MX2013015338A

MX2013015338A - Metodos y composiciones para la regulacion selectiva de la expresion de proteinas.

Info

Publication number: MX2013015338A
Application number: MX2013015338A
Authority: MX
Inventors: Youlin Qi; Jintai Huang; Sergey Ivashuta; Barbara E Wiggins; Yuanji Zhang
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2011-07-01
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2014-01-31
Also published as: AR126724A2; RS61292B1; US9816106B2; EP2726493B1; EP2726493A1; US20160208283A1; US20180030474A1; CN103635483B; RU2667424C2; ZA201309287B; CN103635483A; CA2840646C; RU2014103436A; CA2840646A1; PE20141518A1; BR112013033972A2; MX354471B; UY34176A; US20200340010A1; WO2013006472A1

Abstract

La invención presenta métodos y composiciones para suprimir selectivamente la expresión de una proteína recombinante en un tejido reproductor masculino de una planta transgénica; la invención presenta asimismo métodos y composiciones para inducir la esterilidad masculina en una planta transgénica; las plantas, células vegetales, partes de plantas, semillas y productos de consumo que incluyen dichas composiciones constituyen aspectos de la invención.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA REGULACIÓN SELECTIVA DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud provisoria de Estados Unidos 61/504,102, que fue presentada el 1 de julio de 2011 , que se incorpora a la presente como referencia en su totalidad.

Incorporación de listado de secuencias El listado de secuencias contenido en el archivo denominado "MONS294US.txt", que tiene un tamaño de 40.5 kilobytes (tamaño medido en Microsoft Windows®) y que fuera generado el 15 de junio de 2012, se presenta junto con este documento mediante presentación electrónica y se incorpora a la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona, en general, con los campos de la agricultura, el mejoramiento genético de plantas y la biología molecular. Más específicamente, la invención se relaciona con métodos y composiciones para suprimir en forma recombinante la expresión de proteínas en el tejido reproductivo masculino de las plantas transgénicas y con usos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La semilla híbrida, es decir la semilla producida mediante la hibridación o fertilización cruzada de plantas estrechamente relacionadas, puede ser cultivada para obtener plantas híbridas de la progenie procesando una combinación conveniente de rasgos que no posee ninguna de las plantas progenitoras. Las plantas híbridas pueden exhibir características agronómicas superiores, que incluyen la mejora del tamaño de la planta, el rendimiento, la composición nutricional, la resistencia a las enfermedades, tolerancia a los herbicidas, tolerancia al estrés, adaptación climática y otros rasgos ventajosos. La producción eficiente de semillas híbridas requiere que no se permita que el propio polen de la planta autofertilice la planta.

En la producción de semillas híbridas, se puede prevenir la producción y/o diseminación del polen en una planta progenitora hembra a fin de facilitar la polinización cruzada de la hembra en lugar de autopolinización. Dicha prevención se puede lograr, por ejemplo, mediante la remoción manual de las estructuras con contenido de polen (por ej., despanojado manual o mecánico en el caso del maíz), el uso de un medio genético de control de la polinización (por ej., macho esterilidad citoplasmática, macho esterilidad nuclear) y/o el uso de un agente químico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona, en general, con métodos para suprimir selectivamente la expresión de proteínas recombinantes en el tejido reproductivo masculino de las plantas transgénícas, con constructos de ADN recombinante útiles en dichos métodos, como así también con plantas, células y semillas transgénícas que contienen dichos constructos de ADN recombinante. Los constructos de ADN recombinante y las plantas, células y semillas transgénícas que contienen dichos constructos ofrecen una manera muy mejorada de utilizar herbicidas para inducir la esterilidad masculina en plantas transgénícas para la producción de semillas híbridas.

En un aspecto, la invención presenta un constructo de ADN recombinante que incluye una secuencia codificadora de proteínas que codifica una proteína recombinante y un elemento ARNsi específico del tejido masculino (el ARNsi-mts) operativamente ligado a la secuencia codificadora de proteína. En una modalidad, el elemento ARNsi-mts está incluido dentro de la región 3' sin traducir de la secuencia codificadora de proteína. En otra modalidad, el elemento ARNsi-mts está situado entre la secuencia codificadora de proteína y una secuencia de poliadenilación que es parte de una región 3' sin traducir. En otra modalidad, el elemento ARNsi-mts incluye por lo menos una secuencia de ARNsi-mts. En otra modalidad, el elemento ARNsi-mts incluye por lo menos una secuencia de ARNsi-mts seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-56 y 105-149. En otra modalidad, el elemento ARNsi-mts es seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-94 y 96-104. En otra modalidad, la expresión de la proteína recombinante en una planta transgénica confiere a la planta por lo menos la tolerancia vegetativa a los herbicidas. En otra modalidad, la proteína recombinante es una EPSPS tolerante al glifosato.

Otro aspecto de la invención presenta un método para generar un constructo de ADN recombinante que incluye identificar un elemento ARNsi-mts que incluye por lo menos una secuencia de ARNsi-mts y ligar operativamente el elemento ARNsi-mts a una secuencia codificadora de proteína, por ejemplo una secuencia de ADN que codifica una proteína recombinante. En una modalidad, el elemento ARNsi-mts incluye por lo menos una secuencia de ARNsi-mts seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-56 y 105-149 o es por lo menos un elemento ARNsi-mts seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-94 y 96-104. En otra modalidad, el elemento ARNsi-mts es específico de las panojas.

En otro aspecto, la invención da a conocer una planta transgénica que incluye un constructo de ADN recombinante de la invención, como así también una semilla, célula o parte de la planta transgénica. En una modalidad, la planta es una planta monocotiledónea. En otra modalidad, la planta es una planta de maíz (Zea mays).

En otro aspecto, la invención también presenta un método para suprimir selectivamente la expresión de una proteína recombinante en un tejido reproductor masculino de una planta transgénica mediante la expresión en la planta transgénica de un constructo de ADN recombinante que incluye una secuencia codificadora de proteína operativamente ligada a una secuencia de ADN que incluye un elemento ARNsi-mts. En una modalidad, el elemento ARNsi-mts incluye por lo menos una secuencia de ARNsi-mts. En otra modalidad, el tejido reproductor masculino es una panoja de una planta de maíz. En otra modalidad, el elemento ARNsi-mts incluye por lo menos una secuencia de ARNsi-mts seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-56 y 105-1 9. En otra modalidad, el elemento ARNsi-mts es por lo menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-94 y 96-104. En otra modalidad, la expresión de la proteína recombinante en una planta transgénica confiere a la planta por lo menos tolerancia vegetativa a los herbicidas. En otra modalidad, la proteína recombinante es una EPSPS tolerante al glifosato.

La invención presenta además un método para inducir la esterilidad masculina en una planta transgénica, que incluye el paso de aplicar herbicida a una planta transgénica que tiene, en su genoma, un constructo de ADN recombinante que comprende una secuencia codificadora de proteína operativamente ligada a una secuencia de ADN que incluye un elemento ARNsi-mts que confiere a la planta transgénica por lo menos tolerancia vegetativa a los herbicidas, donde el herbicida es aplicado durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta transgénica, para inducir así la macho esterilidad en la planta transgénica. En una modalidad, la planta transgénica es una planta de maíz. En otra modalidad, la aplicación de herbicida previene por lo menos la diseminación del polen o la extrusión de las anteras en la planta transgénica tratada. En otra modalidad, la etapa de desarrollo del tejido reproductor masculino durante la cual se aplica el herbicida es una etapa seleccionada del grupo que consiste en las etapas V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 , V12, V13 y V14 del desarrollo de la planta de maíz. En otra modalidad, el herbicida es seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de la acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa), inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS), inhibidores del fotosistema II (PSII), inhibidores de la protoporfirinógeno oxidasa (PPO), inhibidores de la 4— hidroxifenil dioxigenasa (HPPD), inhibidores de la 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS), inhibidores de la glutamina sintetasa (GS) y auxinas sintéticas. En otra modalidad, el herbicida es glifosato y la proteína recombinante es una EPSPS tolerante al glifosato.

La invención presenta asimismo un método para producir semillas híbridas que incluye aplicar una cantidad efectiva de un herbicida a una planta transgénica que incluye en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende una secuencia codificadora de proteína operativamente ligada a una secuencia de ADN que incluye un elemento ARNsi-mts, donde el herbicida es aplicado durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta transgénica, para inducir así la macho esterilidad en la planta transgénica; fertilizar la planta transgénica con polen de una segunda planta; y cosechar semillas híbridas de la planta transgénica. En una modalidad, la planta transgénica es de maíz. Una cantidad efectiva de herbicida es una dosis de herbicida suficiente para transformar en macho estéril una planta transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante de la invención (una dosis efectiva). En otra modalidad, el herbicida es glifosato y la proteína recombinante es una EPSPS tolerante al glifosato. En otra modalidad, el glifosato es aplicado durante el desarrollo en una dosis efectiva de aproximadamente 0.125 libras de equivalente ácido por acre (0.14 kg/ha) a aproximadamente 8 libras de equivalente ácido por acre (8.96 kg/ha). En la siguiente descripción detallada se explican otras modalidades específicas de la invención. En toda esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que el contexto demande lo contrario, se ha de entender que el término "comprender" y sus variaciones, como por ejemplo "comprende" y "que comprende" implica la inclusión de un número entero, elemento o paso o grupo de números enteros, elementos o pasos, aunque no excluye a ningún otro número entero, elemento o paso o grupo de números enteros, elementos o pasos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ¡lustra el mapeo de secuencias de ARNsi-mts sobre un elemento ARNsi-mts (SEQ ID NO: 85), descripto en el Ejemplo 1. El eje X de izquierda a derecha representa la orientación del elemento ARNsi-mts donde la hebra superior está representada en la mitad superior del gráfico y la hebra inferior está representada en la mitad inferior del gráfico; la posición de los nucleótidos en la orientación de 5' a 3' está expuesta de izquierda a derecha en la parte superior y de derecha a izquierda en la inferior. Las secuencias de ARNsi-mts están expuestas en sus posiciones de alineamiento relativo. El eje Y representa la abundancia relativa del ARNsi-mts expresado en el tejido de las panojas en términos de transcriptos por cuarto de millón de secuencias (tpq). Los ARNsi-mts con gran representación en la genoteca están rodeados por círculos.

La Figura 2 ilustra análisis de Northern blot para medir la expresión de ARNs específica de la panojas, como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 3 ¡lustra el mapeo de las secuencias de ARNsi-mts sobre un elemento ARNsi-mts (SEQ ID NO: 87), de acuerdo con lo descripto en los Ejemplos 2 y 8. El eje X de izquierda a derecha representa la orientación del elemento ARNsi-mts donde la hebra superior está representada en la mitad superior del gráfico y la hebra inferior está representada en la mitad inferior del gráfico; la posición de los nucleótidos en la orientación de 5' a 3' está expuesta de izquierda a derecha en la parte superior y de derecha a izquierda en la inferior. Las secuencias de ARNsi-mts están expuestas en sus posiciones de alineamiento relativo. Las tres secuencias de ARNsi-mts utilizadas para diseñar tres sondas específicas (SR648011 (SEQ ID NO: 8), sR1372590 (SEQ ID NO: 26) y sR410590 (SEQ ID NO: 33)) están indicadas.

La Figura 4 ilustra análisis de Northern blot de la expresión temporal en la madurez de las panojas de un elemento ARNsi-mts (SEQ ID NO: 87) usando ARN de un germoplasma endogámico diferente, de acuerdo con lo descripto en el Ejemplo 2.

La Figura 5 ilustra la localización in situ de la expresión de ARNsi en las anteras maduras empleando sondas antisentido (panel izquierda) o codificantes (panel derecho) para una secuencia de ARNsi-mts (sR648011 , SEQ ID NO: 8), de acuerdo con lo descripto en el Ejemplo 2 Las Figuras 6A-6B ilustran la localización de la proteína CP4-EPSPS en las anteras de plantas no rociadas correspondiente al constructo 3 (Figura 6A) o al constructo 4 (Figura 6B), según lo descripto en el Ejemplo 4. Las plantas transgénicas de maíz del constructo 3 contienen un cassette de expresión del elemento CP4-EPSPS/ ARNsi-mts. Las plantas con el constructo 4 son un control.

Las Figuras 7A-7E ilustran plantas transgénicas de maíz generadas a partir de constructos que contienen un cassette de expresión del elemento CP4-EPSPS/ ARNsi-mts, que resultaron vegetativamente tolerantes al glifosato y tenían macho esterilidad inducida con la aplicación tardía de glifosato, de acuerdo con lo descripto en el Ejemplo 7. La Figura 7A ilustra plantas transgénicas de maíz rociadas con glifosato y no rociadas. La Figura 7B muestra las panojas de plantas transgénicas sin rociar y la Figura 7C ilustra granos de polen de plantas transgénicas sin rociar. La Figura 7D ilustra panojas de plantas transgénicas rociadas y la Figura 7E ilustra granos de polen de plantas transgénicas rociadas.

Las Figuras 8A-8C ilustran datos correspondientes a un año de ensayos de campo que medían la Tasa de Fertilidad Masculina (MFR) después del rocío tardío con glifosato. La Figura 8A ilustra la MFR promedio producida por tres regímenes diferentes de tratamiento con rocío de glifosato (Trt 1 , Trt 2 y Trt 3) correspondientes a NK603 (maíz transgénico con CP4-EPSPS), MON 87427 (maíz transgénico con CP4-EPSPS esterilidad masculina inducida por glifosato) y dos eventos del constructo 3, de acuerdo con lo descripto en el Ejemplo 5; la línea de guiones indica el standard de la industria para la macho esterilidad, MFR 2. La Figura 8B ilustra una panoja de una planta tratada con un tratamiento de rocío únicamente de las malezas. La Figura 8C ilustra una panoja de una planta tratada con un tratamiento de rocío tardío de glifosato para inducir la macho esterilidad.

La Figura 9 ilustra los resultados de ensayos de campo que medían el número de plantas por lote con macho esterilidad, medida por la extrusión de las anteras por medio de S90, a S90+3 y a S90+6 en dos regímenes diferentes de tratamiento con glifosato (Trt 2 y Trt 3) correspondientes a NK603 (CP4-EPSPS), MON 87427 (maíz transgénico CP4-EPSPS con macho esterilidad inducible por glifosato) y cuatro eventos del constructo 3, según lo descripto en el Ejemplo 5.

Las Figuras 10A-10D ilustran los resultados de estudios de viabilidad del polen descriptos en el Ejemplo 5. Las Figuras 10A y 10B ¡lustran un ejemplo de extrusión de las anteras de rotura tardía en las panojas de un evento del constructo 3 rociado para la esterilidad. La caja de la Figura 10A es la porción ampliada de la Figura 10B. Un ejemplo de extrusión de las anteras de rotura tardía está rodeado por un círculo en la Figura 10B. La tinción de Alexander del polen de las anteras extruidas de rotura tardía, rociadas para inducir esterilidad de los eventos del constructo 3 rociados demuestra sólo polen no viable (granos de polen de color azul claro traslúcido, de forma irregular) (Figura 10C). El polen de las anteras no rociadas con el constructo 3 era totalmente viable y aparece opaco, de color violeta oscuro y esférico con la tinción de Alexander (Figura 10D).

La Figura 11 ilustra los resultados de las pruebas de ensayos de campo de plantas NK603 y eventos del constructo 3 correspondientes al rendimiento de grano endogámico y fertilidad masculina, según lo descripto en el Ejemplo 6. Se midió el rendimiento endogámico en términos de bushels/acre (Bu/acre) y la macho esterilidad fue medida en términos de Tasa de Fertilidad Masculina (MFR). La barra horizontal indica el standard de la industria correspondiente a la macho esterilidad, MFR 2. Trt 1 , Trt 2 y Trt 3 se refieren a los regímenes de tratamiento 1 , 2 y 3.

La Figura 12 ilustra los resultados de las pruebas de ensayos de campo de una línea endogámica femenina no transgénica, la línea MON87427 y tres eventos del constructo 3, todas con el mismo antecedente genético, que fueron sometidas a polinización cruzada con un standard masculino de análisis MON810/MON88017 para generar semillas híbridas F1. Se midió el rendimiento de los granos híbridos en términos de bushels/acre (Bu/acre). Trt 1 , Trt 2 y Trt 3 se refieren a los regímenes de tratamiento 1 , 2 y 3.

La Figura 13 ilustra el análisis de los granos de polen de plantas híbridas F1 , según lo descripto en el Ejemplo 7. Los paneles exponen los resultados de la tinción de Alexander del polen de tres cruzas híbridas F1 diferentes: hembra no transgénica x macho MON880 7; hembra MON87427 x macho MON88017 y hembra del evento del constructo 3 x macho MON88017. Se restableció funcionalmente la fertilidad de las panojas en híbridas F1 producidas por plantas con el evento del constructo 3 usando el polen MON88017.

La Figura 14 ilustra dibujos esquemáticos de modalidades de los constructos de ADN recombinante (expuestos en la dirección 5' a 3' de izquierda a derecha) que incluyen (parte superior) una secuencia codificadora de proteína (por ej., ADN que codifica una EPSPS resistente al glifosato) operativamente ligada a una secuencia de ADN que comprende un elemento ARNsi-mts (por ej., una o más seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-94 y 96-104) (parte superior). En una modalidad específica no restrictiva (parte inferior) el constructo de ADN recombinante incluye un promotor operativamente ligado a, en ese orden, un intrón, un péptido de tránsito, CP4-EPSPS codificada por SEQ ID NO: 95, un elemento ARNsi-mts (SEQ ID NO: 81) y una 3'UTR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Constructos de ADN recombinante La invención presenta composiciones y métodos para suprimir selectivamente la expresión recombinante en un tejido reproductor masculino de una planta transgénica y los usos de los mismos. En un aspecto, la invención da a conocer un constructo de ADN recombinante que incluye una secuencia codificadora de proteína operativamente ligada a una secuencia de ADN que incluye un elemento ARNsi-mts, es decir, un transgén quimérico que incluye una secuencia codificadora de proteína que codifica la proteína recombinante y por lo menos un elemento ARNsi-mts operativamente ligado a la secuencia codificadora de proteína. En una modalidad, esas construcciones de ADN recombinantes son útiles para suprimir selectivamente la expresión de una proteína recombinante en un tejido reproductor masculino de una planta transgénica. En un aspecto, la invención presenta una molécula de ADN recombinante que comprende el constructo de ADN recombinante y métodos de uso de los mismos. Las secuencias de ácido nucleico se pueden presentar en forma de ADN o ARN, según se indique; la descripción de una define necesariamente la otra, como es de conocimiento de la persona con capacitación normal en la técnica. Más aun, la descripción de una secuencia dada de ácido nucleico define el complemento exacto de esa secuencia, como es de conocimiento de la persona con capacitación normal en la técnica.

Un "ARNsi específico de los tejidos masculinos" o "ARNsi-mts" es un pequeño ARN (ARNs) de aproximadamente 18 a aproximadamente 26 nucleótidos (por ej., 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25 o 26 nucleótidos) enriquecido o expresado específicamente en el o los tejidos reproductores masculinos (por ej., inflorescencia masculina) de una planta, es decir, que tiene un patrón de expresión de tejidos específicos. Los ARNsi específicos de los tejidos masculinos son de origen natural en las plantas y se los puede detectar empleando métodos conocidos en la técnica, tales como análisis northern de bajo peso molecular. En la presente se hace referencia a una secuencia de ADN que es complementaria de un ARNsi-mts como "secuencia ARNsi-mts". Los ejemplos de secuencias de ARNsi-mts correspondientes a ARNsi-mts endógenos de las plantas se presentan como SEQ ID NO: 1-56 y 105-149. En una modalidad, una secuencia de ARNsi-mts es el complemento de ADN exacto (sin errores de apareamiento) de un ARNsi-mts dado. En otras modalidades, una secuencia de ARNsi-mts varía en malapareamientos de 1-3 nucleótidos en comparación con un ARNsi-mts dado y, de todas maneras, tiene suficiente complementariedad para unirse o hibridarse, por ej., en condiciones fisiológicas típicas, a esos ARNsi-mts. "Complementariedad" se refiere a la capacidad de los nucleótidos de una cadena polinucleotídica con los nucleótidos de otra cadena polinucleotídica de acuerdo con las reglas de complementariedad de Watson-Crick (es decir, pares de guanina con citosina (G:C) y pares de adenina con timina (A:T) o con uracilo (A:U); es posible que se produzca la hibridación intracatenaria entre dos o más regiones de complementariedad de un único polinucléotido. Cuando está incluido en un constructo de ADN recombinante descripto en la presente, un ARNsi-mts tiene capacidad para la supresión o alteración mediada por ARNi de la expresión de un gen y/o una proteína.

Por lo menos una, por lo menos dos, por lo menos tres o más de tres secuencias de ARNsi-mts pueden estar agrupadas o incluso superpuestas dentro de una única molécula de ADN. En la presente se hace referencia a ese tipo de molécula de ADN como "elemento ARNsi específico de los tejidos masculinos" o "elemento ARNsi-mts" y se lo define por incluir por lo menos una, por lo menos dos, por lo menos tres o más de tres secuencias de ARNsi-mts dentro de una ventana de secuencia de aproximadamente 500 nucleótidos. Un elemento ARNsi-mts puede tener cualquier longitud, como por ejemplo de aproximadamente 20 nucleótidos (nt), aproximadamente 25 nt, aproximadamente 30 nt, aproximadamente 40 nt, aproximadamente 50 nt, aproximadamente 60 nt, aproximadamente 70 nt, aproximadamente 80 nt, aproximadamente 100 nt, aproximadamente 150 nt, aproximadamente 200 nt, aproximadamente 250 nt, aproximadamente 300 nt, aproximadamente 350 nt, aproximadamente 400 nt, aproximadamente 450 nt, aproximadamente 500 nt, aproximadamente 550 nt o aproximadamente 600 nt.

Un constructo de ADN recombinante de la invención es una molécula de ADN que incluye por lo menos una secuencia codificadora de proteína operativamente ligada a una secuencia de ADN que incluye un elemento ARNsi-mts. El término "recombinante" se refiere a una molécula o una célula u organismo que ha sido creado por el hombre por medio de ingeniería genética y, por ello, es el producto de la actividad humana y de notro modo no aparecería normalmente en la naturaleza. En el presente contexto, un constructo de ADN recombinante es una molécula de ADN recombinante que incluye dos o más secuencias de ADN heterólogas. El término "heterologa" se refiere a la relación entre dos o más secuencias de ácido nucleico o proteína que son derivadas de diferentes fuentes (por ej., de diferentes ubicaciones en un genoma o de diferentes especies). En un ejemplo, un promotor y una secuencia de AND codificadora de proteína son heterólogos entre sí si el promotor no es el promotor nativo de la secuencia de ADN que codifica la proteína. En otro ejemplo, una secuencia codificadora de proteína es heterologa con respecto a un elemento ARNsi-mts si esa combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza, como por ejemplo un elemento ARNsi-mts vegetal operativamente ligado a un gen para tolerancia a los herbicidas, como ser CP4-EPSPS. Además, una secuencia específica puede ser "heteróloga" con respecto a una célula u organismo en el cual se la introduce (es decir, una secuencia que no aparece naturalmente en esa célula u organismo específico).

El término "operativamente ligado" se refiere a dos moléculas polinucleotídicas ligadas de manera tal que una pueda afectar la expresión de la otra. Por ejemplo, una primera molécula polinucleotídica está operativamente ligada a una segunda molécula polinucleotídica cuando las moléculas polinucleotídicas están dispuestas de tal manera que la primera molécula polinucleotídica pueda afectar la expresión de la segunda molécula polinucleotídica. Las dos moléculas polinucleotídicas pueden ser parte de una única molécula polinucleotídica contigua y pueden estar adyacentes o separadas. Por ejemplo, un elemento ARNsi-mts está operativamente ligado a una secuencia codificadora de proteina si, después de la transcripción en la célula del tejido reproductor masculino, la presencia del elemento ARNsi-mts da lugar a la supresión de la expresión de proteínas recombinantes en la célula. El ligamiento operativo de la secuencia codificadora de proteína y el elemento ARNsi-mts se puede lograr, por ejemplo, por medio de la incorporación de un elemento ARNsi-mts adyacente a la secuencia codificadora de proteína (como por ejemplo situado 5' o 3' con respecto a la secuencia codificadora de proteína, aunque no necesariamente en un enlace contiguo) en o adyacente a una región sin traducir (UTR) del constructo de ADN recombinante (por ejemplo situado en o junto a la 5' UTR o la 3' UTR), y/o después de la secuencia codificadora de proteína y antes de la señal de poliadenilación. En una modalidad, hay uno o más elementos ARNsi-mts situados entre la secuencia codificadora de proteína y la secuencia de poliadenilación, es decir, 3' con respecto a la secuencia codificadora de proteína y adyacente a la misma. En otra modalidad, uno o más elementos ARNsi-mts están situados entre el codón de terminación de la secuencia codificadora de proteína y la secuencia de poliadenilación. En otra modalidad, uno o más elementos ARNsi-mts están situados dentro de la secuencia 3' UTR adyacente a la secuencia codificadora de proteína.

La secuencia de ADN del elemento ARNsi-mts se puede variar utilizando diferentes combinaciones y ubicaciones de las secuencias individuales de ARNsi-mts y/o incorporando 1-3 apareamientos erróneos de nucleótidos en un elemento ARNsi-mts (con respecto a una secuencia dada de ARNsi-mts). Se presentan aquí ejemplos de elementos ARNsi-mts con los títulos SEQ ID NO: 57-94 y 96-104 y en los Ejemplos de trabajo. Un elemento ARNsi-mts puede funcionar en cualquier dirección, es decir que es no direccional y, por tal motivo, se lo puede utilizar en la orientación 5' a 3? en la orientación 3' a 5' en un constructo de ADN recombinante.

Los elementos ARNsi-mts, secuencias de ARNsi-mts y los ARNsi-mts pueden ser identificados por métodos conocidos por las personas con capacitación en la técnica, como por ejemplo por medio de análisis bioinformático del ARNs de la planta y genotecas de ADNc. En los Ejemplos expuestos más adelante se presenta un ejemplo de ese método de identificación. En particular, el ARNsi-mts y las secuencias de ARNsi-mts pueden ser identificados de genotecas de ARNs. Las secuencias identificadas de ARNsi-mts se pueden comparar con el ADNc y/o colecciones de secuencias genómicas para identificar los elementos ARNsi-mts (es decir, las regiones de ADN que incluyen por lo menos una, por lo menos dos, por lo menos tres o más de tres secuencias de ARNsi-mts dentro de una ventana de secuencia de 500 nucleótidos), que sirven para desarrollar constructos de ADN recombinante de acuerdo con lo descripto en la presente.

En algunas modalidades, estos elementos ARNsi-mts son sintetizados o modificados in vitro para que contengan más, menos o diferentes secuencias de ARNsi-mts y/o para reubicar la posición relativa de una o más secuencias de ARNsi-mts, donde dicha modificación es ventajosa para aumentar o reducir el efecto del elemento ARNsi-mts. Los métodos para sintetizar o para la modificación in vitro de un elemento ARNsi-mts y para determinar la variación óptima para el nivel de supresión deseado son conocidos por las personas con capacitación en la técnica. También se pueden diseñar elementos ARNsi-mts quiméricos utilizando métodos conocidos por las personas con capacitación en la técnica, como por ejemplo insertando secuencias de ARNsi-mts adicionales ventajosas internamente en un elemento ARNsi-mts o ligando secuencias de ARNsi-mts adicionales 5' o 3' con respecto a un elemento ARNsi-mts. Entre las modalidades no excluyentes de un elemento ARNsi-mts quimérico se cuentan elementos ARNsi-mts que tienen aproximadamente 80 nt, aproximadamente 100 nt, aproximadamente 150 nt, aproximadamente 200 nt, aproximadamente 250 nt o aproximadamente 300 nt de SEQ ID NO: 86; aproximadamente 80 nt, aproximadamente 100 nt, aproximadamente 150 nt, aproximadamente 200 nt, aproximadamente 250 nt o aproximadamente 300 nt de SEQ ID NO: 87; y/o aproximadamente 80 nt, aproximadamente 100 nt, aproximadamente 150 nt, aproximadamente 200 nt, aproximadamente 250 nt, aproximadamente 300 nt, aproximadamente 350 nt, aproximadamente 400 nt, aproximadamente 450 nt, aproximadamente 500 nt o aproximadamente 550 nt de SEQ ID NO: 85. En los Ejemplos de trabajo se presentan otras modalidades.

El constructo de ADN recombinante se puede utilizar para suprimir en forma selectiva la expresión de la proteína recombinante en los tejidos reproductores masculinos de una planta transgénica que expresan el constructo, es decir, que dan lugar a la expresión en por lo menos los tejidos vegetativos, aunque no en los tejidos reproductores masculinos. En el presente contexto, "expresión de una proteína recombinante" se refiere a la producción de una proteína recombinante a partir de una secuencia codificadora de proteína el transcripto así obtenido (ARNm) en una célula. En el presente contexto el término "suprimir" se refiere a reducir; por ejemplo, suprimir la expresión de una proteína recombinante significa reducir el nivel de proteína recombinante producido en una célula, por ej., por medio de la supresión post-transcripción de genes mediada por ARNi.

La supresión selectiva de proteína recombinante se refiere, en el presente contexto, a una reducción de la producción de proteínas recombinantes en una célula o tejido en comparación con una célula o tejido de referencia de por lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 85%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95% o por lo menos aproximadamente 99%. Una célula o tejido de referencia puede ser, por ej., una célula o tejido vegetativo de la misma o planta transgénica o de otra similar que expresa la proteína recombinante o, por ejemplo, una célula o tejido vegetativo de una planta transgénica que tiene un transgén similar o que expresa la proteína recombinante pero carece del elemento ARNsi-mts. La supresión de la expresión de proteínas se puede determinar empleando cualquier método conocido por las personas con capacitación en la técnica, como por ejemplo midiendo directamente la acumulación de la proteína en una muestra de células tejidos utilizando una técnica tal como ELISA o análisis de western blot, midiendo la actividad enzimática de la proteína o determinando por fenotipos la expresión de la proteína. En una modalidad, la supresión selectiva de proteínas recombinantes se refiere a una reducción suficiente de la expresión de una proteína recombinante con capacidad para conferir tolerancia a los herbicidas en e tejido masculino de una planta transgénica, que da lugar a un fenotipo detectable de fertilidad masculina alterada en una planta transgénica a la cual se aplicara el herbicida en forma de rocío esterilizador. La detección de la fertilidad masculina alterada en esa planta transgénica indicaría, por lo tanto, la supresión selectiva de la proteína recombinante.

En el presente contexto, el término "secuencia codificadora de proteína" se refiere a una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptido o proteína, es decir, una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína recombinante. Dependiendo de las condiciones, la secuencia de nucleótidos puede o no traducirse en realidad en una molécula polipeptídica en una célula. Los límites de una secuencia codificadora de proteína están delineados por lo general por un codón de iniciación de la traducción en el término 5' y un codón de terminación de la traducción en el término 3'. Una secuencia codificadora de proteína de la invención incluye, aunque no a modo de limitación, una secuencia codificadora de proteína que otorga una característica conveniente asociada a la morfología, fisiología, crecimiento y desarrollo, rendimiento, mejora nutricional, resistencia a las enfermedades o plagas, tolerancia a los herbicidas o tolerancia ambiental o química. En una modalidad, una secuencia codificadora de proteína de la invención codifica una proteína recombinante que, al expresarse en una planta transgénica, confiere tolerancia a los herbicidas por lo menos en una célula y/o tejido en que aparece la proteína expresada; la supresión selectiva de la proteína de tolerancia a los herbicidas en el tejido reproductor masculino de la planta transgénica junto con la aplicación oportuna del herbicida da lugar a por lo menos macho fertilidad reducida o a la macho esterilidad. Dicha macho esterilidad, combinada con la tolerancia vegetativa a los herbicidas puede ser aprovechada para aumentar la eficiencia con la cual se producen semillas híbridas, por ejemplo eliminando o reduciendo la necesidad de emascular físicamente la planta de maíz utilizada como hembra en una cruza determinada durante la producción de semillas híbridas. Los sistemas de herbicida-macho-esterilidad inducible han sido descriptos, por ejemplo, en la Pat. de EE.UU. No.6.762.344 y en la Sol. de Pat. de EE. UU 2011/0126310. Entre los ejemplos de herbicidas útiles para poner en práctica la invención se incluyen, aunque no a modo de limitación, los inhibidores de la acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) {por ej., fops y dims), inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) (por ej., sulfonilureas (SUs) e imidazolinonas (IMIs)), inhibidores del fotosistema II (PSII) (por ej., triazinas y éteres fenílicos), inhibidores de la protoporfirinógeno oxidasa (PPO) (por ej., flumioxazina y fomesafeno), inhibidores de la 4— hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) {por ej., isoxaflutol y tricetonas tales como mesotriona), inhibidores de la 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS) (por ej., glifosato), inhibidores de la glutamina sintetasa (GS) {por ej., glufosinato y fosfinotricina), auxinas sintéticas {por ej., 2,4-D y dicamba). Los ejemplos de secuencia codificadora de proteínas y/o proteínas recombinantes para usar en la práctica de la invención incluyen, aunque no a modo de limitación, genes que codifican proteínas recombinantes que confieren tolerancia a los inhibidores de la HPPD (como por ejemplo HPPD insensible a los herbicidas), genes que codifican proteínas recombinantes que confieren tolerancia al glufosinato (tale como pat y bar), genes que codifican proteínas recombinantes que confieren tolerancia al glifosato (como por ejemplo la EPSPS tolerante al glifosato conocida como CP4-EPSPS, que se presenta aquí como SEQ ID NO: 95) y genes que codifican proteínas recombinantes que confieren tolerancia al dicamba (tal como la dicamba monooxigenasa (DMO)).

Los constructos de ADN recombinante de la invención se preparan por métodos conocidas en la técnica y en diversas modalidades se los incluye un vectores de transformación de plantas, plásmidos y ADN plastidial. Dichos constructos de ADN recombinante son útiles para producir plantas y/o células transgénicas y, por ello, también pueden estar contenidos en el ADN genómico de una planta, semilla, célula o parte de planta transgénica. Por lo tanto, la presente invención incluye modalidades en las cuales el constructo de ADN recombinante está situado dentro de un vector de transformación o en una partícula biolística para la transformación de una célula vegetal o dentro de un cromosoma o plastidio de una célula vegetal transgénica o dentro de una célula transgénica, tejido vegetal transgénico, semilla de planta transgénica, grano de polen transgénico o una planta transgénica o parcialmente transgénica (por ej., injertada). Un vector es cualquier molécula de ADN que se pueda utilizar con el propósito de transformación de plantas, es decir, para la introducción de ADN en una célula. Los constructos de ADN recombinante de la invención se pueden insertar, por ejemplo, en un vector de transformación de plantas y utilizar para producir plantas, semillas y células transgénicas. Los métodos para construir vectores de transformación de plantas son conocidos en la técnica. Los vectores de transformación de plantas de la invención incluyen en general, aunque no a modo de limitación, un promotor adecuado para la expresión de un ADN operativamente ligado, un constructo de ADN recombinante operativamente ligado y una señal de poliadenilación (que puede estar incluida en una secuencia de 3'UTR). Los promotores útiles para poner en práctica la invención incluyen los que funcionan en una planta para la expresión de un polinucleótido operativamente ligado. Dichos promotores son variados y muy conocidos en la técnica e incluyen los que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos, temporalmente regulados, espacialmente regulados y/o espacie—temporalmente regulados. Otros componentes opcionales incluyen, aunque no a modo de limitación, uno o más de los siguientes elementos: 5' UTR, potenciador, elemento de acción en cis, intrón, secuencia señal, secuencia de péptido de tránsito y uno o más genes marcadores seleccionables. En una modalidad, un vector de transformación de plantas comprende un constructo de ADN recombinante.

Los constructos de ADN recombinante y los vectores de transformación de plantas de la presente invención se preparan por cualquier método adecuado para la aplicación a que están destinados, tomando en cuenta, por ejemplo, el tipo de expresión pretendida, la secuencia codificadora de proteína (y por consiguiente tolerancia a los herbicidas) pretendida y la conveniencia para utilizarlos en la planta en la cual se ha de expresar el constructo de ADN recombinante. Los métodos generales útiles para manipular moléculas de AND para la preparación y uso de constructos de ADN recombinante y vectores de transformación de plantas son muy conocidos en la técnica y han sido descriptos en detalle, por ejemplo, en textos y manuales de laboratorio incluyendo el de Sambrook y Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (tercera edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001. Los constructos de ADN recombinante de la invención pueden ser modificados por métodos conocidos en la técnica, ya sea completamente o en parte, por ejemplo, para mayor conveniencia de la manipulación de ADN (tales como sitios de reconocimiento de enzimas de restricción o sitios de clonación basada en la recombinación) o para incluir secuencias preferidas para plantas (tales como el uso de codones de plantas o secuencias consensúales de Kozak) o para incluir secuencias útiles para el diseño de constructos de ADN recombinante (tales como secuencias espaciadoras o ligantes). En ciertas modalidades, la secuencia de ADN del constructo de ADN recombinante incluye una secuencia de ADN cuyos codones se han optimizado para la planta en la cual se ha de expresar el constructo de ADN recombinante. Por ejemplo, se pueden optimizar los codones de la totalidad o parte de la secuencia de una planta para la expresión en una planta por métodos conocidos en la técnica. Los constructos de ADN recombinante de la invención pueden ser apilados con otro ADN recombinante para impartir rasgos adicionales (por ej., en el caso de las plantas transformadas, rasgos que incluyen resistencia a los herbicidas, resistencia a las plagas, tolerancia a la germinación en frío, tolerancia al déficit de agua) por ejemplo, mediante la expresión o supresión de otros genes.

Células de plantas transgénicas y plantas transqénicas Un aspecto de la invención incluye células de plantas transgénicas, tejido vegetal transgénico y plantas o semillas transgénicas que incluyen un constructo de ADN recombinante de la invención. Un aspecto adicional de la invención incluye cromosomas vegetales artificiales o recombinantes que incluyen un constructo de ADN recombinante de la invención. Los métodos adecuados para la transformación de células vegetales huéspedes para usar con la presente invención incluyen virtualmente cualquier método por el cual se pueda introducir ADN en una célula (por ej., donde un constructo de ADN recombinante está integrado de manera estable en un cromosoma vegetal) y son muy conocidos en la técnica. Un método ilustrativo y de uso generalizado para introducir un constructo de ADN recombinante en plantas es el sistema de transformación de Agrobacterium, que es muy conocido por las personas con capacitación en la técnica. Las plantas transgénicas se pueden regenerar a partir de una célula vegetal transformada por los métodos de cultivo de células vegetales. Se puede obtener una planta transgénica homocigota con respecto a un transgén mediante su apareamiento sexual (autofecundación) de una planta transgénica segregante independiente que contiene una única secuencia de gen exógeno consigo misma, por ejemplo una planta F0, para producir semillas F1. Un cuarto de la semilla F1 producida es homocigota con respecto al transgén. Las plantas cultivadas de semillas F1 en germinación pueden ser analizadas para determinar su heterocigosidad, por lo general utilizando un ensayo SNP o un ensayo de amplificación térmica que da lugar a la distinción entre heterocigotas y homocigotas (es decir, un ensayo de cigosidad).

La invención presenta una planta transgénica que tiene, en su genoma, un constructo de ADN recombinante de la invención, incluyendo, aunque no a modo de limitación, alfalfa, algodón, maíz, cañóla, arroz, soja y trigo, entre otras. La invención presenta además, células de planta transgénica, partes de planta y la progenie de dicha planta transgénica. En el presente contexto, la "progenie" incluye cualquier planta, semilla, célula vegetal y/o parte de una planta producida o regenerada a partir de una planta, semilla, célula vegetal y/o parte de una planta que incluía un constructo de ADN recombinante de la invención. Las plantas transgénicas, células, partes y semillas producidas de dichas plantas pueden ser homocigotas o heterocigotas para el constructo de ADN recombinante de la invención.

También se incluye en la presente invención modalidades en las cuales el constructo de ADN recombinante se encuentra en un producto de consumo producido a partir de una planta, semilla o parte de planta transgénica de la presente invención; dichos productos de consumo incluyen, aunque no a modo de limitación, partes de una planta, granos o semillas triturados o enteros de una planta o cualquier producto alimenticio o no alimenticio que comprenda el constructo de ADN recombinante de la presente invención.

Métodos para Inducir la macho-esterilidad en plantas transgénicas y para producir semillas Híbridas Otro aspecto de la invención incluye un método para inducir macho esterilidad en una planta transgénica que incluye aplicar una cantidad efectiva de un herbicida a una planta transgénica que incluye un constructo de ADN recombinante que incluye una secuencia codificadora de proteína que codifica una proteína recombinante que confiere a la planta transgénica tolerancia a los herbicidas operativamente ligada a una secuencia de ADN que incluye un elemento ARNsi-mts que confiere a la planta transgénica por lo menos tolerancia vegetativa a los herbicidas, donde la aplicación del herbicida se lleva a cabo durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta transgénica, para inducir así macho esterilidad en la planta transgénica.

En una modalidad, la planta transgénica es una planta de maíz. En una modalidad, la aplicación del herbicida previene por lo menos la diseminación del polen o la extrusión de las anteras. En una modalidad, el desarrollo del tejido reproductor masculino es una etapa seleccionada del grupo que consiste en la etapa V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 , V12, V13 y V14 del desarrollo de la planta de maíz.

En una modalidad, el herbicida es seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de la acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa), inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS), inhibidores del fotosistema II (PSII), inhibidores de la protoporfirinógeno oxidasa (PPO), inhibidores de la 4-hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD), inhibidores de la 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS), inhibidores de la glutamina sintetasa (GS) y auxinas sintéticas. En una modalidad, el herbicida es glifosato y la proteína recombinante es una EPSPS tolerante al glifosato.

Un aspecto adicional de la invención incluye un método para producir semillas híbridas que incluye: (a) aplicación de herbicida a una planta transgénica que incluye un constructo de ADN recombinante que contiene una secuencia codificadora de proteína que codifica una proteína recombinante que confiere a la planta transgénica tolerancia a los herbicidas operativamente ligada a una secuencia de ADN que incluye un elemento ARNsi-mts, donde la aplicación del herbicida se lleva a cabo durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta transgénica, para inducir así macho esterilidad en la planta transgénica; (b) la fertilización de la planta transgénica con el polen de una segunda planta y (c) la cosecha de la semilla híbrida de la planta transgénica. En una modalidad, la planta transgénica es de maíz. En una modalidad, el herbicida es glifosato y la proteína recombinante es una EPSPS tolerante al glifosato. En una modalidad, el glifosato es aplicado durante el desarrollo en una dosis efectiva de aproximadamente 0.125 libras de equivalente ácido por acre (0.14 kg/ha) a aproximadamente 8 libras de equivalente ácido por acre (8.97 kg/ha).

Otro de los aspectos de la invención incluye semilla híbrida cosechada de una planta transgénica macho-estéril que ha sido fertilizada con el polen de una segunda planta, donde la planta transgénica macho-estéril incluye un constructo de ADN recombinante que incluye una secuencia codificadora de proteína que codifica una proteína recombinante que confiere a la planta transgénica tolerancia a los herbicidas, operativamente ligada a una secuencia de ADN que incluye un elemento ARNsi-mts y donde se ha inducido la macho-esterilidad en la planta transgénica mediante la aplicación de una cantidad efectiva de herbicida durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de la planta transgénica. En una modalidad, la semilla híbrida es semilla híbrida de maíz transgénico. En una modalidad, el herbicida es glifosato y la proteína recombinante es una EPSPS tolerante al glifosato. En una modalidad, el glifosato es aplicado durante el desarrollo en una dosis efectiva de aproximadamente 0.125 libras de equivalente ácido por acre (0.14 kg/ha) a aproximadamente 8 libras de equivalente ácido por acre (8.97 kg/ha). En una modalidad, la aplicación del herbicida previene por lo menos la diseminación del polen o la extrusión de las anteras. En una modalidad, el desarrollo del tejido reproductor masculino es una etapa seleccionada del grupo que consiste en la etapa V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13 y V14 del desarrollo de la planta de maíz.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Este ejemplo describe la identificación de los elementos ARNsi-mts y los elementos ARNsi-mts. El análisis bioinformático de los datos de secuenciación de múltiples bibliotecas de pequeño ARN de maíz identificó un grupo de pequeños ARN (ARNs) que estaban enriquecidos o específicamente expresados en la panoja de maíz. La abundancia relativa de estos ARNsi-mts en las panojas de maíz oscilaba entre aproximadamente 50 y 631 transcriptos por cuarto de millón de secuencias, que es la abundancia normalizada. Estos ARNs se identifican como ARNsi debido a su longitud (18-26 nucleótidos) y su probable origen de un precursor de ARNds. Debido a su patrón de expresión, se hace referencia a los ARNsi específicos de tejidos masculinos como "ARNsi-mts". En el presente contexto, un "patrón de expresión" es cualquier patrón de expresión diferencial de ADN, ARN o proteína. Por ejemplo, un patrón de expresión específico de las panojas se refiere a una expresión específica o enriquecida de ADN, ARN o proteína en un tejido y/o célula de la panoja. Los ejemplos de la correspondiente secuencia de ADN de los ARNsi-mts, a las que en la presente se hace referencia como "secuencias de ARNsi-mts", llevan el título SEO. ID NO: 1-56 y 105-149.

A continuación se compararon estas secuencias de ARNsi-mts con colecciones de secuencias de ADNc. Una comparación de secuencias del ARNsi-mts contra una colección de unigén de maíz (secuencias compiladas de ADNc) utilizando BLAST arrojó el sorprendente resultado de que un gran número de ARNsi-mts estaba acumulado e incluso superpuesto, dentro de una región del ADN encontrada en varias secuencias estrechamente relacionadas, aunque distintas, de ADNc. Todo el grupo de secuencias de ADNc contenía esa región, si bien la secuencia de AND de la región variaba debido a las diferentes combinaciones y ubicaciones de las secuencias individuales de ARNsi-mts y/o 1-3 apareamientos erróneos de nucleótidos con las secuencias individuales de ARNsi-mts. Esa región que se define por tener por lo menos una secuencia de ARNsi-mts dentro de una ventana de secuencia nucleotídica, se denomina en la presente "elemento ARNsi-mts". En diversas modalidades, la ventana de la secuencia de nucleótidos incluye por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos contiguos (nt) (por ej., por lo menos 18, 19, 20, 21 , 22, 23 o 24 nt), por lo menos aproximadamente 25 nt, por lo menos aproximadamente 30 nt, por lo menos aproximadamente 40 nt, por lo menos aproximadamente 50 nt, por lo menos aproximadamente 100 nt o por lo menos aproximadamente 150 nt. En la presente se exponen ejemplos de la secuencia de ADN correspondiente a los elementos ARNsi-mts con el título SEQ ID NO: 57-94 y 96-104. Un elemento ARNsi-mts puede tener más de una secuencia de ARNsi-mts, por ejemplo, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco o más de cinco secuencias de ARNsi-mts dentro de una determinada ventana de la secuencia de nucleótidos. Dos o más secuencias de ARNsi-mts dentro de un elemento ARNsi-mts dado se pueden superponer porque por lo menos una porción de sus secuencias de nucleótidos es idéntica (remitirse a al cuadro 5 para ver ejemplos de ARNsi-mts con secuencias de nucleótidos superpuestas).

El análisis bioinformático indicó que se podían generar múltiples ARNsi-mts a partir del mismo transcripto de ARN, por ejemplo un transcnpto producido a partir de una de las secuencias de ADNc descriptas anteriormente que incluyen un elemento ARNsi-mts. También se encontraron que todos los ARNsi-mts tenían 1-3 malapareamientos en comparación con los elementos ARNsi-mts de todo el grupo de secuencias de ADNc estrechamente relacionadas. Se cree que esto indica que estos ARNsi-mts se generan a partir de múltiples transcriptos estrechamente relacionados que dan lugar a un gran grupo estrechamente relacionados de ARNsi-mts. Por consiguiente, un transcripto de ARN producido a partir de un ADNc que incluye un elemento ARNsi-mts (que contiene múltiples secuencias de ARNsi-mts) sería complementario, y por lo menos capaz de hibridarse a múltiples ARNsi-mtss y/o sus complementos. Por consiguiente, un ARNsi-mts de origen natural tiene una secuencia de ARN que es un complemento perfecto o casi perfecto de una secuencia de ARNsi-mts (por ej., donde el ARNsi-mts tiene una secuencia de ARN que no tiene más de aproximadamente 1-3 malapareamientos con respecto a la secuencia de ARNsi-mts); de ello se sigue que el mismo ARNsi-mts tiene una secuencia de ARN que es un complemento perfecto o casi perfecto de un segmento de un elemento ARNsi-mts.

Una búsqueda de similitud de secuencias de los ARNsi-mts en una base de datos de ADN genómico del maíz utilizando BLAST identificó múltiples loci con similitud significativa con el elemento ARNsi-mts. A continuación se analizaron estos loci para detectar marcos de lectura abiertos (ORFs), aunque no se encontró que los polipéptidos putativos identificados tuvieran homología significativa con ninguna proteína conocida. El análisis bioinformático de las secuencias de ADNc productoras de ARNsi-mts indicó que no había homología de secuencias significativa en el nivel nucleotídico con ningún gen vegetal. Estos datos sugieren que se podrían producir ARNsi-mts de dichos loci mediante el procesamiento del ARNds formado entre transcriptos de polaridad opuesta o mediante el procesamiento de ARNds de transcriptos aberrantes debido a la actividad de ARN polimerasa dependiente del ARN. También es posible el procesamiento de ARNsi-mts a partir de estructuras secundarias de ARNds que se pueden formar en algunos transcriptos productores de ARNsi-mts.

La transcripción inversa de los ARNsi-mts produjo secuencias de ARNsi-mts que fueron mapeadas sobre uno de los elementos ARNsi-mts (SEQ ID NO: 87). Esto está representado en la Figura 1 donde el eje X representa la posición de los nucleótidos de la orientación 5' a 3' de izquierda a derecha en la parte superior y de derecha a izquierda en la parte inferior. La abundancia relativa de los ARNsi-mts está dada en términos de transcriptos por cuarto de millón de secuencias (tpq) representadas en el eje Y. Como se puede apreciar en la Figura 1 , algunos ARNsi-mts (rodeados por círculos) están altamente representados en la biblioteca de ARNs específico de las panojas (eje Y). Las secuencias de ARNsi-mts previstas también están distribuidas de manera no uniforme en todos los elementos ARNsi-mts (eje X).

EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra el análisis de expresión endógena de las panojas de los ARNsi-mtss. Los patrones de expresión nativa in planta de los ARNsi-mts fueron analizados utilizando varios métodos diferentes. Estos análisis confirmaron que los ARNs que se hibridan a elementos ARNsi-mts están enriquecidos y/o se expresan específicamente en las panojas de todos los germoplasmas de maíz (es decir, que los ARNsi-mts están enriquecidos y/o se expresan específicamente en las panojas) y que, en una modalidad, un ARNsi-mts está enriquecido y/o se expresa específicamente en el grano de polen en la etapa de microesporas uninucleadas del desarrollo del polen.

Para demostrar la acumulación in planta específica de las panojas del ARNsi-mts, se utilizaron tres secuencias de ARNsi-mts representativas (SEQ ID NO: 26 (1372590), SEQ ID NO: 8 (648011), SEQ ID NO: 33 (410590)) para diseñar sondas para el análisis de northern blot de bajo peso molecular (LMW) de ARNs preparados del maíz o arroz. Para estos experimentos, se extrajo ARN total del tejido vegetal empleando el reactivo TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se desnaturalizó ARN (7.5 pg) de cada muestra a 95°C durante 5 minutos antes de la separación en un gel de PAGE al 17% que contenía urea 7 M en 0.5X buffer TBE (Alien et al. (2004) Nature Genetics 36:1282-1290). Después de la electroforesis, se transfirió el gel a una membrana Nytran SuPerCharge® (Whatman-Schleicher & Schuell, Florham Park, NJ) usando una Celda de Transferencia Electroforética Semi-seca Trans-Blot® SD (Bio-Rad, Hercules, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se entrecruzó la transferencia así obtenida a 1200 microjoules/cm2 x 100 en un Stratalinker® 1800 (Stratagene, Cedar Creek, TX). Para preparar las sondas, se generó una plantilla de sondas de ARN por PCR que contenía el promotor T7 en un extremo y una de las pequeñas secuencias de ARN en el extremo opuesto. La secuencias de ARNs incorporadas a la plantilla de sondas de ARN incluían: [1] Gma-miR159a (número de acceso a miRBase.org MI0001773), que fue utilizada como control para la carga; [2] sR1372590 (SEQ ID NO: 26); [3] sR648011 (SEQ ID NO: 8) y [4] sR410590 (SEQ ID NO: 33). Se transcribieron sondas de ARN utilizando ARN polimerasa T7 y se las marcó con digoxigenina (DIG) utilizando el DIG Northern Starter Kit (Roche, Indianapolis, IN), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se llevó a cabo la hibridación con 100 ng de la sonda marcada con DIG en el buffer de hibridación PerfectHyb™ (Sigma, St. Louis, MO) a 38°C por espacio de 16 h. Se realizó la detección con el DIG Northern Starter Kit de acuerdo con el protocolo del fabricante, antes de la exposición a película Kodak ® Biomax™ XAR (Sigma, St. Louis, MO). Las muestras analizadas incluían todas o una subserie de las siguientes: hojas de maíz de plantas cultivadas bajo estrés de nitrógeno, brotes de maíz, raíz o endosperma de plantas cultivadas bajo estrés por fío, hojas y raíces de maíz de plantas cultivadas bajo estrés por sequía, estigmas de maíz, panojas jóvenes de maíz, panojas maduras de maíz, granos de maíz sin polinizar, embriones de maíz -24 días después de la polinización (DAP); granos de maíz - 22 DAP; granos de maíz maduros; granos (secos maduros -embriones de maíz; endosperma de maíz - seco; granos de arroz y plántulas de arroz. Los resultados obtenidos con el análisis northern LMW utilizando por lo menos tres sondas diferentes de ARNsi-mts (sR1372590, sR648011 y sR410590) exhibieron señal sólo en las bandas correspondientes a las panojas jóvenes y bandas de panojas maduras, confirmando el análisis bioinformático y la conclusión de que la expresión de ARNsi-mts está muy enriquecida en el tejido de la panoja o es específica del mismo.

La especificidad tisular y la acumulación de ARNs que reconocería un elemento ARNsi-mts fue evaluada en todo un amplio espectro de germoplasmas de maíz utilizando el análisis northern LMW. Para este análisis se seleccionó un elemento ARNsi-mts (SEQ ID NO: 87, que contiene múltiples secuencias de ARNsi-mts). Este elemento ARNsi-mts incluye las tres secuencias de ARNsi-mts empleadas para diseñar las sondas de ARNsi sR1372590, sR648011 y sR410590, lo que habilita el uso de estas sondas para el análisis northern LMW de las muestras de germoplasma del maíz. Para estos experimentos, se preparó ARN de veinte líneas endogámicas diferentes de maíz con diversos antecedentes genéticos, por ejemplo con una madurez relativa clasificada de 83 a 120 (cuadro 1). En el caso de tres de estas líneas endogámicas (91 DUA6, 01 DKD2 y LH244), se recogió el tejido de panoja joven, panoja vieja, hoja, mazorca y raíz. El cuadro 1 expone la correspondiente etapa V y el tamaño de las panojas en el momento de la recolección de las panojas jóvenes y las panojas viejas. Se extrajo ARN total utilizando la solución TRIzol®. Se aisló ARN LMW con el kit de aislamiento de ARNmi mirVana™ (No. cat. AM1560, Ambion, Austin, TX). El análisis northern LMW se realizó utilizando un gel de TBE al 15%-urea acrilamida Bic—Rad Criterion™ Precast (No. cat. 345-0092, BioRad, Hercules, CA). Se transfirió el gel a una membrana con carga positiva (No. cat. 11209272, Roche Applied Systems, Mannheim, Alemania). Las sondas fueron marcadas con (1) cebadores 32-P-aleatorios o (2) con DIG ADN utilizando el kit de marcación para PCR de Roche o (3) con la sonda de ARN DIG ante descripta. Todas las sondas empleadas para sondear los northern blots fueron el complemento inverso a la transcripción endógena o la secuencia de ADNc del elemento ARNsi-mts. La presencia de ARNs que se hibridó al elemento transgénico ARNsi-mts fue específica de la panoja; no se detectó señal para la hoja, mazorca o raíz de ninguno de los genotipos de maíz endogámico 91 DUA6, 01 DKD2 y LH244 (Figura 2).

Para determinar el patrón de expresión temporal durante el desarrollo de las panojas de los ARNs que reconocerían un elemento ARNsi-mts (SEQ ID NO: 87), se realizó el análisis northern LMW. Se preparó ARN de panojas jóvenes y viejas de diferentes líneas endogámicas de maíz; ver el cuadro 1 . La preparación del ARN y las técnicas de northern LMW fueron esencialmente las descriptas anteriormente.

CUADRO 1 Germoplasma endogámico, clasificación de madurez y etapa de desarrollo de las panojas Como se aprecia en la Figura 4, una sonda de ARN marcada con DIG que corresponde al complemento inverso de un elemento ARNsi-mts (SEQ ID NO: 87) se hibridó al ARNs tanto en la panoja joven como en la vieja, con la excepción de la panoja joven de 2.5 pulgadas a 3 pulgadas(6.35-7.62cm) de longitud: calles 5 (DIDA404 endogámica), 9 (JED0115 endogámica), 10 (FIDA240 endogámica), 16 (DIDA403 endogámica), 17 (64DJD1 endogámica), 18 (DIQ423 endogámica) y 20 (LH244 endogámica). Además, este experimento confirmó la falta de detección de ARNs que se hibride al elemento ARNsi-mts de las muestras de hojas (calles 21 y 22) o las mazorcas (calles 23 y 24) de las endogámicas BIQA208 y LH244. En su conjunto, estos datos indican que los ARNs que se hibridan al elemento ARNsi-mts se expresan específicamente en la panoja de cada genotipo endogámico analizado cuando la panoja es de más de aproximadamente 3.5 pulgadas (8.89 cm).

Se realizó el análisis de hibridación \n situ para investigar la expresión específica de las células de una secuencia de ARNsi-mts (sR648011 , SEQ ID NO: 8). En las anteras de maíz, se producen microesporas por medio de la meiosis y se desarrollan hasta formar polen maduro. La microesporogénesis del maíz se puede dividir, a grandes rasgos, en las siguientes etapas: meiosis de las células esporógenas, liberación de tétradas en forma de microesporas libres, mitosis de as microesporas uninucleadas para producir polen tricelular y granos de polen maduros. Para estos experimentos, se utilizó la panoja del maíz anterior a la antesis, obtenida de plantas de maíz cultivadas en condiciones standard en un invernadero. Se utilizaron sondas de ácido nucleico cerrado (LNA o Locked Nucleic Acid) (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) como se indica más adelante, donde la posición de la LNA está indicada por un símbolo '+'. La sonda no codificadora estaba destinada a detectar el ARNsi-mts correspondiente a SR64801 1 (SEQ ID NO: 8) (5 -Biotina- CAT+GCA+CTG+GTG+AGT+CAC+TGT-3'), en tanto que la sonda codificadora era el complemento inverso de la sonda no codificadora (5 -Biotina-ACA+GTG+ACT+CAC+CAG+TGC+ATG-3') para usar como control negativo. Las sondas LNA permiten lavados de alta rigurosidad y, por lo tanto, garantizan la hibridación muy específica (Válóczi et al. , 2006; Nuovo et al., 2009). Todas las sondas fueron marcadas con biotina. Se fijaron las muestras de panojas de maíz en paraformaldehído al 4% en 1 *PBS a 4°C por espacio de 36 h y luego se las deshidrató a 4°C por medio de una serie graduada de etanol:H20. A continuación se colocaron las panojas en EtOH al 75% e Histociear al 25% (National Diagnostics, Atlanta, GA) durante 1 ,5 h, EtOH al 50% e Histociear al 50% por espacio de 1 ,5 h, EtOH al 25% e Histociear al 75% durante 1 ,5 h e Histociear al 100% durante 3x1 ,5 h, todo a 25°C. A continuación, se reemplazó gradualmente el Histociear con paraplast fundido a 50°C y se transfirieron las panojas a moldes y se las almacenó a 4°C antes de seccionarlas. Se seccionaron las panojas embebidas en parafina en un micrótomo a un espesor de 8 µ??. Se efectuó una serie de secciones de las mismas anteras y luego se utilizaron secciones adyacentes para sondear con la sonda en el sentido codificador y no codificador, respectivamente. Se llevó a cabo la prehibridación y la hibridación a 42°C y el lavado a 55°C. La detección de las sondas LNA marcadas con biotina reasociadas a los transcriptos se realizó con una dilución de 1 a 400 de Fosfatasa Alcalina anti-biotina (AP) y Sustrato Purple AP BM (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Se capturaron imágenes de una cámara en un microscopio Olympus (Center Valley, PA). Se dividieron las secciones de las mismas anteras en dos grupos - uno fue utilizado para la sonda antisentido (Figura 5, panel izquierdo) y el otro para la sonda sentido (Figura 5, panel derecho). La señal de hibridación (violeta oscuro) fue detectada únicamente en las secciones que se hibridaron a la sonda antisentido, pero no en las incubadas con la sonda sentido (Figura 5). La fuerte señal obtenida con la sonda antisentido indica que este ARNsi-mts era abundante (altamente expresado) en el grano de polen en la etapa de microesporas uninucleadas del desarrollo del polen.

EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra constructos para la transformación de plantas y la producción de plantas transgénicas. Se incorporó un elemento ARNsi-mts en la 3'UTR de un cassette de expresión del transgén y se la utilizó para producir plantas de maíz transgénico para evaluar el efecto del elemento sobre la expresión del transgén en las plantas transgénicas. Se insertó un elemento ARNsi-mts (SEQ ID NO: 87) en la 3'UTR de un cassette de expresión del transgén CP4-EPSPS para la transformación del maíz. Este elemento ARNsi-mts fue elegido debido a su abundante contenido de secuencias de ARNsi-mts (Figura 3), incluyendo secuencias correspondientes a tres de las sondas de ARNsi (sR1372590, SR648011 y SR410590) utilizadas para el análisis northern LMW del Ejemplo 2. Este elemento ARNsi-mts también permitió evaluar el efecto de los malapareamientos de ARNsi-mts. El elemento ARNsi-mts aquí analizado (SEQ ID NO: 87) tiene un cambio de un nucleótido (CAT: AAGCTATTGATTCCCTAAGTGCCA) en comparación con una se las secuencias de ARNsi-mts subyacentes (SEQ ID NO: 33, utilizadas para diseñar la Sonda sR410590). El elemento ARNsi-mts fue insertado en el cassette del transgén en la orientación de complemento inversa con respecto a su posición en el ADNc endógeno, aunque se cree que el elemento funciona de manera similar en ambas orientaciones, puesto que se puede encontrar complementariedad de las secuencias de ARNsi específico de las panojas con cualquiera de las hebras del elemento ARNsi-mts en la panoja del maíz (Figuras 1 y 3).

Se construyeron varios cassettes de expresión de CP4-EPSPS/elemento ARNsi-mts (cuadro 2) y se los utilizó para transformar plantas de maíz. Se analizaron diferentes combinaciones de elementos de expresión en los cassettes de expresión de CP4-EPSPS/ elemento ARNsi-mts. Los elementos de expresión tales como promotores, guías, ¡ntrones, péptidos de tránsito de cloroplastos y 3'UTR's necesarios para la expresión eficiente y estable de un transgén son muy conocidos en la técnica. Los cassettes de expresión de CP4-EPSPS/elemento ARNsi-mts fueron diseñados de manera que incluyeran uno de dos promotores individuales, operativamente ligado a un ADN de una de las dos guías individuales, operativamente ligado a un ADN de uno de los dos intrones; operativamente ligado a una de las dos moléculas de ADN que codifican el mismo péptido de transito de cloroplasto (CTP); operativamente ligado a una molécula de ADN derivada de un gen aroA de la cepa de Agrobacteríum sp. CP4 y que codifica la proteína CP4-EPSPS; operativamente ligado un ADN que codifica un elemento ARNsi-mts; operativamente ligado a una de dos moléculas de ADN 3'UTR. El constructo 4 contenía el gen CP4-EPSPS de tipo salvaje y todos los demás vectores contenían una versión con codones optimizados de una planta del gen CP4-EPSPS. Los constructos 3, 5 y 6 (cuadro 2) fueron diseñados para determinar si un elemento ARNsi-mts incorporado a la 3'-UTR produciría plantas con sensibilidad al glifosato específica de las panojas y tolerancia vegetativa al glifosato. Los constructos 4 y 7 son constructos control, que carecen de un elemento ARNsi-mts.

CUADRO 2 Constructos para transformación de plantas Se produjeron plantas transgénicas de maíz transformadas con uno de cada uno de los cinco cassettes utilizando métodos muy conocidos en la técnica. En pocas palabras, se transformaron células de maíz mediante transformación mediada por Agrobacterium con uno de cada uno de los constructos enumerados en el cuadro 2 (individualmente) y se las regeneró para obtener plantas intactas de maíz. Se seleccionaron plantas individuales de la población de plantas que exhibían integridad del cassette de expresión del transgén y resistencia al glifosato. Las plantas enraizadas con características fenotípicas normales fueron seleccionadas y transferidas al suelo para su cultivo y posterior evaluación. Las plantas R0 fueron transferidas al suelo para su desarrollo, rociadas con 0.75 libras/acre (0.84 kg/ha) de glifosato en la V3-V4 seguidas por 0.75 libras/acre (0.84 kg/ha) de glifosato en la V7-V9 y luego se las sometió a polinización cruzada con el polen de plantas de maíz no transgénicas del mismo germoplasma (en el caso de los eventos de constructos 3, 5 y 6) o autopolinización (en el caso de eventos de los constructos 4 y 7) para producir semillas R1. Seguidamente las plantas fueron seleccionadas mediante una combinación de técnicas analíticas, incluyendo TaqMan, análisis de PCR y tolerancia vegetativa al rocío de herbicida y fertilidad masculina reducida (conveniente) después del rocío del herbicida (glifosato).

EJEMPLO 4 Este ejemplo ilustra métodos para analizar plantas transgénicas en un invernadero. Las plantas transgénicas transformadas con los cassettes de expresión de CP4-EPSPS/elemento ARNsi-mts fueron analizadas para evaluar la tolerancia vegetativa al glifosato y la macho esterilidad. Se encontró que las plantas transgénicas generadas por los constructos que contenían los cassettes de expresión de CP4-EPSPS/elemento ARNsi-mts tenían tolerancia vegetativa al glifosato e inducían macho esterilidad con la aplicación tardía de glifosato.

Se cultivaron plantas RO por duplicado en el invernadero y se las dejó sin rociar o se las roció con 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) de glifosato en la etapa V6 (temprana) seguida por 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) de glifosato en la etapa V9 (tardía). (Figuras 7A-7E y cuadro 3) Los eventos R0 analizados fueron eventos de múltiples copias. Todas las plantas R0 que quedaron sin rociar tuvieron extrusión normal de las anteras y polen completamente fértil según se determinó por tinción de Alexander. Todas las plantas R0 que fueron rociadas tuvieron tolerancia vegetativa al glifosato. Las plantas R0 producidas por los constructos 4 y 7, que no contenían el elemento ARNsi-mts, no exhibieron sensibilidad de las panojas al glifosato ni macho esterilidad inducida. Las plantas RO producidas por los constructos 3, 5 y 6, que sí contenían el elemento ARNsi-mts, exhibieron sensibilidad de las panojas al glifosato y macho esterilidad inducida; estas plantas no tuvieron o tuvieron muy escasa extrusión de las anteras y >99% del polen fue no viable, según se determinó por tinción de Alexander.

CUADRO 3 Datos de rocío de glifosato Estas observaciones demostraron que la presencia del elemento ARNsi-mts en la 3'UTR de un cassette del transgén llevó al silenciamiento del transgén específico de las panojas. La pérdida específica de las panojas del transcripto de ARNm producido por el cassette de expresión de CP4-EPSPS/el ARNsi-mts dio origen a panojas que eran sensibles al glifosato, produciendo una planta con macho esterilidad inducida, en tanto que los demás tejidos de la planta eran tolerantes al glifosato, produciendo tolerancia vegetativa al glifosato y buena fertilidad femenina.

A continuación se utilizó la inmunolocalización para medir la proteína CP4-EPSPS en los tejidos de la planta transgénica. Se obtuvieron panojas de plantas transformadas con el constructo 3 o el constructo 4 u de maíz no transgénico (LH198). Las plantas fueron cultivadas en un invernadero con 14 horas de luz a 80°F (26.6X) y 8 horas de oscuridad a 70°F (21 ,1°C). Se plantó una semilla por maceta. Las macetas fueron dispuestas al azar en el piso del invernadero. Se regaron las plantas según la necesidad y se las fertilizó con una mezcla 20-20-20 de nitrógeno, potasio y fósforo, respectivamente. Las plantas procedentes del constructo 3 o el constructo 4 fueron rociadas con glifosato a razón de 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) en la etapa V2 para confirmar la tolerancia vegetativa al glifosato. Se cosecharon panojas jóvenes en la V10-V11 para obtener tejidos de las anteras en las etapas de células madres de microesporas y microesporas libres; las panojas maduras fueron cosechadas en la etapa T7, 1-2 días antes de la diseminación del polen, para obtener tejidos de las anteras con polen completamente desarrollado. Se extrajeron las anteras de las espiguillas de la panoja utilizando pinzas de disección y se las fijó inmediatamente en formaldehído al 3.7% en salina con buffer de fosfato (PBS) bajo vacío suave. Después de lavarlos en PBS, se colocaron los tejidos en medio de incrustación y se los congeló de inmediato. Se almacenaron los bloques de tejido congelados a -80°C hasta seccionarlos en el micrótomo a -20°C y colectarlos en los portaobjetos cargados.

Se bloquearon secciones de tejido con agente de bloqueo (suero de cabra normal al 10%, seroalbúmina bovina al 5%, Tritón X-100 al 0.1 % en PBS) por espacio de 2 horas. Se incubaron las secciones con anticuerpo anti-CP4-EPSPS (1/500 en PBS). Después de lavar las secciones tres veces en PBS, se incubaron las secciones de tejido con el anticuerpo secundario, IgG de cabra anti-ratón con el fluoróforo Alexa 488 (Invitrogen, Eugene, Oregon). Para incluir un control negativo, se omitió la incubación del anticuerpo CP4-EPSPS. Como control positivo, se utilizó un anticuerpo para la a-tubulina (Sigma, St. Louis, MO), una proteína citoesquelética que se expresa en la mayoría de los tipos de células, en lugar del anticuerpo CP4-EPSPS en secciones separadas. Tanto los anticuerpos primarios como los secundarios fueron incubados a temperatura ambiente por espacio de 2-4 horas y luego se los volvió a incubar de un día para otro a 4 °C. Después del lavado, se tomaron imágenes de los tejidos con el Microscopio confocal de Barrido Láser Zeiss (LSM) 510 META utilizando un láser de 488 nm para la excitación y 500-550 nm para la serie de filtros de emisión. Se aplicó el mismo parámetro de captación de imágenes a todas las muestras, incluyendo los controles. Se barrieron imágenes de campo de luz fluorescente y brillante de cada sección y se las fusionó utilizando el software LSM posteriormente para exhibir la información estructural. Se obtuvo una fuerte señal con el anticuerpo anti-CP4-EPSPS en el tejido de los filamentos (Figura 6A, flecha corta) y el polen (Figura 6A, flecha larga) en la panoja madura de las plantas generadas con el constructo 4 (Figura 6A), que carecían del elemento ARNsi-mts. La planta de la Figura 6A es homocigota para el cassette del transgén; por lo tanto, sólo aproximadamente 50% del polen exhibió la señal CP4-EPSPS positiva. Por el contrario, se obtuvo una fuerte señal con el anticuerpo anti-CP4-EPSPS sólo en el tejido filamentoso (Figura 6B, flecha corta) y no se observó señal alguna en el polen (Figura 6B, flecha larga) de la panoja madura de las plantas generadas con el constructo 3 que contenía el elemento ARNsi-mts (Figura 6B). El anticuerpo control positivo (anti-alfa-tubulina) exhibió señal en el polen dentro de la panoja madura de las plantas generadas con el constructo 4 o el constructo 3. Los datos de los controles negativos arrojaron la esperada ausencia de señal. Los datos correspondientes al control no transgénico convencional exhibieron la esperada ausencia de señal de la tinción con el anticuerpo anti-CP4-EPSPS y la señal positiva con la tinción con el anticuerpo anti-alfa-tubulina. Estos datos indican que ninguno o muy pocos de los transcriptos del cassette de transformación que contiene el elemento ARNsi-mts se traslada al polen, aunque el transcripto se trasladó al tejido filamentoso vegetativo. La pérdida de expresión de la proteína CP4-EPSPS en el polen se correlaciona con la sensibilidad al glifosato específica de las panojas observada en las plantas generadas con el constructo 3.

EJEMPLO 5 Este ejemplo ilustra pruebas del ensayo de campo para evaluar la fertilidad o esterilidad masculina. Trece eventos de plantas transgénicas confirmados de copia simple R1-R3 generados por la transformación con el cassette de expresión CP4-EPSPS/ elemento ARNsi-mts (constructo 3) fueron analizados en ensayos de campo para determinar la eficacia del cassette de expresión. En el primer año, se analizaron trece eventos en una ubicación en el campo. En el segundo año, se analizaron ocho eventos en cuatro ubicaciones de campo. En el tercer año, se analizaron cuatro eventos en cuatro ubicaciones de campo Durante los tres años de los ensayos de campo, la tasa de fertilidad masculina (MFR) correspondiente a los eventos generados a partir del constructo 3 fue aproximada o inferior a la MFR 2, que se considera el standard de la industria para macho esterilidad.

Los datos correspondientes a un año de ensayos de campo de eficacia están presentados en las Figuras 8A-8C, donde la MFR promedio producida bajo tres regímenes diferentes de tratamiento con fumigación de glifosato presentados en el gráfico (Figura 8A) correspondientes a NK603 (CP4-EPSPS maíz transgénico), MON87427 (maíz transgénico CP4-EPSPS con macho-esterilidad inducible por glifosato) y dos eventos del constructo 3. Las fotos de las panojas de las plantas cultivadas durante este ensayo de eficacia en el campo en particular ilustran panojas fértiles cuando se rocían las plantas con glifosato a razón de 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) sólo en la V3 (Figura 8B); y panojas estériles (sin o con escasa extrusión de las anteras) en las plantas rociadas con glifosato 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) en la V3 seguido por 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) en la V8 y luego 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) en la V10 (Figura 8C). Para este ensayo de campo, los regímenes de fumigación fueron: el tratamiento 1 consistió en 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) glifosato en la V3 (control de malezas); tratamiento 2 consistió en 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) de glifosato en la V3 (control de malezas) seguido por 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) en la V8 y luego 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) en la V10; el tratamiento 3 consistió en 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) de glifosato en la V3 (control de malezas) seguido por 1 ,25 Ib./acre (1 ,40 kg/ha) en la V8 y luego 1 ,25 Ib./acre (1 ,40 kg/ha) en la V10. Se hace referencia astas últimas dos fumigaciones (es decir, V8 y V10) como fumigaciones de esterilidad. Estos resultados indican que con el tratamiento 1 de fumigación de glifosato sólo para control de malezas, todas las plantas (NK603, MON87427 y eventos del constructo 3) fueron macho fértiles. Con el tratamiento 2 de fumigación con glifosato para esterilidad, las plantas NK603 plantas tuvieron una MFR=5, las MON87427 fueron estériles con MFR=2 y los eventos 2 y 3 del constructo 3 fueron parcialmente macho fértiles con una MFR<3. Con el tratamiento 3 de fumigación para esterilidad con glifosato, las plantas NK603 tuvieron una MFR=5, las MON87427 fueron macho estériles con una MFR<2 y los eventos 2 y 3 del constructo 3 fueron macho estériles con una MFR aproximada o inferior a un puntaje de 2.

Si bien la MFR promedio fue aproximada o inferior a un puntaje de 2, se observó extrusión de las anteras en los eventos del constructo 3 tratados con glifosato en S90+3 y S90+6 (Figura 9). Para estos datos, se compararon cuatro eventos separados del constructo 3 con las plantas MON87427 y NK603 con respecto a dos regímenes de fumigación con glifosato: el tratamiento 2 consistió en 1 ,5 Ib./acre (1 ,68 kg/ha) de glifosato en la V2/V3 (control de malezas) seguido por 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) de glifosato en las unidades de grado de crecimiento (GDU) 875 (~V8) y luego 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) de glifosato en la GDU 1025 (~V10) y el tratamiento 3 consistió en 1 ,5 Ib./acre (1 ,68 kg/ha) de glifosato en la V2/V3 (control de malezas), seguido por 1 ,25 Ib./acre (1 ,40 kg/ha) de glifosato en la GDU 875 (~V8) y luego 1 ,25 Ib./acre (1 ,40 kg/ha) de glifosato en la GDU 1025 (~V10). Se asignó puntuación al número de plantas por lote (68 - 74 plantas/lote) que exhibían extrusión de las anteras en S90, S90+3 y S90+6, donde S90 es el día en que 90% de las plantas del campo exhiben filamentos; S90+3 es 3 días después de S90; y S90+6 es 6 días después de S90. Como se observa en la Figura 9, en S90 hubo 70(±15) plantas NK603 por lote que exhibían extrusión de las anteras en ambos regímenes de tratamiento con glifosato. Por el contrario, en el caso de MON87427 y los cuatro eventos del constructo 3, hubo 1(±12) planta por lote que exhibía extrusión de las anteras en S90 en ambos regímenes de tratamiento con glifosato. En S90+3 y S90+6, hubo 30(±12) a 70(±12) plantas por lote correspondientes a los cuatro eventos del constructo 3 que exhibían extrusión de las anteras con cualquiera de estos regímenes de tratamiento con glifosato, aproximándose al observado en el caso de NK603. La extrusión de las anteras correspondiente al evento MON87427 se mantuvo en el nivel de S90 tanto en los puntos de tiempo S90+3 como S90+6 y por cada régimen de tratamiento con glifosato. A toda planta con=1 antera eximida se asignó una calificación positiva con respecto a la extrusión de las anteras. Esta extrusión tardía de las anteras, es decir, S90+3 y S90+6, se produce en un período del desarrollo del maíz en que hay una máxima altura de crecimiento de la panoja y hay suficiente distancia para permitir el corte a máquina de la panoja con mínimo daño ocasionado a las dos hojas superiores de la planta de maíz, y por ende un mínimo impacto sobre el rendimiento endogámico. Asimismo, se considera que la extrusión de las anteras en S90+3 o posterior tiene escaso impacto sobre la pureza de la semilla.

Se llevó a cabo el análisis de viabilidad del polen para determinar si la extrusión de las anteras de bajo nivel, aunque persistente observada en S90+3 a S90+6 era una indicación de rotura tardía de fertilidad masculina. Las Figuras 10A y 10B ilustran un ejemplo de extrusión de las anteras de rotura tardía en la panoja de un evento del constructo 3 rociado para esterilidad. El recuadro de la Figura 10A es la porción ampliada de la Figura 10B. Un ejemplo de extrusión de las anteras de rotura tardía está indicado con un círculo en la Figura 10B. Para determinar la viabilidad del polen, se recogió polen de anteras extruidas de rotura tardía y se las tiñó con tinción de Alexander, Figura 10C. También se recogió polen de eventos del constructo 3 no rociados el mismo día y se los tiñó con tinción de Alexander para comparar, Figura 10D. Los resultados de esta tinción de Alexander demuestran sólo polen no viable (granos de polen de forma irregular, azul celeste traslúcido) de las anteras de rotura tardía de los eventos del constructo 3 rociados (Figura 10C). El polen completamente viable aparece opaco, de color violeta oscuro y esférico con la tinción de Alexander (Figura 10D). Además de la tinción del polen recogido de anteras extruidas de rotura tardía individualmente aisladas, se colocaron bolsas de polinización en algunos eventos del constructo 3 rociados a fin de determinar la diseminación del polen. No se diseminó polen en forma apreciable en estas bolsas de polinización, que no pudieron general semillas cuando se las utilizó para la polinización cruzada de mazorcas receptoras. Este resultado sugiere que no se diseminó polen de las anteras con extrusión tardía o que el polen que se pueda diseminar no es viable.

En su conjunto, estos datos indican que, si bien hay un bajo nivel de extrusión de las anteras en los eventos del constructo 3 rociados para la esterilidad, estas anteras extruidas no esparcen polen viable.

EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra ensayos de campo con plantas transgénicas para evaluar el rendimiento. Las plantas R2 del constructo 3 fueron analizadas para evaluar el rendimiento de endogámicas e híbridas. En el caso del rendimiento endogámico, se analizaron las plantas R2 del constructo 3 en cuatro ubicaciones de campo para determinar el rendimiento, la tolerancia vegetativa a la fumigación con glifosato y la macho esterilidad con la fumigación con glifosato. Para estas pruebas de campo, se plantaron cuatro eventos del constructo 3 en lotes de 68-74 plantas/lote. Los tratamientos de fumigación fueron: el tratamiento 1 consistió en 1 ,5 Ib./acre (1 ,68 kg/ha) de glifosato en la V3 (control de malezas); el tratamiento 2 consistió en 1 ,5 Ib./acre (1 ,68 kg/ha) de glifosato en la V3 seguido por 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) en la V8 y luego 0.75 Ib./acre (0.84 kg/ha) en la V11 ; el tratamiento 3 consistió en 1 ,5 Ib./acre (1 ,68 kg/ha) de glifosato en la V3 seguido por 1 ,25 Ib./acre (1 ,40 kg/ha) en la V8 y luego 1 ,25 Ib./acre (1,40 kg/ha) en la V11. Como se puede apreciar en la Figura 11 , los eventos del constructo 3 en los tres regímenes de tratamiento con glifosato exhibieron buena tolerancia vegetativa (barras blancas) medida por la altura de las plantas, y buen rendimiento endogámico (barras negras) medido en términos de bushels (Bu)/acre. Estos mismos eventos fueron completamente macho fértiles cuando se los trató con el régimen de tratamiento con glifosato sólo para control de malezas (tratamiento 1), pero resultaron macho estériles con una puntación de MFR igual o inferior a 2 (barras grises) cuando se las trató con los regímenes de tratamiento con glifosato 2 o 3. La barra horizontal de la Figura 11 indica el standard de la industria correspondiente a esterilidad, MFR 2. Se presenta la NK603 con fines comparativos. Las medidas de rendimiento del grano endogámico correspondiente a los eventos del constructo 3 y NK603 con fumigación con glifosato están consignadas en el cuadro 4, donde MST = % de humedad del grano, TWT = peso analítico (una puntuación de densidad, por lo general en libras por bushel) y S50D es el número de días hasta la aparición de 50% de filamentos de las mazorcas en el lote. No hubo diferencia significativa (nd) medida en rendimiento correspondiente a ninguno de los cuatro eventos del constructo 3 analizados con alguno de tratamientos 2 o 3 con glifosato, en comparación con el control NK603.

CUADRO 4 Medidas de rendimiento de los granos endogámicos En cuanto al rendimiento de los granos híbridos F1 , los eventos del constructo 3 R3 fueron analizados en cuatro ubicaciones de campo. Para estos ensayos de rendimiento de híbridas, se efectuó la polinización cruzada de una línea endogámica hembra no transgénica (Nula) MON87427 y tres eventos del constructo 3, todas con los mismos antecedentes genéticos, con una línea de prueba macho MON810/MON88017 para generar semillas híbridas F1. Se plantó la semilla híbrida F1 generada de cada una de estas cruzas en lotes standard de 68 - 74 plantas/lote. Los tratamientos de fumigación consistieron en el tratamiento 1 sin fumigación con glifosato; el tratamiento 2 de 2.25 Ib./acre (2.5 kg/ha) de glifosato en la V4 seguido por 2.25 Ib./acre (2.5 kg/ha) en la V7; el tratamiento 3 de 2.25 Ib./acre (2.5 kg/ha) de glifosato en la V4 seguido por 2.25 Ib./acre (2.5 kg/ha) en la V7 seguido por 2.25 Ib./acre (2.5 kg/ha) en la V10. Las plantas F1 fueron sometidas a polinización abierta para generar grano F2, que es el rendimiento medido en bushels/acre (Bu/acre). Los tres eventos del constructo 3 exhibieron rendimiento equivalente del grano híbrido F1 en todos los regímenes de tratamiento con glifosato en comparación con las cruzas control de NuloxMON810/MON88017 y MON87427x ON810/MON88017 (Figura 12).

EJEMPLO 7 Este ejemplo ¡lustra el restablecimiento de la fertilidad masculina en plantas híbridas F1. Las plantas híbridas F1 generadas por una cruza de eventos del constructo 3 como progenitora femenina fueron analizadas para evaluar la fertilidad masculina. Se establecieron tres cruzas híbridas F1 diferentes: hembra no transgénica x macho MON880 7; hembra MON87427 x macho MON88017; y hembra del evento del constructo 3 x macho MON88017. Se cosechó la semilla híbrida F1 de cada una de las tres cruzas, se la plantó en un campo y se la roció con glifosato a razón de 1,125 Ib./acre (1 ,26 kg/ha) en la V4 seguido por 1,125 Ib./acre (1,26 kg/ha) en la V10. Se evaluó la fertilidad masculina en F1 por cálculo de tasa de fertilidad masculina (MFR) y mediante tinción de viabilidad de Alexander del polen. Por cada una de las cruzas, la MFR de las plantas híbridas F1 fue de 5 o completamente fértil. La tinción de viabilidad de Alexander demostró que 50% del polen producido por la híbrida F1 de cada una de las cruzas era viable, como se esperaba. (Figura 13) Estos datos indican que se puede restablecer funcionalmente la fertilidad masculina en las plantas híbridas F1 producidas a partir de plantas transgénicas con macho esterilidad inducible por glifosato transformadas con un cassette de expresión CP4-EPSPS/elemento ARNsi-mts.

EJEMPLO 8 Este ejemplo ilustra la construcción de elementos ARNsi-mts variantes y quiméricos. Se mapearon ARNsi-mts individuales sobre un elemento ARNsi-mts presentado en la Figura 3; el eje X indica la posición de los nucleótidos de la orientación 5' a 3' de izquierda a derecha en la parte superior y de derecha a izquierda en la parte inferior y el eje Y indica que la abundancia relativa de los ARNsi-mts está indicada en términos de transcriptos por cuarto de millón de secuencias (tpq). Los ARNsi-mts también fueron distribuidos en forma no uniforme por todos los ARNsi-mts (Eje X).

Usando esta información, se diseñaron variantes de un elemento ARNsi-mts y/o quimeras producidas utilizando uno o más elementos ARNsi-mts de manera que contuvieran más (o menos) secuencias totales de ARNsi-mts (opcionalmente, o por otro lado, se agrega (o suprime) una o más secuencias de ARNsi-mts, para dar lugar a un mayor (o menor) silenciamiento de una secuencia codificadora de proteína operativamente ligada. Dichas variantes o elementos ARNsi-mts quiméricos son útiles para aumentar o reducir la supresión selectiva de la expresión de una proteína recombinante en un tejido reproductor masculino de una planta transgénica.

Se construyeron ejemplos de variantes y quimeras de elementos ARNsi-mts empleando fragmentos de SEQ ID NO: 87. La primera variante (SEQ ID NO: 88) fue construida empleando un fragmento de 104 nucleótidos del extremo 5' de SEQ ID NO: 87. La segunda variante (SEQ ID NO: 89) fue construida empleando un fragmento de 80 nucleótidos de la mitad 3' de SEQ ID NO: 87. Se construyeron elementos ARNsi-mts quiméricos uniendo un fragmento (SEQ ID NO: 88) a otro fragmento (SEQ ID NO: 89) para formar nuevos elementos ARNsi-mts quiméricos (SEQ ID NO: 90 y SEQ ID NO: 91). Se construyeron elementos ARNsi-mts quiméricos adicionales reuniendo tres ARNsi-mts individuales contenidos dentro de SEQ ID NO: 87: una primera quimera (SEQ ID NO: 92) fue construida uniendo las secuencias de ARNsi-mts SEQ ID NO: 26, 27 y 8; una segunda quimera (SEQ ID NO: 93) fue construida uniendo las secuencias de ARNsi-mts SEQ ID NO: 10, 33 y 5; una tercera quimera (SEQ ID NO: 94) fue construida uniendo las secuencias de ARNsi-mts SEQ ID NO: 26, 10 y 33. Estas variantes y quimeras pueden estar operativamente ligadas a una secuencia codificadora de proteínas para producir constructos de ADN recombinante (ver la Figura 14) que pueden ser analizados en plantas y células vegetales para detectar la supresión selectiva de una proteína recombinante codificada por la secuencia codificadora de proteína en un tejido reproductor masculino de una planta transgénica.

EJEMPLO 9 Este ejemplo ¡lustra el diseño de elementos ARNsi-mts variantes y quiméricos. Se diseñaron elementos ARNsi-mts variantes y quiméricos sobre la base de un elemento ARNsi-mts de 300 nucleótidos (nt) de longitud que tiene la SEQ ID NO: 81 , que es similar a los elemento ARNsi-mts de 300 nucleótidos que tienen las SEQ ID NO: 82 y 87. Una secuencia consensual altamente conservada respecto de los elementos ARNsi-mts SEQ ID NO: 81 , 82 y 87 es aportada por la SEQ ID NO: 96. Individualmente, cada una de estas es útil asimismo como elemento ARNsi-mts o como base para el diseño de elementos ARNsi-mts variantes o quiméricos, por ej., mediante la selección de fragmentos de un elemento ARNsi-mts identificado de la secuencia genómica o ADNc, como por ejemplo fragmentos que incluyen por lo menos una secuencia de ARNsi-mts y la combinación o concatenación de dichos fragmentos.

Se seleccionaron dos fragmentos de SEQ ID NO: 81 ; el fragmento A (SEQ ID NO: 97) contenía 104 nucleótidos contiguos de la región 5' (posiciones 1 - 104) de SEQ ID NO: 81 y el fragmento B (SEQ ID NO: 98) contenía 80 nucleótidos contiguos de la región 3' (posiciones 215 - 294) de SEQ ID NO: 81 ; es evidente que tanto el fragmento A (SEQ ID NO: 97) como el fragmento B (SEQ ID NO: 98) individualmente, son elementos ARNsi-mts que contienen por lo menos una secuencia de ARNsi-mts. La ubicación de los fragmentos A y B (indicada por el texto subrayado) está expuesta en la siguiente secuencia completa de SEQ ID NO: 81 , que también indica la ubicación de las secuencias de ARNsi-mts (indicada por el texto en letra cursiva; los segmentos en letra cursiva de más de 18 nucleótidos contiguos pueden incluir más de una secuencia de ARNsi-mts superpuesta) que demostró mapearse contra este elemento ARNsi-mts: GGACAACAAGCACCTTCTTGCCTTGCAAGGCCTCCCTTCCCTATGGTAGC CACTTGAGTGGATGACTTCACCTTAAAGCTATCGATTCCCTAAGTGCCAG ACATAATAGGCTATACATTCTCTCTGGTGGCAACAATGAGTCATTTTGGTT GGTGTGGTAGTCTATTATTGAGTTTGTTTTGGCACCGTACTCCCATGGAG AGTACAAGACAAACTC TTCA CCG TTG TA G TCG TTGA TGG1A TTGG TGGTG ACGACA TCCTTGGTGTGCA TGCACTGGTGAGTCACTGTTGTACTCGGCG (SEQ ID NO: 81). Se diseñaron elementos ARNsi-mts variantes empleando los fragmentos "A" y "B", que incluían el elemento ARNsi-mts "A+B" (SEQ ID NO: 99) y un elemento ARNsi-mts "B+A" (SEQ ID NO: 100). Se diseñó un elemento quimérico (SEQ ID NO: 101) de manera que incluyera las secuencias de mts de ARNsi-mts (que aparecen en el texto en cursiva anterior de la SEQ ID NO: 81) y se encontró que se mapeaban contra el elemento ARNsi-mts (SEQ ID NO: 81).

Del mismo modo, se identificó un elemento ARNsi-mts de 251 nt de longitud (SEQ ID NO: 102) y se identificó un elemento ARNsi-mts de 121-nt de longitud (SEQ ID NO: 103, un fragmento de SEQ ID NO: 102, es decir, el segmento contiguo situado en las posiciones de nucleótidos 47 - 167 de SEQ ID NO: 102) de la secuencia genómica del maíz (Zm_B73_CR10::Segment{75361491..75361742}) como específicos de las panojas y correspondientes a los ARNsi-mts de las panojas jóvenes (maíz LH244, biblioteca 347; los ARNsi-mtss identificados individualmente en algunos casos se superponen en gran parte de su secuencia y varían sólo en pocos nucleótidos; ver el cuadro 5). Basándose en SEQ ID NO: 102 y 103, se diseñó un elemento quimérico ARNsi-mts (SEQ ID NO: 104).

CUADRO 5 ARNsi-mts maneados contra la SEQ ID NO: 103 *posición de los nucleótidos dentro de SEQ ID NO: 103 EJEMPLO 10 Este ejemplo ilustra vectores y células, tejidos y plantas transgénicas que contienen constructos de ADN recombinante que incluyen una secuencia codificadora de proteína que codifica una proteína recombinante y un elemento ARNsi-mts operativamente ligado a la secuencia codificadora de proteína.

Se utiliza un vector de transformación de plantas que comprende un constructo de ADN recombinante para la transformación mediada por Agrobacteríum de células de maíz. Este vector de transformación incluye ADN para la transferencia mediada por Agrobacteríum de ADN-T, un cassette de expresión (promotor operativamente ligado a una secuencia de ADN de interés), un cassette de expresión de marcador seleccionare (para la selección conveniente de las células o plantas de maíz transformadas) y ADN para el mantenimiento del vector en E. coli (por ej., una secuencia de origen de replicación de E. colí). En una modalidad, el vector de transformación incluye un cassette de expresión que comprende un constructo de ADN recombinante flanqueado por secuencias de borde derecha e izquierda de Agrobacterium, donde el constructo de ADN recombinante incluye el transgén de tolerancia a los herbicidas CR-AGRtu.aroA-CP4.nat (presentado como SEQ ID NO: 95) como secuencia codificadora de ADN que codifica una proteína recombinante. El transgén de tolerancia a los herbicidas CR-AGRtu.aroA-CP4.nat está operativamente ligado al mt-siRNA presentado como SEQ ID NO: 81 como secuencia de ADN que codifica un elemento ARNsi-mts.

Se construyen vectores de transformación para expresar diferentes constructos de ADN recombinante mediante la inserción de un polinucleótido que incluye un elemento ARNsi-mts (por ej., SEQ ID NO: 57-94 o 97-104) en el vector de transformación de plantas. Se inserta el elemento ARNsi-mts adyacente a la secuencia de ADN que codifica una proteína recombinante o dentro de la región 3' sin traducir de la secuencia de ADN que codifica una proteína recombinante. Esos vectores de transformación de plantas son ventajosos para generar plantas transgénicas en las que se puede inducir la macho-esterilidad mediante la aplicación de herbicida.

Los métodos para la transformación de plantas son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, se cultivan plantas de maíz de una línea transformable en el invernadero y se cosechan las mazorcas cuando los embriones tienen una longitud de 1 ,5 a 2.0 mm. Se esteriliza la superficie de las mazorcas con etanol al 80%, seguido por secado al aire. Se aislan los embriones inmaduros de los granos individuales de las mazorcas esterilizadas. Antes de la inoculación de las células de maíz, se mantienen cultivos individuales de Agrobacterium, cada uno de los cuales contiene un vector de transformación para expresar por lo menos uno de los constructos de ADN recombinante de la presente invención de un día para otro a temperatura ambiente. Se inoculan los cultivos de células embrionarias de maíz con Agrobacterium, se los incuba a temperatura ambiente con Agrobacterium por espacio de 5 a 20 minutos, se los co-cultiva con Agrobacterium durante 1 a 3 días a 23 grados Celsius en la oscuridad, se los transfiere a un medio de selección y se los cultiva durante aproximadamente 2 semanas para dar lugar al desarrollo del callo embriogénico. Se transfiere el callo embriogénico a un medio de cultivo que contiene 100 mg/l de paromomicina y se lo subcultiva a intervalos de aproximadamente dos semanas. Se recuperan múltiples eventos de células vegetales transformadas 6 a 8 semanas más tarde, una vez iniciada la selección.

Se regeneran plantas transgénicas de maíz del callo de células vegetales transgénicas por cada uno de los eventos transgénicos que se producen como resultado de la transformación y selección, colocando callo transgénico de cada evento en un medio para iniciar los brotes y el desarrollo de las raíces en las plántulas que son transferidas al suelo para macetas para el desarrollo inicial en una cámara de cultivo a 26 grados centígrados, seguido por el cultivo en un banco de fumigación antes de transplantarlos a macetas donde las plantas son cultivadas hasta su madurez. Las plantas regeneradas son autofecundadas. Se cosecha la primera generación de semillas ("R1"). Las plantas cultivadas a partir de semillas R1 (plantas "R2") son utilizadas para producir la progenie.

EJEMPLO 11 Este ejemplo ilustra métodos para seleccionar secuencias de ARNsi-mts y elementos ARNsi-mts para usar en los constructos de ADN recombinante que incluyen una secuencia codificadora de proteína que codifica una proteína recombinante y un elemento ARNsi-mts operativamente ligado a la secuencia codificadora de proteína.

Un método para verificar la eficacia de un elemento ARNsi-mts para suprimir selectivamente la expresión de una proteína recombinante en un tejido reproductor masculino de una planta transgénica conlleva el uso de un ensayo de protoplastos en el cual los protoplastos de las células vegetales son co-transformados con: (a) un vector que contiene un constructo de ADN recombinante que incluye una secuencia codificadora de proteína y un elemento ARNsi-mts operativamente ligado a la secuencia codificadora de proteína y (b) ARN(s) que tienen la secuencia del o los ARNsi(s) que corresponde al elemento o los elementos ARNsi-mts (o, por otro lado, la secuencia o secuencias de ARNsi-mts), donde se estima que el nivel de expresión de la proteína recombinante ha de ser inversamente proporcional al grado en el cual el elemento ARNsi-mts es escindido por el o los ARN(s).

Esto se ilustra mediante el siguiente ejemplo no limitante. El ensayo se llevó a cabo en dos secuencias de ARNsi-mts (que corresponden a dos ARNsi que demostraron expresarse profusamente en la panoja del maíz). En pocas palabras, se cotransforman protoplastos foliares de maíz con: (a) un plásmido (3 microgramos/320.000 células) que contiene un constructo de ADN recombinante que incluye una secuencia codificadora de proteína que codifica una proteína recombinante (CP4-EPSPS, SEQ ID NO: 95) y un elemento ARNsi-mts (SEQ ID NO: 81) y (b) un primer ARNds en el cual una primera hebra tiene la secuencia SEQ ID NO: 150 en la dirección 5' a 3' y una segunda hebra que es el complemento de la primera y un segundo ARNds en el cual una primera hebra tiene la secuencia SEQ ID NO: 151 en la dirección 5' a 3' y una segunda hebra que es el complemento de la primera. Los ARNds (de Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, lowa) fueron analizados a razón de 0, 5, 25 o 50 nanogramos/320.000 células, ajustándose el ARN total utilizado en cada ensayo de cotransformación con un ARN "de relleno" que consistía en miRNA395 (en forma de 21-mero maduro, provisto en forma de ARNds) o bien en ARNt de levadura hasta 50 nanogramos/320.000 células. Se determinó el nivel de proteína CP4-EPSPS por ELISA y se lo utilizó para evaluar la capacidad de los ARNds analizados para suprimir la expresión de la proteína recombinante. Los resultados están consignados en el cuadro 6.

CUADRO 6 Nivel de proteína CP4-EPSPS *estadísticamente significativo con respecto al control Cada uno de los ARNds (SEQ ID NO: 150 y 151) suprimió vigorosamente la expresión de CP4-EPSPS (indicada por la acumulación reducida de proteína CP4-EPSPS) cuando se los cotransformó con el plásmido que contenía el constructo de ADN recombinante que incluye la secuencia codificadora de proteína CP4-EPSPS y el elemento ARNsi-mts. La supresión observada de CP4-EPSPS fue dependiente de la dosis de la cantidad de ARNds e independiente del tipo de ARN de relleno. No se observó la supresión de CP4-EPSPS en las muestras control cotransformadas con el ARN de relleno en lugar de los ARNds del ensayo.

EJEMPLO 12 Este ejemplo ilustra constructos de ADN recombinante, vectores y plantas transformadas de la invención. Se utilizaron vectores y métodos de transformación similares a los descriptos en el Ejemplo 10 para producir plantas de maíz establemente transformadas que contenían, en su genoma, un constructo de ADN recombinante que incluye una secuencia codificadora de proteína operativamente ligada a una secuencia de ADN que comprende un elemento ARNsi-mts. Se analizaron seis combinaciones de diseño del constructo/elemento ARNsi-mts (ver el cuadro 7). Se rociaron las plantas dos veces (en la V5 y V8) con 0.75 Ib. ae/A (0.84 kg/ha) de Roundup WeatherMAX®. Los resultados están consignados en el cuadro 7. Por cada diseño de la combinación constructo/elemento ARNsi-mts, se dejaron aproximadamente 20 plantas sin rociar para compararlas con las plantas rociadas con glifosato. Todas las plantas sin rociar esparcieron polen y exhibieron buena fertilidad masculina (no se presentan datos). Las plantas de maíz transformadas con el diseño del constructo B exhibieron macho esterilidad más pronunciada que las plantas de maíz transformadas con el diseño del constructo A. Los constructos diseñados (5' a 3', de izquierda a derecha) fueron: el Constructo A que es promotor A/intrón A/péptido de tránsito A/CP4-EPSPS (SEQ ID NO: 95)/elemento ARNsi-mts /3'UTR y el Constructo B es el promotor B/intrón B/péptido de tránsito B/CP4-EPSPS/elemento ARNsi-mts /3'UTR. En el contexto siguiente, "n.m." significa no se midió. La escala de cálculo de tasa de fertilidad masculina (MFR) es: 5 = la emergencia de las anteras es normal, el volumen de polen es igual al de los lotes no fumigados pero puede o no esparcir polen; 4 = la emergencia de las anteras es 50% de la normal, pero esparcen escasamente o no esparcen cantidades normales de polen; 3 = la panoja parece normal aunque hay una esporádica extrusión de las anteras (>10 anteras por panoja) y no se esparce o se esparce escaso polen; 2.5 = no se esparce polen, la antesis se reduce considerablemente (<10 anteras por panoja) o es muy tardía (1 semana) con respecto al final de la formación de filamentos; 2 = no se esparce polen, no hay antesis o es muy tardía (1 semana) con respecto al final de la formación de filamentos; y 1 = no se esparce polen, la panoja tiene un fenotipo de tallo anormal o la antesis se demora dos o más semanas después de la aparición de los filamentos. S90 es cuando 90% de las plantas tienen filamentos listos para la polinización y S90+3 es 3 días después de S90.

CUADRO 7 Diseño del constructo/datos de rocío con el elemento ARNsi-mts Todos los materiales y métodos descriptos y reivindicados en la presente se pueden preparar y utilizar sin indebida experimentación, según las indicaciones de la descripción que antecede. Los ejemplos expuestos se incluyen para demostrar las modalidades de la invención. Las personas con capacitación en la técnica han de apreciar que las técnicas descriptas en los ejemplos representan técnicas que el inventor ha comprobado que dan buen resultado para poner en práctica la invención y, por consiguiente, se los puede considerar modalidades preferidas para ponerla en práctica. Sin embargo, las personas con capacitación en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que se pueden efectuar numerosos cambios a las modalidades específicas que se presentan y obtener de todos modos un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Todas dichas sustituciones similares y modificaciones evidentes para una persona con capacitación normal en la técnica se consideran incluidas en el espíritu, alcance y concepto de la invención definida por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un constructo de ADN recombinante que comprende una secuencia codificadora de proteína operativamente ligada a una secuencia de ADN que comprende un elemento ARNsi-mts.

2. - El constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho elemento ARNsi-mts comprende por lo menos una secuencia de ARNsi-mts.

3. - El constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha secuencia de ARNsi-mts es seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-56 y 105-149.

4. - El constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho elemento ARNsi-mts es seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-94 y 96-104.

5. - El constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la expresión de dicha secuencia codificadora de proteína en una planta transgénica confiere a dicha planta por lo menos tolerancia vegetativa a los herbicidas.

6. - El constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha secuencia codificadora de proteína codifica una EPSPS tolerante al glifosato.

7. - Un método para generar un constructo de ADN recombinante que comprende identificar un elemento ARNsi-mts que comprende por lo menos una secuencia de ARNsi-mts y ligar operativamente dicho elemento ARNsi-mts a una secuencia codificadora de proteína.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicha por lo menos una secuencia de ARNsi-mts es por lo menos una seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-56 y 105-149 o dicho elemento ARNsi-mts es seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-94 y 96-104.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho elemento ARNsi-mts es específico de las panojas.

10. - Una planta transgénica que tiene, en su genoma, el constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1.

11. - Una semilla, progenie o parte de la planta transgénica de conformidad con la reivindicación 10.

12. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha planta transgénica es una planta monocotiledónea.

13. - La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha planta transgénica es una planta de maíz.

14. - Un método para suprimir selectivamente la expresión de una proteína recombinante en un tejido reproductor masculino de una planta transgénica que comprende expresar en dicha planta transgénica un constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho tejido reproductor masculino es una panoja de una planta de maíz.

16. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho elemento ARNsi-mts comprende por lo menos tres secuencias de ARNsi-mts.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho elemento ARNsi-mts comprende por lo menos una secuencia de ARNsi-mts seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-56 y 105-149.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicho elemento ARNsi-mts es seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57-94 y 96-104.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la expresión de dicha proteína recombinante en una planta transgénica confiere a dicha planta por lo menos tolerancia vegetativa a los herbicidas.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicha proteína recombinante es una EPSPS tolerante al glifosato.

21. - Un método para inducir la macho esterilidad en una planta transgénica que comprende aplicar una cantidad efectiva de un herbicida a una planta transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , en el cual dicha aplicación de herbicida se lleva a cabo durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de dicha planta transgénica para inducir de esa manera la macho-eterilidad en dicha planta transgénica.

22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicha planta transgénica es una planta de maíz.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicha aplicación de herbicida previene por lo menos la diseminación de polen o la extrusión de las anteras.

24. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho desarrollo del tejido reproductor masculino es en una etapa seleccionada del grupo que consiste en las etapas V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11 , V12, V13 y V14 del desarrollo de una planta de maíz.

25. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho herbicida es seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de la acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa), inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS), inhibidores del fotosistema II (PSII), inhibidores de la protoporfirinógeno oxidasa (PPO), inhibidores de la 4-hidroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD), inhibidores de la 5-enolpiruvil shikimato 3-fosfato sintasa (EPSPS), inhibidores de la glutamina sintetasa (GS) y auxinas sintéticas.

26. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho herbicida es glifosato y dicha proteína recombinante es una EPSPS tolerante al glifosato.

27. - Un método para producir semillas híbridas que comprende: a. aplicar una cantidad efectiva de herbicida a una planta transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , en el cual dicha aplicación de herbicida se lleva a cabo durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de dicha planta transgénica, induciendo de esa manera la macho-esterilidad en dicha planta transgénica; b. fertilizar dicha planta transgénica con polen de una segunda planta y c. cosechar semillas híbridas de dicha planta transgénica.

28. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicha planta transgénica es de maíz.

29. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicho herbicida es glifosato y dicha proteína recombinante es una EPSPS tolerante al glifosato.

30. - El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque dicho glifosato es aplicado durante dicho desarrollo en una dosis efectiva de aproximadamente 0.125 libras de equivalente ácido por acre (0.14 kg/ha) a aproximadamente 8 libras de equivalente ácido por acre (8.97 kg/ha).

31.- Semilla híbrida cosechada de una planta transgénica macho-estéril que ha sido fertilizada con polen de una segunda planta, en donde dicha planta transgénica macho-estéril comprende un constructo de ADN recombínante de conformidad con la reivindicación 1 y se le ha inducido la mache— esterilidad mediante la aplicación de una cantidad efectiva de herbicida durante el desarrollo del tejido reproductor masculino de dicha planta transgénica.