：
(1)核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白的DNA分子；
(3)来源于甘蓝，核苷酸序列与(1)或(2)限定的DNA分子序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子。
2.一种制备植物单倍体诱导系的方法，其特征在于：基于对BoCENH3基因的遗传操作和/或修饰，所述方法为以下两种方法中的任意一种：
(1)沉默或抑制目的植物基因组中BoCENH3基因的表达或编辑BoCENH3基因，得到基因编辑植株，即为植物单倍体诱导系；
(2)沉默或抑制目的植物基因组中BoCENH3基因的表达或编辑BoCENH3基因，与此同时转入同义突变的BoCENH3基因的CDS序列使目的植物基因组中BoCENH3基因发生修饰，获得单倍体诱导系；优选所述同义突变的BoCENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.8所示；
所述BoCENH3基因为权利要求1所述的植物BoCENH3基因。
3.一种制备植物单倍体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
首先采用权利要求2所述的方法获得单倍体诱导系，然后将获得的单倍体诱导系作为母本或者父本与其他植物材料杂交，得到杂交后代，从杂交后代筛选出植物单倍体。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，其中所述沉默或抑制目的植物基因组中BoCENH3基因的表达是指使目的植物基因组中BoCENH3基因表达量降低；
所述单倍体诱导系为含有以下任一突变的突变株：
(1)基因组中的BoCENH3基因的CDS序列自5’端的第31位碱基后插入1个碱基A；
(2)基因组中的BoCENH3基因的CDS序列自5’端的第1位至第52位的碱基发生缺失突变，且第106位碱基后插入1个碱基T；
(3)基因组中的BoCENH3基因的CDS序列自5’端的第19位碱基至第31位碱基发生缺失突变，且第106位碱基后插入1个碱基T；
(4)基因组中的BoCENH3基因的CDS序列自5’端的第33位碱基至第107位碱基发生缺失突变；
上述突变中，BoCENH3基因的CDS序列如SEQ ID No.4所示。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述突变是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现的；
对于突变(1)，所述CRISPR/Cas9的靶序列为两个，分别如SEQ ID No.6及SEQ ID No.7所示；
对于突变(2)、(3)、(4)，对BoCENH3基因进行编辑并同时转入同义突变的BoCENH3基因的CDS序列，基因编辑的CRISPR/Cas9的靶序列为两个，分别如SEQ ID No.6及SEQ ID No.7所示；所述同义突变的BoCENH3基因的CDS序列如SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述从杂交后代中筛选出植物单倍体通过如下方法实现：杂交后代单株进行单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定；
所述分子标记为InDel标记，鉴定方法具体为：将获得的单倍体诱导系作为母本或者父本与其他植物材料杂交，如果杂交后代单株具有所述其他材料的特异性分子标记且不具有单倍体诱导系的特异性分子标记，该杂交后代单株为候选的植物单倍体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
叶片倍性鉴定具体为：采用流式细胞仪检测，如果杂交后代单株的叶片细胞核具有单倍体细胞核信号峰，该杂交后代单株为候选的植物单倍体；
单倍体性状鉴定具体为：如果杂交后代单株具有植株矮小、叶片狭长的表型，该杂交后代单株为候选的植物单倍体；
所述的方法中，所述植物为如下任一所述的植物：
(1)双子叶植物或单子叶植物；(2)甘蓝种植物；或(3)甘蓝。
8.一种用于对植物的BoCENH3基因进行CRISPR/Cas9基因编辑的载体，其特征在于，
所述载体为以下两种载体中的任一种：
(1)所述载体对权利要求1所述的BoCENH3基因进行编辑，所述CRISPR/Cas9的靶序列有两个，如SEQ ID No.6和7所示；
(2)所述载体对权利要求1所述的BoCENH3基因进行编辑并同时转入同义突变的BoCENH3基因的CDS序列，所述CRISPR/Cas9的靶序列有两个，如SEQ ID No.6和7所示；所述同义突变的BoCENH3基因的CDS序列如SEQ ID NO.8所示。
9.含有权利要求8所述载体的宿主细胞或组织。
10.权利要求1所述的植物BoCENH3基因在制备单倍体诱导系或者诱导植物单倍体中的应用，包括将基因编辑载体导入植物材料，获得具有单倍体诱导能力的植物，具体步骤为：
(1)将权利要求8所述的基因编辑载体导入植物宿主细胞；
(2)以(1)所得的细胞培育转化植株；
(3)检测转化株中BoCENH3基因突变的阳性株，获得基因编辑植株，即为植物单倍体诱导系；
(4)以(3)的阳性株作为母本或者父本，与其他品系杂交，在后代中获得的仅具有所述其他品系的遗传背景的植株，即单倍体。
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