DE68915282T2 - Expressionskassette für pflanzen. - Google Patents
Expressionskassette für pflanzen.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine verbesserte Expressionskassette, die sich für die Überexpression von Genen in transformierten Pflanzen eignet.
- Die Anwendung gentechnischer Verfahren zur Verbesserung von Pflanzenarten kann zu Pflanzenarten führen, die eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pathogenen zeigen, die eine gesteigerte Toleranz gegenüber ungünstigen oder stark wechselnden Wetterbedingungen zeigen, und/oder mehr Nährwert besitzen. Es ist heute gesichert, daß die Eigenschaften der Toleranz gegenüber Pathogenen, der Toleranz gegenüber dem Wetter und der Nährwertzusammensetzung Produkte der genetischen Ausstattung der Pflanze sind. Deshalb kann das Einführen von genetischem Material in eine Pflanze bevorzugte Eigenschaften und dementsprechend verbesserte Pflanzenarten hervorbringen.
- Die genetischen Faktoren, die diese wünschenswerten Eigenschaften bewirken, umfassen Gene für Peptidprodukte, deren Vorhandensein gewünschte Eigenarten verleihen, wie auch solche, deren Nukleotidsequenzen die Erzeugung unerwünschter Proteine verhindern. Pflanzen, bei denen antipathogene Proteine in den Zellen vorliegen, zeigen eine gesteigerte Widerstandsfähigkeit gegenüber pathogenen Einflüssen. Toleranz gegenüber dem Wetter kann durch die Erzeugung bestimmter Proteine in Pflanzen verliehen werden. Der Nährwert von Pflanzen ist häufig mit dem Vorhandensein von Proteinen und insbesondere von erwünschten Aminosäuren, aus denen diese bestehen, verknüpft. Zusätzlich zu Genen, die für Peptide mit der Wirkung der verschiedenen Eigenschaften codieren, können die Eigenarten durch das Vorhandensein von RNA-Molokülen beeinflußt werden, die nicht translatiert werden. So kann die Einführung genetischer Information verwendet werden, um wünschenswerte Merkmale oder Eigenschaften in Pflanzen bereitzustellen oder nachträglich einzuführen.
- In Pflanzen kann genetische Information eingeführt werden, die zu einer gesteigerten Widerstandsfähigkeit gegenüber pathogenen Einflüssen führt. Spezifisch kann das Vorhandensein von antipathogenen Proteinen die Widerstandsfähigkeit gegen virale Infektion steigern wie auch als Mittel gegen Bakterien und andere Mikroorganismen wirken. Darüber hinaus können Peptide eingeführt und exprimiert werden, die als Pestizide, Fungizide und Herbizide wirken. Zusätzlich zur Einführung von genetischen Sequenzen, die für solche Proteinprodukte codieren, kann die Resistenz gegenüber den gleichen Pathogenen einer Pflanze dadurch verliehen werden, daß genetische Information eingeführt wird, die in der Pflanzenzelle in RNA transkribiert wird, welche die Translation für im Zusammenhang mit pathogenen Einflüssen notwendige Proteine codierende RNA inhibiert.
- Toleranz gegenüber schwankenden und ungünstigen klimatischen Bedingungen kann Pflanzen durch die Einführung von genetischer Information verliehen werden. Das Vorhandensein verschiedener Proteine kann zu Pflanzen mit der Fähigkeit zur Anpassung und zum Überleben unter schlechteren als den optimalen klimatischen Bedingungen führen. Man kann Gene isolieren, die Merkmale verleihen, welche sich während der Evolution in Pflanzen entwickelt haben und diese stärker an das Überleben beispielsweise bei Kälte, Hitze, Dürre oder Überflutung anpassungsfähig machen. Diese Gene können in Pflanzen eingeführt werden, denen sie fehlen, und die Pflanzen werden den den Genen gemäßen Phänotyp zeigen.
- In vergleichbarer Weise kann der Nährwert von Pflanzen durch die Einführung genetischer Information verändert und gesteigert werden. Für aus wünschenswerten Aminosäuren bestehende Peptide und Proteine codierende Gene können in Pflanzen eingeführt werden. Die Gene werden exprimiert, und die Pflanze zeigt die dementsprechend verbesserte Zusammensetzung.
- Die Gene, die in die Pflanze eingeführt werden sollen, können aus beliebiger Quelle stammen. Viele Gene, die einer Pflanzenart wünschenswerte Eigenarten verleihen, können übertragen werden, so daß sie diese Eigenart einer zweiten, anderen Pflanze verleihen. Antipathogene Gene können aus Pathogenen stammen. Gene können synthetisiert werden. Alternativ können die Gene mit solchen Genen identisch sein, die bereits im Pflanzengenom gefunden wurden, wohinein sie mittels der Bereitstellung einer Vielzahl von Kopien der Gene zu dem Zweck eingeführt werden, um das entsprechende Merkmal zu ergänzen und zu steigern. Demzufolge können sowohl heterologe als auch endogene Gene in Pflanzen eingeführt werden, um ein gewünschtes Merkmal nachträglich einzuführen oder zu verstärken. Demzufolge können heterologe und auch endogene Gene in Pflanzen eingeführt werden, um ein gewünschtes Merkmal zu verleihen oder nachträglich einzuführen.
- Verfahren zum Einführen von genetischem Material in Pflanzen sind den Fachleuten in weitem Umfang bekannt. Ausgedehnte Studien wurden mit Vektoren von Agrobakterium tumerfaciens durchgeführt. Außerdem wurde genetisches Material in das Genom von Pflanzen eingeführt, indem Pflanzen mit Mikroprojektilen beschossen wurden, die mit dem genetischen Material beschichtet waren. Wenn das genetische Material in die Pflanzenzellen eingebracht ist, kann es in das Genom der Pflanze inkorporiert und, sofern es mit den geeigneten genetischen Regulationselementen verknüpft ist, exprimiert werden. Die Expression der eingeführten Gene kann der Wirtspflanze bestimmte Eigenarten verleihen.
- Um die Expression des eingeführten genetischen Materials zu ermöglichen, müssen die strukturellen Gene, die exprimiert werden sollen, mit Regulatorsequenzen verknüpft werden. Diese Regulatorsequenzen umfassen einen Promotor, ein Initiationscodon und ein Polyadenylierungs-Anheftungssignal.
- Ohne daß diese Elemente mit dem Gen, das exprimiert werden soll, funktionell verknüpft sind ("operably linked"), kann keine Expression stattfinden. Die Expression wird dann stattfinden, wenn das einzuführende genetische Material derart konstruiert ist, daß das zu exprimierende Gen stromabwärts vom Promotor und vom Initiationscodon, im passenden Leserahmen mit dem Initiationscodon und stromaufwärts vom Polyadenylierungs-Anheftungssignal angeordnet ist.
- Häufig ist eine Überexpression wünschenswert, und diese kann durch Hinzufügung von genetischen Sequenzen zusätzlich zu denjenigen, die als Minimum erforderlich sind, erfolgen. Wenn untranslatierte Regionen den Promotor flankieren, kann man häufig eine erhöhte Genexpression erreichen. In gleicher Weise können auch das Initiationscodon flankierende, untranslatierte Regionen zu einer Überexpression führen. Außerdem können diejenigen Sequenzen, die das Anheftungssignal für die Poly-(A) flankieren, zu einer wirksameren Prozessierung der transkribierten RNA und dementsprechend der Genexpression führen.
- Die Expression des Hüllproteins des Tabakmosaikvirus', des Luzernemosaikvirus', des Gurkenmosaikvirus' und des Kartoffelvirus' X in transgenen Pflanzen führte zu Pflanzen, die gegenüber einer Infektion durch das entsprechende Virus resistent sind. Um solche transgenen Pflanzen zu erzeugen, muß das Hüllproteingen in das Genom der Pflanze insertiert werden. Darüber hinaus muß das Hüllproteingen alle diejenigen genetischen Kontrollsequenzen enthalten, die für die Expression des Gens erforderlich sind, wenn es in das Pflanzengenom eingeführt worden ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine verbesserte Expressionskassette für das Einführen von gewünschten Genen in Pflanzen. Diese Kassette enthält einen Promotor, eine AT- reiche 5'-untranslatierte Region, eine Initiationsregion, die die Sequenz AAXXATGG enthält, ein Gen und ein Poly(A)- Anheftungssignal, das untranslatierte flankierende Regionen enthält. Erfindungsgemäß werden in Pflanzen eingeführte Gene überexprimiert, da die genetischen Regulatorsequenzen, die die Expression kontrollieren, eine solche Überexpression erleichtern.
- Die europäische Patentanmeldung EP 0 223 452 beschreibt Pflanzen, die gegenüber viralen Krankheiten resistent sind, und Verfahren für deren Herstellung. Das beschriebene Verfahren umfaßt die Stufen des Transformierens einer Pflanze mit einem DNA-Insert, das einen Promotor, eine aus dem Virus stammende DNA-Sequenz und eine Poly(A)-Anheftungssequenz umfaßt.
- Die PCT-Patentanmeldung PCT/US86/00514 bezieht sich auf ein Verfahren, mit dem einem Wirt eines Parasiten Resistenz gegenüber diesem Parasiten verliehen wird.
- An et al. (1985) "New cloning vehicles for transformation of higher plants", EMBO J. 4:277-285 beschreiben die Konstruktion eines Expressionsplasmids, das sowohl in E. coli als auch in A. tumerfaciens stabil repliziert werden kann.
- An, G. (1986) "Development of plant promoter expression vectors and their use for analysis of differential activity of nopaline synthase promoter in transformed tobacco cells", Plant Physiol. 81:86-91, berichtet über ausgedehnte Unterschiede bei den Promotor-Aktivitäten von übertragenen Genen innerhalb der gleichen Zellen wie auch in unabhängig gewonnenen Zellinien.
- Kozak, M. (1986) "Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes", Cell 44:283-292, offenbart die optimale Sequenz rund um das ATG-Initiatorcodon des Pre-pro- Insulin-Gens für die Initiation durch eukariantische Ribosomen.
- Loesch-Fries et al. (1987) "Expression of alfalfa mosaic virus RNA 4 in transgenic plants confers virus resistance", EMBO J 6:1845-1851, offenbaren, daß die Expression des Hüllproteingens des Luzernemosaikvirus' in transgenen Pflanzen Resistenz gegenüber Infektion durch das Virus verleiht.
- Mazur, B. J. and Chui, C.-F. (1985) "Sequence of a genomic DNA clone for the small subunit of ribulose bis-phosphate carboxylase-oxygenase from tobacco", Nucleic Acids Research 13:2373-2386, offenbaren die DNA-Sequenz der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphat-Carboxylase-Oxygenase aus Tabak.
- Olson, M. K. et al. (1989) "Enhancement of heterologous polypeptide expression by alterations in the ribosome-binding-site sequence", J. Biotech. 9:179-190, offenbaren die Steigerung der Genexpression von heterologen Genen in E. coli als Folge des Vorhandenseins einer AT-reichen 5'-untranslatierten Region.
- Pietrzak et al. (1986) "Expression in plants of two bacterial antibiotic resistant genes after protoplast transformation with a new plant expression vector", Nucleic Acids Research 14:5857-5868, offenbaren die Expression fremder Gene in Pflanzen, die unter Verwendung eines Expressionsvektors in die Pflanze eingeführt wurden, der eine aus dem Blumenkohlmosaikvirus 35S Promotor und Transkriptionsterminator, die durch einen verschiedene einzelne Restriktionsschnittstellen enthaltenden Polylinker getrennt sind, bestehende, bewegliche Expressionskassette enthält.
- Powell-Abel et al. (1986) "Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene", Science 232:738-743, offenbaren die erhöhte Resistenz gegenüber Infektion durch das Tabakmosaikvirus in transgenen Pflanzen, die das Hüllproteingen aus dem Tabakmosaikvirus enthalten.
- Tumer et al. (1987) "Expression of alfalfa mosaic virus coat protein gene confers cross-protection in transgenic tobacco and tomato plants", EMBO J. 6:1181-1188, offenbaren, daß transgene Tabak- und Tomatenpflanzen, die mit dem Hüllproteingen des Luzernemosaikvirus transformiert wurden, eine gesteigerte Resistenz gegenüber der Infektion durch das Luzernemosaikvirus zeigen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine Expressionskassette, die ein gewünschtes Gen überexprimieren kann. Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor, der eine Expressionskassette enthält. Der Überexpressionsvektor der vorliegenden Erfindung umfaßt: Einen Promotor; eine 5'- untranslatierte Region, die zu mindestens 60% aus A und T besteht; ein das Kozak'sche Element enthaltendes Initiationscodon; eine Klonierungsstelle, an der ein gewünschtes Gen insertiert werden kann, so daß eine funktionelle Expressionseinheit gebildet wird; und eine 3'-untranslatierte Region, die ein Poly(A)-Anheftungssignal und eine zu erhöhter Expression führende flankierende Sequenz umfaßt. Die vorliegende Erfindung betrifft transformierte Bakterien- und Pflanzenzellen, die den Expressionsvektor enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen, die aus mit dem Expressionsvektor transformierten Zellen erzeugt wurden. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen transgener Pflanzen mit wünschenswerten Eigenschaften durch Erzeugen dieser Pflanzen aus Pflanzenzellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, der solche Eigenschaften verleihende Gene enthält.
- Bestimmte Elemente werden in den Darstellungen 1 bis 9 verwendet, um Plasmide und DNA-Fragmente wie folgt zu illustrieren:
- (1) Die Figuren mit einer einzelnen Linie stellen sowohl zirkuläre als auch lineare doppelsträngige DNA dar.
- (2) Sternchen (*) geben an, daß das dargestellte Molekül kreisförmig ist. Das Fehlen eines Sternchens gibt an, daß das Molekül linear ist.
- (3) Verknüpfungen zwischen den natürlichen Begrenzungen funktioneller Komponenten sind durch senkrechte Linien entlang der waagerechten Linien angegeben.
- (4) Gene oder funktionelle Bestandteile sind unter den waagerechten Linien angegeben.
- (5) Restriktionsschnittstellen sind oberhalb der waagerechten Linien angegeben.
- (6) Abstände zwischen Genen und Restriktionsschnittstellen sind nicht im Maßstab gehalten. Die Figuren zeigen nur die relativ zu einander gelegenen Positionen, sofern nichts anderes angegeben ist.
- (7) Die folgenden Abkürzungen werden zur Darstellung von Funktion und Bestandteilen verwendet:
- a) Pca = CaMV35S-Promotor
- b) Ic = Region innerhalb des Genbereichs von CMV, wobei die Region innerhalb des Genbereichs das Initiationscodon und eine AT- reiche 5'-untranslatierte Region umfaßt;
- c) Sca = CaMV35S-Poly(A)-Anheftungssignal; und
- d) Nos = Nos nptII-Gen.
- Die meisten der DNA-Rekombinationstechniken, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Standardverfahren, die den Fachleuten gut bekannt und beispielsweise im einzelnen in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 223452, veröffentlicht am 29. November 1986, beschrieben sind; durch die Bezugnahme ist die genannte Schrift vorliegend mit einbezogen. Enzyme werden vom Handel bezogen und gemäß den Empfehlungen des Verkäufers oder nach anderen, in der Technik bekannten Abwandlungen verwendet. Allgemeine Literaturstellen, die solche Standardtechniken enthalten, umfassen die Folgenden: R. Wu, Hrsg. (1979) Methods in Enzymolgy, Vol. 68; J. H. Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics; T. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual; D. M. Glover, Hrsg. (1985) DNA Cloning Bd. II; H. G. Polites und K. R. Marotti (1987) "A step-wise protocol for cDNA synthesis". Biotechniques 4:514-520; S. B. Gelvin und R. A. Schilperoort, Hrsg. Introduction, Expression, and Analysis of Gene Products in Plants, wobei all die genannten Zitate durch die Bezugnahme vorliegend mit einbezogen sind.
- Für die vorliegende Offenbarung sollen die folgenden Definitionen für hier benutzte Ausdrücke gelten.
- "Expressionskassette" bedeutet ein DNA-Fragment, das ein Gen enthält, welches funktionell mit regulatorischen, für die Genexpression erforderlichen Sequenzen verknüpft ist ("operably linked").
- "Promotor" bedeutet einen Promotor, der in der Wirtspflanze wirksam ist.
- "Initiationsregion" umfaßt das Initiationscodon und Nukleotide, die das Initiationscodon flankieren.
- "Funktionell verknüpft" ("operably linked") bezieht sich auf die Verknüpfung von Nukleotidregionen, die für eine spezifische genetische Information codieren, derart, daß die Nukleotidregionen aneinander angrenzen, die Funktionalität der Region bewahrt wird und in Relation zu den anderen Regionen als Teil einer funktionellen Einheit fungiert.
- "AT-reiche 5' "-untranslatierte Region ist eine Nukleotidsequenz, die aus mindestens 60% Adenin- oder Thymin-Nukleotiden zusammengesetzt ist.
- "Untranslatierte flankierende Region" bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, die sich in 3'-Stellung zum Terminationscodon befinden und am Poly(A)-Anheftungssignal enden.
- "Vektor" ist ein Vehikel, mit dessen Hilfe DNA-Fragmente in Wirtsorganismen eingeführt werden können.
- "Expressionsvektor" ist ein Vehikel, mit dessen Hilfe DNA- Fragmente, die ausreichend genetische Information enthalten, in Wirtsorganismen eingeführt und deshalb durch den Wirt exprimiert werden können.
- "Antipathogenes Gen" ist ein Gen, das für eine DNA-Sequenz codiert, welche entweder die Antisequenz ("antisense sequence") eines pathogenen Gens ist, oder das antipathogene Gen codiert für ein Peptid, dessen Vorhandensein in einem Organismus diesem eine gesteigerte Resistenz gegenüber einem Pathogen verleiht.
- Um die vorliegende Erfindung auszuführen, muß das Gen, das in das genetische Material der Pflanze eingeführt werden soll, in einen Vektor insertiert werden, der die für die Expression des insertierten Gens erforderlichen, genetischen Regulatorsequenzen enthält. Dementsprechend muß ein Vektor so konstruiert werden, daß die Regulatorsequenzen derart bereitgestellt werden, daß sie nach Insertion eines gewünschten Gens funktionell sind. Wenn das Expressionsvektor-/Insertions-Konstrukt zusammengefügt ist, wird es verwendet, um Pflanzenzellen zu transformieren, die ihrerseits dann zur Erzeugung neuer Pflanzen verwendet werden. Diese transgenen Pflanzen tragen das Gen im Expressionsvektor/Insertions-Konstrukt. Das Gen wird in der Pflanze exprimiert, und die durch das Gen beeinflußte Eigenart wird damit auf die Pflanze übertragen.
- Um das Gen zu exprimieren, müssen die notwendigen genetischen Regulatorsequenzen zur Verfügung gestellt werden. Sowohl das Transkriptions- als auch das Translationssignal sind für die Genexpression notwendig, wenn das Gen in ein Pflanzengenom übertragen und integriert wurde. Es muß deshalb so konstruiert sein, daß es einen in einer Pflanze exprimierbaren Promotor, ein Translations-Initiations-Codon (ATG) und ein in einer Pflanze funktionelles Poly(A)-Anheftungssignal (AATAAA) in 3'-Stellung seines Translations- Terminationscodons enthält.
- In der vorliegenden Erfindung sind zusätzliche genetische Regulatorsequenzen vorgesehen, um eine Überexpression des Gens zu erreichen. Wie oben beschrieben, muß ein Expressionsvektor einen Promotor, ein Initiationscodon und ein Poly(A)-Anheftungssignal enthalten. Um einen höheren Expressionsgrad zu erreichen, sind untranslatierte Regionen in 5'- und 3'-Stellung zu den insertierten Genen vorgesehen. Darüber hinaus optimieren bestimmte Sequenzen, die das Initiationscodon flankieren, die Expression. Der eingesetzte Promotor ist ein solcher, der für Überexpression ausgewählt wird.
- Eine 5'-untranslatierte Region, die zu einem höheren Expressionsgrad eines insertierten Gens führt, ist stromabwärts vom Promotor und stromaufwärts vom Initiationscodon liegend vorgesehen. In dieser Region sind mindestens 60% der Sequenz Adenin und Thymin. Es gibt eine statistische Tendenz für die Expression, wenn eine solche AT-reiche Region zwischen dem Promotor und dem Initiationscodon angeordnet ist. Dieser Vorteil wird in der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch den Einbau eines AT-reichen, in der 5'-untranslatierten Region zwischen Promotor und Initiationscodon gelegenen Zwischenstücks genutzt.
- Die vorliegende Erfindung enthält auch eine spezifische Nukleotidsequenz, die das Initiationscodon flankiert. Diese bevorzugte Sequenz, die als Kozak'sches Element bezeichnet wird, ist AAXXATGG, worin X ein beliebiges der vier Nukleotide darstellt. Gemäß der Kozak'schen Regel führt das Vorliegen des Initiationscodons zu einer gesteigerten Expression, wenn es in einem Expressionsvektor verwendet wird. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die kleine Untereinheit der Ribulosebisphösphat- Carboxylase-Oxygenase (SS RUBISCO) ein Initiationscodon, in welchem das Kozak'sche Element verwendet wird.
- Darüber hinaus enthält die vorliegende Erfindung eine 3'- untranslatierte Region stromabwärts von der Klonierungsstelle, an der das Hüllproteingen insertiert wird, und stromaufwärts vom Poly(A)-Anheftungssignal. Die Sequenz dieser 3'-untranslatierten Region führt zu einer statistischen Tendenz für die Proteinproduktion. Die Sequenz fördert eine Überexpression. Das Poly(A)-Anheftungssignal befindet sich direkt stromabwärts von der 3'-untranslatierten Region gelegen und kann aus derselben Quelle stammen. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammen die 3'-untranslatierte Region und das Poly(A)-Anheftungssignal aus dem CaMV 35S-Gen oder dem Phaseolinsamen-Speicherprotein-Gen.
- Auch das Poly(A)-Anheftungssignal der Gene für CaMV, Nopalinsynthase, Octopinsynthase, Bohnen-Speicherprotein und SS RUBISCO eignen sich für diese Konstruktion. Verschiedene, in Pflanzen funktionierende Promotoren sind verfügbar, die besten Promotoren sind jedoch der konstitutive Promotor des Blumenkohlmosaikvirus' (CaMV ein Planzen-DNA-Virus) und das SS RUBISCO-Gen.
- Mit Verfahren, die den Fachleuten mit den üblichen Kenntnissen der Technik gut bekannt sind, werden Pflanzenzellen mit dem Vektor-Konstrukt transformiert, und die Regeneration der Pflanzenzellen wird induziert. Die gebildeten Pflanzen enthalten die Hüllproteingene und erzeugen das Hüllprotein. Die Erzeugung des Proteins verleiht der Pflanze eine gesteigerte Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Infektion durch das Virus, aus dem das Hüllproteingen stammte.
- Darüber hinaus enthält der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung ein DNA-Molekül mit einem Promotor, einer AT- reichen 5'-untranslatierten Region, einer Initiationsregion, einem Gen und einem Polyadenylierungs-Signal mit untranslatierten flankierenden Regionen, wobei der Promotor stromaufwärts von der AT-reichen 5'-untranslatierten Region liegt und funktionell mit dieser verknüpft ist, die AT-reiche 5'-untranslatierte Region stromaufwärts von der Initiationsregion liegt und funktionell mit dieser verknüpft ist, wobei die Initiationsregion wiederum ihrerseits stromaufwärts zum antipathogenen Gen gelegen ist und mit diesem funktionell verknüpft ist, welch letzteres stromaufwärts vom Poly(A)-Anheftungssignal liegt und mit diesem funktionell verknüpft ist.
- Das oben beschriebene DNA-Molekül kann einen Promotor enthalten, der aus dem Blumenkohlmosaikvirus CaMV 35S-Gen stammt. Das den oben beschriebenen Expressionsvektor umfassende DNA-Molekül kann eine AT-reiche 5'-untranslatierte Region enthalten, die aus der 5'-untranslatierten Region des Gurkenmosaikvirus CMV Hüllproteingens oder des SS RUBISCO-Gens stammt. In gleicher Weise kann die Initiationsregion im oben beschriebenen DNA-Molekül aus der 5'-untranslatierten Region des Gurkenmosaikvirus CMV Hüllproteingens oder des SS SUBISCO-Gens stammen. Die Initiationsregion des oben beschriebenen DNA-Moleküls enthält die DNA-Sequenz AAXXATGG. Darüber hinaus kann das oben beschriebene DNA-Molekül ein Poly(A)-Anheftungssignal enthalten, das entweder aus dem Blumenkohlmosaikvirus CaMV 35S-Gen, dem Phaselin- Speicherprotein-Gen, dem Nopalinsynthase-Gen, dem Octopinsynthase-Gen, dem Bohnenspeicherprotein-Gen oder dem SS RUBISCO-Gen stammt.
- Der oben beschriebene Expressionsvektor kann ein DNA-Molekül enthalten, in welchem das antipathogene Gen ein virales, pathogenes Hüllproteingen, ein virales Enzymgen, ein aus einem Wirtsgen stammendes Gen oder ein nicht verwandtes Gen ist. Darüber hinaus kann das eingesetzte Gen für ein Peptid vorgesehen sein, daß als Pestizid, Fungizid oder Herbizid fungiert, wenn es in einer Pflanze exprimiert wird. Das Gen kann für ein Peptid codieren, dessen Vorhandensein Toleranz gegenüber ungünstigen oder schwankenden klimatischen Bedingungen verleiht. Das Gen kann alternativ für ein Protein codieren, dessen Vorhandensein in einer Pflanze den Nährwert der Pflanze steigert. Die vorliegende Erfindung stellt ein rekombinantes DNA-Molekül zur Verfügung, das ein beliebiges gewünschtes Gen funktionell an genetische Regulationselemente verknüpft enthält, die für eine überexpression in transformierten Pflanzen erforderlich sind. Darüber hinaus kann es sein, daß das Gen nicht in ein Peptid transkribiert werden muß. Das Gen kann für einen zu einer Nukleotidsequenz antiparallelen Strang codieren, für welche die Inhibition der Translation wünschenswert ist.
- Der Expressionsvektor kann ein binärer, aus dem Agrobakterium stammender Vektor sein. Der Expressionsvektor kann zur Transformierung von Zellen verwendet werden, und es lassen sich transgene, die transformierten Zellen enthaltende Pflanzen erzeugen.
- Das Wassermelonenmosaikvirus II (WMV II) wurde in Zucchinipflanzen (Cucurbita pepo L) vermehrt, und RNA wurde mit Hilfe des von Yeh und Gonsalves (Virology 143:260, 1985) beschriebenen Verfahrens isoliert.
- Das Papayaringfleck-Virus ("ringspot virus") vom Stamm prv (PRV-p) wurde in Geleemelonen-Pflanzen, Cucumis metuliferus (Nand.) Mey. Acc. 2549 vermehrt, und RNA wurde mit Hilfe des von Yeh und Gonsalves (Virology 143:260, 1985) beschriebenen Verfahrens isoliert.
- Gelbes Zucchinimosaikvirus (ZYMV) wurde in Zucchinipflanzen (Cucurbita pepo L) vermehrt, und RNA wurde mit Hilfe des von Yeh und Gonsalves (Virology 143:260, 1985) beschriebenen Verfahrens isoliert.
- Das zum Erzeugen doppelsträngiger cDNA aus isolierter viraler RNA verwendete Verfahren ist für alle wie oben isolierten viralen RNA's gleich. Die gereinigte RNA wurde gemäß der von Polites und Marotti (Biotechniques 4:514, 1986) beschriebenen Arbeitsvorschrift für cDNA-Synthese unterworfen, und da diese RNA eine A-reiche Region an ihrem 3'-Ende besitzt (vergleichbar mit solcher, die man bei vielen eukaryontischen mRNA's findet), war das Verfahren einfach. Die Synthese doppelsträngiger cDNA erfolgte ebenfalls wie von Polites and Marotti beschrieben. Nachdem die doppelsträngige cDNA synthetisiert worden war, wurde sie durch Passieren durch eine G-100 Sephadex-Säule gereinigt, mit Ethanol ausgefällt und in 20 ul 10X EcoRI Methylasepuffer (100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, ph 8,0, 1 mM EDTA, 80 uM S- Adenosylmethionin und 100 ug/ml Rinderserumalbumin) suspendiert. Eine zusätzliche Menge an S-Adenosylmethionin (1ul einer 32 mM Lösung) wurde zu der Reaktionsmischung zugesetzt, und im Anschluß daran 1 ul (20 Einheiten) EcoRI Methylase. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde durch 10-minütiges Inkubieren bei 70ºC beendet. Dann wurden 1 ul (5 Einheiten) des Klenow-Fragments der E. coli DNA Polymerase I hinzugefügt, und es erfolgte eine 10-minütige Inkubation bei 37ºC, gefolgt von einer Phenol/Chloroform-Extraktion und einer Ausfällung mit Ethanol. Das Pellet wurde in 70%igem Ethanol und dann in 70% Ethanol/0,3 M Natriumacetat gewaschen. Das Pellet wurde getrocknet und in 8 ul von 0,5 ug/ul phosphorylierten EcoRI-Linkern (Collaborative Research, Inc., 128 Spring St., Lexington, MA 02173) resuspendiert. Ein ul 10X Ligasepuffer (800 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM MgCl&sub2;, 150 mM DTT, 10 mM ATP) und 1 ul T4 DNA-Ligase (4 Einheiten) wurden zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 15ºC inkubiert. Die Ligierungsreaktion wurde durch 10-minütiges Inkubieren bei 65ºC beendet. Sechzig ul H&sub2;O, 10 ul 10X EcoRI-Salze (900 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl) und 10 ul EcoRI (10 Einheiten/ul) wurden hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde mit Hilfe von Phenol/Chloroform- und Chloroform-Extraktionen beendet. Dann wurde die Reaktionsmischung durch Leiten über eine Sephadex G-100-Säule der Größe nach fraktioniert, und die Fraktionen mit den größten doppelsträngigen cDNA-Molekülen wurden durch Butanol-Extraktionen aufkonzentriert und mit Ethanol ausgefällt, und das Produkt wurde in 10 ul H&sub2;O resuspendiert. Fünf ul der doppelsträngigen cDNA's wurden zu 0,5 ug pUC19 DNA (die zuvor zur Entfernung der 5'-Phosphate mit Phosphatase behandelt worden war), 1 ul 10X Ligasepuffer und 1 ul T4 Ligase gegeben, und die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden lang bei 15ºC inkubiert. Die gebildeten, ligierten, doppelsträngigen pUC19-Hüllproteingen- cDNA-Moleküle wurden wie vom Hersteller (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD 20877) beschrieben in E. coli-Wirtszellen transformiert und auf Medium ausplattiert, das 50 ug/ml Ampicillin, 0,04 mM IPTG und 0,004% X- Gal enthielt. Bakterienkolonien, die keine blaue Farbe zeigten, wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Klone, die die 3'-Region und möglicherweise das Hüllproteingen enthielten, wurden durch Hybridisieren gegen eine ³²P-markierte Oligo-dT identifiziert. Bakterienkolonien, die eine Hybridisierung mit dieser Sonde zeigen, sollten zumindest die Poly(A)-Region des jeweiligen Potyvirus-Genoms enthalten. Einige der hybridisierenden bakteriellen Klone wurden selektioniert, und die Plasmid-DNA's wurden gemäß Verfahren isoliert, die den Fachleuten bekannt sind.
- Einige der klonierten cDNA's der PVP-p RNA wurden mit Hilfe der chemischen DNA-Sequenzierungsmethode, die von Maxam und Gilbert (Methods of Enzymology 65:499, 1980) beschrieben wurde, sequenziert. Basierend auf dieser Information und einer vergleichenden Analyse mit anderen Potyviren wurde gefunden, daß der Klon mit der Nummer pPRV-117 eine vollständige Kopie des PRV-p Hüllproteingens enthielt. Der N-Terminus des Hüllproteins wurde durch den Ort der Dipeptidsequenz Gln-Ser identifiziert. Die Länge der für das PRV-p Hüllproteingen codierenden Region stimmt mit einem Gen überein, daß für ein Protein mit etwa 33 kDal codiert.
- Die Anfügung der notwendigen Pflanzen-Regulationssignale an das PRV-p Hüllproteingen wurde durch Konstruieren einer translationalen Fusion mit einem Klon erreicht, der ursprünglich für die Expression des CMV Hüllproteingens entworfen worden war, unter Verwendung des Klons pUC1813/CP19. Das Plasmid pUC1813/CP19 ist ein Vektor, der sich für eine Genübertragung unter Zwischenschaltung von Agrobakterium eignet. Ein EcoRI-EcoRI-Fragment wurde aus pDH51/CP19 entfernt und in die EcoRI-Schnittstelle des Plasmids pUC1813 (zu beziehen von Robert K., Department of Chemistry, Washington State University, Pullman, Washington), eingefügt, wobei das Plasmid pUC1813/CP19 erzeugt wurde. Das Plasmid pUC1813/CP19 wurde in der U.S. Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 07/135.591 beschrieben, die am 21. Dezember 1987 eingereicht wurde und durch die Bezugnahme vorliegend mit umfaßt ist. Der genannte Klon mit translationaler Fusion wurde erzeugt, indem zuerst zwei Restriktionsenzym-Schnittstellen innerhalb des Klons pUC1813/CP19 ermittelt wurden. Die eine Schnittstelle (Tth111I) befindet sich zwischen den Aminosäuren 13 bis 17, während sich die andere Schnittstelle (BstXI) nahe dem Ende der 3'-untranslatierten Region des CMV Hüllproteingens befindet.
- Das Anheften dieser spezifischen Restriktionsenzym-Schnittstellen an das PRV-p Hüllproteingen wurde mit Hilfe der Polyinerase-Kettenreaktions-Technik (PCR-Technik) durchgeführt, wobei eine Vorrichtung und Taq Polymerase verwendet wurden, die von Perkin Elmer-Cetus, Emeryville, Ca. bezogen wurden. Im einzelnen wurden 2 entsprechende 5'- und 3'-Oligomere (CGACGTCGTCAGTCCAAGAATGAAGCTGTG, das eine Tth111I- Schnittstelle enthält, und CCCACGAAAGTGGGGTGAAACAGGGTCGAGTCAG, das eine BstXI- Schnittstelle enthält), die mindestens 20 Nukleotide mit dem PRV-p Hüllproteingen gemeinsam haben, verwendet, um die Synthese und Gen-Amplifizierung des Hüllproteingens zu initiieren. Nach der Synthese wurden die amplifizierten Fragmente mit Tth111I und BstXI verdaut, um die Schnittstellen freizulegen.
- Wie in Darstellung 1 gezeigt, ist pUC1813/CP19 der Expressionsvektor, der das CMV Hüllproteingen enthält. Das Plasmid pUC1813/CP19 enthält Tth111I- und BstXI-Schnittstellen.
- Die verdauten, amplifizierten Fragmente werden in die entsprechenden freigelegten Schnittstellen von pUC1813/CP19 ligiert, und das erwartete neue Konstrukt wurde unter Verwendung von Verfahren identifiziert, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Polyrnerase-Kettenreaktions- Techniken wurden verwendet, um das PRV-P Hüllproteingen, das die Tth111I- und BstXI-Schnittstellen enthält, zu amplifizieren. Das Plasmid pUC1813/CP19 und PRV-P-Hüllproteingen-Fragmente wurden mit Tth111I und BstXI verdaut und aneinander ligiert. Der gebildete Klon, der mit pUC1813/CP19-PRVexp bezeichnet wurde, wurde einer Nukleotid-Sequenzierung unterworfen, um sicherzustellen, daß die Klonierung und Gen-Amplifizierung keine störenden Artefakte eingefügt hatte. Die Sequenz zeigte keine Artefakte, was nahelegt, daß diese Pflanzen-Expressionskassette in der Lage sein sollte, ein PRV-p Hüllproteingen zu exprimieren, das 16 zusätzliche Aminosäuren des CMV Hüllproteins an seinem N-Terminus trägt.
- Wie in Darstellung 2 gezeigt, wurde die Pflanzen-Expressionskassette für das PRV-p Hüllproteingen auf einen geeigneten T-DNA-Mikrovektor übertragen, der die notwendigen Agrobakterium T-DNA-Transfersignale für die Übertragung aus einem Agrobakterium und die Integration in ein Pflanzengenom sowie einen Replikationsursprung (für die Replikation in Agrobakterium) mit breitem Wirtsbereich trägt. Das Plasmid pUC1813/CPO19-PRVexp wurde mit HindIII verdaut, und das gebildete, 2,2 kB lange Insertionsfragment, das die pflanzenexprimierbare Kassette trägt, wurde entfernt und in die HindIII-Schnittstelle des modifizierten, aus dem Agrobakterium stammenden Mikrovektors pGA482 (die Modifizierung umfaßte die Anfügung des β-Glucuronidasegens) ligiert. Der T-DNA Mikrovektor, pGA482, kann von G. An, Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA, bezogen werden. Das gebildete Plasmid wurde mit pGA482/G/CP19-PRVexp bezeichnet und ist in Abbildung 2 dargestellt. Dieses Plasmid (oder Derivate davon) wurde in virulente oder nichtvirulente Stämme von Agrobakterium tumefaciens oder rhizogenes, beispielsweise A208, C58, LBA4404, C58Z707 A4RS, A4RS(pRiB278b), und andere übertragen. Die Stämme A 208, C58, LBA4404 und A4RS können von der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, bezogen werden. Das Bakterium A4RS (pRiB278b) steht bei Dr. F. Casse-Delbart, C.N.R.A., Routede Saint Cyr. F78000, Versailles, Frankreich, zur Verfügung. Der Stamm C58Z707 kann von Dr. A.G. Hepburn, Dept. of Agronomy, University of Illinois, Urbana, IL, bezogen werden.
- Nach Übertragung des gentechnisch erzeugten Plasmids pGA482/G/CP19-PRVexp in einen beliebigen der oben aufgelisteten Agrobakterium-Stämme können diese Agrobakterium- Stämme verwendet werden, um das in Pflanzen exprimierbare PRV-p Hüllproteingen, das in seiner T-DNA-Region enthalten ist, auf ein Pflanzen-Genom zu übertragen und in dieses zu integrieren. Diese Übertragung kann mit Hilfe der Standardverfahren für die T-DNA-Übertragungen erfolgen, die den Fachleuten bekannt sind, oder diese Übertragung kann unter Verwendung der Verfahren erfolgen, die in einer U.S. Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/135.655, eingereicht am 21. Dezember 1987, beschrieben ist, und die den Titel "Agrobacterium Mediated Transformation of Germinating Plant Seeds" trägt und durch die Bezugnahme vorliegend mit umfaßt ist.
- In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde die folgende Expressionskassette konstruiert, mit der die notwendigen Pflanzen-Regulationssignale (die die Anfügung eines Promotors, einer 5'-untranslatierten Region, eines Translations-Initiations-Codons und eines Polyadenylierungssignals umfassen) für die Gen-Inserte bereitgestellt werden, um eine Überexpression der Inserte zu erreichen. Die Expressionskassette kann verwendet werden, um beliebige darin insertierte Gene zu exprimieren. Dementsprechend ist die Anwendbarkeit der Expressionskassette breiter als ihre Verwendung zum Exprimieren von Hüllproteingenen. In der Tat kann die Expressionskassette verwendet werden, um ein beliebiges gewünschtes Protein in transgenen Pflanzen zu exprimieren. Die Expressionskassette ist das bevorzugte Expressionssystem für die Exprimierung von viralen Hüllproteingenen in Pflanzen.
- Die Expressionskassette der bevorzugten Ausführungsform umfaßt: einen konstitutiven Promotor; eine 5'-untranslatierte Region, die die Genexpression beschleunigt; ein Initiationscodon, daß das Kozak'sche Element enthält; eine Klonierungsstelle, in welche das zu exprimierende Gen insertiert werden kann, wodurch eine funktionelle Expressionseinheit erzeugt wird; und eine 3'-untranslatierte Region, die ein Poly(A)-Anheftungssignal und nicht translatierte, flankierende Regionen umfaßt, die zu einem höheren Expressionsgrad führen.
- Im einzelnen besteht die Expressionskassette, die die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) 35S Transkriptions-Promotor, der 5'-untranslatierten Region des Gurkenmosaikvirus (CMV), dem CMV Translations-Initiations-Codon und dem CaMV Polyadenylierungs-Signal. Die Konstruktion dieser Expressionskassette erfolgt mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktions-Technik (PCR-Technik), um die korrekte Position der Pflanzen-Regulationssignale zu erhalten, und mit Hilfe der Anfügung geeigneter Restriktionsenzym Schnittstellen, die die einfache Einfügung eines Hüllproteingens und das Ausschneiden der vervollständigten Kassette ermöglichen, so daß diese auf andere Plasmide übertragen werden kann.
- Um die Konstruktion dieser Expressionskassette durchzuführen, wurden die folgenden Oligomere synthetisiert:
- 1. 5'-GAAGCTTCCGGAAACCTCCTCGGATTCC-3', enthält eine HindIII-Schnittstelle an seinem 5'-Ende und enthält 21 Basen, die mit 21 Basen in der 5'-flankierenden Region von CaMV übereinstimmen.
- 2. 5'-GCCATGGTTGACTCGACTCAATTCTACGAC-3', enthält eine NcoI-Schnittstelle an seinem 5'-Ende, welches ein den Kozak'schen Regeln entsprechendes Translations-Initiations-Codon enthält, und besitzt 21 Basen, die mit 21 Basen im gegenläufigen Strang ("antisense strand") der 5'-untranslatierten Region von CMV übereinstimmen.
- 3. 5'-GCCATGGTTGCGCTGAAATCACCAGTCTC-3', enthält eine NcoI-Schnittstelle an seinem 5'-Ende (welches das gleiche Translations-Initiations-Codon wie das Oligomere 2 enthält) und besitzt 20 Basen, die mit 20 Basen in der 3'-untranslatierten Region von CaMV übereinstimmen.
- 4. 5'-GAAGCTTGGTACCACTGGATTTTGGTT-3', enthält eine HindIII-Schnittstelle an seinem 3'-Ende und besitzt ein 20 Basen langes Gegenstück zu der flankierenden DNA-Region, die sich in 3'-Stellung zur CaMV Polyadenylierungsstelle (auf dem gegenläufigen Strang) befindet.
- Diese Oligomeren wurden verwendet, um Sequenzen zu amplifizieren, die sich innerhalb des mit pUC1813/CP19 bezeichneten CMV-Expressionsklons befinden, der in der Darstellung 1 gezeigt ist und auf den weiter oben Bezug genommen wurde. Wie in Darstellung 3 gezeigt, wurde die PCR-Technik verwendet, um die Genregulations-Regionen in pUC1813/CP19 zu amplifizieren. Die Amplifizierung der 5'-flankierenden, CMV 5'-untranslatierten Region und des CMV Initiations-Codons (das modifiziert worden war, um der Kozak'schen Regel AAXXATGG zu entsprechen) führte zu einem Fragment mit einer Länge von etwa 400 Basenpaaren, und die Amplifizierung der 3'-untranslatierten und flankierenden Region von CaMV führte zu einem Fragment mit einer Länge von ungefähr 200 Basenpaaren. Diese Fragmente wurden mit NcoI und HindIII verdaut, aus einem Polyacrylamidgel isoliert und dann in pUC18 ligiert, das mit HindIII verdaut und mit Phosphatase behandelt worden war. Der gebildete Klon wird mit p18CaMV/CMV- exp bezeichnet und ist in Darstellung 3 abgebildet.
- Das klonierte WMVII cDNA-Insert aus dem Klon pWMVII-41-3.2, das wie oben beschrieben erzeugt worden war, wurde mit Hilfe sowohl des chemischen (Maxam and Gilbert, Methods of Enzymology 65:499, 1980) als auch des enzymatischen (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463, 1977) Verfahrens sequenziert. Auf der Grundlage dieser Information und einer vergleichenden Analyse mit anderen Potyviren wurde gefunden, daß die Nukleotidsequenz des Klons pWMVII- 41-3.2 eine vollständige Kopie des WMVII Hüllproteingens enthält. Der N-Terminus des Hüllproteins wurde durch die Stellung der Dipeptidsequenz Gln-Ser nahegelegt. Die Länge der für das WMVII Hüllprotein codierenden Genregion (281 Aminosäuren) stimmt mit einem Gen überein, das für ein Protein mit etwa 33 kD codiert.
- Wie in Darstellung 4 gezeigt, wurde die Anfügung der erforderlichen Pflanzen-Regulationssignale an das WMVII Hüllproteingen durchgeführt, indem zur Amplifizierung des WMVII Hüllproteingens die PCR-Technik unter Einsatz von solchen Oligomeren verwendet wurde, die die notwendigen Schnittstellen an seine 5'- und 3'-Sequenzen anfügen sollten. Nach dieser Amplifizierung wird das gebildete Fragment mit dem passenden Restriktionsenzym geschnitten und in die NcoI- Schnittstelle der oben beschriebenen, das Plasmid p18CaMV/CMV-exp enthaltenden Expressionskassette kloniert. Die das WMVII Hüllproteingen-Insert enthaltenden Klone müssen nur daraufhin überprüft werden, ob sie sich bezüglich des CaMV-Promotors in der korrekten Orientierung befinden. Um jedoch sicherzustellen, daß während der PCR-Amplifizierung keine Artefakte eingebaut wurden, wird die gesamte Hüllproteingenregion mit Hilfe von Nukleotid-Sequenzanalyse überprüft.
- Um das amplifizierte WMVII Hüllproteingen mit NcoI Restriktionsenzym-Schnittstellen an beiden Enden zu erhalten, wurden die beiden folgenden Oligomere synthetisiert:
- 1. 5'-ACCATGGTGTCTTTACAATCAGGAAAAG-3', welches eine NcoI-Schnittstelle an das 5'-Ende des WMVII Hüllproteingens anfügt und das gleiche ATG-Translations-Startcodon beibehält, das in der Expressionskassette, P18CaMV/CMV-exp, vorhanden ist.
- 2. 5'-ACCATGGCGACCCGAAATGCTAACTGTG-3', das eine NcoI-Schnittstelle an das 3'-Ende des WMVII-Hüllproteingens anfügt; diese Schnittstelle kann in die Expressionskassette p18CaMV/CMV-exp ligiert werden.
- Die Klonierung dieses PCR WMVII Hüllproteingens in p18CaMV/CMV-exp unter Verwendung dieser beiden Oligomeren, liefert ein in Pflanzen exprimierbares WMVII-Gen (das mit p18WMVII-exp bezeichnet wird), das nach Transkription und Translation ein WMVII Hüllprotein erzeugt, welches mit demjenigen, das sich aus der Nukleotidsequenz des WMVII Hüllproteingens herleiten läßt, identisch ist. Dieses Hüllprotein wird sich jedoch unterscheiden, und zwar wegen der notwendigen gentechnischen Eingriffe für die Anfügung des ATG-Initiationscodons und durch die Einbeziehung der letzten 4 Aminosäuren des nukleären 54 kD Einschlußproteins (das sich in Nachbarschaft zur Glu-Ser-Proteasenschnittstelle befindet); die hinzugefügten Aminosäuren sind Val- Ser-Leu-Glu-N-ter WMVII. Die Hinzufügung dieser vier Aminosäurereste sollte die Fähigkeit dieses Hüllproteins, gegenüber WMVII-Infektionen resistente Pflanzen zu liefern, nicht beeinflussen, da die N-terminale Region von Potyvirus-Hüllproteinen weder bezüglich der Länge noch bezüglich der Aminosäure-Identität besonders stark konserviert zu sein scheint. Sollte sich jedoch herausstellen, daß dies ein Nachteil ist, so würde ihr Ersatz die Verwendung eines anderen Oligomeren einschließen, um N-terminale Abwandlungen des WMVII Hüllproteingens zu erhalten. Das klonierte Konstrukt des in Pflanzen exprimierbaren WMVII Hüllproteingens wird als p18WMV-II-exp bezeichnet und ist in der Darstellung 4 gezeigt.
- Beispiel 11 Konstruktion eines T-DNA-Mikroplasmids, das das in Pflanzen exprimierbare WMVII Hüllproteingen-Konstrukt enthält.
- Wie in Darstellung 5 gezeigt, wurde die Pflanzen-Expressionskassette für das WMVII Hüllproteingen in einen geeigneten T-DNA-Mikrovektor übertragen, der die notwendigen Agrobakterium T-DNA-Transfersignale (um die Übertragung aus einem Agrobakterium und die Integration in ein Pflanzengenom zu bewirken) und einen Replikationsursprung mit breitem Wirtsbereich (für die Replikation in Agrobakterium) enthält, wobei das Plasmid PGA482/G/CPWMVII-exp entstand. Für die Konstruktion dieses Plasmids wurde das Plasmid p18WMVII-exp mit HindIII (das innerhalb der Polyklonierungsstellen von pUC18, deutlich außerhalb der Expressionskassette, schneidet) verdaut, und ein 1,8 kB Fragment, das die in Pflanzen exprimierbare Kassette enthält, wurde entfernt und in die HindIII-Schnittstelle des modifizierten, aus Agrobakterium stammenden Mikrovektors pGA482 (die Modifizierung umfaßte die Anfügung des β-Glucuronidasegens) ligiert. Der T-DNA-Mikrovektor pGA482 ist in der Darstellung 2 gezeigt und kann von G. An, Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, WA, bezogen werden. Das gebildete Plasmid wurde mit pGA482/G/CPWNVII-exp bezeichnet und ist in Darstellung 5 gezeigt. Dieses Plasmid (oder Derivate davon) wurde in virulente oder nichtvirulente Stämme von Agrobakterium tumefaciens oder rhizogenes, beispielsweise A208, C58, LBA4404, C58Z707 A4RS, A4RS(pRiB278b), und andere übertragen. Die Stämme A 208, C58, LBA4404 und A4RS können von der American Type Culture Collection (ATCC)1 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, bezogen werden. Das Bakterium A4RS(pRiB278b) steht bei Dr. F. Casse-Delbart, C.N.R.A., Routede Saint Cyr. F78000, Versailles, Frankreich, zur Verfügung. Das Bakterium C58Z707 kann von Dr. A.G. Hepburn, Dept. of Agronomy, University of Illinois, Urbana, IL, bezogen werden.
- Nach Übertragung des gentechnisch erzeugten Plasmids pGA482/G/CPWMVII-exp in einen beliebigen der oben aufgelisteten Agrobakterium-Stämme können diese Agrobakterium- Stämme verwendet werden, um das in Pflanzen exprimierbare WMVII-Hüllproteingen, das in seiner T-DNA-Region enthalten ist, auf ein Pflanzen-Genom zu übertragen und in dieses zu integrieren. Diese Übertragung kann mit Hilfe der Standardverfahren für die T-DNA-Übertragungen erfolgen, die den Fachleuten bekannt sind, oder diese Übertragung kann unter Verwendung der Verfahren erfolgen, die in der U.S. Patentanmeldung SN 07/135.655, eingereicht am 21. Dezember 1987, beschrieben ist, und die den Titel "Agrobacterium Mediated Transformation of Germinating Plant Seeds" trägt und durch die Bezugnahme vorliegend mit umfaßt ist.
- Vor kurzem wurde eine alternative Lösung für den Transfer und die Integration von DNA in ein Pflanzengenom entwikkelt. Diese Technik beruht auf der Verwendung von Mikroprojektilen, an denen die DNA (Plasmid-Form) haftet. Diese Mikroprojektile werden auf hohe Geschwindigkeiten beschleunigt, und ihre Bewegungsenergie wird genutzt, um Pflanzenzellwände und Membranen zu durchdringen. Nach dem Eindringen in eine Pflanzenzelle diffundiert die anhaftende DNA vom Mikroprojektil weg und wird auf den Kern übertragen, wo DNA-Reparaturenzyme die "freie" DNA in das Pflanzengenom integrieren. In seiner derzeitigen Form ist das Verfahren völlig zufällig, es können jedoch Pflanzengewebe, die erfolgreich mittels der plasmidischen DNA (oder einem Teil davon) transformiert wurden, mit Hilfe selektionierbarer Markergene (wie beispielsweise dem bakteriellen Neomycin- Phosphotransferase II-Gen, NPTII) oder Reportergenen (wie beispielsweise dem bakteriellen β-Glucuronidasegen, Gus) identifiziert und bis zur Homogenität kultiviert werden. Erfolgreiche Verwendung der Beschleunigung von Teilchen für die Transformierung von Pflanzen wurde vor kurzem für Sojabohnen gezeigt, und der Transfer von p18WMVII-exp in das Genom könnte zur Gewinnung von Sojabohnen-Pflanzen führen, die gegenüber Infektionen durch Sojabohnenmosaikvirus-Stämme resistent sind.
- Die Verwendung dieses Verfahrens für die Übertragung von p18WMVII-exp kann nach dem Anfügen von entweder in Pflanzen exprimierbaren Genen NPTII oder Gus-Genen oder beidem erfolgen. Plasmide, die die nptII- und Gus-Gene an p18WMVII- exp enthalten, sind in der Darstellung 6 gezeigt und werden mit p18GWMVII-exp und p18NGWMVII-exp bezeichnet. Darüber hinaus kann auch das in Beispiel 11 beschriebene Konstrukt für die Mikroprojektil-Übertragung verwendet werden, da es sowohl das nptII- als auch das Gus-Gen an die pWMVII-exp- Kassette angefügt enthält (siehe Darstellung 5). Die einzige Schwierigkeit, auf die man bei der Verwendung von pGA482GG/cpWMVII-exp während der Übertragung mit Hilfe des Mikroprojektil-Verfahrens stoßen kann, ist eine Folge von dessen erheblicher Größe, etwa 18 kB, derentwegen eine weniger wirksame Übertragung stattfinden kann, und solche größeren Plasmide liefern im allgemeinen während der Vermehrung weniger DNA.
- Für die Konstruktion des Plasmids p18GWMVii-exp wird das Plasmid p18WMVii-exp mit BamHI verdaut und mit einem isolierten, 3,0 Kilobasen langen BamHI-Fragament ligiert, welches das Gus-Gen enthält. Für die Konstruktion des Plasmids p18NGWMVii-exp wird das Plasmid p18GWMVii-exp mit 5mal verdaut und mit einem isolierten, 2,4 kB langen Fragment ligiert, welches das durch Verdauung mit Dral und Stul erzeugte Nos-nptII-Gen enthält.
- Das klonierte ZYMV cDNA-Insert aus dem Klon pZYMV-15, der gemäß dem oben beschriebenen Verfahren kloniert worden war, wurde mit Hilfe sowohl des chemischen (Maxam und Gilbert, Methods of Enzymology 65:499, 1980) als auch des enzymatischen (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 74:5463, 1977) Verfahrens sequenziert. Basierend auf dieser Information und der vergleichenden Analyse mit anderen Potyviren wurde gefunden, daß die Nukleotidsequenz des Klons pZYMV-15 eine vollständige Kopie des ZYMV Hüllproteingens enthält. Der N-Terminus des Hüllproteins wurde an der Stelle der Dipeptid-Sequenz Gln-Ser vermutet, die für Schnittstellen in Potyviren charakteristisch ist (siehe Dougherty et al. EMBO J. 7:1281, 1988). Die Länge der für das ZYMV Hüllprotein codierenden Genregion (280 Aminosäuren) stimmt mit einem Gen überein, das für ein Protein mit etwa 31,3 kD codiert.
- Wie in Darstellung 7 gezeigt, wurde die Anfügung der erforderlichen Pflanzen-Regulatorsignale an das ZYMV Hüllproteingen durchgeführt, in dem man die PCR-Technik für die Amplifizierung des ZYMV Hüllproteingens unter Verwendung von Oligomeren einsetzte, die die notwendigen Schnittstellen an dessen 5'- und 3'-Sequenzen anfügen sollten. Nach dieser Amplifizierung wird das gebildete Fragment mit dem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und in die NcoI- Schnittstelle des die obige Expressionkassette enthaltenden Plasmid pUC18CP-exp einkloniert. Klone, die das ZYMV Hüllproteingen-Insert enthalten, brauchen nur auf die korrekte Orientierung bezüglich des CaMV-Promotors überprüft zu werden. Um jedoch sicherzustellen, daß während der PCR-Amplifizierung keine Artefakte eingebaut wurden, wird die gesamte Hüllproteingenregion mit Hilfe von Nukleotid-Sequenzanalyse überprüft.
- Um das amplifizierte ZYMV Hüllproteingen mit NcoI-Restriktionsenzym-Schnittstellen an beiden Enden zu erhalten, wurden die beiden folgenden Oligomere synthetisiert:
- 1. 5'-ATCATTCCATGGGCACTCAACCAACTGTGGC 3', das eine NcoI-Schnittstelle an das 5'-Ende des ZYMV Hüllproteingens anfügt und das gleiche ATG-Translations-Startcodon beibehält, das in der Expressionskassette, pUC18cpexp, vorhanden ist.
- 2. 5'-AGCTAACCATGGCTAAAGATATCAAATAAAGCTG-3', das eine NcoI-Schnittstelle an das 3'-Ende des ZYMV Hüllproteingens anfügt; diese Schnittstelle kann in die Expressionskassette pUC18cpexp ligiert werden.
- Die Klonierung dieses PCR ZYMV Hüllproteingens in pUC18cpexp unter Verwendung dieser beiden Oligomeren liefert ein in Pflanzen exprimierbares ZYMV-Gen (das mit pUC18cpZYMV bezeichnet wird), das nach Transkription und Translation ein ZYMV Hüllprotein hervorbringt, welches mit demjenigen identisch ist, das sich aus der Nukleotidsequenz des ZYMV Hüllproteingens herleiten läßt. Dieses Hüllprotein wird sich jedoch unterscheiden, und zwar wegen der notwendigen gentechnischen Eingriffe, um das ATG-Initiatioscodons anzufügen, dem sich Gly anschließt, bei dem es sich um die zu dem Ser der Polyprotein-Schnittstelle in 3'-Stellung benachbarte Aminosäure handelt. Der Gly-Aminosäurerest wurde als mögliche N-terminale Aminosäure gewählt, da viele Potyvirus-Hüllproteine entweder ein Ser, ein Gly oder ein Ala an ihrem N-Terminus aufweisen. Sollte sich jedoch herausstellen, daß dies ein Nachteil sein sollte, würde dessen Ersatz die Verwendung eines davon verschiedenen Oligomeren umfassen, damit man eine andere N-terminale Aminosäure für das ZYMV Hüllprotein erhält. Das klonierte Konstrukt des in Pflanzen exprimierbaren ZYMV Hüllproteingens wird mit pUC18cpZYMV bezeichnet und ist in der Darstellung 7 gezeigt.
- Gemäß den Anweisungen des Beispiels 11 wurde unter Beachtung der entsprechenden Modifikationen das Konstrukt eines T-DNA Mikroplasmids gebildet, das ein in Pflanzen exprimierbares ZYMV Hüllprotein enthält. Das Plasmid pUC18cpZYMV (Darstellung 7) wurde mit HindIII (das innerhalb der Polyklonierungsstellen von pUC18, deutlich außerhalb der Expressionskassette, schneidet) verdaut, und ein 1,6 kB langes, die in Pflanzen exprimierbare Kassette enthaltendes Fragment wurde abgetrennt und in die HindIII-Schnittstelle des Mikrovektors pGA482 (Darstellung 2) ligiert. Das gebildete Plasmid wurde mit pGA482GG/cpZYMV bezeichnet und ist in Darstellung 8 gezeigt.
- Nach der Übertragung des gentechnisch hergestellten Plasmids pGA482GG/cpZYMV in Agrobakterium-Stämme können die Agrobakterium-Stämme verwendet werden, um das innerhalb seiner T-DNA-Region enthaltene, pflanzenexprimierbare ZYMV Hüllproteingen auf ein Pflanzengenom zu übertragen und in dieses zu integrieren.
- Gemäß den Lehren des Beispiels 12 kann die Mikroprojektil Übertragungstechnik verwendet werden, um das ZYMV Hüllproteingen mit geeigneten genetischen Regulatorsequenzen in Pflanzengewebe einzuschleusen.
- Der Einsatz dieses Verfahrens für die Übertragung von pUC18cpZYMV kann nach der Hinzufügung von entweder in Pflanzen exprimierbaren Genen NPTII oder Gus-Genen oder beidem erfolgen. Plasmide, die das nptII- und das Gus-Gen an pUC18cpZYMV enthalten, sind in der Darstellung 9 gezeigt und werden als pUC18GcpZYMV und pUC18NGcpZYMV bezeichnet. Darüber hinaus kann das in Beispiel 15 beschriebene Konstrukt ebenfalls für die Mikroprojektil-Übertragung verwendet werden, da es bereits sowohl das nptII- als auch das Gus-Gen an die pUC18cpZYMV-Kassette angefügt enthält (siehe Darstellung 8). Die einzige Schwierigkeit mit der Verwendung von pGA4-82GG/cpZYMV kann während der Übertragung mit Hilfe des Mikroprojektil-Verfahrens infolge seiner deutlichen Größe, etwa 18kB, auftreten, die zu einer weniger wirksamen Übertragung führen kann; und solche größeren Plasmide liefern ganz allgemein während der Vermehrung weniger DNA.
- Für die Konstruktion des Plasmids pUC18GCPZYMV wird das Plasmid pUC18CPZYMV mit BamHI verdaut und in ein isoliertes 3,0 BamHI-Fragment ligiert, daß das Gus-Gen enthält. Für die Konstruktion des Plasmids pUC18GCPZYMV wird das Plasmid pUC18GCPZYMV mit SmaI verdaut und mit einem 2,4 kB langen, isolierten Fragment ligiert, das das Nos nptII-Gen enthält, und das durch Verdauung mit DraI und StuI isoliert wurde.
Claims (11)
1. DNA-Pflanzen-Expressionskassette, in stromabwärts
aufgeführter Reihenfolge enthaltend:
(a) einen Promotor,
(b) die 5'-untranslatierte Region des
Gurkenmosaikvirus-(CMV)-Hüllproteingens,
(c) eine die Sequenz AAXXATGG enthaltende
Initiationsregion, wobei X ein beliebiges Nukleotid
darstellt,
(d) ein Gen und
(e) ein Poly(A)-Anheftungssignal, das untranslatierte
flankierende Sequenzen enthält,
worin die Initiationsregion mit dem Gen funktionell
erknüpft ist und worin das Gen mit dem Poly(A)-
Anheftungssignal funktionell verknüpft ist.
2. Kassette nach Anspruch 1, worin der Promotor der
Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) 35S-Promotor ist.
3. Kassette nach Anspruch 1 oder 2, worin die
Initiationsregion aus der 5'-untranslatierten Region des CMV
Hüllproteingens oder aus der 5'-untranslatierten
Region des SS RUBISCO-Gens stammt.
4. Kassette nach einem der voranstehenden Ansprüche,
worin das Poly(A)-Anheftungssignal aus dem CaMV 35S-
Gen, aus dem Phaseolin-Speicherproteingen, aus dem
Nopalin-Synthasegen, aus dem Octopin-Synthasegen, aus
dem Bohnen-Speicherproteingen oder aus SS RUBISCO
stammt.
5. Kassette nach Anspruch 2, worin die Initiationsregion
aus der 5'-untranslatierten Region des CMV
Hüllproteingens stammt und worin das Poly(A)-
Anheftungssignal aus dem CaMV 35S-Gen stammt.
6. Kassette nach einem der voranstehenden Ansprüchen
worin das Gen ein anti-pathogenes Gen ist.
7. Kassette nach Anspruch 6, worin das Gen ein
Hüllproteingen ist.
8. Transformierte Pflanzenzelle, die eine Kassette nach
einem der voranstehenden Ansprüche enthält.
9. Transgene Pflanzen, enthaltend transformierte
Pflanzenzellen nach Anspruch 8.
10. Transgene Pflanze nach Anspruch 9 aus der Familie der
Cucuribitaceen, Caricaceen, Solanaceen oder
Leguminosen.
11. Verfahren zum Einbringen einer Eigenschaft in eine
Pflanze, umfassend die folgenden Schritte:
(a) das Isolieren eines Gens, dessen Expression in
eine Pflanze die Eigenschaft verleiht,
(b) das Konstruieren einer
DNA-Pflanzen-Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit
dem isolierten Gen,
(c) das Transformieren der Pflanzenzellen mit der
Kassette und
(d) das Regenerieren von Pflanzen aus den
transformierten Pflanzenzellen.
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