CN110938120B - 改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白 - Google Patents

改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN110938120B
CN110938120B CN201911230001.4A CN201911230001A CN110938120B CN 110938120 B CN110938120 B CN 110938120B CN 201911230001 A CN201911230001 A CN 201911230001A CN 110938120 B CN110938120 B CN 110938120B
Authority
CN
China
Prior art keywords
stsci
protein
nucleotide sequence
potato
self
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911230001.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110938120A (zh
Inventor
黄三文
马玲
尚轶
张春芝
李灿辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Original Assignee
Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS filed Critical Agricultural Genomics Institute at Shenzhen of CAAS
Priority to CN201911230001.4A priority Critical patent/CN110938120B/zh
Publication of CN110938120A publication Critical patent/CN110938120A/zh
Priority to EP20895309.1A priority patent/EP4023665A4/en
Priority to PCT/CN2020/094344 priority patent/WO2021109507A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110938120B publication Critical patent/CN110938120B/zh
Priority to US17/831,509 priority patent/US20220298526A1/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/827—Solanum tuberosum [potato]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A01H1/022—Genic fertility modification, e.g. apomixis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/04—Stems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白，所述StSCI蛋白的氨基酸序列包含或由如下序列组成：1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，2)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的功能性同源序列；或3)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个(例如1‑10个)氨基酸且具有抑制自交不亲和活性的蛋白质。本发明的优点在于，StSCI蛋白可以抑制多种类型S‑RNase的细胞毒性作用，具有遗传性，从根本上克服了二倍体马铃薯自交不亲和的缺陷，有利于实现二倍体马铃薯高代纯合自交系的培育。

Description

改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白
技术领域
本发明涉及遗传育种技术领域，具体涉及一种改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白。
背景技术
二倍体马铃薯实生种子育种指的是通过连续多代自交培育基因组基本纯合的高代自交系，然后将自交系相互杂交产生具有杂种优势的F1代杂交种子，利用杂交一代种子实现马铃薯种植的计划。相比于传统的四倍体块茎繁殖，二倍体实生种子育种工作有以下突出优势：首先传统四倍体育种的亲本含有高度杂合的四套染色体组，遗传背景复杂，优良性状出现频率低，育种效率低下，育成优良品种的难度大。而二倍体亲本材料由于只含有两套染色体组，遗传背景相对简单，能够很好的克服四倍体的缺陷，并且水稻、玉米等主要粮食作物均是二倍体杂交育种，这些作物的育种经验可为二倍体马铃薯实生种子育种工作的开展提供很好的技术借鉴。其次相较于传统的块茎繁殖，种子繁殖具有很多优势。块茎繁殖的效率低，一个种薯只能产生约10个薯块，每年生产种薯需要耗费大量的土地，并且种薯不易存储运输又容易积累各类病虫害。种子繁殖能有效克服上述缺点，种子繁殖的繁殖效率高达1:5000～10000，种子体积小重量轻，易于存储运输，且基本不携带病虫害。
虽然二倍体马铃薯实生种子育种具有突出的优势，但是二倍体马铃薯的自交不亲和性限制了实生种子育种工作的开展，很难通过多代自交的方式获得纯合的亲本材料。因此打破二倍体马铃薯的自交不亲和具有重要的现实意义。
研究表明，马铃薯的自交不亲和属于配子体型自交不亲和，由1号染色体上的S-基因座控制，当自身或具有相同S单倍型的花粉落在柱头上时，花粉管不能一直延伸至胚珠完成受精过程，即自花授粉是不能产生种子的。S-基因座中至少包含两类基因，一类是在雌蕊中特异表达的，决定了雌蕊的自交不亲和反应，因此被称为雌蕊S因子，编码的是一类分泌型的RNase，被命名为S-RNase；另一类决定了雄蕊的自交不亲和反应，被称为雄蕊S因子，编码的是一类F-box蛋白，被命名为SLF(S-Locus F-box)蛋白。S-RNase在雌蕊花柱传导组织细胞中表达，表达后被分泌至花柱的传导管中，当花粉在柱头上萌发后，花粉管延伸至传导管中，游离的S-RNase进入到花粉管中，S-RNase能够降解花粉管中的rRNA并解聚花粉管中的细胞骨架最终造成花粉管细胞死亡，具有细胞毒性作用，终止花粉管的延伸。在花粉管中表达的SLF蛋白具有一定程度的解毒作用，通过与其它蛋白质共同组成SCF复合体，可以特异性的识别并泛素化S-RNase，被泛素化的S-RNase由26S蛋白酶体降解。但是某一特定的SLF蛋白只能解除某一种或者几种S-RNase的细胞毒性，且肯定不能识别自身雌蕊产生的S-RNase，因此二倍体马铃薯自交是不亲和的。
现有的创制自交亲和的二倍体马铃薯材料的方法主要是利用一种自交亲和的二倍体野生马铃薯S.chacoence作为父本，与其它二倍体马铃薯材料杂交后通过大量授粉工作鉴定后代是否是自交亲和的，这一方法的主要缺点是该野生马铃薯与二倍体栽培马铃薯的亲缘关系较远，杂交后代会导入很多野生不良性状，如薯块变小、薯肉龙葵素含量升高、匍匐茎变长等，需要多代回交才可剔除这些野生不良性状，耗费了大量的时间和人力资源。因此，亟需研发更好的方式去克服马铃薯的自交不亲和性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白，StSCI蛋白可以抑制多种S-RNase的细胞毒性作用，以此来克服二倍体马铃薯自交不亲和的缺陷，从而获得一种新的二倍体马铃薯自交亲和材料，实现二倍体马铃薯实生种子育种。
本发明一方面提供了一种改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白，所述StSCI蛋白的氨基酸序列包含或由如下序列组成：
1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或，
2)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的功能性同源序列；或
3)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个(例如1-10个)氨基酸且具有抑制自交不亲和活性的蛋白质。
本发明通过大规模的资源筛选，发现二倍体马铃薯材料RH89-039-16是自交亲和的，即自花授粉可以产生种子。利用RH89-039-16的花粉对原本自交不亲和的马铃薯二倍体材料PI 225689进行授粉，收获种子作为F1代，对F1代植株的自交亲和性状进行调查发现自交亲和与自交不亲和的植株各占一半，说明RH89-039-16中的自交亲和基因处于杂合状态，而RH89-039-16表现出自交亲和性状，说明控制RH89-039-16的自交亲和的基因是显性的，把这个显性基因命名为自交亲和诱导基因(Self-compatibility inducer),简写为StSCI基因。
StSCI基因编码的蛋白被命名为StSCI蛋白，StSCI蛋白可以降解多种S-RNase，从而阻止S-RNase降解花粉管中的rRNA和解聚花粉管中的细胞骨架，保证花粉管的正常延伸，进而克服了二倍体马铃薯材料的自交不亲和性。
在本发明的一种实施方式中，所述StSCI蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述StSCI蛋白的氨基酸序列为与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的功能性同源序列。所述的同一性的功能性同源序列包括但不限于SEQ ID NO.2所示的氨基酸具有约95％或以上、95.5％或以上、96％或以上、96.5％或以上、97％或以上、97.5％或以上、98％或以上、98.5％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述StSCI蛋白的氨基酸序列为在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、缺失、替换一个或多个(例如可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、)氨基酸且具有抑制自交不亲和活性的蛋白质。
本发明另一方面提供一种编码上述的StSCI蛋白的核苷酸序列。
进一步的，所述编码上述的StSCI蛋白的核苷酸序列，包含或由如下序列组成：
1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或，
2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的互补序列、简并序列或同源序列；
优选地，其中所述同源序列为与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列约90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性且编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的多核苷酸序列，或其相对应的cDNA分子；或
3)在严格条件下与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，且能够编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述编码上述的StSCI蛋白的核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述的同源序列包括但不限于SEQ ID NO.2所示的核苷酸具有约90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性的多核苷酸，或其相对应的cDNA分子。
在本发明的一种实施方式中，所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列为在严格条件下与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，且能够编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的核苷酸序列。
示例性地，在本文中所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性。这些在严格条件下杂交的核苷酸序列可用于，例如，表达SEQ ID NO.1的变体蛋白质或可作为引物、探针、外源供体序列、向导RNA、反义RNA、shRNA和siRNA。
在本发明的一种实施方式中，所述的简并序列，改变SEQ ID NO.2核苷酸某个或多个核苷酸序列后，改变序列位置对应编码的氨基酸种类不变，编码的StSCI蛋白的氨基酸序列不变。
本发明另一方面提供一种调节编码StSCI蛋白核苷酸序列的启动子，所述启动子的核苷酸序列包含或由如下序列组成：
1)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，
2)与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的功能性同源序列；或，
3)在严格条件下与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸或其互补序列。
启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。
调节编码StSCI蛋白核苷酸序列的启动子的序列长度并不能准确地确定，只要包含核心启动子片段在内的启动子均可以使编码StSCI蛋白基因表达。
在本发明的一种实施方式中，启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。该启动子区域包含了一段长度为538bp的序列，该序列为SEQ ID NO.6所示，SEQ ID NO.6位于StSCI基因的起始密码子上游100bp处，含有一个注释的启动子核心元件。SEQ ID NO.6序列的缺失造成了StSCI基因在常规二倍体马铃薯材料，例如PI 225689、S15-65等中不表达，这也是常规二倍体材料不亲和的原因。而在二倍体马铃薯材料RH89-039-16中，StSCI基因的启动子区域如SEQ ID NO.3所示，包含有SEQ ID NO.6的序列，因此StSCI基因在RH89-039-16的花粉中具有很高的表达水平，能够有效解除S-RNase的细胞毒性，因此RH89-039-16是自交亲和的。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列为与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的功能性同源序列。
优选地，其中所述同源序列为与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列约90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、99.9％或以上同一性的多核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子的核苷酸序列为在严格条件下与SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸或其互补序列。
示例性地，在本文中所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性。
进一步地，所述启动子的核苷酸序列与异源编码序列可操作连接。
在本发明的一种实施方式中，自交亲和的二倍体马铃薯RH89-039-16中提供的启动子核苷酸序列，与其它种类自交不亲和的二倍体马铃薯提供的StSCI基因，即异源的编码StSCI蛋白序列可以操作连接，进而可以在细胞外构建包含所述启动区区域和异源编码区的重组基因片段，用于后续的基因工程操作。
本发明另一方面提供一种扩增所述编码StSCI蛋白核苷酸序列的PCR引物。
此处对扩增编码StSCI蛋白核苷酸序列的PCR产物的核苷酸序列不做具体的限定，能够满足特异性扩增出所述的编码StSCI蛋白核苷酸序列的引物即可。
在本发明的一种优选地实施方式中，所述PCR引物是上游引物和/或下游引物，其中上游引物包含5′-ATGGACTATTTCCTATTGCTACCAGAAGG-3′(SEQ ID NO.4)的序列；下游引物包含5′-TCATTCTGGTCTAAATTCAATTCCTTGAA-3′(SEQ ID NO.5)的序列。
使用上游引物和下游引物组合成的引物对进行PCR扩增，可以扩增出编码StSCI蛋白的核苷酸序列的双链DNA。优选上述引物对进行PCR扩增，扩增出的StSCI基因条带特异性好，杂带少。
本发明另一方面提供一种包含所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述的启动子的载体。
编码StSCI蛋白的核苷酸序列和启动子组成的核苷酸序列，与载体的核苷酸序列具备相同的酶切位点或者同源重组位点，从而构成重组的表达载体。对具体的载体种类不作限定，能够满足成功构建重组的表达载体，且该表达载体能够通过工程菌介导进入二倍体马铃薯中正常表达StSCI基因即可。
进一步，载体包括但不限于pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pCAMBIA1304、pCAMBIA1305、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pCAMBIA1380、pCAMBIA1390、pCAMBIA super1300、pCAMBIA super1300-GFP、pCAMBIAsuper1300-EGFP、pCAMBIA super1390-GFP中的一种或几种的组合。
在本发明的一种优选地实施方式中，一种包含所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列和异源启动子的载体。
需要说明的是，此处“异源启动子”表示调节StSCI基因的启动子不是来源于提供StSCI基因的具有自交亲和性的二倍体马铃薯，其来源可以包括但不限于其它种类的具有自交亲和性的二倍体马铃薯，或植物基因工程中常用的启动子。
进一步，所述异源启动子包括但不限于：CaMV35S启动子、NOs启动子、Ocs启动子。
在本发明的一种优选地实施方式中，异源启动子为CaMV35S启动子。
进一步，载体包括但不限于pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pCAMBIA1304、pCAMBIA1305、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pCAMBIA1380、pCAMBIA1390、pCAMBIA super1300、pCAMBIA super1300-GFP、pCAMBIAsuper1300-EGFP、pCAMBIA super1390-GFP中的一种或几种的组合。
在本发明的一种优选地实施方式中，载体为pCAMBIA1301。
本发明另一方面提供一种导入了所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列的微生物或植物细胞。
本发明另一方面提供一种导入了所述载体的微生物或植物细胞。
本发明中所述的编码StSCI蛋白的核苷酸序列和/或载体可以被引入到微生物或植物细胞中。此处，“微生物”是指引入StSCI基因的特定微生物，并且还包括携带所述载体的这种微生物的子代。微生物可以是任何原核或真核细胞生物。
进一步，StSCI基因可以在微生物，包括但不限于农杆菌、枯草杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸菌、昆虫细胞中表达。或本领域技术人员常用的其它合适作为宿主细胞的微生物。
进一步，微生物优选农杆菌。农杆菌的菌种包括但不限于：农杆菌LBA440、农杆菌EHA101、农杆菌EHA105、农杆菌GV3101。
进一步，在体内和体外将StSCI基因引入宿主细胞的方法包括但不限于电穿孔、聚乙二醇(PEG)转化、脂质转染、热休克、磷酸钙沉淀、病毒介导和显微注射。
本发明另一方面提供一种植物中表达目的基因的方法，将所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列，或将所述的载体，或将所述的微生物转入植物体中，获得目的基因表达。
进一步，所述植物包括但不限于：二倍体马铃薯、水稻、小麦、玉米、大豆、拟南芥、烟草、番茄、土豆、油菜、萝卜、甘蓝、洋葱。
进一步，所述植物也包括如外植体的植物部分，包括但不限于：插条、组织培养物、细胞悬浮液和愈伤组织。
进一步，所述植物更优选为二倍体马铃薯。
本发明另一方面提供一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法，其包括使二倍体马铃薯植物表达所述的StSCI蛋白。
进一步，将所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列，或将所述的载体，或将所述的微生物转入二倍体马铃薯中，使二倍体马铃薯中的StSCI蛋白表达。
进一步，微生物优选农杆菌。农杆菌的菌种包括但不限于：农杆菌LBA440、农杆菌EHA101、农杆菌EHA105、农杆菌GV3101。
进一步，载体包括但不限于pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pCAMBIA1304、pCAMBIA1305、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pCAMBIA1380、pCAMBIA1390、pCAMBIA super1300、pCAMBIA super1300-GFP、pCAMBIAsuper1300-EGFP、pCAMBIA super1390-GFP中的一种或几种的组合。
进一步，在体内和体外将StSCI基因引入工程菌的方法包括但不限于电穿孔、聚乙二醇(PEG)转化、脂质转染、热休克、磷酸钙沉淀、病毒介导和显微注射。
在本发明的一种具体实施方式中，一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法，采用农杆菌，将携带有所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述同源启动子的pCAMBIA1301载体转入二倍体马铃薯中，使二倍体马铃薯中的StSCI蛋白大量表达。
在本发明的一种具体实施方式中，一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法，采用农杆菌，将携带有所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体转入二倍体马铃薯中，使二倍体马铃薯中的StSCI蛋白大量表达。
本发明另一方面提供所述的产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法获得的二倍体马铃薯植物、马铃薯块茎、马铃薯叶子。
在本发明的一种具体实施方式中，所述二倍体马铃薯中包括有编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述同源启动子的pCAMBIA1301载体。所述载体进入二倍体马铃薯中，在同源启动子的激活作用下，StSCI基因能够表达StSCI蛋白，进而抑制多种S-RNase的细胞毒性作用，使所述二倍体马铃薯具有自交亲和性。
在本发明的一种具体实施方式中，所述二倍体马铃薯中包括有编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述异源CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体。所述载体进入二倍体马铃薯中，在异源CaMV35S启动子的激活作用下，StSCI基因能够表达StSCI蛋白，进而降解多种S-RNase，使所述二倍体马铃薯具有自交亲和性。
本发明另一方面提供一种二倍体马铃薯的育种方法，包含编码所述的StSCI蛋白的核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物，或所述的在植物中表达目的基因的方法获得的二倍体马铃薯植物，或所述的产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法获得的二倍体马铃薯植物进行自交或与其他二倍体马铃薯植物进行杂交。
在本发明的一种具体实施方式中，利用本身含有StSCI基因的自交亲和的二倍体马铃薯材料(例如RH89-039-16)进行自交，二倍体马铃薯本身的雄蕊产生的花粉给本身的雌蕊进行授粉，通过自交产生具有自交亲和性的二倍体马铃薯后代和二倍体马铃薯实生种子。
在本发明的一种具体实施方式中，利用本身含有StSCI基因的自交亲和的二倍体马铃薯材料(例如RH89-039-16)的花粉，对其它二倍体马铃薯材料(例如自交不亲和的二倍体马铃薯)进行授粉，通过杂交把二倍体马铃薯材料RH89-039-16中能正常表达StSCI基因的染色体片段导入到其它二倍体马铃薯材料中，通过杂交产生具有自交亲和性的二倍体马铃薯后代和二倍体马铃薯实生种子。
本发明另一方面提供一种二倍体马铃薯的育种方法，包含编码所述的StSCI蛋白的核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物，或所述的在植物中表达目的基因的方法获得的二倍体马铃薯植物，或所述的产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法获得的二倍体马铃薯植物加倍变成四倍体后与其他四倍体马铃薯植物进行杂交后再降倍变成二倍体马铃薯植物。
本发明另一方面提供一种四倍体马铃薯的育种方法，包含编码所述的StSCI蛋白的核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物，或所述的在植物中表达目的基因的方法获得的二倍体马铃薯植物，或所述的产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法获得的二倍体马铃薯植物加倍变成四倍体后与其他四倍体马铃薯植物进行杂交。
本发明另一方面提供产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法获得的二倍体马铃薯植物，或所述的二倍体马铃薯的育种方法获得的二倍体马铃薯植物，或所述的四倍体马铃薯的育种方法获得的四倍体马铃薯植物制备的食品。
进一步，所述食品包括：新鲜的马铃薯、干燥的马铃薯、冷冻的马铃薯、薯条、薯片、马铃薯面粉或马铃薯淀粉。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：相对于传统的解决马铃薯自交不亲和的方法，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供了一种改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白，StSCI蛋白可以解除多种S-RNase的细胞毒性作用，克服了二倍体马铃薯自交不亲和的缺陷，实现二倍体马铃薯实生种子育种；
(2)本发明提供一种包含所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列和所述的启动子的载体，对自交不亲和的基因进行定性编辑，激活StSCI基因，使二倍体马铃薯中StSCI基因正常表达StSCI蛋白，克服二倍体马铃薯的自交不亲和性；
(3)本发明提供了一种二倍体马铃薯的育种方法，利用二倍体马铃薯材料RH89-039-16进行自交，通过自交产生具有自交亲和性的二倍体马铃薯后代和二倍体马铃薯实生种子，自交亲和性具有遗传性，从根本上解决马铃薯自交不亲和的障碍；
(4)本发明提供了一种二倍体马铃薯的育种方法，利用二倍体马铃薯RH89-039-16作为StSCI基因的供体材料，与现有的二倍体马铃薯栽培种遗传背景类似，杂交后代不会产生不良性状。
附图说明
图1所示为实施例1中StSCI基因的初定位区间图；
图2所示为实施例2中二倍体马铃薯材料的自交亲和表型鉴定图，其中A为互补表达StSCI基因的二倍体马铃薯材料S15-65，B为过表达StSCI基因的二倍体马铃薯材料PI225689；
图3所示为自交亲和材料RH89-039-16敲除StSCI基因后的自交亲和表型鉴定图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中，二倍体马铃薯材料RH89-039-16是自交亲和的，二倍体马铃薯材料PI 225689、S15-65是自交不亲和的。
下述实施例中无特殊说明的操作手法均为本领域技术人员常用的现有技术，在此不做过多解释。
实施例一 StSCI基因定位
利用二倍体马铃薯材料RH89-039-16的花粉对原本自交不亲和的二倍体材料PI225689进行授粉，收获种子作为F1代。对F1代植株的自交亲和性状进行调查发现自交亲和与自交不亲和的植株各占一半，说明RH89-039-16中的自交亲和基因处于杂合状态，而RH89-039-16表现出自交亲和性状，说明控制RH89-039-16的自交亲和的基因是显性的，把这个显性基因命名StSCI基因。从F1代中分别选取40株自交亲和的单株和40株自交不亲和的单株的叶片进行混合后提取基因组DNA，并对两组混池基因组DNA进行测序。
对测序结果进行分析，利用两个池SNP-index的差值，将StSCI基因初步定位于12号染色体的末端一段2.5Mb的区间内，获得了StSCI基因的初定位区间(图1)。
对自交亲和的二倍体马铃薯材料RH89-039-16和自交不亲和的二倍体马铃薯材料PI 225689进行基因组重测序，根据RH89-039-16和PI 225689在StSCI基因初定位区间内的基因组序列信息开发用于StSCI基因定位的分子标记，由于StSCI基因在RH89-039-16中处于杂合状态，在PI 225689中纯合隐性状态，因此待开发的与StSCI基因连锁的分子标记在RH89-039-16中应该也是处于杂合状态，在PI 225689中处于纯合状态，按照这个原则开发初定位区间内的分子标记，以F1群体单株作为定位群体，对StSCI基因进行精细定位，最终把StSCI基因定位在一个76Kb的区间内，该区间内共有6个注释基因，利用这6个注释基因的序列信息，设计了6对分别用于检测这6个注释基因表达水平的定量引物，同时提取RH89-039-16和PI 225689的花粉部位的植物总RNA，利用实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)，检测注释基因在花粉中的表达水平，其中有三个基因在RH89-039-16的花粉中高表达，这三个在RH89-039-16的花粉中高表达的基因中，编码为PGSC0003DMG400016861的基因在PI225689的花粉中完全没有表达，这个基因可能就是造成RH89-039-16自交亲和而PI 225689自交不亲和的原因，是StSCI基因的候选基因。
依据PGSC0003DMG400016861基因在DM基因组中的注释序列信息，设计了用于扩增包含基因以及启动子区域的引物对(如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)，分别使用RH89-039-16和IP65C的基因组DNA作为模板，PCR扩增后进行PCR产物的序列测定，发现在该基因启动子区域，RH89-039-16相比较于PI 225689有一段538bp的插入序列，这段插入序列位于起始密码子上游100bp处，并且插入序列内含有一个注释的启动子核心元件，这段序列是造成该基因在RH89-039-16中表达而在PI 225689中不表达的原因。
所述的StSCI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示
上述的插入序列为所述的调节StSCI基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
实施例二 StSCI基因验证
为了验证PGSC0003DMG400016861基因就是造成RH89-039-16中的自交亲和诱导基因，以pCAMBIA1301为骨架载体，构建了包含RH89-039-16中PGSC0003DMG400016861基因起始密码子上游的1245bp的启动子区域和3352bp的基因全长区域在内的植物双元载体，借助于农杆菌转化系统，把RH89-039-16中的PGSC0003DMG400016861基因连同其启动子转入到原本自交不亲和的二倍体马铃薯材料S15-65中，获得互补转基因植株。同时构建了以CaMV35S为启动子连接PGSC0003DMG400016861基因编码区的过表达载体，采用同样的方法转入到自交不亲和材料PI 225689中。
同时，采用CRISP/Cas9技术，构建了包含4个靶标位置的PGSC0003DMG400016861基因的基因敲除载体，在自交亲和的RH89-039-16材料中敲除PGSC0003DMG400016861基因。图2的结果发现：在自交不亲和材料S15-65中互补表达或者过表达PGSC0003DMG400016861基因，均能使自交不亲和材料S15-65和PI 225689变为自交亲和的，分别如图2中A和B所示。而在自交亲和材料RH89-039-16中敲除PGSC0003DMG400016861基因后，原本自交亲和的RH89-039-16变为自交不亲和(如图3所示)，说明PGSC0003DMG400016861基因是造成RH89-039-16自交亲和的StSCI基因。
实施例三 一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法
采用农杆菌LBA440，将携带有所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)和所述启动子(SEQ ID NO.3)的pCAMBIA1301载体转入经鉴定为自交不亲和的二倍体马铃薯中。结果发现，上述pCAMBIA1301载体的导入使二倍体马铃薯中的StSCI基因表达StSCI蛋白，进而使自交不亲和的二倍体马铃薯转变为自交亲和。
实施例四 一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法
采用农杆菌LBA440，将携带有所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)和CaMV35S启动子的pCAMBIA1301载体转入经鉴定为自交不亲和的二倍体马铃薯中。结果发现，上述pCAMBIA1301载体的导入使二倍体马铃薯中的StSCI基因表达StSCI蛋白，进而使自交不亲和的二倍体马铃薯转变为自交亲和。
实施例五 一种二倍体马铃薯的自交育种方法
花粉中能够表达StSCI基因的二倍体马铃薯材料，例如RH89-039-16均是自交亲和的，因此在RH89-039-16进入盛花期后，挑取RH89-039-16雄蕊中的花粉抹在RH89-039-16雌蕊的柱头上进行自交授粉，由于RH89-039-16是自交亲和的，因此自交授粉后RH89-039-16可以产生种子，获得了RH89-039-16的二倍体马铃薯实生种子。
实施例六 一种二倍体马铃薯的杂交育种方法
花粉中能够表达StSCI基因的二倍体马铃薯材料，例如RH89-039-16均是自交亲和的，而多数的二倍体马铃薯材料例如PI 225689是自交不亲和的，在上述的RH89-039-16和PI 225689材料进入盛花期后，挑取RH89-039-16雄蕊中的花粉，抹在PI 225689的柱头上进行杂交授粉，利用基因组重组，产生的种子中有一半是能够表达StSCI基因的，因此是自交亲和的，通过杂交获得了自交亲和的二倍体马铃薯材料。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农业基因组研究所
中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120> 改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 266
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> StSCI蛋白的氨基酸序列
<400> 1
Met Asp Tyr Phe Leu Leu Leu Pro Glu Gly Cys Val Cys Asp Ile Leu
1 5 10 15
Ser Phe Thr Ser Pro Lys Asp Val Val Ile Ser Ser Ala Ile Ser Arg
20 25 30
Gly Phe Asn Ser Ala Ala Glu Ser Asp Val Ile Trp Val Lys Phe Leu
35 40 45
Pro Asp Asp Tyr Glu Asp Ile Ile Ser Arg Tyr Val Ser Pro Arg Ile
50 55 60
Tyr Pro Ser Lys Lys Glu Leu Tyr Phe Ser Leu Cys Asp Phe Pro Val
65 70 75 80
Leu Met Asp Gly Gly Lys Leu Ser Phe Ser Leu Asp Lys Lys Thr Gly
85 90 95
Lys Lys Cys Phe Met Ile Ser Ala Arg Glu Leu Ala Ile Ser Trp Gly
100 105 110
Val Asp Thr Pro Trp Tyr Trp Glu Trp Ile Ser His Pro Asp Ser Arg
115 120 125
Phe Ser Glu Val Ala His Leu Lys Gly Val Ser Trp Leu Asp Ile Arg
130 135 140
Gly Thr Ile Gly Thr Gln Ile Leu Ser Lys Arg Thr Lys Tyr Val Val
145 150 155 160
Tyr Leu Val Phe Lys Leu Ala Lys Asp His Asp Gly Leu Glu Ile Ala
165 170 175
Asn Ala Phe Val Arg Phe Val Asn Arg Val Ser Asp Lys Asp Ala Glu
180 185 190
Glu Arg Ala Ser Val Val Ser Leu Val Gly Lys Arg Val Arg Arg Arg
195 200 205
Lys Arg Asn Val Lys Arg Pro Arg Lys Arg Val Asp Gly Trp Met Glu
210 215 220
Ile Glu Leu Gly Asn Phe Ile Asn Asp Thr Gly Asp Asp Gly Asp Val
225 230 235 240
Glu Ala Arg Leu Met Glu Ile Thr Arg Leu His Gly Lys Gly Gly Leu
245 250 255
Ile Val Gln Gly Ile Glu Phe Arg Pro Glu
260 265
<210> 2
<211> 801
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 编码StSCI蛋白的核苷酸序列
<400> 2
atggactatt tcctattgct accagaaggt tgtgtttgtg atattctctc ctttacttcc 60
ccgaaagatg tcgtgatttc atccgcgatc tctcggggat tcaactctgc tgctgaatcc 120
gacgttattt gggtaaagtt tttaccagat gattatgaag atattatctc gagatatgtc 180
tccccgcgga tttatccgtc taaaaaggag ctttacttta gtctatgtga cttccctgtt 240
ctaatggatg gaggcaaatt gagcttttca cttgataaga aaacaggcaa gaaatgtttt 300
atgatatcag ctagagaact tgctatttca tggggagttg atacaccatg gtattgggaa 360
tggatttctc atcccgactc cagattttcg gaagtggcac atctcaaggg tgtaagttgg 420
ctagacatac gaggcacgat tggaacacaa atattgtcga aaagaaccaa atatgttgtt 480
tatttggtgt tcaaattggc aaaggatcat gatggactag aaattgctaa tgcatttgtt 540
agatttgtga atcgtgtgag cgataaagat gccgaggaac gagctagtgt cgtgagtcta 600
gtcggaaaaa gggttaggag acgcaaacgt aacgtaaaac gtccacgaaa aagagtcgat 660
ggatggatgg aaatagaatt gggaaatttt atcaacgata caggagatga tggagatgtt 720
gaagcgcgat tgatggagat tacgcggctt catggaaaag gtggccttat tgttcaagga 780
attgaattta gaccagaatg a 801
<210> 3
<211> 2000
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 调节编码StSCI蛋白核苷酸序列的启动子
<400> 3
tcatttttaa aaaacagcgt attcccatat ggtggagatg gtactactgg tgttgtcctg 60
ttgcctggac cttgtatggt ttggttgcat cacaatttgg agatcttcag aacaaactta 120
ctgatgagga aacagtggaa caatttttga gacgttactt cggcttcaag catgattttc 180
ttccaatagt tgcagtcgcg attgttgggt acactgttct ttttggcttc acatttgctt 240
tcgctattaa ggcattcaac ttccaaacga gataaaaaga cattacctgc tgaagatgta 300
gtaaagacaa cgtgtgaaac gttctctcca ctgctcgtga aatggggaag acgcggttag 360
tataaggaat ttttctcgag ctcaagtacg agcaagagat tgattttgaa agtactgtat 420
atagattacc acttgaacaa gggtatgttc tgttattatt attatttttt atgaatttca 480
agttcatttt tctgtgtaag agatagtaat ttgttaatgt tgaagtacta ttctgttact 540
atctggtgtt tcttgtactt ttgttgtgtc tttttctgaa ctgctttgga ttatttttct 600
cgagtcgagg atctatcgga agaagacttt ctacctctga ggtaagagta aagtttgctt 660
acactctacc cttcccatac tccactttgt gggggagaca catggtatgt tgttcttata 720
gttacaacta taagaaatta atgaaatgat gaatgtaaga atttgtgaat attgcttttc 780
gggaactgcc acaactgtgg tgcgagaatg agacttctct agtgttaact aaacaacaag 840
tctttggttt gaattcggag aatggagaaa ttcttggtcg ggaacgctcc ttgataaatg 900
gaccttagat gatgctaatc ttaaattagt cgggccagta aatttcgaat cttccaagac 960
atttcatgtt ttaattcact aaaaaggaaa gacaaaaaat ttcaaactca aaacatttca 1020
tgtttagtat tattggaata tcttcctcca catgagttgt ttgtttggtg tatctaagca 1080
atatcaattc tttaatttta tttttttttg gaaataaaat gtacatatgt gagaactaga 1140
taaaaataat gaaaaataaa caaaaatgat ttttttaaaa ataaaataaa attaaatatt 1200
ttcacttcca ttaggccaaa agggtatatc taggctattt gtgtaatagt ataggtatgt 1260
atgagccatt tttataacga ggtatgtatc agctctaaat tatatgacct tttcacttat 1320
tatattcata ctggagaagt aaaaatgaac aaaacaatat ttaaccgcag tgccggctca 1380
atgcttataa aaattaggca tatgccttag gcccccaatt ttaggggggc ctcaaatttt 1440
taccaacaat aaattatgtg ttaatttttt ttatagaaaa aattaattat ttaagataaa 1500
tgtacttttc atatatatat tattttattc tccttaacct caatcaaata gaagaaatca 1560
agaaaaacgt tgttttgtct tcttacactc tcttcactta ctctcgcgtt gtaattttct 1620
ataccccttt tatactctat gtaagttaga gctctatcaa aaatatgaat caatagtaaa 1680
actaatgtgt tggataaagc gaattacaag cctgtttaga ttgacttatg ttatgtgctt 1740
ttaaataaaa aaagaagttt ataagcagtt ttgtcaactt attacttata gaataatgtt 1800
aacaatttat ttaataattg cctcagctaa aagattttag gcctttaatt taaattttgt 1860
tttaggcctc caaatacgtt gagccgcccc tgcttaaccg tcgagacata tgaagtgtaa 1920
caacttttca acaaactttt ctcagtttgc tttatataaa gaaaaaaaat tcacaaaact 1980
tcaaattcaa ttttccaata 2000
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增编码StSCI蛋白核苷酸序列的上游产物
<400> 4
atggactatt tcctattgct accagaagg 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增编码StSCI蛋白核苷酸序列的下游产物
<400> 5
tcattctggt ctaaattcaa ttccttgaa 29
<210> 6
<211> 538
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 调节StSCI基因启动子的插入序列
<400> 6
caggggcggc tcaacgtatt tggaggccta aaacaaaatt taaattaaag gcctaaaatc 60
ttttagctga ggcaattatt aaataaattg ttaacattat tctataagta ataagttgac 120
aaaactgctt ataaacttct ttttttattt aaaagcacat aacataagtc aatctaaaca 180
ggcttgtaat tcgctttatc caacacatta gttttactat tgattcatat ttttgataga 240
gctctaactt acatagagta taaaaggggt atagaaaatt acaacgcgag agtaagtgaa 300
gagagtgtaa gaagacaaaa caacgttttt cttgatttct tctatttgat tgaggttaag 360
gagaataaaa taatatatat atgaaaagta catttatctt aaataattaa ttttttctat 420
aaaaaaaatt aacacataat ttattgttgg taaaaatttg aggcccccct aaaattgggg 480
gcctaaggca tatgcctaat ttttataagc attgagccgg cactgcggtt aaatattg 538

Claims (31)

1.StSCI蛋白在克服二倍体马铃薯材料自交不亲和中的应用，其特征在于，所述StSCI蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.编码StSCI蛋白的核苷酸序列在克服二倍体马铃薯材料自交不亲和中的应用，其特征在于，编码StSCI蛋白的核苷酸序列，由如下序列组成：
1)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或，
2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的互补序列、简并序列；
3)在严格条件下与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交，且能够编码具有抑制自交不亲和活性的蛋白的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于，将所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列转入植物体中，并使目的基因表达。
4.用于调节编码StSCI蛋白的核苷酸序列的启动子，其特征在于，编码StSCI蛋白的核苷酸序列如权利要求2中1)- 3)所示；
所述启动子的核苷酸序列由如下序列组成：
1)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；或，
2)与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列完全互补序列。
5.包含编码StSCI蛋白的核苷酸序列和权利要求4所述的启动子的载体，其特征在于，编码StSCI蛋白的核苷酸序列如权利要求2中1)- 3)所示。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体包括：pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pCAMBIA1304、pCAMBIA1305、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pCAMBIA1380、pCAMBIA1390、pCAMBIA super1300、pCAMBIA super1300-GFP、pCAMBIA super1300-EGFP、pCAMBIA super1390-GFP。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体为pCAMBIA1301。
8.导入了编码StSCI蛋白的核苷酸序列和权利要求4所述的启动子的微生物，其特征在于，编码StSCI蛋白的核苷酸序列如权利要求2中1)- 3)所示。
9.导入了权利要求6或7所述载体的微生物。
10.如权利要求8或9所述的微生物，其特征在于，所述微生物包括：农杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸菌。
11.如权利要求10所述的微生物，其特征在于，所述微生物为农杆菌。
12.一种在植物中表达目的基因的方法，其特征在于，将权利要求5所述的载体，或将权利要求8-11任一项所述的微生物转入植物体中，获得目的基因表达。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述植物为二倍体马铃薯。
14.包含编码StSCI蛋白的核苷酸序列和异源启动子的载体在克服二倍体马铃薯材料自交不亲和中的应用，其特征在于，编码StSCI蛋白的核苷酸序列如权利要求2中1)- 3)所示。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述异源启动子包括：CaMV35S启动子、NOs启动子、Ocs启动子。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述异源启动子为CaMV35S启动子。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述载体包括：pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pCAMBIA1304、pCAMBIA1305、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pCAMBIA1380、pCAMBIA1390、pCAMBIA super1300、pCAMBIAsuper1300-GFP、pCAMBIA super1300-EGFP、pCAMBIA super1390-GFP。
18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述载体为pCAMBIA1301。
19.如权利要求14所述的应用，其特征在于，将所述载体导入微生物中。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述微生物包括：农杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸菌。
21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述微生物为农杆菌。
22.如权利要求14所述的应用，其特征在于，将所述的载体转入植物体中，获得目的基因表达。
23.如权利要求19-21任一项所述的应用，其特征在于，将所述的微生物转入植物体中，获得目的基因表达。
24.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述植物为二倍体马铃薯。
25.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述植物为二倍体马铃薯。
26.一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法，其包括使二倍体马铃薯植物表达StSCI蛋白；所述方法包括将编码StSCI蛋白的核苷酸序列转入二倍体马铃薯中，编码StSCI蛋白的核苷酸序列如权利要求2中1)- 3)所示，所述二倍体马铃薯中包含使所述核苷酸序列激活表达的启动子，使二倍体马铃薯中的StSCI蛋白表达。
27.一种产生自交亲和的二倍体马铃薯的方法，其包括将权利要求5-7任一项所述的载体，或将权利要求8-11任一项所述的微生物转入二倍体马铃薯中，使二倍体马铃薯中的StSCI蛋白表达。
28.一种二倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，使包含编码StSCI蛋白的核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物进行自交或与其他二倍体马铃薯植物进行杂交，或加倍变成四倍体后与其他四倍体马铃薯植物进行杂交后再降倍变成二倍体马铃薯植物，所述二倍体马铃薯中包含使所述核苷酸序列激活表达的启动子，所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列如权利要求2中1)- 3)所示。
29.一种四倍体马铃薯的育种方法，其特征在于，使包含编码StSCI蛋白的核苷酸序列的自交亲和二倍体马铃薯植物加倍变成四倍体后与其他四倍体马铃薯植物进行杂交，所述二倍体马铃薯中和/或四倍体马铃薯中包含使所述核苷酸序列激活表达的启动子，所述编码StSCI蛋白的核苷酸序列如权利要求2中1)- 3)所示。
30.由权利要求28所述的二倍体马铃薯的育种方法获得的二倍体马铃薯植物制备的食品，或权利要求29所述的四倍体马铃薯的育种方法获得的四倍体马铃薯植物制备的食品。
31.根据权利要求30所述的食品，其特征在于，所述食品包括：新鲜的马铃薯、干燥的马铃薯、冷冻的马铃薯、薯条、薯片、马铃薯面粉或马铃薯淀粉。
CN201911230001.4A 2019-12-04 2019-12-04 改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白 Active CN110938120B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911230001.4A CN110938120B (zh) 2019-12-04 2019-12-04 改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白
EP20895309.1A EP4023665A4 (en) 2019-12-04 2020-06-04 STSCI PROTEIN FOR MODIFYING SELF-CROSS-LINKING INCOMPATIBILITY OF DIPLOID POTATO MATERIALS
PCT/CN2020/094344 WO2021109507A1 (zh) 2019-12-04 2020-06-04 改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白
US17/831,509 US20220298526A1 (en) 2019-12-04 2022-06-03 Stsci protein for changing self-incompatibility of diploid potato materials

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911230001.4A CN110938120B (zh) 2019-12-04 2019-12-04 改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110938120A CN110938120A (zh) 2020-03-31
CN110938120B true CN110938120B (zh) 2021-12-03

Family

ID=69909168

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911230001.4A Active CN110938120B (zh) 2019-12-04 2019-12-04 改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220298526A1 (zh)
EP (1) EP4023665A4 (zh)
CN (1) CN110938120B (zh)
WO (1) WO2021109507A1 (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105766658B (zh) 2009-10-26 2018-06-26 艾格文册尔有限公司 杂交种用马铃薯的育种
WO2020226499A1 (en) * 2019-05-07 2020-11-12 Agventure B.V. Self-compatibility in cultivated potato
CN110894539B (zh) * 2019-12-04 2022-01-25 云南师范大学 鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法
CN110938120B (zh) * 2019-12-04 2021-12-03 中国农业科学院农业基因组研究所 改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白
CN111621504B (zh) * 2020-06-30 2022-08-02 长江师范学院 一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS及其应用
CN113603772B (zh) * 2021-08-05 2023-08-04 广东省农业科学院作物研究所 一种可检测烟草凝集素蛋白的抗体及其制备方法和应用
CN116803248A (zh) * 2022-03-16 2023-09-26 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 自交不亲和的双单倍体马铃薯品系及其选育方法和杂交马铃薯及其制种方法
CN114731953A (zh) * 2022-04-22 2022-07-12 云南师范大学 二倍体马铃薯cip149高效离体再生体系及茎段遗传转化体系的构建

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011053135A2 (en) * 2009-10-26 2011-05-05 Agventure B.V. Hybrid seed potato breeding
WO2018112356A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Two Blades Foundation Late blight resistance genes and methods of use
CN109548646A (zh) * 2018-06-14 2019-04-02 中国农业科学院农业基因组研究所 一种使马铃薯自交亲和的方法
CN109750061A (zh) * 2018-04-08 2019-05-14 中国农业科学院农业基因组研究所 一种克服二倍体马铃薯自交不亲和的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2514303A1 (en) * 2011-04-21 2012-10-24 Agventure B.V. Hybrid seed potato breeding
US10448588B2 (en) * 2013-03-15 2019-10-22 Syngenta Participations Ag Haploid induction compositions and methods for use therefor
CN103484474B (zh) * 2013-09-18 2015-04-22 中国科学院遗传与发育生物学研究所 参与控制茄科植物种内及种间生殖障碍的一类基因slf及其应用
WO2020226499A1 (en) * 2019-05-07 2020-11-12 Agventure B.V. Self-compatibility in cultivated potato
CN110894539B (zh) * 2019-12-04 2022-01-25 云南师范大学 鉴定二倍体马铃薯是否自交亲和的方法
CN110938120B (zh) * 2019-12-04 2021-12-03 中国农业科学院农业基因组研究所 改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011053135A2 (en) * 2009-10-26 2011-05-05 Agventure B.V. Hybrid seed potato breeding
WO2018112356A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Two Blades Foundation Late blight resistance genes and methods of use
CN109750061A (zh) * 2018-04-08 2019-05-14 中国农业科学院农业基因组研究所 一种克服二倍体马铃薯自交不亲和的方法
CN109548646A (zh) * 2018-06-14 2019-04-02 中国农业科学院农业基因组研究所 一种使马铃薯自交亲和的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Generation of self-compatible diploid potato by knockout of S-RNase;Mingwang Ye;《Nature Plants》;20180930;第4卷;第651–654页 *
Overcoming Self-Incompatibility in Diploid Potato Using CRISPR-Cas9;Felix Enciso-Rodriguez;《Frontiers in Plant Science》;20190430;第10卷;第1-12页 *
PREDICTED: Solanum pennellii F-box protein PP2-B10-like (LOC107005456), mRNA;GenBank;《GenBank》;20151223;XM_015204055.1 *
PREDICTED: Solanum tuberosum F-box protein PP2-B10-like (LOC107061040), mRNA;GenBank;《GenBank》;20160105;XM_015309736.1 *
The genetic basis of inbreeding depression in potato;Chunzhi Zhang;《NatUre Genetics》;20190331;第51卷;第374–378页 *
二倍体马铃薯自交不亲和与自交衰退研究;张春芝;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20190515(第 05 期);D047-32 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110938120A (zh) 2020-03-31
EP4023665A4 (en) 2023-02-08
WO2021109507A1 (zh) 2021-06-10
EP4023665A1 (en) 2022-07-06
US20220298526A1 (en) 2022-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110938120B (zh) 改变二倍体马铃薯材料自交不亲和性的StSCI蛋白
EP3018217B1 (en) Maize cytoplasmic male sterility (cms) c-type restorer rf4 gene, molecular markers and their use
US20220186238A1 (en) Diplospory gene
US20200140874A1 (en) Genome Editing-Based Crop Engineering and Production of Brachytic Plants
MX2013015338A (es) Metodos y composiciones para la regulacion selectiva de la expresion de proteinas.
WO2019038417A1 (en) METHODS FOR INCREASING GRAIN YIELD
CN111153974A (zh) 玉米抗病基因和分子标记及其应用
CN102432679A (zh) 水稻类伸展蛋白OsPEX1及其应用
CN110903368B (zh) 一种控制玉米雌性性状的基因以及用于创制玉米雌性不育系的试剂盒、突变基因型和方法
CN115552038A (zh) 通过4号染色体上的qtl增强玉米对玉米大斑病的抗病性
US20160017347A1 (en) Terminating flower (tmf) gene and methods of use
US20230279418A1 (en) Plant haploid induction
WO2019129145A1 (en) Flowering time-regulating gene cmp1 and related constructs and applications thereof
CN110386967B (zh) 与植物雄性育性相关的蛋白SiMS1及其编码基因与应用
CN112521471B (zh) 一个控制玉米籽粒含水量的基因和分子标记及其应用
US20190200554A1 (en) Compositions and Methods for Plant Haploid Induction
CN113151295A (zh) 水稻温敏雄性不育基因OsFMS1及其应用
EP4278891A1 (en) Clubroot resistance and markers in brassica
CN111825752B (zh) 水稻小穗簇生突变体及其分子鉴定方法和应用
CN114989281B (zh) 一个控制玉米籽粒含水量基因ZmEIN2-1及其分子标记
CN115697043A (zh) 通过靶向诱变获得突变植物的方法
CN116887669A (zh) 具有细胞质雄性不育恢复基因的玉米植物的鉴定和选择方法
CN110734484A (zh) Nrt2_5蛋白在调控植物苞叶宽度中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Huang Sanwen

Inventor after: Ma Ling

Inventor after: Shang Die

Inventor after: Zhang Chunzhi

Inventor after: Li Canhui

Inventor before: Huang Sanwen

Inventor before: Ma Ling

Inventor before: Shang Die

Inventor before: Zhang Chunzhi

Inventor before: Li Canhui

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant