DE4013099A1 - Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen - Google Patents

Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen

Info

Publication number
DE4013099A1
DE4013099A1 DE19904013099 DE4013099A DE4013099A1 DE 4013099 A1 DE4013099 A1 DE 4013099A1 DE 19904013099 DE19904013099 DE 19904013099 DE 4013099 A DE4013099 A DE 4013099A DE 4013099 A1 DE4013099 A1 DE 4013099A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
embryos
somatic
plants
phosphinothricin
somatic embryos
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19904013099
Other languages
English (en)
Inventor
Guenter Dr Donn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Priority to DE19904013099 priority Critical patent/DE4013099A1/de
Priority to FR9104984A priority patent/FR2661421A1/fr
Publication of DE4013099A1 publication Critical patent/DE4013099A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

Dikotyle Pflanzen sind im wesentlichen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens transformierbar. Bisher ist dieser Weg nur auf wenige monokotyle Pflanzen angepaßt worden. Der direkte Gentransfer, ohne bakterielle oder virale Vektoren, hat sich bei monokotylen Pflanzen bislang besser bewährt. Insbesondere der Einsatz von Protoplasten als zu transformierendes Objekt hat sich zumindest bei Reis und Mais auf Zellebene als gangbarer Weg erwiesen. Problematisch ist jedoch die Regenerierbarkeit der Protoplasten zu fertilen Pflanzen.
In Wo 88/09 374 wird ein Verfahren beschrieben, in dem sexuelle Embryonen von Nutzpflanzen als Aufnahmesystem für fremde genetische Informationen dienen. Embryonen reifer Samen sind in der Lage während der Quellung, im isolierten Zustand oder mechanisch freigelegt im Samen, fremde genetische Information aufzunehmen. 1 bis 3 Tage nach der Transformation konnte in den Embryonen transiente Genexpression nachgewiesen werden. Es gelang bisher aber noch nicht, stabil transformierte Zellen in den entstandenen Pflanzen bzw. in der Nachkommenschaft aufzufinden.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß unreife somatische Embryonen getrocknet werden können und durch Rehydratisierung in einer DNA-Lösung fremde genetische Information aufnehmen können.
Die Erfindung betrifft somit
  • 1. Ein Verfahren zur Transformation von Embryonen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß unreife somatische Embryonen in getrocknetem Zustand mit einer DNA oder RNA enthaltenden Lösung inkubiert werden.
  • 2. Die transformierten somatischen monokotylen Embryonen.
  • 3. Die aus den transformierten somatischen Embryonen erhältlichen monokotylen Pflanzen.
  • 4. Die Verwendung der getrockneten, monokotylen somatischen, gegebenenfalls transgenen Embryonen zur Herstellung von artifiziellem Saatgut.
  • 5. Die Verwendung der transformierten somatischen Embryonen zur Regenerierung und Züchtung fertiler transgener Nutzpflanzen.
Die Erfindung wird im folgenden detailliert erläutert, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird die Erfindung durch den Inhalt der Ansprüche beschrieben.
Zur Ausführung der Erfindung können unreife somatische Embryonen grundsätzlich aller Pflanzen verwendet werden. Bevorzugt werden die Zellen von Nutzpflanzen, z. B. Gramineen, wie Mais, Weizen und Gerste, Holzgewächsen, wie Fichte, Lärche und Pinusarten, oder krautigen dikotylen Nutzpflanzen, wie Luzerne, Raps, Sojabohne, Baumwolle, Sellerie und Karotte eingesetzt. Bevorzugt sind Mais, Raps und Luzerne. Insbesondere bevorzugt wird mit monokotylen Embryonen gearbeitet, wobei hierbei die Gramineen, insbesondere die Maispflanze, wiederum besonders bevorzugt sind. Die unreifen somatischen Embryonen können sowohl aus embryogenen Kalluskulturen als auch aus Organkulturen gewonnen werden.
Unter "unreifen Embryonen" sind Embryonen unterschiedlicher Entwicklungsstadien, die sich aus embryogenen Zellverbänden in pflanzlichen Zellkulturen oder Organkulturen ausdifferenzieren und maximal 75% der Größe eines reifen, samenbürtigen Embryos erreicht haben, zu verstehen. Organkulturen sind gut ausdifferenzierte Embryonen zygotischer oder somatischer Herkunft, die in geeignetem Medium Adventiv-Embryonen ausbilden. Unter "getrocknetem Zustand" ist ein Wassergehalt von maximal 20% zu verstehen. Bevorzugt beträgt der Wassergehalt der Embryonen 5 bis 15%, ausgehend von einer Zelle im turgeszenten Zustand.
Die Embryonen werden unter sterilen Bedingungen schonend über einen Zeitraum von 10 bis 18 Tagen getrocknet. Bevorzugt werden die Zellen zuvor mindestens 7 Tage, besser aber ca. 2-8 Wochen auf einem Nährmedium mit hohem Zucker- bzw. Zuckeralkoholgehalt kultiviert. Die Konzentration des Zuckers bzw. Zuckeralkohols sollte bei ca. 8 bis 12% bezogen auf das Gewicht des Nährmediums, bevorzugt bei 9 bis 10%, liegen. Es können z. B. Glucose, Saccharose, Fructose, bzw. Sorbit oder Mannit in Kombination oder einzeln eingesetzt werden. Bevorzugt wird Saccharose verwendet.
Getrocknete Embryonen, die wie beschrieben behandelt wurden, können bei Zimmertemperatur mehr als ein Jahr lufttrocken aufbewahrt werden. Diese Embryonen können auch als artifizielles Saatgut bereitgestellt werden. Bevorzugt werden dann monokotyle Embryonen z. B. von Gramineen entsprechend verwendet, insbesondere von Mais.
Zur Rehydratisierung und zur Wiederaufnahme des Wachstums werden die getrockneten Embryonen auf ein Wachstumsmedium mit oder ohne Agar mit einem Zuckergehalt, insbesondere Saccharose, von 2 bis 6% gegeben.
Zur Transformation werden die getrockneten Zellen in einer wäßrigen DNA- oder RNA-Lösung, die auch Mediumsbestandteile und Puffersalze enthalten kann, gebadet.
Es kann jegliche DNA oder RNA in die Zelle eingeschleust werden. Vorteilhaft wird mit selektierbaren Markergenen gearbeitet, wie z. B. das Gen für Phosphinothricinacetyltransferase, Hygromycinphosphotransferase, Acetolactatsynthetase, 5-Enolpyruvyl-shikimat-phosphat-synthetase (EPSP-Synthetase), Glutaminsynthetase oder Transaminase. Es können natürlich auch Gene eingeschleust werden, deren Expression nicht durch Wachstum der Pflanze selektiert werden kann. Derartige Gene können beispielsweise für das δ-Endotoxin von Bacillus thuringiensis kodieren oder für Virusresistenz, wie z. B. Gene für Virus "coat" Proteine, insbesondere des Cucumber Mosaic Virus, des Alfalfa Mosaic Virus oder des Brom Mosaic Virus. Ferner kann das Chitinase Gen oder Gene, die die photosynthetische Leistungsfähigkeit der Pflanze verbessern, wie z. B. das Gen für Phosphoenolpyruvatcarboxylase oder bakterielle Asparaginsynthetase (Nakamura, M.M. et al. Nucleic Acids Research 9, 4669 (1981)) eingesetzt werden. Bevorzugt wird mit dem Gen für die Phosphinothricinacetyltransferase aus Streptomyces viridochromogenes (Wohlleben, W. et al., Gene 80, 25-57 (1988)) gearbeitet, das für eine Expression in Pflanzen entsprechend modifiziert werden kann. Durch den Einbau dieses Gens werden die Maispflanzen und ihre Nachkommen resistent gegen Phosphinothricin (Glufosinate) und Bialaphos.
Nach Synthetisierung bzw. Isolierung kann das Gen nach herkömmlichen Methoden, z. B. durch Transformation von E. coli oder durch "polymerase chain reaction", vermehrt werden. Das isolierte funktionelle Gen kann dann direkt oder auf einem beliebigen Klonierungsvektor, vorteilhaft pBR 322, pUC 18 oder pDH 51 (Pietrzak, M. et al. NAR 14, 5857 (1986)) mit oder ohne einen in Pflanzen wirksamen Promotor in die Embryozellen gebracht werden. Als Promotor wird bevorzugt der 35S Promotor verwendet. DNA kann auch in Form eines Komplexes mit Histonen eingesetzt werden, wie z. B. in der Deutschen Patentanmeldung P 40 05 152.8 beschrieben wird. Es ist für die Transformation vorteilhaft, die somatischen Embryonen einer Behandlung, die DNA-Strangbrüche induziert, zu unterwerfen, z. B. UV- oder Röntgenbestrahlung. Die anschließende Selektion erfolgt nicht, wie in WO 88/09 374 beschrieben, auf der Ebene der ganzen Pflanze, sondern auf der Ebene der Einzelzelle. Insofern können auch extrem seltene Transformationsereignisse mit vertretbarem Aufwand angereichert und aufgefunden werden.
Aus den transformierten somatischen Embryonen, bevorzugt aus monokotylen Embryonen, wie z. B. von Gramineen, insbesondere von Mais, können fertile Pflanzen nach an sich bekannten Methoden regeneriert werden.
Ferner können auch die transformierten somatischen Embryonen, insbesondere die monokotylen Embryonen, wie schon oben für die nicht-transformierten Embryonen erwähnt, nach Selektion und Vermehrung, die nach an sich bekannten Methoden durchgeführt werden, als artifizielles Saatgut verwendet werden. Hierbei ist die Verwendung von entsprechenden Gramineen-, insbesondere Maisembryonen, besonders bevorzugt.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Schutz von monokotylen Pflanzen, durch selektive Vernichtung von Unkraut mit Phosphinothricin, indem Anbauflächen mit Pflanzen, die aus dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind und die das Phosphinothricinacetyltransferasegen tragen sowie mit deren Nachkommen bepflanzt werden.
Die folgenden Beispiele sollen zur weiterführenden Erläuterung der Erfindung dienen.
Beispiele 1. Initiation von embryogenen Mais Kalluskulturen und deren Präkonditionierung für die Trocknung
Unreife Embryonen gewebekulturtauglicher Mais-Genotypen, z. B. H99, B73, A188, W64A und deren Hybriden, werden bei einer Embryonengröße von 1-1,5 mm aus oberflächensterilisierten Karyopsen unter aseptischen Bedingungen herauspräpariert und auf modfiziertem N6-Medium nach Duncan (Planta 165, 322 (1985)), das 9% Saccharose und 1 mg/l Dichlororthoanissäure (Dicamba) enthält, in Kultur genommen. Embryogener Kallus, der sich an den Rändern des Scutellums bildet wird auf N6-Medium mit 1 mg/l Dicamba und 3% Saccharose im Abstand von 3-4 Wochen subkultiviert. Für das Transformationsverfahren geeignete embryogene Kalluskulturen lassen sich in der hier beschriebenen Weise für 1-3 Jahre unter Beibehaltung ihrer Regenerationsfähigkeit subkultivieren. Die Kultivierung erfolgt bei 25 ± 2°C 12 h Licht/Dunkelrhythmus bei ca. 1000-5000 Lux.
Vor der Trocknung werden die Kalli 15 ± 5 Tage auf N6-Medium mit 9% Saccharose kultiviert. Der durch den erhöhten Saccharosegehalt induzierte osmotische Streß erhöht die Überlebensfähigkeit im nachfolgenden Trocknungsprozeß.
2. Trocknung der embryogenen Maiskalli
Der präkonditionierte Kallus wird in sterile Petrischalen mit Entlüftungsnocken ohne Kulturmedium überführt. Die Petrischalen werden bei Raumtemperatur vorzugsweise bei 23°C ± 3°C im Dunkeln aufgestellt. Pro Petrischale werden mindestens 1 g und maximal 2 g Kallusgewebe getrocknet. Nach 2 Wochen haben die embryogenen Kalli mehr als 80% ihres ursprünglichen Gewichtes verloren.
3. Lagerung der getrocknete embryogenen Kalli
Sobald die Kalli noch 15 ± 5% des Ausgangsgewichtes besitzen, können sie entweder für eine unbegrenzt lange Zeit bei -70°C oder bei -193°C unter Beibehaltung ihrer Lebensfähigkeit gelagert werden. Das Einbringen in flüssigen Stickstoff kann direkt oder über eine schrittweise Abkühlung erfolgen. Eine Abkühlung bei definiertem Temperaturabfall, beispielsweise 1°C/min ist nicht erforderlich.
4. Rehydratisierung der Embryonen
Zur Rehydratisierung und zur Wiederaufnahme des Wachstums werden die embryogenen Kalli auf Agar-Medium (N6-Medium mit 3% Saccharose) gebracht. Die Rehydratisierung und Revitalisierung gelingt auch auf anderen Medien, beispielsweise Murashige-Skoog-Medium (Physiol. Plant 15, 473 (1962)) und bei höheren Saccharosegehalten. Mit Ausnahme von Auxin-autotrophen Maiskulturen ist ein Gehalt von 0,5-2 mg/l 2,4 Dichlorphenoxyessigsäure oder 3,6-Dichlororthoanissäure (Dicamba) im Medium vorteilhaft. Innerhalb von einer halben Stunde nehmen die Kalli aus dem Medium das beim Trocknen verlorene Wasser wieder auf. Gewebeteile, die aus somatischen Embryonen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien bestehen, sind imstande weiter zu wachsen.
Die rehydratisierten Gewebe werden zunächst 7 Tage bei 25 ± 2° im Dunkeln und dann bei ∼1000-3000 Lux/12 h Photoperiode kultiviert. Im Licht ergrünen die überlebenden embryogenen Kallusbereiche innerhalb von 7-10 Tagen. Die ergrünten Gewebe bzw. Gewebe mit sichtbarem Wachstum werden 2-3 Wochen nach der Wiederbefeuchtung auf frisches Medium transferiert.
5. Transformation der embryogenen Kalli
Auf das Agarmedium (N6-Medium mit 1 mg/l 2,4 Dichlorphenoxyessigsäure und 3% Saccharose) wird die DNA-Lösung in Tropfen von 20-50 µl, je nach Größe der getrockneten Kallusfragmente, pipettiert. Die Transformationslösung enthält 20 µg Plasmid-DNA/ml. Sie wird durch Mischen einer doppelt konzentrierten DNA- Stammlösung in TE-Puffer (10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 7,0) mit flüssigem N6-Medium im Verhältnis 1 : 1 unmittelbar vor Gebrauch hergestellt. Zur Transformation wird das unten angegebene synthetische Phosphinothricin-acetyltransferasegen unter der Kontrolle des Promotors des 35 S-Transcripts des cauliflower-Mosaic-Virus (vgl. Sequenzausdruck unten), bzw. das synthetische Gen aus der Europäischen Patentanmeldung EP 02 75 957 verwendet. Dieses chimäre Gen ist in die EcoR1-site des Polylinkers von pUC18 integriert.
Es wird in der Mehrzahl der Experimente ungeschnittenes pUC18-35S Acetyltransferase-Plasmid verwendet. In einzelnen Experimenten wird das Plasmid mit EcoR1 gespalten und die Mischung von linearisiertem puc 18-Plasmid und dem 1,1 Kb, 35S-Acetyltransferase-Insert zur Transformation verwendet.
Die trockenen embryogenen Kalli werden in die die DNA enthaltenden Tropfen auf das Agarmedium gelegt. Embryogener Kallus, der im getrockneten Zustand größer als 3 mm ist, wird durch ein Sieb von den kleineren Stücken abgetrennt. Die kleinen Fragmente werden ohne weitere Vorbehandlung verwendet. Die größeren Fragmente werden in getrocknetem Zustand entweder durch vorsichtiges Mörsern zerkleinert oder durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff vorbehandelt. Auf diese Weise entstehen in den trockenen embryogenen Kalli Risse, die das Eindringen der Transformationslösung in tiefere Gewebeschichten begünstigt. Innerhalb von 15-30 min saugen die Kalli die DNA-Lösung auf. Die Kalli können dann wie im Beispiel 4 beschrieben weiterkultiviert werden. Es erwies sich als vorteilhaft, die Kalli 2 bis 24 h nach der Rehydratisierung für 5-20 sec mit kurzwelligem UV-Licht zu bestrahlen. Dazu werden die Petrischalen in geöffnetem Zustand auf einen UV-Transiluminator (254 nm; 8000 µW/cm2) in der Weise gelegt, daß die Kalli dem UV-Licht direkt ausgesetzt sind.
Sequenz Phosphinothricinacetyltransferasegen
6. Kultivierung der DNA-behandelten Gewebe
Die Kultivierung erfolgt während der ersten 4 Wochen in identischer Weise wie die der untransformierten embryogenen Kalli (s. Beispiel 4). Danach werden die überlebenden embryogenen Kallusfragmente auf ein modifiziertes N6-Medium, das frei von Glutamin und Caseinhydrolysat ist, aber 20 mg/l L-Phosphinothricin enthält, umgesetzt. Durch diese Phosphinothricinmenge wird embryogenes, nicht transformiertes Gewebe nicht sofort abgetötet, sondern übernimmt die Funktion einer Ammenkultur für die stabiltransformierten Zellen in dem Gewebeverband. Hierbei ist die Phosphinothricinkonzentration hinreichend hoch, um nur ein sehr schwaches Wachstum der nicht transformierten Zellen zu ermöglichen. Transgene Maiszellen, die das Phosphinothricin-acetyltransferasegen exprimieren, haben einen selektiven Vorteil und können sich in der Zellpopulation anreichern.
Da die Selektion auf Expression des Markergens frühestens 4 Wochen nach der Transformation beginnt, spielt eine mögliche transiente Expression der übertragenen DNA nur eine untergeordnete Rolle. Nach 4-6 Wochen werden die embryogenen Kalli auf frisches N6-Medium mit 20 mg/l L-Phosphinothricin umgesetzt.
Nach einer Kultivierungsdauer von insgesamt 8-10 Wochen in Anwesenheit von 20 mg/l (1×10-4 M -L-Phosphinothricin-NH4) zeigt nicht transgenes Maisgewebe auf aminosäurefreiem Medium kein Wachstum. Einige Kalli überleben diese Selektion. Diese Stücke werden auf frisches N6-Medium mit 100 mg/l L-Phosphinothricin-Ammonium transferiert. 2 aus ca. 10 000 Kallusstückchen zeigen ein dem Kontrollkallus auf Phosphinothricin-freiem Medium vergleichbares Wachstum. Nur diese Gewebe werden für die weitere biochemische Charakterisierung und für Regenerationsversuche herangezogen.
7. Aufzucht transgener Regeneratpflanzen
Das embryogene transformierte Maisgewebe wird auf hormonfreiem N6-Medium in Gegenwart von 5×10-4 M L-Phosphinothricin kultiviert. Auf diesem Medium entwickeln sich Maisembryonen, die das Phosphinothricin- Acetyltransferase-Gen (PAT-Gen) hinreichend stark exprimieren, zu Pflanzen. Nicht transformierte Embryonen oder solche mit nur sehr schwacher PAT-Aktivität sterben ab. Sobald die Blätter der in vitro-Pflanzen eine Länge von 4-6 mm erreicht haben, können diese in Erde transferiert werden. Nach Abwaschen von Agarresten an den Wurzeln werden die Pflanzen in ein Gemisch von Lehm, Sand, Vermiculit und Einheitserde im Verhältnis 3 : 1 : 1 : 1 gepflanzt und während der ersten 3 Tage nach dem Verpflanzen bei 90-100% relativer Luftfeuchte an die Erdkultur adaptiert. Die Anzucht erfolgt in einer Klimakammer mit 14 h Lichtperiode ca. 25 000 Lux in Pflanzenhöhe bei einer Tag/Nachttemperatur von 23 ± 2/17 ± 1°C. Die adaptierten Pflanzen werden bei einer Luftfeuchte von 65 ± 5% kultiviert.
8. Expressionsnachweis des übertragenen Phosphinothricinacetyl-transferase Gens
a) Besprühen der transgenen Pflanzen mit Phosphinothricin
3-4 Wochen nach dem Transfer in Erde werden transgene Regeneratpflanzen und als Kontrollen Regeneratpflanzen aus nicht mit DNA-behandelten Kalli mit Phosphinothricin in den handelsüblichen Formulierungen (Basta ®), besprüht. Es wird eine Phosphinothricinmenge verwendet, die der Behandlung mit 2,0 kg Wirkstoff/ha entspricht. Das Herbizid wird in einer Wassermenge von 50 ml/m2 ( 500 l/ha) ausgebracht. Von dieser Phosphinothricinmenge werden Pflanzen ohne PAT-Aktivität innerhalb von 7-10 Tagen abgetötet. Dagegen werden Maispflanzen mit PAT-Aktivität in Abhängigkeit vom Expressionsgrad des Gens entweder überhaupt nicht geschädigt oder, im Falle niedriger PAT-Aktivität, werden lokale Blattflecken sichtbar, die aber das Wachstum der behandelten Pflanzen nicht meßbar beeinflussen.
b) Jeweils 100-mg-Proben von Maiskallus und Blattgewebe werden in 1,5-ml-Reaktionsgefäßen in flüssigem Stickstoff eingefroren und mit einem der Gefäßform angepaßten Mikropistill aus Edelstahl homogenisiert. Dazu wird 100 µl TRIS-EDTA-Puffer (50 mM Tris/2 mM EDTA pH 7,5) zugesetzt. Das Homogenat wird bei 12 000 Upm eine Minute in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der klare Überstand wird abpipettiert und das Pellet verworfen. Es wird der Proteingehalt des Rohextraktes mittels des Bio-Rad Proteinassays ermittelt. Für den PAT-Test werden Aliquots der Rohextrakte genommen, die jeweils 20 µg Protein enthalten. Den Extrakten werden Acetyl-Co-A und 14C-L-Phosphinothricin zugesetzt. Die Endkonzentration im Inkubationsgemisch beträgt 1 mM für Acetyl-Co-A und 0,1 mM für 14C-L-Phosphinothricin. Die Proben werden kurz gemischt und bei 37°C 1 h inkubiert. Danach wird die Embryoreaktion durch Zugabe von 1/2 Vol 12% Trichloressigsäure gestoppt, gut gemischt und 10 min auf Eis gestellt. Danach wird bei 12 000 Upm 10 min zentrifugiert und der Überstand für die DC verwendet. Auf eine Dünnschichtplatte (Cellulose F254, Fa. Merck) werden je 6 µl der Inkubationsgemische aufgetragen, ebenso die Referenzsubstanzen 14C-Phosphinothricin und 14C-Acetylphosphinothricin. Als Laufmittel für die Dünnschichtchromatographie wird entweder n-Propanol: 25% NH3 (3 : 2) oder Pyridin : n-Butanol : Eisessig : Wasser (3 : 5 : 1 : 4) verwendet.
Die getrocknete Dünnschichtplatte wird in Kunststoffolie verpackt und in einer Röntgenfilmkassette exponiert. Auf dem entwickelten Röntgenfilm ist die PAT-Aktivität an der (nur im transgenen Gewebe vorkommenden) Acetyl- Phosphinothricin Bande erkennbar. Phosphinothricin und Acetylphosphinothricin sind dünnschichtchromatographisch in den obengenannten Laufmitteln gut trennbar.

Claims (17)

1. Verfahren zur Transformation von Embryonen, dadurch gekennzeichnet, daß unreife somatische Embryonen in getrocknetem Zustand mit einer DNA- oder RNA enthaltenden Lösung inkubiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß somatische Embryonen aus embryogenen Kalluskulturen eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß somatische Embryonen aus Organkulturen eingesetzt werden.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß somatische Embryonen von monokotylen Pflanzen eingesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß somatische Embryonen von Gramineen eingesetzt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß somatische Embryonen von Mais eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die somatischen Embryonen vor der Inkubation mit DNA- oder RNA-Lösung auf einem Nährmedium mit einem Zucker- oder Zuckeralkoholgehalt des Nährmediums, kultiviert werden.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als DNA das Phosphinothricinacetyltransferasegen aus Streptomyces viridochromogenes gegebenenfalls in modifizierter Form eingesetzt wird.
9. Transformierte somatische monokotyle Embryonen.
10. Transformierte somatische Embryonen aus Gramineen.
11. Transformierte somatische Maisembryonen.
12. Somatische Maisembryonen, enthaltend das Phosphinothricinacetyltransferasegen.
13. Pflanzen erhältlich aus den somatischen Embryonen nach Anspruch 9 bis 12.
14. Verwendung der nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 erhältlichen transformierten Embryonen zur Herstellung von artifiziellem Saatgut.
15. Verwendung getrockneter somatischer Embryonen als artifizielles Saatgut.
16. Verwendung der nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 erhältlichen transformierten somatischen Embryonen zur Regenerierung und Züchtung fertiler transgener Nutzpflanzen.
17. Verfahren zum Schutz von monokotylen Pflanzen durch selektive Vernichtung von Unkraut mit Phosphinothricin auf Anbauflächen, dadurch gekennzeichnet, daß die Anbaufläche mit Pflanzen erhältlich aus den somatischen Embryonen nach Anspruch 12 sowie deren Nachkommen bepflanzt wird.
DE19904013099 1990-04-25 1990-04-25 Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen Withdrawn DE4013099A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19904013099 DE4013099A1 (de) 1990-04-25 1990-04-25 Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
FR9104984A FR2661421A1 (fr) 1990-04-25 1991-04-23 Procede pour la transformation d'embryons somatiques de plantes utiles.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19904013099 DE4013099A1 (de) 1990-04-25 1990-04-25 Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE4013099A1 true DE4013099A1 (de) 1991-10-31

Family

ID=6405010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19904013099 Withdrawn DE4013099A1 (de) 1990-04-25 1990-04-25 Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE4013099A1 (de)
FR (1) FR2661421A1 (de)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992009696A1 (en) * 1990-11-23 1992-06-11 Plant Genetic Systems, N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
EP0586355A2 (de) * 1992-08-19 1994-03-09 Monsanto Company Verfahren zur Transformation monokotyler Pflanzen
WO1995006128A2 (en) * 1993-08-25 1995-03-02 Dekalb Genetics Corporation Fertile, transgenic maize plants and methods for their production
WO1996004392A2 (en) * 1994-07-29 1996-02-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transgenic cereal plants
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5554798A (en) * 1990-01-22 1996-09-10 Dekalb Genetics Corporation Fertile glyphosate-resistant transgenic corn plants
US5736369A (en) * 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
WO1998052411A1 (en) * 1997-05-20 1998-11-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cryopreservation of embryogenic callus
US6271016B1 (en) 1993-08-25 2001-08-07 Dekalb Genetics Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US6329574B1 (en) 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
EP1424887A1 (de) * 2001-08-24 2004-06-09 BASF Plant Science GmbH In-planta-transformation durch aufnahme von agrobakterium durch den embryo
US6777589B1 (en) 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6025545A (en) 1990-01-22 2000-02-15 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6326527B1 (en) 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
US6040497A (en) * 1997-04-03 2000-03-21 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
DK0975778T3 (da) 1997-04-03 2007-10-08 Dekalb Genetics Corp Anvendelse af glyphostat-resistende majslinier
EP1934354B1 (de) 2005-10-13 2017-11-08 Monsanto Technology, LLC Verfahren zur herstellung von hybridsaat
WO2013006472A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selective regulation of protein expression

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN87100603A (zh) * 1987-01-21 1988-08-10 昂科公司 抗黑素瘤疫苗
CH670655A5 (de) * 1987-01-29 1989-06-30 Inst Botan Im N G Kholodnogo A
DK240088A (da) * 1987-05-05 1988-11-06 Sandoz Ag Fremgangsmaade til transformation af et plantecellematerale
DE3715958A1 (de) * 1987-05-13 1988-11-24 Hoechst Ag Herbizidresistente kulturpflanzen, verfahren zu deren selektion und deren regeneration
EP0362244B1 (de) * 1987-05-22 1994-04-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Embryonen von nutzpflanzen als aufnahmesystem für fremde genetische information
FI890917A (fi) * 1988-03-02 1989-09-03 Eidgenoess Tech Hochschule Foerfarande foer framstaellning av transgena vaexter.
GB8806643D0 (en) * 1988-03-21 1988-04-20 Ici Plc Genetic manipulation
NL8801444A (nl) * 1988-06-06 1990-01-02 Solvay Werkwijze voor het genetisch transformeren van cellen van een multicellulair eukaryotisch organisme.
ZA901241B (en) * 1989-02-17 1991-10-30 United Agriseeds Inc Method for increasing the ability of maize to undergo androgenesis,and products produced therefrom
WO1991002071A2 (en) * 1989-08-09 1991-02-21 Dekalb Plant Genetics Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
CA2074355C (en) * 1990-01-22 2008-10-28 Ronald C. Lundquist Method of producing fertile transgenic corn plants

Cited By (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6803499B1 (en) 1989-08-09 2004-10-12 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5554798A (en) * 1990-01-22 1996-09-10 Dekalb Genetics Corporation Fertile glyphosate-resistant transgenic corn plants
US6777589B1 (en) 1990-01-22 2004-08-17 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6329574B1 (en) 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
US5919675A (en) * 1990-04-17 1999-07-06 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5969213A (en) * 1990-04-17 1999-10-19 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6399861B1 (en) 1990-04-17 2002-06-04 Dekalb Genetics Corp. Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
EP0955371A3 (de) * 1990-11-23 1999-12-01 Plant Genetic Systems N.V. Verfahren zur Transformation monokotyler Pflanzen
US6002070A (en) * 1990-11-23 1999-12-14 Plant Genetic Systems, N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
US5641664A (en) * 1990-11-23 1997-06-24 Plant Genetic Systems, N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
US6074877A (en) * 1990-11-23 2000-06-13 Plant Genetic Systems, Nv Process for transforming monocotyledonous plants
WO1992009696A1 (en) * 1990-11-23 1992-06-11 Plant Genetic Systems, N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
US5712135A (en) * 1990-11-23 1998-01-27 Plant Genetic Systems, N.V. Process for transforming monocotyledonous plants
EP0955371A2 (de) * 1990-11-23 1999-11-10 Plant Genetic Systems N.V. Verfahren zur Transformation monokotyler Pflanzen
EP0586355A3 (en) * 1992-08-19 1994-07-13 Monsanto Co Method for transforming monocotyledonous plants
EP0586355A2 (de) * 1992-08-19 1994-03-09 Monsanto Company Verfahren zur Transformation monokotyler Pflanzen
US6271016B1 (en) 1993-08-25 2001-08-07 Dekalb Genetics Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
WO1995006128A2 (en) * 1993-08-25 1995-03-02 Dekalb Genetics Corporation Fertile, transgenic maize plants and methods for their production
US5780709A (en) * 1993-08-25 1998-07-14 Dekalb Genetics Corporation Transgenic maize with increased mannitol content
WO1995006128A3 (en) * 1993-08-25 1995-09-14 Dekalb Genetics Corp Fertile, transgenic maize plants and methods for their production
US7288403B2 (en) 1993-08-25 2007-10-30 Anderson Paul C Anthranilate synthase gene and method for increasing tryptophan production
WO1996004392A2 (en) * 1994-07-29 1996-02-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transgenic cereal plants
US5736369A (en) * 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
WO1996004392A3 (en) * 1994-07-29 1996-03-28 Pioneer Hi Bred Int Transgenic cereal plants
US6143563A (en) * 1997-05-20 2000-11-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cryopreservation of embryogenic callus
WO1998052411A1 (en) * 1997-05-20 1998-11-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cryopreservation of embryogenic callus
EP1424887A1 (de) * 2001-08-24 2004-06-09 BASF Plant Science GmbH In-planta-transformation durch aufnahme von agrobakterium durch den embryo
EP1424887A4 (de) * 2001-08-24 2006-05-17 Basf Plant Science Gmbh In-planta-transformation durch aufnahme von agrobakterium durch den embryo

Also Published As

Publication number Publication date
FR2661421A1 (fr) 1991-10-31
FR2661421B1 (de) 1995-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE4013099A1 (de) Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
DE69434744T3 (de) Positive selektion auf mannose oder xylose basierend
DE60033959T2 (de) Regenerierung und transformation von zuckerrüben
DE69429012T2 (de) Transformation von musa-arten durch verwendung von agrobacterium tumefaciens
DE69229556T3 (de) Verfahren zur selektion genetisch transformierter zellen und dafür verwendbare verbindungen
DE69617749T2 (de) Transformation von baumwollpflanzen
DE69325389T2 (de) Verfahren zur stabile transformation von weizen
DE69332338T2 (de) Verfahren zur genetische einkreisung von pflanzen
DE69031711T2 (de) Methoden und zusammensetzungen für die herstellung von stabil transformierten, fruchtbaren mais pflanzen und zellen dafür
Chupeau et al. Transgenic plants of lettuce (Lactuca sativa) obtained through electroporation of protoplasts
DE69232132T2 (de) Verfahren zur schöpfung einer transformierten reispflanze
DE69826596T2 (de) Verbesserte methode zur transformation von pflanzen
DE60024607T2 (de) Pflanzentransformationsverfahren
KR20000067901A (ko) 식물의 성장 및 수율을 증가시키는 방법
EP0301316B1 (de) Verfahren zum Gentransfer in Pflanzen
DE69931050T2 (de) Brassica-transformation durch teilchenbeschuss
EP0469273B1 (de) Fertile transgene Maispflanzen mit artfremdem Gen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
DE60219673T2 (de) Förderung der somatischen embryogenese in pflanzen durch wuschel-genexpression
DE69924005T2 (de) Transgene pflanzen mit konditional lethalem gen
CN1098029C (zh) 使用固体培养基的基于花粉的转化系统
WO1998013504A1 (de) Verfahren zur herstellung weiblich steriler pflanzen
DE69828051T2 (de) Resistenzmarker für einkeimblättrige pflanzen
DE102005007311B4 (de) Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit verminderter Ruheperiode
KR100850525B1 (ko) 선인장의 형질전환 방법
DE10015458A1 (de) Verfahren zur raschen Herstellung von transgenen, markergen-freien Pflanzen

Legal Events

Date Code Title Description
8130 Withdrawal