CN115697043A

CN115697043A - 通过靶向诱变获得突变植物的方法

Info

Publication number: CN115697043A
Application number: CN202180034712.3A
Authority: CN
Inventors: W·维里森
Original assignee: Nunhems BV
Current assignee: Nunhems BV
Priority date: 2020-05-13
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2023-02-03
Also published as: IL298021A; CA3178193A1; JP2023526035A; KR20230010678A; MX2022014186A; AU2021271086A1; WO2021228700A1; EP4149243A1; CL2022003128A1; US20230183725A1

Abstract

本发明涉及用于在植物中引入和选择特定可遗传突变的方法，所述方法包括用外源DNA转染植物细胞，其中所述外源DNA编码RNA引导的DNA内切核酸酶、适合于引导所述RNA引导的DNA内切核酸酶以诱导所述特定可遗传突变的向导RNA和选择性标记物；从转染的细胞再生植物以提供多株T0植物，将所述T0植物与不包含所述外源DNA的等基因植物杂交以提供多株后代植物；以及从所述后代植物中选择一株或多株具有所述可遗传突变的植物。

Description

通过靶向诱变获得突变植物的方法

发明领域

本发明涉及植物育种领域。提供用于在植物中引入和选择特定可遗传突变的方法，所述方法包括用外源DNA转染植物细胞，其中所述外源DNA编码RNA引导的DNA内切核酸酶、适合于引导所述RNA引导的DNA内切核酸酶以诱导所述特定可遗传突变的向导RNA和选择性标记物；从转染的细胞再生植物以提供多株T0植物，将所述T0植物与不包含所述外源DNA的等基因植物杂交以提供多株后代植物；以及从所述后代植物中选择一株或多株具有所述可遗传突变的植物。

背景技术

诱变技术允许产生可用于植物育种的额外遗传多样性。这种额外遗传多样性的产生是特别重要的，因为在大多数作物植物中，由于驯化和随后的选择性育种过程导致的遗传瓶颈效应，种质库中可获得的遗传多样性受到限制。诱变方法，如化学诱变和辐射诱变因此在植物育种中使用数十年，用于寻找在植物育种中有用的新的和改进的植物性状。

靶向诱变方法的开发与作物植物中性状的遗传基础的快速发展的知识相结合，为产生可用于植物育种的新等位基因开辟了进一步的可能性。一种特别有前景的靶向诱变方法是使用工程化核酸酶的基因组编辑，其中使用工程化核酸酶在靶细胞的基因组DNA中诱导位点特异性双链断裂。用于基因组编辑方法中的工程化核酸酶包括兆核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(transcriptionactivator-like effector-based nucleases，TALEN)和规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)相关核酸酶。特别有用的基因组编辑方法包括基于CRISPR/Cas9的靶向诱变方法和基于CRISPR/Cpf1的靶向诱变方法；参见例如Brooks等人(2014)Plant Physiol 166，1292-1297和WO2016/205711 A1。

由工程化核酸酶诱导的双链断裂可通过细胞的内源DNA双链断裂修复机制来修复，例如同源定向修复机制(homology directed repair mechanism，HDR)或非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)。特别是在修复模板存在下的HDR(所述修复模板是在宿主细胞的DNA修复过程中用作模板的DNA分子)，允许在靶细胞中基因组DNA的特定突变的相对有效的位点特异性引入。通过将独特设计的修复模板引入靶细胞中，可以以良好的效率和可靠性实现靶细胞中DNA的特定缺失、修饰、插入或置换。通过NHEJ的双链断裂的DNA修复是较不可预测的，并且可能导致不同的可遗传突变，例如在双链断裂的位点处一个或多个核苷酸的置换和/或缺失和/或插入。

然而，可预期在靶植物细胞的基因组DNA中诱导一个或多个双链断裂后可发生的某些突变仅以相对低的频率发生。如果需要非常特定的修饰，例如非常特定的核苷酸缺失、置换或插入，则情况尤其如此。可以以低频发生的其它修饰是较大DNA片段的缺失、DNA片段的倒位或易位。如果这种低频突变代表所需突变，则需要产生和筛选多株突变植物，以便鉴定和选择包含特定所需突变的突变植物。特别是当所需突变仅以非常低的频率发生时，需要产生非常大量的突变植物用于筛选，这是昂贵且耗时的。

因此，需要一种用于在植物中引入和选择特定可遗传突变的方法，其允许对具有所需可遗传突变的植物的更有时效性的和有成本效益的筛选。

发明内容

本发明提供用于在植物中引入和选择特定可遗传突变的方法，包括：(a)用外源DNA转染植物细胞，其中所述外源DNA编码RNA引导的DNA内切核酸酶、适合于引导所述RNA引导的DNA内切核酸酶以诱导所述特定可遗传突变的向导RNA(gRNA)和选择性标记物；(b)从转染的细胞再生植物以提供多株T0植物；(c)将所述T0植物与不包含所述外源DNA的等基因植物杂交以提供多株后代植物；和(d)从所述后代植物中选择一株或多株具有所述可遗传突变的植物。

附图说明

图1：实施例1的方法概述。A.番茄的Ch02上涉及的基因位置的示意图。MS指雄性不育基因，以及AA指花色素苷缺失基因。基因的大小和位置没有按比例绘制。B.这两个基因中CRISPR-Cas诱导的双链断裂的位置显示为闪电状。一小部分切除的染色体片段以相反的方向被修复，导致诱导的倒位。此外，两个基因(MS和AA)都被敲除。这导致雄性不育和花色素苷缺失。在杂种中，ms和aa之间的遗传距离降低到0cM，因为诱导的倒位导致重组抑制。用于检查诱导的倒位的存在的引物如小箭头所示。

图2：表示靶向的诱导的倒位。使用的CRISPR-Cas9构建体每个构建体含有两个gRNA，例如gMS1和gAA1，分别靶向MS-基因和AA-基因。当在同一染色体中的在两个位点处诱导双链断裂时，两者之间的DNA片段可发生倒位。倒位将导致两个基因都失活，因为一个基因的一部分与另一个基因的剩余部分反向融合。使用精心设计的PCR引物明确地检测倒位事件。在该实例中，在同一DNA链上在倒位的边界处的两个引物位点(MS-R和AA-R)在野生型基因组中以阻止PCR中任何扩增的方式被定向。然而，倒位后，引物结合位点的新位置靠近在一起并且方向相反，这使得DNA片段的扩增成为可能。

图3：图的上部表示野生型参考基因组。倒位后，gMS侧的序列被倒置并连接到gAA侧，如箭头所示。参考基因组上相隔约1.1Mbp的gRNA序列连接在一起，如底部的序列所示。图的下部的比对显示DNA在gRNA结合位点的预测位置被切割。加粗的gRNA序列部分对应于倒位的另一侧的序列。用构建体1转染后诱导的倒位的一端的DNA序列分析。Sanger序列是用引物MS-R和AA-R以及来自用包含gRNA序列gMS1和gAA1的构建体1转染的原生质体的基因组DNA产生的PCR产物的一部分。Sanger序列是指倒位的右侧，以及在该侧的侧翼DNA。

图4：图的上部表示野生型参考基因组。倒位后，gMS侧的序列被倒置并连接到gAA侧，如箭头所示。参考基因组上相隔约1.1Mbp的gRNA序列连接在一起，如底部的序列所示。图的下部的比对显示DNA在gRNA结合位点的预测位置被切割。加粗的gRNA序列部分对应于倒位的另一侧的序列。用构建体3转染后诱导的倒位的一端的DNA序列分析。Sanger序列是用引物MS-F和AA-F以及来自用包含gRNA序列gMS3和gAA3的构建体3转染的原生质体的基因组DNA产生的PCR产物的一部分。Sanger序列是指倒位的左侧，以及在该侧的侧翼DNA。

图5：图的上部表示野生型参考基因组。倒位后，gMS侧的序列被倒位并连接到gAA侧，如箭头所示。参考基因组上相隔约1.1Mbp的gRNA序列连接在一起，如底部的序列所示。图的下部的比对显示DNA在gRNA结合位点的预测位置被切割。加粗的gRNA序列部分对应于倒位的另一侧的序列。用构建体4转染后诱导的倒位的一端的DNA序列分析。Sanger序列是用引物MS-R和AA-R和来自用包含gRNA序列gMS4和gAA4的构建体4转染的原生质体的基因组DNA产生的PCR产物的一部分。Sanger序列是指倒位的右侧，以及在该侧的侧翼DNA。

具体实施方式

通用定义

应当理解，本发明不限于特定的方法或方案。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。必须注意，如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数的提及，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“一个载体”的提及是对一个或多个载体的提及并且包括本领域技术人员已知的其等价物等等。术语“约”在本文中用于表示近似、大致、大约或在该范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界扩展到规定的数值之上和之下来修改该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于将数值修改为高于和低于规定值的20％变化，优选上或下10％(更高或更低)。如本文所使用的，词语“或”表示特定列表的任何一个成员并且还包括该列表的成员的任何组合。当在本说明书和所附权利要求书中使用时，词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(including)”和“包括(includes)”旨在指定一个或多个所述特征、整数、成分或步骤的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、成分、步骤或其组的存在或添加。为清楚起见，说明书中使用的某些术语的定义和使用如下：

术语“基因组”涉及生物体的遗传物质。它由DNA组成。基因组包括基因和DNA的非编码序列。

术语“基因”指(基因组)DNA序列，其包括在细胞中被转录成信使RNA分子(mRNA)的区域(转录区)和可操作地连接的调节区(在本文中也描述为调控序列，例如启动子)。因此，基因可以包括几个可操作地连接的序列，例如启动子、5’前导序列(包括例如涉及翻译起始的序列、(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA))和3’非翻译序列(包括例如转录终止位点)。因此，基因的不同等位基因是该基因的不同替代形式，其形式可以是例如：基因组DNA序列(例如启动子序列、外显子序列、内含子序列等)、mRNA的一个或多个核苷酸的差异和/或编码蛋白质的氨基酸序列的差异。基因可以是内源基因，其在本文中定义为包含源自原始物种(species 0forigin)的DNA序列的基因座。

对植物诱导的遗传修饰可为顺基因修饰(cisgenic modification)，其在本发明的上下文中是指经由整合来源于相同或性相容的物种的全(完整)基因(包括编码序列及它们的天然调控元件(例如启动子和终止子))对植物基因组的修饰。对植物的诱导的遗传修饰也可为基因内修饰(intragenic modification)，其在本发明的上下文中是指经由整合来源于相同或性相容的物种的重组基因(包括编码序列及它们的天然调控元件(例如启动子和终止子))对植物基因组的修饰。内发生(Intragenesis)不同于顺式发生(cisgenesis)之处在于可使用遗传元件的不同组合，例如来自不同基因的启动子。将来自非性相容的生物体或来自不同属的生物体的任何DNA序列整合在基因组中的植物称为“转基因植物”。“可杂交物种”包括该生物体的分类学上的科内的物种。“不可杂交的物种”是在该物种的分类学上的科之外的物种。

基因序列的“启动子”被定义为启动特定基因转录的DNA区域。启动子位于其转录的基因附近，位于DNA的同一条链和上游。启动子的长度约为100-1000个碱基对。在一方面，启动子被定义为在基因编码的蛋白质的起始密码子(即ATG)的上游约1000个碱基对或更多碱基对(例如大约1500或2000)的区域。

“基因的表达”是指一个过程，其中DNA区域——其可操作地连接到适当的调节区(特别是启动子)——被转录成具有生物活性的RNA，即所述RNA能够被翻译成具有生物活性的蛋白质或肽(或活性肽片段)或本身具有活性(例如在转录后基因沉默或RNAi中)。编码序列可以是正义方向的并且编码所需的生物活性蛋白质或肽或活性肽片段。

“数量性状基因座”或“QTL”是编码影响连续分布的(数量)表型的表现度(expressivity)的一个或多个等位基因的染色体基因座。

在同一染色体上的基因座之间(例如基因之间和/或分子标记物之间和/或表型标记物之间)的“物理距离”为实际物理距离，其用碱基或碱基对(bp)，千碱基或千碱基对(kb)或者兆碱基或兆碱基对(Mb)表示。

通过交换频率或重组频率(RF)测量在同一染色体上的基因座之间(例如分子标记物之间和/或表型标记物之间)的“遗传距离”，并且用厘摩(cM)表示。1cM相当于1％的重组频率。如果没有发现重组体，则RF为零并且基因座在物理上非常紧密地在一起或它们是相同的。两个基因座的相距越远，RF越高。

术语“减数分裂重组”是指涉及在减数分裂期间在真核生物中发生的同源染色体配对的遗传重组。同源染色体的配对之后可为所述染色体之间的信息传递。这种信息传递可不伴随物理交换而发生(一段遗传物质从一条染色体复制到另一条染色体，而供体染色体未改变)或通过DNA链的断裂和再连接而发生，这形成新的重组DNA分子。

术语“RNA引导的DNA内切核酸酶”是指能够切割靶核酸(例如靶DNA)内的磷酸二酯键的酶，由此通过与RNA引导的DNA内切核酸酶结合以形成复合物的向导RNA来特别地确定切割位点。这种RNA引导的DNA内切核酸酶通常与细菌中的规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)适应性免疫系统相关，其中不同的RNA引导的DNA内切核酸酶来源于不同的细菌物种。RNA引导的DNA核酸内切酶是本领域公知的，包括但不限于Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c和Cas13；参见例如Schindele 2018doi：10.1002/1873-3468.13073。

术语“向导RNA”(gRNA)是指能够与RNA引导的DNA内切核酸酶结合并且特异性结合靶核酸序列，从而将RNA引导的DNA内切核酸酶引导至所述靶核酸的非编码短RNA。gRNA包含“间隔基核酸(spacer nucleic acid)”，其是包含足够数目的碱基的核酸，所述碱基与靶核酸互补以特异性结合靶核酸，从而能够将RNA引导的DNA内切核酸酶引导至靶核酸的目的区域。

术语“CRISPR RNA”(crRNA)是指gRNA的组分，其中所述crRNA是包含定位宿主DNA的正确区段的间隔基核酸的gRNA的元件。在CRISPR-Cas9系统中，所述crRNA包含与tracrRNA结合以形成活性gRNA的区域。包含在CRISPR-Cas9系统中的活性gRNA可包含形成复合物的单独的crRNA和单独的tracrRNA，或者可包含活性sgRNA，所述活性sgRNA包含例如通过接头共价连接的crRNA和tracrRNA。术语“反式激活的crRNA”(trans-activatingcrRNA，tracrRNA)是指包含在CRISPR-Cas9系统中的gRNA的组分，其通常包含发夹环并且与crRNA结合形成活性gRNA。

术语“选择性标记物”是指这样的基因，即当其被引入细胞时，赋予适合于人工选择的性状以显示转染成功(意味着将外源DNA引入细胞)。特别合适的选择性标记物包括抗生素抗性基因，例如ntp II(卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II)、hpt(潮霉素B(hygromycin B)抗性的潮霉素磷酸转移酶)和aadA(链霉素抗性的氨基糖苷-3腺苷转移酶(adenyltransferase))。

术语“转染”或“转化”或“转导”涉及将核酸人为地(deliberately)引入细胞的过程。

“野生型等位基因”(WT)在本文中是指编码完全功能性蛋白质(野生型蛋白)的基因的形式。

例如，术语“野生型MS10等位基因”或“MS10等位基因”或“MS10基因的野生型等位基因”是指MS10基因的完全功能性等位基因，当与野生型MS10等位基因相比时，其允许正常蛋白质的功能(即正常的蛋白质表达与所表达蛋白质的正常的酶活性的组合)。MS10基因编码碱性螺旋-环-螺旋转录因子。例如，番茄(Solanum lycopersicum)种中野生型MS10等位基因的一个实例是编码SEQ ID NO：2所示的野生型MS10 cDNA(mRNA)序列的野生型基因组DNA。由该野生型MS10 cDNA编码的蛋白质序列具有209个氨基酸残基，并描绘于SEQ ID NO：1，其对应于NCBI参考序列XM_026029418.1。野生型番茄MS10等位基因还包含编码本文所述的野生型MS10cDNA和氨基酸序列的野生型基因组DNA的功能性变体。本文具体描述的野生型MS10等位基因的某一变体是否代表“功能性变体”可以通过使用常规方法来确定，包括但不限于正常有活力的花粉生产的表型检测和影响蛋白质功能的氨基酸改变的计算机(insilico)预测。例如，基于网络的计算机程序SIFT(Sorting Intolerant from Tolerant)是预测氨基酸置换是否影响蛋白质功能的程序；参见万维网sift.bii.a-star.edu.sg/。功能上重要的氨基酸在蛋白质家族中是保守的，因此在保守位置的改变倾向于被预测为不容许或有害的；还参见Ng和Henikoff(2003)Nucleic Acids Res 31(13)：3812-3814。例如，如果蛋白质家族比对中一个位置仅含有氨基酸异亮氨酸，则假定不选择将其置换为任何其它氨基酸，并且异亮氨酸是蛋白质功能所必需的。因此，改变为任何其它氨基酸将被预测对蛋白质功能有害。如果比对中一个位置含有疏水性氨基酸异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸，则SIFT实际上假定该位置只能包含具有疏水性的氨基酸。在该位置，改变为其它疏水性氨基酸通常被预测是容许的，但改变为其它残基(例如带电荷的或极性的)将被预测为影响蛋白质功能。用于预测蛋白质功能的替代性工具是Provean；参见万维网provean.jcvi.org/index.php。此外，番茄MS10基因的直系同源物，特别是番茄种的野生近缘种中，可为野生型MS10等位基因的功能性变体，条件是所述变体允许正常的蛋白质功能。

作为另一实例，“野生型AA等位基因”或“AA等位基因”或“AA基因的野生型等位基因”是指AA基因的完全功能性等位基因，当与野生型AA等位基因相比时，其允许正常的蛋白质功能(即正常的蛋白质表达与所表达蛋白质的正常的酶活性的组合)。AA基因编码谷胱甘肽S-转移酶。例如，番茄种中野生型AA等位基因的一个实例是编码SEQ ID NO：4所示的野生型AA cDNA(mRNA)序列的野生型基因组DNA。由该野生型AA cDNA编码的蛋白质序列具有230个氨基酸残基，并描绘于SEQ ID NO：3，其对应于NCBI参考序列XM_004232621.4。野生型番茄AA等位基因还包含编码如本文所述的野生型AA cDNA和氨基酸序列的野生型基因组DNA的功能性变体。本文具体描述的野生型AA等位基因的某一变体是否代表“功能性变体”可通过使用常规方法来确定，包括但不限于酶活性的测试、下胚轴颜色的表型检测和如上文进一步描述的影响蛋白质功能的氨基酸改变的计算机预测。此外，番茄AA基因的直系同源物，特别是在番茄种的野生近缘种中，可为野生型AA等位基因的功能性变体，条件是所述变体允许正常的蛋白质功能。

“突变体等位基因”在本文中是指与野生型等位基因相比包含一个或多个突变的等位基因，从而产生本发明的性状。所述一个或多个突变可以在编码序列(mRNA、cDNA或基因组序列)中或在相关的非编码序列和/或调控编码序列表达水平的调控序列中。这种突变(例如一个或多个核苷酸的插入、倒位、缺失和/或置换)可导致编码的蛋白质具有降低的体外和/或体内功能性(降低的功能)或没有体外和/或体内功能性(丧失功能)，例如由于蛋白质被截短或具有其中一个或多个氨基酸被缺失、插入或置换的氨基酸序列。这种改变可导致蛋白质具有不同的3D构象、被靶向至不同的亚细胞区室(compartment)、具有一个或多个修饰的催化结构域、对核酸或蛋白质具有修饰的结合活性等，优选地，本发明的突变等位基因与野生型蛋白质相比编码具有降低的功能或功能丧失的截短的蛋白质。此外，突变(例如一个或多个核苷酸的插入、倒位、缺失和/或置换)可导致编码的蛋白质具有降低的表达或无蛋白质表达。

例如，术语“突变的MS10等位基因”或“MS10等位基因”或“MS10基因的突变等位基因”或“野生型MS10基因的突变等位基因”尤其是指在编码序列中包含一个或多个突变的MSI0基因的等位基因，该一个或多个突变导致编码的基因产物的功能降低或功能丧失，并且当该突变等位基因是纯合形式时，其导致植物具有雄性不育性状。术语“雄性不育”或“雄性不育性状”是指导致植物不能产生功能性花药、花粉或雄性配子的植物性状。术语突变的ms10等位基因还包含敲除(knock-out)ms10等位基因和敲低(knock-down)ms10等位基因，以及编码具有降低的功能或无功能的突变的ms10蛋白的ms10等位基因。如本文所用，术语“敲除等位基因”是指其中相应(野生型)基因的表达不再可检测的等位基因。与野生型等位基因相比，“敲低”等位基因降低了相应(野生型)基因的表达。

作为另一实例，术语“突变的aa等位基因”或“aa等位基因”或“AA基因的突变等位基因”或“野生型AA基因的突变等位基因”尤其是指在编码序列中包含一个或多个突变的AA基因的等位基因，该一个或多个突变导致编码的基因产物的功能降低或功能丧失，并且当该突变等位基因是纯合形式时，导致植物具有花色素苷缺失性状。术语“花色素苷缺失”或“花色素苷缺失性状”是指导致所述植物的下胚轴中花色素苷着色缺失的植物性状。术语突变的aa等位基因还包含敲除aa等位基因和敲低aa等位基因，以及编码具有降低的功能或无功能的突变的aa蛋白的aa等位基因。

本文所用的术语“诱导的突变等位基因”是指通过人为干预如诱变产生的导致本发明性状的野生型基因的任何等位基因。优选地，所述诱导的突变等位基因不能在自然种群或培育种群的植物中发现。

本文所用的术语“自然突变等位基因”是指导致本发明性状的野生型基因的任何等位基因，其中所述突变等位基因在没有直接人为干预下逐渐演变。优选地，自然突变等位基因可以在自然种群或培育种群中的植物中发现。

术语“直系同源基因”或“直系同源物”定义为经物种形成事件逐渐演化的不同物种中的基因。通常假定直系同源物在不同物种中具有相同的生物学功能。因此，特别优选由番茄种的野生近缘种中的野生型番茄MS10基因的直系同源物编码的蛋白质具有与野生型番茄MS10蛋白质相同的生物学功能。此外，特别优选由番茄种的野生近缘种中的野生型番茄AA基因的直系同源物编码的蛋白质具有与野生型番茄AA蛋白质相同的生物学功能。用于鉴定直系同源物的方法在本领域中是众所周知的，正如它实现两个目标：描绘基因的谱系(genealogy)以研究演变过程的力量(force)和机制并创建具有相同生物学功能的基因群(Fang G，et al(2010)Getting Started in Gene Orthology and FunctionalAnalysis.PLoS Comput Biol 6(3)：e1000703.doi：10.1371/journal.pcbi.1000703)。例如，特定基因或蛋白质的直系同源物可使用目的蛋白质的基因序列与其它物种的基因序列的序列比对或序列同一性来鉴定。基因比对或基因序列同一性测定可以根据本领域已知的方法进行，例如通过鉴定现有核酸或蛋白质数据库(例如GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL)中的核酸或蛋白质序列并使用标准序列分析软件，例如序列相似性搜索工具(BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等)。

“基因渗入片段”或“基因渗入部分”或“基因渗入区域”是指已通过杂交或传统育种技术(例如回交)引入到相同或相关物种的另一植物中的染色体片段(或染色体部分或区域)，即基因渗入片段是由动词“渐渗”提及的育种方法(例如回交)的结果。应当理解，术语“基因渗入片段”绝不包括整个染色体，而仅包括染色体的一部分。基因渗入片段可以是大的，例如甚至是染色体的四分之三或一半，但优选更小的，例如约15Mb或更小、如约10Mb或更小、约9Mb或更小、约8Mb或更小、约7Mb或更小、约6Mb或更小、约5Mb或更小、约4Mb或更小、约3Mb或更小、约2.5Mb或2Mb或更小、约1Mb(等于1,000,000碱基对)或更小、或约0.5Mb(等于500,000碱基对)或更小、如约200,000bp(等于200千碱基对)或更小、约100,000bp(100kb)或更小、约50,000bp(50kb)或更小、约25,000bp(25kb)或更小。

术语“等基因植物(isogenic plant)”是指除了目的突变等位基因之外在遗传上相同的两种植物。然后可以在包含突变的植物系(品种)与其不包含突变的等基因系之间比较目的突变等位基因的影响，例如对突变植物表型的影响。

术语“核酸序列”或“核酸分子”或多核苷酸可互换使用，并且是指单链或双链形式的DNA或RNA分子，特别是编码本发明蛋白质或蛋白质片段的DNA。“分离的核酸序列”指不再处于其分离的自然环境中的核酸序列，例如细菌宿主细胞或植物核基因组或质体基因组(plastid genome)中的核酸序列。

术语“蛋白质”，“肽序列”，“氨基酸序列”或“多肽”可互换使用，并且是指由氨基酸链组成的分子，不涉及特定的作用模式、大小、三维结构或来源。因此，蛋白质的“片段”或“部分”仍可称为“蛋白质”。“分离的蛋白质”用于指不再处于其自然环境中的蛋白质，例如在体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。

“活性蛋白”或“功能性蛋白”是具有可在体外(例如通过体外活性测定)和/或在体内(例如通过蛋白质赋予的表型)测量的蛋白活性的蛋白。“野生型”蛋白是如野生型植物中存在的完全功能性蛋白质。“突变蛋白”在本文中是在编码蛋白质的核酸序列中包含一个或多个突变的蛋白，由此所述突变产生(突变的核酸分子编码的)具有改变的活性的蛋白质，优选具有降低的活性的蛋白质，最优选不具有活性的蛋白质。

本文所述的蛋白质的“功能衍生物”是保留至少一部分活性或与突变蛋白的特异性抗体的免疫交叉反应性的蛋白的片段、变体、类似物或化学衍生物。

突变蛋白的片段是指该分子的任何子集(subset)。

变体肽可以通过直接化学合成制备，例如使用本领域众所周知的方法。

突变蛋白的类似物是指基本上类似于完整蛋白或其片段的非天然蛋白。

核酸分子中的“突变”是与野生型序列相比一个或多个核苷酸的改变，例如通过一个或多个核苷酸的置换、缺失或插入。

组成蛋白质的氨基酸分子中的“突变”是与野生型序列相比一个或多个氨基酸的改变，例如通过一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入。这样的蛋白也称为“突变蛋白”。

“点突变”是单个核苷酸的置换，或单个核苷酸的插入或缺失。

“无义突变”是编码蛋白质的核酸序列中的(点)突变，由此核酸分子中的密码子变为终止密码子。这导致mRNA中存在提前终止密码子并导致截短的蛋白的翻译。截短的蛋白可能具有降低的功能或功能丧失。

“错义或非同义突变”是编码蛋白质的核酸序列中的(点)突变，由此改变密码子以编码不同的氨基酸。所得蛋白质可能具有降低的功能或功能丧失。

“剪接位点突变”是编码蛋白质的核酸序列中的突变，由此改变前mRNA的RNA剪接，产生具有与野生型不同的核苷酸序列的mRNA和具有与野生型不同的氨基酸序列的蛋白质。所得蛋白质可能具有降低的功能或功能丧失。

“移码突变”是编码蛋白质的核酸序列中的突变，mRNA的读码框通过该突变改变，导致不同的氨基酸序列。所得蛋白质可能具有降低的功能或功能丧失。

在本发明上下文中，“缺失”是指与相应野生型序列的核酸序列相比，在给定核酸序列的任何地方缺少至少一个核苷酸，或与相应(野生型)序列的氨基酸序列相比，在给定氨基酸序列的任何地方缺少至少一个氨基酸。

在本发明上下文中，“倒位(inversion)”是指一种突变，其中当与野生型核苷酸序列相比时，在给定的核酸序列中至少3个或更多个核苷酸的片段的核苷酸序列被反转。

本发明上下文中的“重复(duplication)”是指一种突变，其中与野生型核苷酸序列相比，在给定核酸序列中至少3个或更多个核苷酸的片段的核苷酸序列被重复。所述重复片段可包含一个或多个全基因(whole gene)。所述重复片段还可包含一个或多个调控区。此外，该片段可以在基因组的相同染色体内重复，或者可在基因组中的不同染色体上重复。

在本发明的上下文中，“易位(translocation)”是指一种突变，其中当与野生型核苷酸序列相比时，在给定的核酸序列中至少3个或更多个核苷酸的片段的核苷酸序列从基因组中的一个基因座缺失并插入基因组中的不同基因座。至少3个或更多个核苷酸的易位片段可包含一个或多个全基因。至少3个或更多个核苷酸的易位片段可以进一步包含一个或多个调控区。此外，该片段可以在基因组的相同染色体内易位，或者可在基因组的中不同染色体上易位。

“截短”应理解为意指与相应野生型序列的核酸序列相比，在核苷酸序列的3’端或5’端缺少至少一个核苷酸，或与相应野生型蛋白质的氨基酸序列相比，在蛋白质的N-末端或C-末端缺少至少一个氨基酸，由此在3’端或C-末端截短中，分别在5’端的至少第一个核苷酸或在N-末端的第一个氨基酸仍然存在，并且在5’端或N-末端截短中，分别在3’端的至少最后一个核苷酸或在C-末端的最后一个氨基酸仍然存在。5’端由在相应野生型核酸序列的翻译中用作起始密码子的ATG密码子决定。

“置换”是指核酸序列中的至少一个核苷酸或蛋白质序列中的至少一个氨基酸分别与相应的野生型核酸序列或相应的野生型氨基酸序列相比由于相应蛋白质的编码序列中的核苷酸的交换而不同。

“插入”是指蛋白质的核酸序列或氨基酸序列与相应的野生型核酸序列或相应的野生型氨基酸序列相比分别包含至少一个额外的核苷酸或氨基酸。

在本发明的上下文中，“提前终止密码子”是指存在于编码序列(cds)中的终止密码子，其与相应的野生型编码序列的终止密码子相比，更接近于5’端的起始密码子。

“调控序列中的突变”，例如在基因的启动子或增强子中，是与野生型序列相比一个或多个核苷酸的改变，例如通过一个或多个核苷酸的置换、缺失或插入，导致例如产生的基因的mRNA转录产物减少或没有。因此，“基因序列的启动子”定义为开始特定基因转录的DNA区域。启动子位于它们转录的基因附近，在同一条链上并在DNA的上游。启动子可为约100-1000碱基对长。在一个方面，启动子定义为由基因编码的蛋白质的起始密码子(即ATG)的上游约2000碱基对或更多的区域，优选地，启动子是起始密码子上游约1500碱基对的区域，更优选地，启动子是起始密码子上游约1000碱基对的区域。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件以功能关系连接。当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，它是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或转录调控序列影响编码序列的转录，则其可操作地连接至编码序列。可操作地连接是指被连接的核酸序列通常是相邻的(contiguous)。

可通过使用全局或局部比对算法进行的两个肽或两个核苷酸序列的比对来确定“序列同一性”或“序列相似性”。然后，当通过例如程序GAP或BESTFIT或Emboss程序“Needle”(使用默认参数，参见下文)对序列进行最佳比对时，这些序列共有至少某一最小的序列同一性百分比(如下文进一步定义的)时，所述序列可以被称作“基本相同”。这些程序使用Needleman和Wunsch全局比对算法来在全长上比对两个序列，最大化匹配数并最小化空位数。通常，使用默认参数，其中空位生成(gap creation)罚分＝10，空位延伸(gapextension)罚分＝0.5(对于核苷酸和蛋白质比对均如此)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是DNAFULL，而对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，10915-10919)。例如可以使用计算机程序，如EMBOSS，(例如可在互联网上通过ebi.ac.uk在http://www.ebi.ac.uk的/Tools/psa/emboss_needle/下获得)来确定用于百分比序列同一性的序列比对和评分。或者，可以通过搜索数据库(例如FASTA、BLAST等)来确定序列相似性或同一性，但是应检索命中并进行成对比对以比较序列同一性。如果序列同一性百分比为至少95％、96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或更优选地99.7％(如通过使用默认参数(即，空位生成罚分＝10，空位延伸罚分＝0.5)，对于核酸，使用评分矩阵DNAFULL，对于蛋白质，使用评分矩阵Blosum62通过Emboss“Needle”所确定的)，则两个蛋白质或两个蛋白质结构域或两个核酸序列具有“基本序列同一性”。这样的序列在本文中也称为“变体”，例如除了本文公开的特定核酸和氨基酸序列，可鉴定导致本发明的雄性不育性状和/或本发明的花色素苷缺失性状的等位基因的其他变体，其对雄性不育和/或下胚轴中花色素苷的缺失具有与本发明的植物相同的作用。

如本文所使用的，术语“杂交”通常用于指核酸在合适的严格条件(严格杂交条件)下的杂交，这对于本领域技术人员来说是显而易见的，取决于探针序列和靶序列的性质。杂交和洗涤的条件在本领域中是众所周知的，并且通过改变溶液的培育时间、温度和/或离子强度，根据所需的严格性来调节条件是容易实现的。参见例如Sambrook，J.等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York，1989。条件的选择取决于被杂交的序列的长度，特别是探针序列的长度、核酸的相对G-C含量和允许的错配量。当需要互补程度较低的链之间部分杂交时，优选低严格条件。当需要完全或接近完全的互补性时，优选高严格条件。对于典型的高严格条件，杂交溶液包含6X S.S.C.、0.01M EDTA、1X Denhardt′s溶液和0.5％SOS。对于克隆的DNA片段，杂交在约68℃进行约3至4小时，并且对于总真核DNA，杂交进行约12至约16小时。对于较低的严格性，杂交温度降低至低于双链体的解链温度(T_M)约42℃。已知T_M是G-C含量和双链体长度以及溶液的离子强度的函数。

如本文所用，短语“杂交”到DNA或RNA分子是指杂交的分子，例如寡核苷酸、多核苷酸或任何核苷酸序列(正义或反义方向)识别并与另一核酸分子中的序列杂交，所述另一核酸分子具有大致相同的大小且与其具有足够的序列相似性以在合适的条件下实现杂交。例如，来自基因的3’编码或非编码区的100个核苷酸长的分子将识别并杂交至该基因或任何其他植物基因的3’编码或非编码区内的核苷酸序列的约100个核苷酸部分，只要这两个序列之间有约70％或更多的序列相似性。应理解，相应部分的大小将允许杂交中的一些错配，使得相应部分可比与其杂交的分子更小或更大，例如更大或更小20-30％，优选更大或更小不超过约12-15％。

如本文所用，短语“包含至少95％序列同一性的序列”或“包含至少95％氨基酸序列同一性的序列”或“包含至少95％核苷酸序列同一性的序列”是指当与指定的参考序列相比时具有至少95％，例如至少96％、97％、98％、98.3％、98.7％、99.0％或99.3％或更优选99.7％序列同一性的序列。序列同一性可根据本文所述的方法测定。

基因或DNA序列的“片段”是指该分子的任何子集，例如较短的多核苷酸或寡核苷酸。在一个方面，所述片段包含如本发明所定义的突变。

基因或DNA的“变体”是指基本上类似于整个基因或其片段的分子，例如具有一个或多个被置换的核苷酸的核苷酸置换变体，但是其保持与特定基因杂交或编码与天然DNA杂交的mRNA转录产物的能力。优选地，所述变体包含本发明定义的突变等位基因。

本文使用的术语“植物”包括完整的植物或其任何部分或衍生物，例如植物器官(如采收的或未采收的花、叶等)、植物细胞、植物原生质体、可由其再生出完整植物的植物细胞或组织培养物、可再生或非可再生植物细胞、植物愈伤组织、植物细胞团和植物中完整的植物细胞，或植物的部分，例如胚、花粉、胚珠、子房(例如采收的组织或器官)、花、叶、种子、块茎、无性繁殖的植物、根、茎、子叶、下胚轴、根尖等。还包括任何发育阶段，例如未成熟和成熟的幼苗等。

“植物系”或“育种系”是指植物及其后代。本文使用的术语“近交系”是指已经反复自交并且各项特征几乎是纯合的植物系。因此，“近交系”或“亲本系”是指经历了几代(例如，至少5、6、7或更多代)近交的植物，导致具有高度均一性的植物系。

“植物品种”是在已知最低等级的相同植物分类群中的一组植物，所述植物品种可以是基于源自某一特定基因型或基因型组合的特征的表达来定义(无论是否满足《植物育种者权利》(plant breeder′s rights)中的认可条件)，可以通过那些特征中的至少一种的表达而将所述植物品种与任何其他组的植物区分开，也可将所述植物品种看作一个实体，因为其可被繁殖而无任何改变。因此，如果一组植物的特征都在于存在1个或或基因(或者由该基因座或基因产生的一系列表型特征)，但是它们又在其它基因座或基因上可以彼此显著不同，那么即使它们是同一类的，也不可以使用术语“植物品种”来表述该组植物。“F1、F2等”是指两个亲本植物或亲本株系之间杂交后的连续相关世代。由两个植物或株系杂交产生的种子长出的植物称为F1代。F1植物自交产生F2代等。“F1杂种”植物(或F1种子、或杂种)是由两个近交的亲本株系杂交得到的世代。因此，“自交”是指植物的自花授粉，即来自相同植物的配子的联合。

“回交”是指一种育种方法，通过该方法可以将(单一)性状(例如雄性不育性状和/或花色素苷缺失性状)，从一种遗传背景(也称为“供体”，通常但不一定是劣等遗传背景)转移到另一种遗传背景(也称为“轮回亲本”；通常但不一定是优良的遗传背景。将杂交的后代(例如，通过将包含本发明的突变等位基因的某一植物物种的第一植物与相同植物物种或可与所述第一植物物种杂交的不同植物物种的第二植物杂交获得的F1植物，其中所述第二植物物种不包含本发明的突变等位基因)；或者通过自交F1获得的F2植物或F3植物等)“回交”到所述第二植物物种的亲本植物中。反复回交后，供体遗传背景的性状，例如如本文所述的赋予雄性不育性状和/或花色素苷缺失性状的突变等位基因，将被掺入到轮回遗传背景中。本文中的术语“基因转化的(gene converted)”或“转化植物”或“单基因座转化”是指通过回交开发的植物，其中除了从供体亲本转移的一个或多个基因之外，还基本上重新获得轮回亲本的所有所需的形态学和/或生理学特征。由F1植物与第二亲本植物系回交产生的种子长成的植物称为“BC1代”。来自BC1群体的植物可自交产生BC1F2代或再次与培养的亲本植物系回交以提供BC2代。“M1群体”是某一植物系的多个诱变的种子/植物。“M2、M3、M4，等”指第一诱变的种子/植物(M1)自交后获得的连续世代。本文所用的术语“T0植物”涉及从一株或多株转染的细胞再生的植物。“T1、T2、T3等”指第一转染的种子/植物(T0)自交后获得的连续世代。

术语“栽培植物”或“栽培种”指由人工栽培并具有优质的农学特征的给定物种的植物，例如所述物种的品种、育种系或栽培种。所谓的珍稀品种(heirloom variety)或栽培种，即通常在人类历史较早时期种植并通常适应于特定地理区域的自由授粉品种或栽培种，在本文中作为栽培植物被包括在本发明的一个方面中。术语“栽培植物”不包括野生植物。“野生植物”包括例如野生种质(accession)。

术语“食物”是被消耗身体以给提供营养支持的任何物质。它通常是植物或动物来源的，并包含有必需营养素，例如碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素或矿物质。所述物质被生物体摄取并被生物体的细胞吸收以产生能量，维持生命或刺激生长。术语食物包括被消耗以给人类和动物机体提供营养支持的物质。

“营养繁殖”或“无性繁殖”是指从营养组织的植物繁殖，例如由插条繁殖植物或通过体外繁殖。体外繁殖包括体外细胞或组织培养和从体外培养再生整株植物。因此可以通过体外培养产生原始植物的克隆(即遗传上相同的营养繁殖体)。“细胞培养”或“组织培养”是指植物的细胞或组织的体外培养。“再生”是指植物从细胞培养或组织培养或营养繁殖发育。“非繁殖细胞”是指不能再生成整株植物的细胞。

“平均值”在本文中是指算术平均值。

应理解，不同植物系(line)之间的比较涉及在与一个或多个对照植物系的植物(优选野生型植物)相同的条件下种植一种系(或品种)的多株植物(例如每种株系至少5株植物，优选至少10株植物)，并测定在相同环境条件下生长时所述植物系之间的差异，优选统计学显著差异。优选地，所述植物是相同的系或品种。

在植物中引入和选择特定可遗传突变的方法

本发明提供用于在植物中引入和选择特定可遗传突变的方法，包括：(a)用外源DNA转染植物细胞，其中所述外源DNA编码RNA引导的DNA内切核酸酶、适合于引导所述RNA引导的DNA内切核酸酶以诱导所述特定可遗传突变的向导RNA(gRNA)和选择性标记物；(b)从转染的细胞再生植物以提供多个T0植物；(c)将所述T0植物与不包含所述外源DNA的等基因植物杂交以提供多株后代植物；和(d)从所述后代植物中选择一株或多株具有所述可遗传突变的植物。

通过将T0植物与野生型植物杂交，可以防止当特定可遗传突变仅以低频率发生时需要产生和筛选非常大量的T0植物。不受理论约束，认为至少在T0植物的子集中，DNA内切核酸酶/gRNA复合物将是具有活性的。通过将T0植物与野生型植物(即不包含活性构建体的植物)杂交，具有活性的DNA内切核酸酶/gRNA复合物的T0植物将在F1代(具有活性构建体的T0植物与野生型植物之间杂交的后代)中诱导所需的突变。其结果是，可产生非常大量的F1植物，需要这些植物来鉴定目的特定可遗传突变。这样大量的F1植物比非常大量的T0植物更容易获得。例如，当所需的可遗传突变是靶植物的基因组DNA中的倒位以将两个性状之间的遗传距离减小到0时，必须克服的最显著的问题是实际的倒位仅以非常低的频率发生。甚至很难产生足够的转基因事件来能够鉴定具有所需倒位的植物。相反，本发明人惊讶地发现，可以选择具有活性构建体的转染植物，并将这些植物与来自具有完整gRNA靶位点的等基因野生型植物的花粉杂交。该等基因野生型花粉为之后的受精带来新的模板。因此，通过取样子叶、DNA分离和基于PCR的筛选，可以容易地筛选来自这些杂交的种子的更大量的幼苗。因此，通过使用本发明的方法，可以容易地产生许多新的单个植物，而无需体外产生从头开始转染或转化的个体以鉴定具有所需的稀有突变的植物。事实上，具有活性CRISPR-Cas构建体的植物可用作任何花粉供体中的“突变诱导物”以进行杂交。仅需要少数回交来产生具有所需突变的供体基因型。

因此，将T0植物与不包含外源DNA的等基因植物杂交的步骤提供了活性的DNA内切核酸酶/gRNA复合物以及具有完整的gRNA靶位点的基因组DNA，由此通过活性DNA内切核酸酶/gRNA诱导所需的突变。因此，将T0植物与不包含如本发明所包含的所述外源DNA的等基因植物杂交的方法步骤代表将性状引入产生的植物的基因组中或在产生的植物的基因组中修饰性状的技术步骤。在将T0植物与不包含所述外源DNA的等基因植物杂交的方法步骤中引入或修饰性状不是选择用于有性杂交的植物的基因混合的结果。

因此，在本发明方法的一个步骤中，用外源DNA转染植物细胞。用于在植物细胞中引入外源DNA的手段和方法是本领域众所周知的，包括但不限于细菌介导的转化(例如农杆菌(Agrobacterium)介导的转化)、病毒介导的基因转移、基于粒子的转染方法如使用颗粒轰击的生物枪法、非化学方法如电穿孔、超声处理(sonification)和显微注射，以及化学方法如脂质体转染；参见例如Keith Lindsey和Wenbin Wei.In：Arabidopsis，A PracticalApproach.Ed.Z.a.Wilson.Oxford Uni-versity Press，2000.New York，USA。外源DNA引入植物细胞可以在植物细胞培养物、植物组织培养物或甚至包含在整株植物中的植物细胞中进行。在后一种情况下，在从转染的细胞再生植物之前，将转染的细胞从未转染的植物细胞中分离或分开。当需要在转化植物的后代中产生和鉴定新的突变事件时，优选通过例如农杆菌的稳定转化，这需要活性的可遗传DNA构建体。

在本发明的方法中被引入植物细胞的外源DNA编码RNA引导的DNA内切核酸酶，适合于引导所述RNA引导的DNA内切核酸酶以诱导所述特定可遗传突变的向导RNA(gRNA)和选择性标记物。在本发明的方法中被引入植物细胞的外源DNA可以编码其它元件，例如但不限于修复模板。修复模板是在宿主细胞的DNA修复过程中，特别是在同源定向修复机制(HDR)中起模板作用的核酸分子的序列。然而，优选在本发明上下文中被引入植物细胞的外源DNA不包含修复模板。

在本发明的方法中被引入植物细胞的外源DNA因此编码RNA引导的DNA内切核酸酶。同时鉴定可用于本发明方法的各种不同的RNA引导的DNA核酸内切酶。在一个方面，在本发明的方法中，由被引入植物细胞的外源DNA编码的RNA引导的DNA内切核酸酶选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c和Cas13。在一个方面，在本发明的方法中，由被引入植物细胞的外源DNA编码的RNA引导的DNA内切核酸酶优选是Cas12a(以前也称为Cpf1)。Cas12a切割DNA，留下粘性末端，这可导致更有效的随后的DNA修复。

在本发明的方法中被引入植物细胞的外源DNA进一步编码向导RNA(gRNA)，其适合于引导RNA引导的DNA内切核酸酶以诱导所需的特定可遗传突变。在本发明上下文中使用的gRNA可由形成复合物的多个RNA组成，或者可由单个gRNA(sgRNA)组成，其中所述gRNA的不同组分例如通过一个或多个接头共价连接。gRNA的设计可以变化很大，并且部分由本发明方法中使用的特定的RNA引导的DNA内切核酸酶的选择决定。例如，选择Cas9作为RNA引导的DNA内切核酸酶要求gRNA包含反式激活crRNA(tracrRNA)和至少一种CRISPR RNA(crRNA)。或者，与Cas9组合使用的gRNA也可以是单一向导RNA(sgRNA)，其包含组合在一种RNA中的tracrRNA和至少一种crRNA。因此，一方面，本发明方法中的RNA引导的DNA内切核酸酶是Cas9，其中gRNA包含tracrRNA和至少crRNA，或者其中gRNA是sgRNA，其包含组合在一种RNA中的tracrRNA和至少一种crRNA。作为另一个实例，选择Cas12a作为RNA引导的DNA不需要gRNA包含tracrRNA。相反，Cas12a需要gRNA包含富含T的原间隔基邻近基序(protospacer-adjacent motif，PAM)。

本发明的方法可用于在植物中诱导任何可遗传的突变。这种可遗传突变可以是选自以下的一个或多个突变：点突变、无义突变、错义突变、剪接位点突变，移码突变、提前终止密码子突变，缺失、截短、置换、插入、倒位、重复和易位。突变可以在一个或多个选自编码区、非编码区、调控序列如启动子序列或增强子序列中。根据本发明的方法对于引入和选择预期仅以相对低的频率发生的可遗传突变特别有用。这种低频突变例如可以是通过非同源末端连接(NHEJ)获得的突变。因此，在另一方面，本发明提供在如本文所述的植物中引入和选择特定可遗传突变的方法，其中所述特定可遗传突变是倒位、重复或易位。当目的是使用本发明的方法获得非转基因植物的植物时，这样的突变是特别有用的。

在本发明的方法中被引入植物细胞的外源DNA进一步编码选择性标记物，所述选择性标记物容许选择外源DNA被成功引入其中的植物细胞，并容许编码的RNA引导的DNA内切核酸酶和gRNA的表达。

在本发明方法的另一步骤中，从转染的细胞再生植物以提供多个T0植物。从植物细胞再生植物的手段和方法是本领域众所周知的。例如，可用生芽(shooting)和/或生根基质处理细胞或组织培养物以再生整株植物。

在本发明的一个方面，基于选择性标记物的活性来选择从其再生T0植物的转染的细胞，其中选择性标记物优选选自卡那霉素抗性；氯霉素抗性、四环素抗性和氨苄青霉素抗性。

在本发明方法的另一步骤中，将所获得的T0植物与不包含所述外源DNA的等基因植物杂交以提供多株后代植物。令人惊讶地发现，通过将T0植物与不包含外源DNA的等基因植物杂交可以获得数目高得多的突变植物。因此，可以容易地筛选来自这些杂交的种子的数量高得多的幼苗。

在本发明方法的另一步骤中，具有可遗传突变的一株或多株植物选自后代植物。筛选大量植物中特定突变的手段和方法是本领域众所周知的，并且可包含使用已知方法在DNA、RNA(或cDNA)或蛋白质水平上进行筛选，以便检测所需突变的存在。例如，可种植在本发明方法中获得的后代植物的幼苗，然后从植物部分如子叶中取样。随后，可以从子叶样品中分离DNA，然后基于PCR筛选所需突变。

可以在基于PRC的筛选之前混合DNA样品以减少PCR的数目。例如，每100个池(pool)可以混合1000个DNA样品，每个池含有来自10株植物的DNA。在这100个池的基于PCR的筛选并鉴定这些库中的一个或多个的突变后，在接下来的PCR中，可以筛选构成所鉴定的池的单个DNA样品以鉴定含有突变的DNA样品(一维混合)。

或者，例如900个DNA样本可被排成30列(x1..x30)和30行(y1..y30)的虚拟二维网格(two dimensional grit)，其中每个样本具有自己的坐标，以x1y1开始并以x30y30结束。混合来自所有列的DNA得到30x-池，以及混合来自所有行的DNA得到30y-池。可对那些30x-池和30y-池进行基于PCR的筛选，并导致鉴定两个池中的突变；一个在x-池中以及一个在y-池中。X-池和y-池的数字导致鉴定包含突变的特定DNA样本，例如x20y10。

或者，例如1000个DNA样本可被排成10x坐标，10y坐标和10z坐标的虚拟三维网格(three-dimensional grit)，其中每个DNA样本具有其唯一坐标，以x1，y1，z1开始并以x10，y10，z10结束。在每个维度中混合DNA样本导致10x-池，10y-池和10z-池，每个包含来自100个个体的DNA，并且每个个体在每个维度的一个池中被表示。30个池的基于PCR的分析可导致鉴定每个维度的池之一(例如x-池3，y-池5和z-池4)中的突变。这将导致鉴定坐标x3，y5，z4的一个单独植物的DNA样本(Tsai等人，2011；https://doi.org/10.1104/pp.110.169748)。

可使用对预期或所需突变特异的引物进行基于PCR的筛选。当发生特定倒位时，可设计引物以仅扩增DNA片段。例如，在靶DNA上以相同方向设计的两个引物不会扩增产物。然而，当发生倒位时，导致引物结合位点之一的倒位，一种引物相对于另一种引物的新方向可允许扩增可用作该特定事件的标记物的特定DNA片段。

或者，如果发生缺失，也可以设计引物组以仅扩增DNA片段。例如，正向引物和反向引物的位置可能太远而不能在选定的反应条件下扩增产物。特定的DNA聚合酶可每分钟转录1kbp。在具有10秒延伸时间的PCR中，约1kbp或更长的产物不能被扩增。突变如缺失可导致引物的物理距离减小，并允许在10秒延伸时间的PCR中产生扩增子，该扩增子随后将是该缺失的标记物。

或者，数字PCR系统如微滴式数字PCR(ddPCR)可用于鉴定混合的DNA样品中的突变。微滴式数字PCR将DNA样品分成数千个微滴。随后在每个单独的微滴中发生模板的PCR扩增，并且对阳性微滴进行计数给出精确的、绝对的靶标定量。数字PCR允许检测和量化稀有序列，例如SNP、等位基因变体、编辑的DNA。

因此，另一方面，本发明提供一种方法，其中通过从后代植物的一部分中分离基因组DNA并确定所述基因组DNA是否包含可遗传突变来选择一株或多株具有可遗传突变的植物。

优选地，DNA测序用于确定在本发明的方法中获得的植物的基因组DNA是否包含所需的可遗传突变。DNA测序的手段和方法是本领域众所周知的，包括例如链终止测序(Sanger测序)、合成测序(Illumina测序)、纳米孔DNA测序，Polony测序、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)和DNA纳米球测序的方法。

或者，SNP基因分型分析(genotyping assay)可用于选择具有所需可遗传突变的植物，特别是当足以检测包含所需突变的植物和不包含所需突变的植物之间的单核苷酸差异(单核苷酸多态性，SNP)时。例如，使用KASP分析(参见万维网kpbioscience.co.uk)或其它SNP基因分型分析可容易地检测SNP。为了开发KASP分析，例如可以选择SNP上游的70个上游碱基对和下游的70个碱基对，并且可以设计两个等位基因特异性正向引物和一个等位基因特异性反向引物。参见例如Allen等人，2011，Plant Biotechnology J.9，1086-1099，尤其是p097-1098的KASP分析法。同样可以使用其它基因分型分析，例如TaqMan SNP基因分型分析、高分辨率熔解(HRM)分析和SNP基因分型阵列(SNP-genotyping array)(例如Fluidigm，Illumina等)。

在另一方面，本发明的方法包括一个步骤，其中在T0植物与野生型植物杂交之前，选择表达RNA引导的DNA内切核酸酶的T0植物以提供一株或多株具有活性构建体的T0植物，并且其中只将所述一株或多株具有活性构建体的T0植物与野生型植物杂交以提供多株后代植物。本文所用的术语“活性构建体”是指由先前引入的外源DNA编码的DNA内切核酸酶/gRNA复合物是具有活性的，即DNA内切核酸酶/gRNA复合物能够在F1代(具有活性构建体的T0植物和野生型植物之间杂交的后代)中诱导所需的突变。

通过选择具有活性构建体的T0植物并将它们与不具有活性构建体的植物杂交，后代植物的筛选更有效。当只有一株或相对低数量的具有活性构建体的T0植物与野生型植物(不具有活性构建体)杂交时，可以产生大量不同的F1植物并筛选低频事件。当从与野生型植物杂交的群体中除去其中DNA内切核酸酶/gRNA复合物没有活性的T0植物时，产生可具有特定可遗传突变的非常大量的F1植物要有效得多。

一方面，本发明的方法包括一个步骤，其中所选择的表达RNA引导的DNA内切核酸酶的T0植物是在其中检测到所述RNA引导的DNA内切核酸酶的RNA的T0植物。鉴定具有活性CRISPR-Cas构建体的T0植物的一种间接方法是存在由活性构建体引起的突变。例如，CRISPR-Cas构建体可编码靶向待倒位的基因组DNA片段的侧翼的两个或更多个向导RNA。所需倒位可能是很少发生的事件，并且可能不存在于T0代中。然而，导致小缺失的突变可发生在gRNA靶位点，这取决于构建体的活性。杂合状态的这些突变的存在证明了活性构建体。纯合状态的突变甚至可以更好地证明CRISPR-Cas构建体是有活性的。

在另一方面，本发明的方法包括一个步骤，其中使后代植物自交，随后从后代植物中选择一株或多株具有可遗传突变的植物。

通过首先使F1后代植物自交以获得F2后代群体并从所述F2后代群体中选择具有可遗传突变的植物，获得对活性构建体的存在而言是纯合的植物。包含活性构建体的F1后代植物总是活性构建体杂合型。或者，可使T0植物自交以获得纯合TI植物，该T1植物可以与不包含外源DNA的等基因植物杂交以提供多株后代植物。因此，本发明的方法可包括使T0植物自交以获得T1植物的步骤，所述TI植物与不包含外源DNA的等基因植物杂交以提供多株后代植物。

在另一方面，本发明的方法还包括多株T0植物的子集(如上文所述的方法步骤(a)中所获得)经受至少一个自交步骤，并且其中将通过所述至少一个自交步骤获得的后代植物与从其中选择一株或多株具有可遗传突变的后代植物(如上文所述的方法步骤(c)中所获得)混合(即组合)。因此，从转染细胞再生的部分T0植物经受至少一个自交步骤，而不是与不包含外源DNA的等基因植物杂交。将从所述至少一个自交步骤获得的植物与通过将T0植物与不包含所述外源DNA的等基因植物杂交获得的后代植物混合，其随后是选择一株或多株具有可遗传突变的植物的步骤。

在另一个方面，本发明的方法还包括将所选择的一株或多株具有可遗传突变的植物回交以获得包含特定可遗传突变且不包含任何外源DNA的后代植物。

以下非限制性实施例描述了如何使用本发明的方法有效地获得突变番茄植物，其中所述番茄植物在其基因组中包含至少一条包含野生型雄性不育10(MS10)基因的突变等位基因和野生型花色素苷缺失(AA)基因的突变等位基因的染色体，其中在所述植物中，所述野生型MS10基因的突体等位基因和所述野生型AA基因的突变等位基因之间的减数分裂重组被抑制。除非在实施例中另有说明，所有重组DNA技术均按照标准方案进行，标准方案描述于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，and Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning：A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY；和Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA的第1卷和第2卷中。植物分子工作的标准材料和方法描述于由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)by R.D.D.Croy。标准育种方法描述于‘Principles of Plant breeding'，Second Edition，Robert W.Allard(ISBN 0-471-02309-4)。

实施例

实施例1

构建体的设计和克隆

对于用于MS的gRNA设计，我们使用了MS的第一外显子。为了设计用于AA的gRNA，我们使用了该基因的第一和第二外显子。对于每个基因，我们使用CRISPOR(http://crispor.tefor，net)软件设计了两个gRNA(表1)。

表1.用于在雄性不育基因MS和花色素苷缺失基因AA(均在Ch02上)中制造双链DNA断裂的gRNA。

制备了两种CRISPR-Cas构建体，将一种用于AA的gRNA与一种用于MS的gRNA组合在一起。构建体1含有gMS1和gAA1，构建体2含有gMS2和gAA2(表1)。

CRISPR-Cas构建体是通过使用Golden Gate MoClo工具包(https://www.addgene.org/kits/marillonnet-moclo/)克隆构建的。设计的gRNA作为寡核苷酸(oligo)订购，并且每个gRNA被分别插入到拟南芥(Arabidopsis thaliana)的U6-26启动子(pICSL90002质粒，https://www.addgene.org/68261/)后面。将具有启动子的gRNA与拟南芥(Arabidopsis)密码子优化的SpCas9序列在皱叶欧芹(Petroselinum crispum)泛素4-2启动子和NOS终止子下(pDe-CAS9，https://www.addgene.org/61433/)结合。我们在CRISPR-Cas构建体中包括了由CaMV-35S启动子和终止子驱动的荧光GFP基因(p35S-fGFP-ter35S)，用于估计成功转染的原生质体的比例。

包含CRISPR-Cas构建体1或2的质粒分离

将包含两种CRISPR-Cas构建体的质粒在大肠杆菌(25ml LB)中增殖并使用QIAGEN质粒中型试剂盒(货号/ID：12143)分离，如手册中所述。

将质粒DNA在200μl EB缓冲液中洗脱，并使用Nanodrop One(Thermofisher)定量。对于转染，将10μg质粒移液到2ml管中，并加入水直至体积达到20μl。

植物材料

栽培种Moneymaker的番茄种子用1％次氯酸盐和0.01％吐温20灭菌。随后，用无菌水洗涤种子3次，并置于容器(pot)中的萌发培养基上。每升所述萌发培养基由2.2克添加MS维生素(Duchefa)的MS培养基(Duchefa)和5克蔗糖组成。将pH值调节至5.8。将所述容器置于24℃的16小时光照和8小时黑暗状态下。

将幼苗移植到带空气过滤装置的容器中，每容器两株幼苗。所述容器包含带有维生素(Duchefa)的4.4g/l MS培养基、每升30克蔗糖，并将pH值调节至5.8。将植物在24℃的16小时光照和8小时的黑暗下种植4周，直到出现几片完全发育的叶子。

转染

对于每次转染，将健康的展开叶(expanded leaves)从两个容器中收获，在酶消化缓冲液中切成小条，并孵育过夜。使用标准方法过滤、洗涤并用PEG和质粒处理原生质体用于转染。随后，洗涤原生质体，将其放入恢复培养基中，并在24℃的黑暗中孵育24小时。通过估计由于GFP基因的存在而显示绿色荧光的原生质体的比例来测量转染效率。对于每次转染反应，在150μl的最终体积中大约有200,000原生质体。这类似于每μl约1,300原生质体的浓度。

检查诱导的倒位的存在

为了检查诱导突变的存在，我们使用靶向PCR，如图1B和C所示。围绕MS和AA向导设计正向和反向引物，使用gRNA位点侧翼序列的参考基因组和引物设计软件Primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。引物对是(AA-F)5'-TGGTTGCTGCTCATCTTCAC-3’(SEQ ID NO：9)与(AA-R)5'-GCAAAGCCACCTTCATTCAT-3’(SEQ ID NO：10)和(MS-F)5'-TAGGGGATTTTCATGCTGGT-3’(SEQ ID NO：11)与(MS-R)5’-GCCAAAAATGAGTCCTTCCA-3’(SEQID NO：12)。

转染的原生质体以下列方式处理：每个样品，用20mM KOH、1％酪蛋白(caseine)溶液1∶1稀释2μl分离的原生质体，煮沸5分钟，并放在冰上5分钟。

将诱导倒位的“左侧”和“右侧”通过PCR扩增，使用Phire聚合酶(Thermofisher)。对于左端，使用正向MS引物(MS-F)和正向AA引物(AA-F)，而对于右侧，我们使用反向MS-R和反向AA-R引物)(图1C)。反应混合物含有5μl 5x缓冲液、1μl 5mM DNTP、1.25μl 10pmol/μlF引物、10pmol/μl R引物、0.35μl Phire聚合酶、4μl原生质体溶液(约2700原生质体)和12.5μl水。还包括水对照。进行80个PCR循环(98℃10秒，61.5℃20秒，和72℃40秒延长时间)以检测同样很少发生的事件。作为阴性对照，使用非转染的原生质体。将PCR产物放在琼脂糖凝胶上以可视化它们。

qPCR

为了估计倒位事件的频率，对处理的原生质体样品进行qPCR。这在qPCR机(Biorad)上的iQ SYBR Green Supermix(Biorad)进行。反应条件如下：12.5μl iQ SYBRGreen Supermix、1.25μl 10pmol/μl F引物、10pmol/μl R引物、2μl原生质体溶液(约1300原生质体)，加水至25μl。

作为参考，包括来自番茄的肌动蛋白(Actin)基因，分别使用正向和反向引物序列5′-ACTGTCCCTATCTATGAAGGTTATGC-3′(SEQ IDNO：13)和5′-GAAACAGACAGGACACTCGCACT-3′(SEQ ID NO：14)。

植物转化

包含CRISPR-Cas的转基因植物(T0)是由根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的转化产生的。因此可以使用以下转换方法。将10天龄幼苗的子叶在悬浮在2％MSO(液体MS培养基，含有100mg L^-1肌醇，400μgL^-1盐酸硫胺素和20g L^-1蔗糖)中的8ml农杆菌细胞中孵育至600nm处的衰减率(attenuance)为0.5。30分钟后，将子叶在无菌滤纸上吸干，并置于含有1×Nitsch和Nitsch维生素混合物、3％w/v蔗糖，1mg L^-1 NAA、1mg L^-1 6-苄氨基嘌呤和0.7％w/v琼脂的MS培养基上，pH 5.7。共培养2天后，将子叶在含有200mgL^-1羧苄青霉素的液体MS培养基中洗涤，并转移到含有1×Nitsch和Nitsch维生素混合物、3％w/v蔗糖，2mg L^-1玉米素、200mg L^-1羧苄青霉素、0.7％w/v琼脂、pH 5.7和100mg L^-1卡那霉素(kanamycin)的生芽(shoot-inducing)MS培养基中用于选择。将开始发展愈伤组织的子叶转移到含有一半的玉米素浓度和1mg L^-1 GA3的新鲜培养基中。将子叶每2周转移到新鲜培养基中。当初始愈伤组织形成时，将枝条原基(shoot primordia)切除并转移到枝伸长(shoot-elongation)MS培养基中，该培养基是含有200mg L^-1羧苄青霉素和100mg L^-1卡那霉素的萌发培养基。从愈伤组织中切除2-4cm的延长枝，并转移至生根MS培养基(1×Nitsch和Nitsch维生素混合物、1.5％w/v蔗糖、5mg L^-1 IAA、200mg L^-1羧苄青霉素，50mg L^-1卡那霉素和0.7％w/v琼脂，pH 5.7)。将生根的(T0)小植株转移到土壤中用于进一步分析。培养基成分和抗生素从Duchefa Biochemie获得。

包含活性CRISPR-Cas构建体的T0转基因植物的选择

CRISPR-Cas构建体的活性取决于整合在基因组中的位置。为了鉴定具有包含突变的活性构建体的T0植物，通过对T0植物中MS和AA基因中的靶区域测序来鉴定。使用Phire聚合酶(Thermofisher)通过PCR扩增这些结构域。使用对MS或AA基因中的靶区域特异性的引物组。反应混合物包含5μl 5x缓冲液、1μl 5mM DNTP、1.25μl 10pmol/μl正向引物、10pmol/μl反向引物、0.35μl Phire聚合酶、4μl基因组DNA溶液(4ng)和12.5μl水。进行30个PCR循环(98℃10秒，60℃20秒和72℃5秒延伸时间)以扩增靶区域。PCR产物由服务供应商测序，并且使用用于DNA序列分析的计算机程序来确定突变的存在。

自花授粉以及T0植物与不包含所述外源DNA的植物杂交以提供多个后代植物

种植具有活性CRISPR-Cas构建体的所选T0植物，并使花自花授粉以产生具有T1种子的果实。使果实生长并收集T1种子。

替代性地，种植具有活性CRISPR-Cas构建体的所选择的T0植物，并在花药开裂之前将花去雄以防止自花授粉。收集从野生型植物分离的花粉并用于授粉所选T0植物，使果实生长并收集F1种子。含有活性CRISPR-Cas构建体的F1植物可以生长以产生F2种子。

使T1、F1和F2种子发芽并从最初叶子分离基因组DNA。设计PCR以检测所需的突变、倒位或其它结构变化。通过使用混合策略(pooling strategy)(例如，Tsai等人，2011；https://doi.org/10.1104/pp.110.169748)用仅有限数目的PCR分析大量幼苗。

实施例2

如实施例1中所述构建CRISPR-Cas9构建体。制备三种CRISPR-Cas9构建体，将一种用于AA的gRNA与一种用于MS的gRNA组合。构建体1包含gMS1和gAA1，构建体3包含gMS3和gAA3，以及构建体4包含gMS4和gAA4。

表2.在番茄Ch02上的雄性不育基因MS和花色素苷缺失基因AA中使双链DNA断裂的gRNA靶位点。

标记位于预期发生双链断裂的位置。PAM位点以斜体字显示。

将构建体在大肠杆菌中繁殖，并分离和纯化质粒用于转染番茄原生质体。将原生质体从“Moneymaker”的体外生长的植物叶片分离。转染和孵育后，通过PCR筛选细胞培养物中的倒位。为此，将一部分转染的原生质体(约2.700细胞)转移到PCR管中并在KOH中变性，如实施例1所述。

在单独的PCR中使用引物组合对AA-F与MS-F或AA-R与MS-R对细胞裂解物进行PCR。一对引物的退火链是相同的，阻止在野生型DNA上的扩增，并且仅在诱导倒位的情况下允许扩增(图2)。此外，在野生型基因组上一对引物之间的距离为约1.1Mbp，其太大而不能扩增PCR产物。

表3.用于扩增倒位边界的PCR引物

然而，gRNA靶标之间的区域的倒位将在使得PCR产物的扩增成为可能的方向上促使引物位点一起，包括如图2中所描绘的倒位的边界。

在琼脂糖凝胶上分离来自用构建体1、3和4转染的原生质体的PCR产物，并从凝胶上切下具有预期大小的片段，并对DNA进行Sanger测序。令人惊讶的是，在大多数PCR中产生了预期大小的DNA片段，这意味着每个反应在一个或多个原生质体中发生了倒位。考虑到一个反应包含来自约2700原生质体的DNA，并且转染效率为约70％(显示自也存在于构建体中的GFP基因的荧光；数据未显示)，这意味着倒位频率＞1/(0.7*2700)细胞。预期的PCR扩增子大小基于引物和gRNA结合位点在基因组上的位置，其约1.3kb。引物和gRNA结合位点位置及它们的序列描绘于表2和3中。

图3显示用引物MS-R和AA-R，以及来自用构建体1(其含有gRNAs gMS1和gAA1)转染的原生质体培养物的基因组DNA产生的PCR产物的一部分的DNA序列。序列来自倒位的下游右端。图下部的比对显示DNA在gMS1结合位点已被切割，并且上游部分已经与gAA1结合位点连接。显然，Cas酶在两个gRNA结合位点都产生双链断裂(DSB)，导致其间约1.1Mbp染色体片段的倒位。DSB在gRNA结合位点中准确地在预测位置产生，其位于PAM位点上游的三个和四个碱基对之间。倒位染色体片段末端进行连接，而无需任何额外的序列修饰。

图4显示用引物MS-F和AA-F以及来自用构建体3转染的原生质体的基因组DNA产生的部分PCR产物的DNA序列。序列来自倒位的上游左端。图下部的比对显示DNA在gMS3结合位点已被切割，并且上游部分已经与gAA3结合位点连接。

Cas9酶在此也在两个gRNA结合位点都产生双链断裂(DSB)，导致其间约1.1Mbp染色体片段的倒位。DSB准确地在gRNA结合位点中的预测位置产生，并且倒位染色体片段末端进行连接而无需任何额外的序列修饰。

图5显示用引物MS-R和AA-R以及来自用构建体4转染的原生质体的基因组DNA产生的部分PCR产物的DNA序列。序列是倒位的下游右端。图下部的比对显示DNA在gMS4结合位点的位置已被切割，并且它已经连接到gAA4结合位点的位置。Cas酶在此也准确地在gRNA结合位点中的预测位置在诱导的倒位的两侧都产生DSB，并且末端进行连接，在连接位点处缺失一个腺苷。

图3至5中的三个序列显示gRNA将Cas9靶向至预测的位置，并且DNA切割发生在预期位置。此外，序列转换(sequenced transition)表明DSB已在染色体上的两个位置产生，并且在一些情况下，中间的染色体片段已在修复之后倒位。连接末端的序列(转换)表明DSB在预测的位置处产生。

因此，实施例2显示，可以通过在大多数包含来自约2700原生质体的DNA的PCR中扩增倒位的边界来检测倒位。如以上解释的，这将意味着在2700*0.7(～转染效率)＝约1900原生质体中的约1个中发生倒位。为了获得具有所需突变的植物，需要大量(＞1900)再生的芽，以有机会找到一个具有所需突变的芽。在许多物种中，包括番茄，从原生质体再生芽在技术上是非常困难的，并且在一些物种中从未成功应用。

为了解决该技术问题，本发明提供一种鉴定这种突变的基于种子的筛选方法。通常，CRISPR-Cas构建体引起DNA中的双链断裂，这在大多数事件中被修复。修复系统经常修饰向导RNA(gRNA)结合位点，这意味着修复后gRNA的结合位点消失，并且不会产生新的双链断裂。然而，当包含活性CRISPR-Cas构建体的植物与野生型植物杂交时，则所产生的种子中至少一半除具有未修饰的gRNA结合位点的野生型DNA以外将还包含活性CRISPR-Cas构建体。这意味着来自这种植物的每粒种子提供诱导和鉴定很少发生的突变事件的新机会。因此，如果一个事件，例如倒位，每1900个事件中发生1个，则可筛选多个该数量的幼苗以鉴定所需突变。筛选可以是使用边界特异性引物的PCR，如上文针对原生质体所述。为了减少单个PCR的数量，可以设计一维、二维或三维的混合策略。

因此，本文描述的方法首次使得能够提供同时包含三种所需性状的番茄植物：

1.敲除MS，导致纯合植物雄性不育，促进杂交种子的产生；

2.敲除AA，导致花色素苷缺失，并因此损失紫色下胚轴颜色。

3.这两个性状的遗传连锁，因为抑制由倒位引起的突变等位基因ms和aa之间的减数分裂重组，并因此丧失了这两个基因之间序列的同源性。

序列表

<110> 纽海姆有限公司

<120> 通过靶向诱变获得突变植物的方法

<130> 200036WO01

<150> EP20174401.8

<151> 2020-05-13

<160> 29

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 209

<212> PRT

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 1

Met Glu Phe Pro Ser Thr Pro Phe Asp Asn Ser Asn Asn Ser Glu Glu

1 5 10 15

Arg Glu Val Gly Arg Arg Thr Asp Lys Arg Lys Gln Ile Asp Gly Glu

20 25 30

Val Lys Glu Tyr Lys Ser Lys Asn Leu Lys Ala Glu Arg Asn Arg Arg

35 40 45

Gln Lys Leu Ser Glu Arg Leu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Val Pro Asn

50 55 60

Ile Thr Asn Met Thr Lys Glu Thr Ile Ile Thr Asp Ala Ile Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Arg Glu Leu Gln Met Asn Val Asp Asn Leu Ser Glu Gln Leu Leu

85 90 95

Glu Met Glu Ala Thr Gln Gly Glu Glu Leu Glu Thr Lys Asn Glu Glu

100 105 110

Ile Ile Asp Thr Ala Asp Glu Met Gly Lys Trp Gly Ile Glu Pro Glu

115 120 125

Val Gln Val Ala Asn Ile Gly Pro Thr Lys Leu Trp Ile Lys Ile Val

130 135 140

Cys Gln Lys Lys Arg Gly Gly Leu Thr Lys Leu Met Glu Ala Met Asn

145 150 155 160

Ala Leu Gly Phe Asp Ile Asn Asp Thr Ser Ala Thr Ala Ser Lys Gly

165 170 175

Ala Ile Leu Ile Thr Ser Ser Val Glu Val Val Arg Gly Gly Leu Thr

180 185 190

Glu Ala Asn Arg Ile Arg Glu Ile Leu Leu Glu Ile Ile His Gly Ile

195 200 205

Tyr

<210> 2

<211> 2696

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 2

tgtaaaaaag aaaaagtgaa aggagaataa aatttctact taaagcagct ctggtcactc 60

atttgtactt tacaatgcca gtaatactag taacaaccac aaagtagtca caaacataac 120

tagcaagaac attacccact tctattcttc tttctgtttg attccttttc tttcgggtgg 180

ttgttactct ttaaccctat agccttttac gagtcctcat aacggaggtg ggttttatta 240

agttgacaac taggcgtaaa taatcaaacc atgaggattc caactattat gcatactagt 300

tggttggcga tgtctatatt caatcattgt tatgctatat gcatactagt tagtatgtaa 360

acataaaaaa agtacttgtt caacttagtc ccaaacaagt taaactcggg gtatatgaat 420

atttactgac catatttccc gtttgaattt atctctttcg ggataacaat aacagtgaaa 480

agtgtaatta gaccaaaact gaaaagggtt gtagtgtctg aacctacaaa aaaaaactct 540

acacactctc tctttctcat gccaaaaatg agtccttcca agacacccca agtacattgt 600

gatcaattag gaaatgccca acaaactaca acaagaagat tcccacaacc aagaaacgtt 660

tctgttgtga ggagcgcacc tatataaacc tattctctgc ctacaaaaaa aaaaacccag 720

tgcagtactg cctcttcttt tagctgcact caacatatta atcattagca ccaatactct 780

ccatctatag atttcctttc taatttagga attcatttta acatatttat aacaatattc 840

tcttttaaat ggtagtaatt aggtgtgcta aaatggaatt ccccagtacc ccatttgata 900

attcaaacaa ctctgaagaa agggaagtag gaagaagaac agataaaagg aagcaaattg 960

atggtgaagt taaagaatac aaatccaaga accttaaggc tgagagaaat aggcgtcaaa 1020

aacttagcga aaggcttctt caattacgct cattggtccc aaacataaca aatatgacaa 1080

aagaaaccat aatcactgac gccatcacct acattaggga gctacaaatg aatgtggaca 1140

acctaagtga gcagcttctt gaaatggaag caactcaggg ggaggaactg gagacaaaaa 1200

atgaagagat tatcgatact gcagacgaga tgggtaaatg gggcatagag cctgaagttc 1260

aagtggctaa cattggccca actaagcttt ggataaaaat agtctgccaa aagaaaagag 1320

gtggattaac taaactgatg gaggcaatga atgctcttgg atttgatata aatgacacca 1380

gtgccactgc ctctaaagga gctattctta ttacttcatc tgtggaggtg gttagaggtg 1440

gactaactga agctaatcga atcagagaga tcttactgga gatcatccac ggaatctact 1500

agaaccagca tgaaaatccc ctaaatctta atagctttag tctcattgga gaaatgccag 1560

agtacctcta atttttagtt atggtgtcaa aaaaaggatt caatcatgtt ttcaaaatat 1620

tgtatccaaa ttgtctgaaa aaagctagtg tgaactcttg tttttgcttt caaatattga 1680

tgaaacaact tatcatatgt tactaattac tctctcctat cttaattcta tagcatttca 1740

tatgcagtca agtttggctt aattcaactg aggcaaactt tgaaatagaa tatactactt 1800

tttaacttgg attttccatg gtgggatcca ggctccaaat tttttggctt ctctatatga 1860

aacaatgaaa aaataacatt tttggtccca tatccagctg aagaaacagc taaataataa 1920

aagccagcac attaagtgtc ctttctgttt gaatattaaa caaacaccaa tattagacgt 1980

gtgaagagtg aaatttattt ctacctataa tacaacagga catttgtttc actgtcatta 2040

aattcttgtt ttcttctctg ttctttgacc aatgtcgtcc tcaatgaaga gtcgaaaata 2100

agcctgcctt aagcatcacc ttcccttgta caggatccaa ataataaaag actacttgga 2160

aaaccaaaat cagacgtcga atcgtcaaaa tttaatacca tggaaagtgt acctaccctt 2220

cttataatat taacacgaaa aagactctca caagtctata ttaataggac taaaacatgc 2280

acacaattgt agcaatattc atattttcta tggctaggct tagttttctc ctcatttgcc 2340

tagttatagc tcaggttaac ttgcttatgc gaaatgctaa tgcacttaga aaactagaca 2400

ccttcacagt agtcccaagt cctgcgccgt ttgaaggagg aatggacaga ggaagaagtg 2460

atcaagctcc agcaatcaca catataagga ctcatcattc tttcaacaag ttcatggctg 2520

gtggagactt gatccttggc ggcttcgcca ctgctctaat tgcttccatt ttttgttaca 2580

ttcgagtcac aggacgaaga aaccaacata gtctgggctg aggcacagca tttttaattt 2640

tgtactactt ttagtttcca aatcaaatat atacacaggg ttcatgattt tgctca 2696

<210> 3

<211> 230

<212> PRT

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 3

Met Val Val Lys Val Tyr Gly Ser Ala Met Ala Ala Cys Pro Gln Arg

1 5 10 15

Val Met Val Cys Leu Ile Glu Leu Gly Val Asp Tyr Glu Leu Ile His

20 25 30

Val Asp Leu Asp Ser Leu Gln Gln Lys Lys Pro Asp Phe Leu Leu Leu

35 40 45

Gln Pro Phe Gly Gln Val Pro Val Ile Glu Glu Gly Asp Phe Arg Leu

50 55 60

Phe Glu Ser Arg Ala Ile Ile Arg Tyr Tyr Ala Ala Lys Tyr Glu Asp

65 70 75 80

Lys Gly Lys Lys Leu Thr Gly Thr Thr Leu Glu Glu Lys Ala Leu Val

85 90 95

Asp Gln Trp Leu Glu Val Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Asp Leu Val Tyr

100 105 110

Asn Met Val Leu Gln Leu Leu Val Phe Pro Lys Met Gly His Lys Ser

115 120 125

Asp Leu Ile Val Val Gln Lys Cys Ala Asn Asn Leu Glu Lys Val Phe

130 135 140

Asp Ile Tyr Glu Gln Arg Leu Ser Lys Ser Lys Tyr Leu Ala Gly Asp

145 150 155 160

Phe Phe Ser Leu Ala Asp Leu Ser His Leu Pro Ser Leu Arg Phe Leu

165 170 175

Met Asn Glu Gly Gly Phe Ala His Leu Val Thr Gln Arg Lys Tyr Leu

180 185 190

His Asp Trp Tyr Leu Asp Ile Ser Ser Arg Pro Ser Trp Ser Lys Val

195 200 205

Leu Asp Phe Met Asn Leu Lys Lys Leu Glu Met Leu Pro Gly Pro Pro

210 215 220

Lys Glu Glu Val Lys Val

225 230

<210> 4

<211> 960

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 4

tatatatatg gtcaattatt gatcacaaat aagaagatta ttagaaattt caacctggtg 60

tactaggaca tcacaacaaa aaaaaaaaga ggaaaaatgg tagtgaaagt gtatggttca 120

gcaatggctg catgtccaca aagggtcatg gtttgtctta tagaattggg agtcgattat 180

gaacttatac atgttgatct tgattctctc cagcagaaaa aacctgattt cttgctttta 240

cagccatttg gacaggttcc tgtcattgaa gagggcgatt tcaggctttt cgaatctaga 300

gcaataataa ggtactatgc agcaaaatat gaagacaagg gaaagaaact aaccggaacg 360

acattggaag aaaaagctct agtagatcaa tggctagaag tggaatccaa caactacaat 420

gacttggtat acaacatggt actccaactc ctcgtattcc ctaaaatggg acacaaaagt 480

gacttgatcg tcgtacaaaa atgtgccaac aatttagaga aagtgttcga tatctatgaa 540

caaaggttgt ccaagagtaa atacttagca ggagattttt tctccttagc tgatctaagc 600

cacctcccta gccttagatt tttgatgaat gaaggtggct ttgcacattt ggtgactcaa 660

aggaagtatt tgcatgattg gtatttggat atttcaagta ggccttcttg gagcaaagtg 720

ttggacttca tgaatttgaa gaaattagag atgttacccg gcccacctaa agaagaagta 780

aaagtttaac aaacactaca acgccatgat tattctgtta cgagtggcat ggatactgag 840

aattcatatt gccaactctg tctatctaat cagttaggtt ttgaaattga agcgttttgt 900

gtttcgttgt gttgtaatca ccaaaaataa aataaaattg aactatgggt ttaccatcaa 960

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 5

ggcgtcaaaa acttagcgaa agg 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 6

atacaaatcc aagaacctta agg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 7

gaaagtgtat ggttcagcaa tgg 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 8

caatggctgc atgtccacaa agg 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 9

tggttgctgc tcatcttcac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 10

gcaaagccac cttcattcat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 11

taggggattt tcatgctggt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 12

gccaaaaatg agtccttcca 20

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 13

actgtcccta tctatgaagg ttatgc 26

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 14

gaaacagaca ggacactcgc act 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 15

aactctgaag aaagggaagt agg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 16

attcaaacaa ctctgaagaa agg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 17

aatggctgca tgtccacaaa ggg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 18

atggtttgtc ttatagaatt ggg 23

<210> 19

<211> 91

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 19

ccaagaacct taaggctgag agaaataggc gtcaaaaact tagccaatgg ctgcatgtcc 60

acaaagggtc atggtttgtc ttatagaatt g 91

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 20

ccaagaacct taaggctgag agaaataggc gtcaaaaact tagc 44

<210> 21

<211> 47

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 21

caatggctgc atgtccacaa agggtcatgg tttgtcttat agaattg 47

<210> 22

<211> 89

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 22

cttcaccatc aatttgcttc cttttatctg ttcttcttcc tactgtggac atgcagccat 60

tgctgaacca tacactttca ctaccattt 89

<210> 23

<211> 44

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 23

cttcaccatc aatttgcttc cttttatctg ttcttcttcc tact 44

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 24

gtggacatgc agccattgct gaaccataca ctttcactac cattt 45

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 25

cctacttccc tttcttcaga gtt 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 26

ccctttgtgg acatgcagcc att 23

<210> 27

<211> 86

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 27

gaattcccca gtaccccatt tgataattca aacaactctg aattgggagt cgattatgaa 60

cttatacatg ttgatcttga ttctct 86

<210> 28

<211> 42

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 28

gaattcccca gtaccccatt tgataattca aacaactctg aa 42

<210> 29

<211> 44

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<400> 29

ttgggagtcg attatgaact tatacatgtt gatcttgatt ctct 44

Claims

1.一种用于在植物中引入和选择特定可遗传突变的方法，其包括：

(a)用外源DNA转染植物细胞，其中所述外源DNA编码RNA引导的DNA内切核酸酶、适合于引导所述RNA引导的DNA内切核酸酶以诱导所述特定可遗传突变的向导RNA(gRNA)和选择性标记物；

(b)从转染的细胞再生植物以提供多株T0植物；

(c)将所述T0植物与不包含所述外源DNA的等基因植物杂交以提供多株后代植物；和

(d)从所述后代植物中选择一株或多株具有所述可遗传突变的植物。

2.权利要求1所述的方法，其中在所述T0植物与野生型植物杂交之前，选择表达所述RNA引导的DNA内切核酸酶的T0植物以提供一株或多株具有活性构建体的T0植物，并且其中只将所述一株或多株具有活性构建体的T0植物与野生型植物杂交以提供多株后代植物。

3.权利要求2所述的方法，其中所选择的表达RNA引导的DNA内切核酸酶的T0植物是在其中检测到所述RNA引导的DNA内切核酸酶的RNA的T0植物。

4.前述权利要求任一项所述的方法，其中使所述后代植物自交，随后从所述后代植物中选择一株或多株具有所述可遗传突变的植物。

5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多株T0植物的子集经受至少一个自交步骤，并且其中将通过所述至少一个自交步骤获得的后代植物与从其中选择一株或多株具有所述可遗传突变的植物的后代植物混合。

6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述特定可遗传突变是倒位、重复或易位。

7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RNA引导的DNA内切核酸酶选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c和Cas13。

8.权利要求7所述的方法，其中所述RNA引导的DNA内切核酸酶是Cas9，并且其中：

所述gRNA包含反式激活crRNA(tracrRNA)和至少一种CRISPR RNA(crRNA)；或者

所述gRNA是单个向导RNA(sgRNA)，其包含组合在一个RNA中的tracrRNA和至少一种crRNA。

9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所选择的一株或多株具有所述可遗传突变的植物回交以获得包含所述特定可遗传突变且不包含任何外源DNA的后代植物。

10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中基于所述选择性标记物的活性来选择从其再生所述T0植物的转柒的细胞，其中所述选择性标记物优选选自卡那霉素抗性；和氨苄青霉素抗性。

11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过从所述后代植物的部分[优选从子叶]中分离基因组DNA并确定所述基因组DNA是否包含所述可遗传突变来选择一株或多株具有所述可遗传突变的植物。