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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Sulfonamid-Resistenzgenen
als Selektionsmarker in Weizen.
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Die
Verwendung der DNA-Rekombinationstechnologie auf dem Gebiet der
Landwirtschaft wird zunehmend wichtiger. Die Anwendung dieser Technologie
bei Monokotyledonen-Arten, wie Weizen, Mais, Reis und Gerste, war
zu Beginn durch ein Fehlen geeigneter Transformationstechniken behindert.
Gordon-Kamm et al. (Plant Cell, 2: 603-618 (1990)) beschrieben eine
stabile Transformation von Mais mit einer durch Mikroprojektil vermittelten
DNA-Abgabe. Anschließend
beschrieben Vasil et al. (Bio-technology, 10: 667-674 (1992)) die Transformation
von Weizen nach Mikroprojektilbeschuss von embryogenem Kallus. Die
Verwendung von unreifen Embryonen als Zielgewebe stellte verbesserte
Transformationsverfahren für
Weizen bereit (Weeks et al., Plant Physiol., 102: 1077-1084 (1993);
EP-A-0709462 (Monsanto)).
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Das
nptII-Gen, das eine Resistenz gegen das Antibiotikum Kanamycin verleiht,
ist der am weitesten verbreitete Selektionsmarker für die Transformation
von Dikotyledonen-Pflanzenarten. Kanamycin ist aufgrund der hohen
Toleranzwerte in diesen Arten gegen das Antibiotikum als Selektionsmittel
für Monokotyledonen-Transformation ungeeignet.
Zudem sorgte man sich in bestimmten Gegenden in Bezug auf die Verwendung
dieser Marker und die folgende Verwendung von Antibiotika für Selektionszwecke
auf dem Gebiet der Landwirtschaft. Diese Sorgen sind zwar gewissermaßen Fehl
am Platze, jedoch besteht die Tatsache, dass es kommerziell wünschenswert
ist, verfügbare
Marker zu besitzen, die nicht auf einem Antibiotikum beruhen. Folglich
musste man anderswo nach einem Markergen Ausschau halten, das sich
zur Verwendung in Monokotyledonen-Transformationssystemen eignet (Wilmink & Dons, Plant Molecular
Biology Reporter 11(2): 165-185 (1993)).
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Das
bar-Gen von Streptomyces hygroscopius, das Resistenz gegen die Herbizide
auf Phosphinothricin(PPT)-Basis Bialaphos und Basta verleiht, wurde
erfolgreich als Selektionsmarker für die Maistransformation verwendet
(Gordon-Kamm et al. (1990), siehe oben) und folglich war es die
erste Wahl als Selektionsmarker zur Entwicklung eines Weizentransformationssystems
(Vasil et al., Biotechnology, 11:1153-1158 (1993); Nehra et al.,
The Plant Journal 5(2): 285-297 (1994); und Becker et al., The Plant
Journal 5(2): 299-307 (1994)). Es treten jedoch Probleme bei der
Verwendung des bar-Gens als Selektionsmarker bei Weizen auf. Insbesondere die
Selektion ist ineffizient, was zu einer hohen Frequenz von untransformierten
Sprossen führt,
die bei der Selektion regenerieren und die eine weitere Untersuchung
(beispielsweise durch PCR-Analyse oder Enzymtest) der regenerierten
Sprosse erfordern, damit diejenigen identifiziert werden, die das
Markergen tragen.
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Eine
Anzahl von Faktoren kann für
die Schwierigkeiten, die bei der Anwendung einer Selektion auf PPT-Basis
zur Monokotyledonen-Transformation, insbesondere Weizentransformation,
auftreten, verantwortlich sein. PPT wirkt durch Hemmung der Glutaminsynthetase,
eines Enzyms, das beim Stickstoff-Metabolismus eine regulatorische Schlüsselrolle
spielt. Dekeyser et al. (Plant Physiol., 90: 217-223 (1989)) beschrieben, dass
Aminosäuren
in dem Kulturmedium das Wachstum untransformierter Reiskalli in
der Gegenwart von PPT ermöglichten.
Sie fanden, dass Glutamin und andere Aminosäuren aus dem Kulturmedium weggelassen
werden müssen,
damit eine Selektion auf PPT-Basis effizient ist. Diese Medienkomponenten
können
jedoch für eine
erfolgreiche Sprossregeneration erforderlich sein.
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Das
bar-Gen verleiht zudem Resistenz gegen Herbizide auf PPT-Basis,
indem es ein Enzym, die Phosphinothricinacteyltransferase (PAT),
kodiert, die das PPT durch Acetylierung entgiftet. Ein Problem von Selektionssystemen
auf der Basis dieses Typs von Resistenzmechanismus ist, dass untransformiertes
Gewebe durch umgebende transformierte Zellen geschützt werden
kann (Wilmink & Dons,
(1993) siehe oben). Durch die Entgiftung wird die wirksame Konzentration
des Herbizids in der Nähe
der transformierten Zellen gesenkt. Ein solcher "Kreuz-Schutz" ermöglicht
die Regeneration untransformierter Zellen, die zu Kulturflüchtlingen
führt.
Christou et al. (Biotechnology, 9, 957-962 (1991)) beobachteten
nicht transformiertes Gewebe von Reis mit einer Regenerationskapazität gleich
der von transformiertem Gewebe, als Folge der Entgiftung des Selektionsmittels
durch transformierte Zellen.
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Schließlich werden
Basta-Markersysteme und tatsächlich
die Basta-Resistenz als Maßnahme
zur Unkrautbekämpfung
ausgiebig bei Ölraps-Kulturen
genutzt, die oft in Fruchtfolge mit Weizenkulturen angebaut werden.
Saatgut von der vorhergehenden Kultur ist oft eindeutig im Boden
vorhanden und stellt das Potential für "Unkraut"-Wachstum während der nächsten Kulturfolge dar. Wenn
die Basta-Resistenz sowohl in Raps als auch in Weizen gentechnisch
erzeugt wurde, dann ist die Verwendung des Herbizids gegen solche "Unkräuter" nicht wirksam.
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Ein
weiterer Vorteil der Verwendung eines Sulfonamidresistenzgens als
Selektionsmarkergen in Weizen ist, dass die Anzahl der beobachteten
Insertionsstellen niedriger ist als man es bei der Verwendung der Bialaphos-Resistenz
als Selektionsmarker beobachtet. Dies ist für die Vermarktung transgener
Pflanzen vorteilhaft.
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Man
möchte
gerne transgene Pflanzen vermarkten, bei denen nur das interessierende
Gen ohne jegliche andere DNA-Sequenzen, die mit dem Transformationsverfahren
einhergehen, in das Pflanzengenom integriert ist. Diese anderen
Sequenzen beinhalten das Selektionsmarkergen, das während des Transformationsverfahrens
zur effizienten Gewinnung transgener Regeneranten erforderlich ist.
Die Abwesenheit von äußeren Sequenzen
aus der kommerziellen transgenen Kultur ist für ein Akzeptieren der Öffentlichkeit
wichtig. Werden zudem mehrere Herbizid-Resistenzgene zur Herstellung von transgenem
Weizen verwendet, kann, wenn diese dereguliert sind und bei herkömmlichen
Kreuzungsprogrammen verwendet werden, der vielfach resistente Weizen
ein Unkraut-Problem darstellen.
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Die
Integrationsstelle für
die Transgene ist statistisch. Der Selektionsmarker kann an einer
Stelle integriert sein, die mit dem interessierenden Gen gekoppelt
ist oder von diesem entfernt ist. Vorteilhafterweise hat man Selektionsmarker
an wenigen Stellen, da dann eine größere Möglichkeit besteht, dass die
Stellen nicht mit dem interessierenden Gen gekoppelt sind und sich
somit bei der Meiose davon abspalten.
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Daher
besteht ein stetiger Bedarf an der Bereitstellung geeigneter Selektionsmarker
zur Verwendung bei Weizentransformationssystemen. Zur Zeit gibt
es sehr wenige solcher Marker, und dies beschränkt schließlich die Zahl der genetischen
Transformationen, die mit dem Weizen durchgeführt werden können. D.h.
jedes Mal, wenn eine neue genetische Modifikation eingebracht wird,
ist ein gesonderter Marker, beispielsweise Resistenzmarker, erforderlich.
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EP-A-0369637
beschreibt Sulfonamid-Herbizid-Resistenzgene
und ihre Verwendbarkeit bei Transformationssystemen von Dikotyledonen
und Monokotyledonen. Bestimmte aufgeführte Monokotyledonen-Arten beinhalten
Weizen. Die einzigen bereitgestellten Beispiele betreffen jedoch
die Dikotyledonen-Arten, und ungeachtet der Anmerkung in dieser
Veröffentlichung
bezüglich
der Verwendung bei Monokotyledonen, würde der Fachmann beim Anmeldezeitpunkt
dieser Anmeldung nicht die Probleme gekannt haben, die bei Monokotyledonen-Transformationssystemen
vorkommen. Da es wie bereits erörtert
mittlerweile eindeutig ist, dass die Verwendung eines Dikotyledonen-Markersystems
in einer Monokotyledonen-Art bestenfalls zu einer Ineffizienz einer
Sorte führen
kann, ist es klar, dass diese frühere
Anmeldung im Zusammenhang mit Monokotyledonen nicht glaubwürdig war.
Tatsächlich
ist es klar, dass bisher keine Berichte zur Verwendung eines Sulfonamid-Resistenzmarkersystems
in einer Monokotyledonen-Art vorliegen.
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Somit
ermöglicht
die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Sulfonamid-Resistenzgens
als Selektionsmarker in einer Weizenart. Geeigneterweise wird das
Sulfonamid-Resistenzgen als DNA-Konstrukt bereitgestellt, das eine
modifizierte Dihydropteratsynthase (DHPS) kodiert, beispielsweise
mit einer Aminosäuresequenz,
wie sie in EP-B-0369637 beschrieben ist (wie in 1 hier
gezeigt), oder einer Sequenz, die durch ein oder mehrere Aminosäure-Insertionen und/oder
-Deletionen modifiziert ist, vorausgesetzt, dass Resistenz gegen
mindestens ein Sulfonamid auf eine Zelle übertragen wird, wenn das Gen
darin exprimiert wird. Zudem können
sogenannte synthetische Gene für
Sulfonamidresistenz verwendet werden. Dies können Sequenzen sein, die zur
Codonnutzung einer bestimmten Pflanzenart modifiziert sind, oder
an diese angepasst sind, so dass eine effiziente Expression gewährleistet
wird.
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Das
Sulfonamidresistenzgen umfasst auch ausreichende regulatorische
Sequenzen, die eine korrekte Expression gewährleisten, beispielsweise einen
geeigneten Pflanzenpromotor. Beispiele für geeignete Promotoren umfassen
den 35S-Promotor von Blumenkohlmosaikvirus, die Adh1- und Emu-Promotoren
von Mais, den Aktinpromotor Act1 aus Reis, und den Ubiquitin-Promotor
Ubi aus Mais. Das Sulfonamidresistenzgen kann weiterhin eine Sequenz
umfassen, die ein Transitpeptid kodiert, welches sich aus der modifizierten
DHPS spalten lässt,
die direkt an das 5'-Ende
des Resistenzgens gebunden ist. Ein Beispiel für ein geeignetes Transitpeptid
ist Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase.
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Somit
ermöglicht
die Erfindung die Verwendung eines Genkonstrukts, umfassend:
- (a) einen Pflanzenpromotor
- (b) ein Sulfonamidresistenzgen, das eine modifizierte DHPS kodiert;
und
- (c) eine Sequenz, die ein Transitpeptid kodiert, das sich aus
der modifizierten DHPS spalten lässt,
die direkt an das 5'-Ende
des Resistenzgens gebunden ist. als Selektionsmarker in einer Weizenart.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Monokotyledonen-Pflanzenvermehrungsmaterial
bereit, das mindestens eine Zelle enthält, die mit einem DNA-Konstrukt transformiert
ist, wie es hier definiert ist, wobei das Vermehrungsmaterial aus
Weizen stammt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine transgene Weizenpflanze bereit,
beispielsweise eine Weizenpflanze, deren Zellen ein DNA-Konstrukt
wie hier definiert enthält.
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In
einem weiteren Aspekt ermöglicht
die vorliegende Erfindung die Unkrautbekämpfung an einer Stelle, an
der ein oder mehrere erfindungsgemäße transgene Pflanze gezüchtet werden,
umfassend den Schritt Aufbringen einer wirksamen Menge eines Herbizids,
das durch Hemmung der DHPS wirkt, beispielsweise Asulam, auf die
Stelle.
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Bei
einem letzten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
einer Weizenpflanze bereit, die gegenüber mindestens einem Sulfonamid
resistent ist, umfassend:
- (a) Transformieren
oder Transfizieren einer oder mehrerer Zellen, die von einer Weizenpflanze
stammen, mit einem DNA-Konstrukt wie es hier definiert ist;
- (b) Vermehren der transformierten oder transfizierten Zellen
von (a) zur Herstellung einer oder mehrerer transgener Pflanzen;
und
- (c) Selektieren derjenigen Pflanzen, die gegenüber einem
oder mehreren Sulfonamidherbiziden resistent sind.
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Bevorzugte
Eigenschaften jedes Aspekts der Erfindung sind wie für jeden
anderen Aspekt nach den nötigen Änderungen.
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Die
Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die
keineswegs als Einschränkung
der Erfindung aufgefasst werden sollen.
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Bei
den hier enthaltenen Figuren zeigt:
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1:
die Aminosäuresequenz
einer bevorzugten modifizierten DHPS; und
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2:
die Schritte bei der Konstruktion von Plasmid pWP258.
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BEISPIEL 1: Regeneration
transgener Weizenpflanzen mit Bialaphos-Resistenz als Selektionsmarker
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Kallus-Induktion, Erhaltung
und Regeneration
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Das
Gewebekulturprotokoll war im Wesentlichen wie das Verfahren von
Weeks et al. (Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993)). Donor-Pflanzen
der südamerikanischen
Frühlingsweizenlinie
mit der Bezeichnung NB1, erhalten von Nickerson Seeds Limited, wurden
in einem Gewächshaus
unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet. Unreife Ähren wurden
14-20 Tage nach der Anthese geerntet, und die unreifen Karyopsen
wurden aus der Ähre
entnommen und mit einer Pinzette geschält. Die Karyopsen wurden für 2 min
mit 70% Ethanol und für
20 bis 30 min mit 20% DomestosTM (Lever,
UK) an der Oberfläche
sterilisiert, und dann mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen.
Unreife Embryonen wurden aseptisch unter einem Stereoseziermikroskop isoliert
und mit der Scutella zuoberst auf W3-Medium (MS, angereichert mit
20 g/l Saccharose und 2 mg/l 2,4-D und
mit 6 g/l Typ I-Agarose [Sigma, Poole, UK]) untergebracht. Die Kulturen
wurden mit einer 16 Std. Photoperiode 5 Tage lang vor dem Beschuss
bei 25°C
gehalten.
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Nach
dem Beschuss wurden die Embryonen auf Selektionsmedium W31B (W3
plus 1 mg/l Bialaphos [Meija Seika Kaisha Ltd., Yokohama]) überführt. Die
Embryonen wurden alle 2 Wochen in frisches W31B-Medium überführt. Sechs
Wochen nach dem Beschuss wurden sämtliche Embryonen mit embryogenem
Kallus auf Regenerationsmedium WR1B (MS, angereichert mit 20 g/l
Saccharose und 1 mg/l Bialaphos, und verfestigt mit 6 g/l Typ I-Agarose
[Sigma, Poole, UK]) überführt. Regenerierte
Sprosse wurde in Wurzelbildungsmedium überführt, das aus 0,5 × MS mit
1 mg/l Bialaphos (1/2 MS1B) bestand. Die Sprosse, die auf 1/2MS1B
Wurzeln erzeugten, wurden auf MS20 (MS-Medium mit 20 g/l Saccharose) überführt.
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Die
Setzlinge wurden von MS20 auf Torf überführt. Proben von Blattgewebe
wurden von diesen Setzlingen zur DNA-Analyse durch Polymerasekettenreaktion
(PCR) entnommen. Die Pflanzen wurden nach der Anzucht in das Gewächshaus überführt, und
weiteres Blattgewebe wurde zur DNA-Analyse durch Southern-Blot entnommen.
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Plasmid-DNA
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Ein
Cotransformationssystem wurde verwendet, wobei das Selektionsmarkergen
und das interessierende Gen auf gesonderten Plasmiden vorlagen.
Das bar-Gen von Streptomyces hygroscopius, das Resistenz gegenüber dem
Herbizid Bialaphos verleiht, befand sich auf dem Plasmid pDM302
(Cao et al., Plant Cell Reports, 11: 586-591 (1992)) unter der Kontrolle
des Aktin 1-(Act 1)-Promotors aus Reis (McElroy et al., Mol. Gen. Genet.,
231: 150-160 (1991)).
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Plasmid-DNA
wurde aus alkalisch lysierten Zellen durch CsCl-Gradienten gereinigt
und bei einer Konzentration von 1 μg/μl in Tris-EDTA-Puffer, pH-Wert
8,0, aufbewahrt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)).
Ein 1:1 Gemisch der beiden Plasmide, die cotransformiert werden
sollen, wurde unmittelbar vor der Beschichtung der Mikroprojektile
hergestellt.
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Mikroprojektil-Beschuss
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Vor
dem Beschuss wurden Wolfram-Teilchen (M10; Sylvania, Towanda, PA,
USA) sterilisiert und durch ein von Finer et al. (Plant Cell Reports,
11: 323-328 (1992)) angepasstes Verfahren mit Plasmid-DNA beschichtet.
50 mg Wolframteilchen wurden in 500 μl 95% Ethanol sterilisiert.
Nach 20 min wurden die Teilchen in einer Mikrozentrifuge pelletiert,
viermal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen, dann in 500 μl sterilem
destilliertem Wasser resuspendiert. 25 μl resuspendierte Teilchen, 7 μl Plasmid-DNA (1 μg/μl), 25 μl 2,5 M CaCl2 und 10 μl
100 mM Spermidin wurden gemischt. Nach 5 min bei 4°C wurden
25 μl Überstand
entfernt und verworfen.
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Der
Beschuss erfolgte mit einer Teilchen-Einschusspistole (PIG) wie von Finer
et al. (siehe oben) beschrieben, wobei DNA-beschichtete Teilchen
mit druckbeaufschlagtem Helium in Kombination mit einem partiellen
Vakuum beschleunigt werden. 2 μl
Teilchensuspension wurden auf dem Sieb auf der Spritzenfiltereinheit der
Vorrichtung untergebracht. Platten von Zielembryonen wurden auf
einer Ablage 17 cm unter der Spritzenfiltereinheit untergebracht.
Eine Prallplatte wurde zwischen Spritzenfiltereinheit und Zielgewebe
untergebracht. Ein Vakuum von 100 kPa wurde angelegt und die Teilchen
wurden entlassen, wenn das Helium (bei 80 psi) durch Aktivierung
des Solenoids durch das Zeigeber-Relais freigesetzt wurde.
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Weizen-DNA-Isolation und
Analyse
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Die
PCR-Analyse erfolgte mit genomischer DNA, die mit dem von Stacey
und Isaac (Methods in Molecular Biology, Bd. 28: Protocols for nucleic
acid analysis by nonradioactive probes, S. 9-15, Humana Press Inc.
Totawa, NJ (1994)) beschriebenen Minipräp-Verfahren aus 1-2 cm2 frischem Blattmaterial extrahiert wurde.
Die PCR-Reaktionen wurden mit Primern durchgeführt, die so entworfen waren,
dass sie ein 312 bp bar-Fragment amplifizierten (5'-TGCACCATCGTCAACCACTA-3' und 5'-ACAGCGACCACGCTCTTGAA-3'). Die Reaktionsbedingungen
waren wie folgt: "Heißer Start" (94°C, 3 min),
gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung (95°C, 30 sec.), Annealing (55°C, 30 sec.)
und Verlängerung
(65°C, 1
min), gefolgt von 1 Zyklus bei 75°C
(5 min) und dann Halten bei 24°C.
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Pflanzen,
die durch PCR als positiv getestet wurden, wurden durch Southern-Hybdidisierung
weiter analysiert. Die Southern-Analyse erfolgte mit DNA von einer
Extraktion im Vollmaßstab
(9 ml) aus lyophilisiertem gemahlenen Gewebe (Stacey und Isaac,
siehe oben). DNA-Proben wurden auf 0,2 mg/ml eingestellt und mit
dem Restriktionsenzym XhoI gespalten. Die Spaltung mit Restriktionsenzym,
Gelelektrophorese und Vakuum-Blotting erfolgten wie von Stacey und
Isaac (1994, siehe oben) beschrieben. Eine mit Digoxygenin markierte
bar-Sonde wurde gemäß den Verfahren
von McCreery und Helentjaris (Methods in Molecular Biology, Bd.
28: Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes,
S. 67-71, Humana Press Inc., Totawa NJ (1994)) durch PCR hergestellt.
Die Primer für
den 5'-Bereich des CaMV
35S-Promotors und das 3'-Ende
des bar kodierenden Bereichs wurden zur Markierung eines 1470 bp-Fragmentes von pBAR
+ INT, einem Plasmid auf pUC-Basis, hergeleitet von pJIT84 durch
Insertion des Mais-adh1-Introns
zwischen den 35S-Promotor und das bar-Gen, verwendet. Die Hybridisierung
der Sonde an den Southern-Blot
und die Erfassung durch Chemilumineszenz wurden gemäß den Verfahren
von McCreery und Helentjaris (Methods in Molecular Biology, Bd. 28:
Protocols for nucleic acid analysis by non-radioactive probes, S.
107-112, Humana Press Inc., Totawa, NJ (1994)) durchgeführt.
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ERGEBNISSE
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Die
Anzahl der Pflanzenlinien, die das bar-Gen enthalten, wurden als
Prozentsatz der Gesamtzahl an erzeugten Linien aufgezeichnet.
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BEISPIEL 2: ASULAM-TÖTUNGSKURVE
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Unreife
Embryonen wurden wie für
Beispiel 1 beschrieben isoliert, auf W3-Medium plattiert und im Dunkeln
gehalten. Nach 5-7 Tagen wurden die Embryonen auf W3-Medium, angereichert
mit Asulam (Rhone-Poulenc Agrochemicals, Ongar, UK) bei einem Konzentrationenbereich
zwischen 0 und 5 mg/l überführt und
bei 25°C
mit einer 16 Std. Photoperiode aufrechterhalten. Embryonen und von
Embryo hergeleitete embryogene Kalli wurden alle 2 Wochen in frisches
Selektionsmedium überführt.
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Die
Kalli wurden nach 6 Wochen auf embryogene Reaktion überprüft.
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Die
Auswirkung von Asulam auf die Produktion des embryogenen Kallus
durch unreife Embryonen von NB1, 1% embryogene
Reaktion = (Anz. Embryonen mit embryogenem Kallus/Gesamtanzahl der
plattierten Embryonen) × 100.
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BEISPIEL 3: Regeneration
von transgenen Weizenpflanzen mit Asulamresistenz als Selektionsmarker.
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Kallusinduktion, Erhaltung
und Regeneration
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Die
Embryonen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert und dann
5 Tage vor dem Beschuss bei 25°C
im Dunkeln gehalten. Nach dem Beschuss wurden die Embryonen bei
25°C mit
einer 16 Std. Photoperiode gezüchtet
und ohne Selektion auf W3-Medium gehalten. Eine Woche nach dem Beschuss
wurden die Embryonen in Selektionsmedium W32A (W3 plus 2 mg/l Asulam) überführt. Die
Embryonen wurden alle 2 Wochen in frisches W32A-Medium überführt. Nach
4 bis 6 Wochen auf der Selektion wurden sämtliche Embryonen mit embryogenem
Kallus in Regenerationsmedium WR (MS, angereichert mit 20 g/l Saccharose
und verfestigt mit 6 g/l Typ-I-Agarose [Sigma, Poole, UK]) mit Asulam
bei einer Konzentration von 0,1 bis 2,0 mg/l überführt. Nach 2 Wochen wurden sämtliche
Gewebe in frisches Regenerationsmedium überführt. Nach weiteren 2 Wochen
wurden sämtliche
Sprosse mit gut ausgebildeten Wurzeln in MS-Medium mit 20 g/l Saccharose überführt (MS20).
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Die
Setzlinge wurden von MS20 in Torf in Magenta GA7-Kulturgefäße (Magenta
Corp. Chicago, USA) überführt, und
vor dem Überführen in
das Gewächshaus
ließ man
sie angehen.
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Plasmid-DNA
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Ein
Cotransformationssystem wurde verwendet, wobei das Selektionsmarkergen
und das interessierende Gen auf getrennten Plasmiden vorlagen. Das
Sulfonamid-Resistenzmerkmal
befand sich auf dem Plasmid pWP258, umfassend das sul-Gen aus Plasmid
R46, das an eine Chloroplasten-Targetting-Sequenz unter der Kontrolle
des Reis-Aktin 1 (Act 1)-Promotors gebunden war. Das Plasmid pWP258
wurde durch das folgende in der 2 gezeigte
Verfahren konstruiert. Das Sulfonamidgen wurde als NcoI- (das stumpfendig
gemacht wurde, indem die Enden mit T4-DNA-Polymerase und dNTPs aufgefüllt wurden),
-SalI-Fragment aus pJIT92 isoliert (Guerineau et al., Plant Molecular
Biolgy, 15: 127-136 (1990). Dieses Fragment wurde zwischen die SphI-
(das mit T4-DNA-Polymerase
stumpfendig gemacht wurde) und die SalI-Stelle von pRPA-RD7 (EP-A-0652286, Rhone-Poulenc)
kloniert. Das gebildete Plasmid (pWP251) kodiert somit das optimierte
Chloroplasten-Transitpeptid (OPT) (EP-A-0652286, siehe oben), das im Leseraster
an das Sul-Gen gebunden ist. Die CaMV-Polyadenylierungssequenz von
pJIT118 (Guerineau et al., (1990) siehe oben) wurde dann zwischen
die SalI- und KpnI-Stellen von pWP257 kloniert. Schließlich wurde
das OPT-Sul-CaMV-PolyA-NcoI,
KpnI- (mit T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht) Fragment von pWP257
zwischen die NcoI- und EcoRV-Stellen
von pCOR112 kloniert (McElroy et al., Mol. Gen. Genet., 231: 150-160
(1991)), so dass pWP258 erhalten wurde.
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Die
Plasmid-DNA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
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Mikroprojektil-Beschuss
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Wie
für Beispiel
1.
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Weizen-DNA-Isolation und
Analyse
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PCR-Analyse
wurde mit genomischer DNA durchgeführt, welche wie bei Beispiel
1 extrahiert wurde. Die PCR-Reaktionen wurden mit Primern durchgeführt, die
zur Amplifikation eines 352 bp sul-Fragmentes (5'-TTGTGCGGTTCTTCGAGGC-3' und 5'-TGCGCTTCGCAGATCTCCA-3') ausgelegt waren.
Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Heißstart (94°C, 3 min.), gefolgt von 30 Zyklen
Denaturierung (95°C,
30 sec.), Annealing (55°C,
30 sec.) und Verlängerung
(73°C, 1
min), gefolgt von 1 Zyklus bei 73°C
(5 min.) und dann Halten bei 24°C.
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Ergebnisse
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Die
Anzahl der Pflanzenlinien, die das Sul-Fragment enthalten, wurden als Prozentsatz
der Gesamtzahl von regenerierten Linien aufgezeichnet.
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BEISPIEL 4: Vergleich
der Anzahl an Insertionsstellen in Weizenpflanzen, transformiert
mit sul und bar
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Die
Southern-Analyse von bar-transformierten Pflanzen wurde wie in Beispiel
1 beschrieben durchgeführt.
Die Anzahl der vollständigen
Insertionen wurde durch Sondieren Xho1-gespaltener genomischer DNA (die
Xho1-Stelle stellt eine Einzelstellenspaltung bereit) und Zählen der
Anzahl resultierender Banden im Luminograph bestimmt. Jedes Fragment
gleich oder größer als
die 2210 bp-Kassettengröße sollte
die vollständige
Kassette enthalten, sämtliche
kleineren enthalten nur partielle Kassetten.
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Die
Southern-Analyse von sul-transformierten Pflanzen erfolgte gemäß dem Verfahren
von Beispiel 1, aber mit der Digoxigenin-markierten sul-Sonde, die
durch PCR aus pWP258 hergestellt wurde. Die Anzahl der vollständigen Insertionen
wurde durch Sondieren von Xho1-gespaltener genomischer DNA (Xho1
stellt ebenfalls eine Einzelstellenspaltung für die pWP258-Kassette bereit)
und Zählen
der Anzahl der resultierenden Banden auf dem Luminograph bestimmt.
Jedes Fragment gleich oder größer als
die 3500 bp-Kassettengröße sollte
die vollständige
Kassette enthalten, jegliches kleinere Fragment enthält nur Partial-Kassetten.
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Ergebnisse
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Anzahl
der Insertionsstellen nach der bar-Transformation
| Linie
Nr. | Anzahl
der Inserts |
| 1 | 7 |
| 2 | 7 |
| 3 | 3 |
| 4 | 2 |
| 5 | >7 |
| 6 | 2 |
| 7 | 4 |
| 8 | 4/6 |
| 9 | 6 |
| 10 | 5/6 |
| 11 | 5/6 |
| 12 | 1/2 |
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Anzahl
der Insertionsstellen nach der sul-Transformation
| Linie
Nr. | Anz.
der Inserts |
| 13 | 2 |
| 14 | 5 |
| 15 | 1 |
| 16 | 5 |
| 17 | 2/3 |
| 18 | 2 |
| 19 | 2 |
| 20 | 2 |
| 21 | 2 |
| 22 | 1/2 |
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Diese
Daten legen nahe, dass eine niedrigere Anzahl von Insertionsstellen
durch Verwendung von Sulfonamidresistenz als Selektionsmarker als
bei Verwendung von Bialaphos-Resistenz erzielt wird.
