JPH04500152A

JPH04500152A - ポティウイルス外皮蛋白遺伝子およびそれで形質転換した植物体

Info

Publication number: JPH04500152A
Application number: JP1508228A
Authority: JP
Inventors: スライトム，ジェリー・エル; クエマダ，ヘクター・ディー; ゴンサルブス，デニス; ロスティ，ブリジット
Original assignee: アズグロウ・シード・カンパニー; コーネル・リサーチ・ファウンデーション、インコーポレイテッド
Priority date: 1988-08-19
Filing date: 1989-07-20
Publication date: 1992-01-16
Also published as: KR900702036A; KR900702041A; DE68915282T2; US5998699A; DK28191D0; AU639891B2; AU634168B2; EP0693555A1; WO1990002184A1; EP0429483B1; WO1990002189A1; ATE160173T1; EP0429483A1; DK28191A; AU3970489A; AU3987089A; DE68928445D1; EP0429478B1; JPH04500151A; DE68928445T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１９、請求の範囲第１０項記載の組換えＤＮＡ分子を含有する請求の範囲第１８項記載の形質転換植物細胞。

２０、請求の範囲第１１項記載の組換えＤＮＡ分子を含有する請求の範囲第１８項記載の形質転換植物細胞。

２１、請求の範囲第１７項記載のａ換えＤＮＡ分子を含有する請求の範囲第２０項記載の形質転換植物細胞。

２２、請求の範囲第１８項記載の形質転換細胞よりなるウリ科、ンスジェニック植物。

２３、請求の範囲第１９項記載の形質転換植物よりなる請求の範囲第２２項記載のトランスジェニックＭｌ”Ａ。

２４．請求の範囲第２０項記載の形質転換植物よりなる請求の範囲第２２項記載のトランスジェニック植物。

２５、請求の範囲第２１項記載の形質転換植物細胞よりなる請求の範囲第２４項記載のトランスジェニック植物。

２Ｂ、ａ）請求の範囲第５項記載のａ換えＤＮＡ分子を構築し。

ｂ）該組換体ＤＮＡで植物細胞を形質転換し：次いで、Ｃ）該形質転換植物細胞から植物を再生する工程よりなるウィルス感染に対して耐性であるトランスジェニック植物の生産方法。

明細書ボティウイルス外皮蛋白遺伝子およびそれで形質転換した植物体発明の分野本発明は、ポティウイルスの外皮蛋白遺伝子に関する。さらに詳しくは、本発明は、ポティウイルスから外皮蛋白遺伝子を調製する方法ならびにそれを移入ベクターに取り込む方法、および当該遺伝子が由来する特定のボティウイルスおよび類縁ウィルスによるウィルス感染に対し耐性である形質転換植物細胞および形質転換植物体に関する。

発明の背景ポティウイルスは種々の作物の病原である植物ウィルスの独自な一部である。ボティウイルスは、スイカモザイクウイルスＨ（ＷＭＶＵ）；一時は独自の？イルス型として分類されていたが、現在では同一ウィルスの異なる株として分類されている２種の密接に関連する植物ボテイウイルス群のメンバーであるババヤリングスポノトウイルス株パパヤリングスボ・ノドおよびスイカモザイクＩ（ＰＲＶ −ｐおよびＰＲＶ−ｗ）；ズノ牛−二イエローモザイクウィルス（ＺＹＭＶ）　：および他の多くのものを包含する。これらのウィルスは大きさがほぼ７８０Ｘ１２ナノメーターの曲がりくねった繊維状粒子よりなる。該ウィルス粒子はプラス（＋、コーディング、またはセンス）の極性の約ｉ　ｏｏｏｏヌクレオチドを含有する一本％　ＲＮ　Ａゲノムを含有する。ボティウイルスのＲＮＡゲノムの翻訳は、該ＲＮＡが約３３０ｋＤの単一の大きなポリ蛋白をコード付けすることを示す。、二のポリ蛋白はいくつかの蛋白を含有し、そのうちの１つは、該ポリ蛋白の少なくとも６種の他のペプチド類への切断に対し特異的な４９ｋＤのプロテアーゼである。このポリ蛋白内に含有さ１する蛋白の１つはウィルスＲｒぐＡを被覆しそれを分野から保護する３５ｋＤのカブノドまたは外皮蛋白である。

ボ云イウイルス科群に属す盃いくつかのウィルスのゲノムの構築は、特にタバコエッチウィルス、タバ７モ１Ｆリングウィルスおよび外皮蛋白遺伝子はＲＮＡの３゛末端、（２００〜３００塩基対の）末端アデニンヌクレオチド残基のストレッチに丁度先立つところに位置決めされてきた。４９ｋＤプロテアーゼ遺伝子の位置はこれらのウィルスで保存されているようである。タバコエッチウィルスでは、該プロテアーゼ切断部位はジペプチドＧ１ｎ−５ｅｒＳＧｉｎ−ｃｒｙまたはＧｉｎ−Ａｌａであると決定されてきた。これらのウィルスポリ蛋白における切断部位としてのこれらのジペプチドの保存は前掲ポティウイルスの配列から明らかである。

タバコモザイクウィルス、アルファルファモザイクウィルス、キュウリモザイクウィルス、およびジャガイモウィルスＸのトランスジェニック植物における発現の結果、各ウィルスによる感染に耐性の植物が得られている。かかるトランスジェニック植物を生産するには、外皮蛋白遺伝子を植物のゲノムに挿入しなければならない。

遺伝子の発現ｌこ必要なすべての遺伝子制御配列を含有しなければならない。

ボティウイルスの外皮蛋白はポリ蛋白の躬訳後ブロセ、シングによって生産されるので、ウィルスＲＮＡから単離した外皮蛋白遺伝子は遺伝子発現に必要な遺伝子調節配列を含有していない。外皮蛋白遺伝子は、植物ゲノムに一旦移入され組み込まれたときにその発現に必要な転写および翻訳シグナルを含有していない。

従って、植物発現可能プロモーター、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）およびその翻訳終止コドンの植物機能的ポリ（Ａ）付加シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を含有させるよう設計しなければならない。

本発明ニオイテハ、ＷＭＶ−Ｉ［、ＰＲＶ−ｐおよびＺＹＭ■についての外皮蛋白遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、該遺伝子を発現ベクターに挿入して、該遺伝子が植物ゲノムに組み込まれた場合に発現され得るように、必要な遺伝子調節配列を供した。植物細胞をベクター構築体で形質転換し、該植物細胞を誘導して再生させた。

蛋白の生産は、外皮蛋白遺伝子が由来するウィルスによる感染に対する耐性の増大を植物に付与する。

１Ｎ皇聞塗欧州特許出願ＥＰＯ２２３４５２号は、ウィルス病に対し抵抗性のある植物およびその生産方法を記載している。記載された該方法は、プロモーター、ウィルス由来のＤＮＡ配列、およびポリ（Ａ）付加配列よりなるＤＮＡインサートで植物体を形質転換する工程からなる。

ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０　Ｏ５１４号は寄生虫の宿主に、該寄生虫に対する抵抗性を付与する方法に関する。

アリンンら（ＡＩｌｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８５）は、「タバコエッチウィルスのカプシド蛋白遺伝子およびカプシド蛋白の生物化学的分析：Ｎ−末端アミノ酸はウィルス粒子の表面に位置する（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｎａＩｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃａｐｓｉｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｃａｐｓｉｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆＴｏｂａｃｃｏ　Ｅｔｃｈ　Ｖｉｒｕｓ：Ｎ −Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄｓ　Ａｒｅ　Ｌｏｃａｔｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅＶｉｒｉｏｎ’ｓ　５ｕｒｆａｃｅ）Ｊ　、パイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１４７　：　３０９〜３１６、カプシド蛋白をコー、ド付けするタバコエッチウィルスゲノムの３゛端部におけるヌクレオチド配列を記載している。

ペパーモアトルウィルスのカブ７ド蛋白をコード付けする配列に対する相同性が報告されている。

アリソンら（Ａｌｌｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８６）は、「夕／＜　コニＬ　７チウイルスゲノミツクＲＮＡの暗号領域のヌクレエオチド配列：単一のポリ蛋白の合成の証拠（Ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣｏｄｉｎｇＲｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｅｔｃｈ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｏ＋ａｉｃ　ＲＮＡ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｐｏ１ｙｐｒｏｔｅｉｎ）Ｊ　、バイｏｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１５４　：　９〜２０、タバコエッチウィルスのゲノム構築を記載している。

カリントン・ジェイ・シイおよびドウフェルティ・ダブリュー・シイ（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ、　Ｊ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、　Ｌ　Ｇ、　）（１９８７）は、「植物ボティウイルスゲノムによってコード付けされる小桟封入体蛋白はプロテアーゼである（ＳＬＩＩａｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｃｏｄｅｄｂｙ　ａ　ｐｌａｎｔ　ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ　ｇｒｎｏｍｅ　ｉｓ　ａ　ｐｒｏｔｅａｓｅ）　Ｊ　、ジで一ナル８バコエノチウイルスのウィルスＲＮＡは、該ウィルスＲＮＡｈ（翻訳さｎた場合に産生されるポリ蛋白の切断の原因となる４９にプロテアーゼをコード付けすることを開示している。

ドノズ９（Ｄｏｄｄｓ　ｅｔ　ａｌＸｌ　９８５）は、「キュウリモサイクウイルスの株間の交差保護、宿主および接種物のタイプが攻撃株のウィルス粒子および二本鎖ＲＮＡの蓄積に与える影響（Ｃｒｏｓｓ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　ｃｕｃｕｔｘｂｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｏｓｔ　ａｎｄｔｙｐｅ　ｏｆｉｎｏｃｕｌｕｍ　ｏｎ　ａｃｃｕｌｌｌｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｉｒｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　５ｔｒａｉｎ）　Ｊ　、”イロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１４４　：　３０１〜３０９、ウィルスの異なる株の感染１こより植物に付与されたウィルスによる攻撃に対する耐性の増加を記載している。

ドウフェルティ・ダブり二一・シイら（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、Ｖ、Ｇ、　ｅｔ　ａｌ）（１９８５）は、「ペパーモノトルウィルスのゲノミックＲＮＡの３゜末端のヌクレオチド配列二ポテイウイルスカブシド蛋白遺伝子構築の別の態様についての証拠（、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｔ　ｔｈｅ　３’ Ｔｅｒｍｉｎｕｓ　ｏｒ　Ｐｅｐｐｅｒ　Ｍｏｔｔｌｅ　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＲＮＡ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｒｏｒ　ａｎＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　Ｍｏｄｅ　ｏｒＰｏｔｙｖｉｒｕｓ　Ｃａｐｓｉｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｏｒｇａｎｉｚａ−ｔｉｏｎＧ　、パイロロジ−（１’ｉｒｏｌｏｇｙ）　１４６　：　２８２〜２９１、ペパーモノトルウィルスのウィルスＲＮＡゲノムの３ °末端のヌクレオチド配列を報告している。

ドウフェルテイ’ダブり二一・シイ”９　（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ　Ｗ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ）（１９８５）は、「植物ウィルスポリ蛋白切断部位の生物化学的および突然変異的分析（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｏｉｃａｌ　ａｎｄ　ａｌｕｔａｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｖｉｒｕｓ　ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ）、ＥＭＢＯＪ、、７　：　１２８１〜１２８７、タバコエッチウィルスの幾何学的に独自な単離体内の蛋白分解切断部位の保存を記載している。

ドウフェルティ・ダブリニー・シイおよびカワントン・ジエイ・シイ（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、Ｗ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｊ、Ｃ，）　（１９８８）は、「ボティウイルス遺伝子産物の発現および機能（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｒ　ｐｏｔｙｖｉｒａｌ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ）Ｊ　ｓアヌ・Ｌ／ブ・ファイトバソル（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏ−１，）、２６　：　１２３〜ｌ　４３、ボテイウィルスおよび当該グループのメンバーが相互に対し有する同様性を３己載している。

ェ、ゲンヘルガー・エイーｃルら（Ｅｇｇｅｎｂｅｒｇｅｒ、　Ａ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ）（１９８９）は、「大豆モザイクウィルス外皮蛋白領域のヌクレオチド配列およびエシェリヒア・コリ、アグロバリテリウム・チニメファシエンス、およびタバコカルスにおけるその発現（Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒ　ａ　５ｏｙｂｅａｎ　Ｍｏ５ａｉｃ　Ｖｉｒｕｓ　Ｃｏａｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｇｉｏｎ　ａｎｄｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕＩＩＩＬｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、ａｎｄ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｃａｌｌｕｓ）、パイロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、大豆モザイクウィルスについての外皮蛋白遺伝子のヌクレオチド配列を開示している。

ヒンチー・エム・エイ・ダブり一一ら（Ｈｉｎｃｈｅｅ、　Ｍ、＾、ｉ、　ｅｔ　ａｌ）は、「アグロバタテリウム媒介ＤＮＡ移入を用いるトランスジェニック大豆植物の生産（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　５ｏｙｂｅａｎ　ｐｌａｎｔｓｕｓｉｎｇ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ＤＮＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒ月、ノイイオテクノロジー（Ｂｉｏ／１ｅｃｈ、　）　８　：　９１５７９２１、カナマイシン耐性／β−グルクロニダーゼ活性またはカナマイシン耐性／グリホスフェート耐性いずれかを付与するエイ・チニメファシエンスブラスミドで形質転換し１こトランスジェニック大豆植物の作出を開示している。

コザク・エム（Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、　Ｘ　ｌ　９８８　）は、「点突然変異は真核生物リポソームによる翻訳を調節するＡＵＧイニシェークーコドン前後にわたる配列を明らかにする（Ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｄｅｆｉｎｅ　ａ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｆｌａｎｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ＡＵＧ　１ｎｉｔｉａｔｏｒ　ｃｏｄｏｎ　ｔｈａｔ　ｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｂｙ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ）Ｊ　、セル（Ｃｅｉｌ）４４　：　２８３〜２９２、真核生物リポソームによる開始用のプレプロインスリンのＡＴＧイニシエーターコドンの回りの最適配列を開示している。

レッジニーフリースら（Ｌｏｅｓｃｈ−Ｆｒｉｅｓ　ｅｔ　ａｌＸ　１９８７）は、［トランスジェニック植物におけるアルファルファモザイクウィルスＲＮＡ４の発現はウィルス耐性を付与する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａｍｌ）ｓａｉｅ　ｖｉｒｕｓ　ＲＮＡ４　ｉｎ　ｔｒａ閥ｇ３ｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｖｉｒｕＦ、ｒｅｓｉｓ−ｔａｎｃｅ）ｊ、ＥｌｉｌＢＯＪ、６：　１８４５〜ｌ９５１、トランスジ；ニック植物にお１するアルファルファモガイクウイルスの外Ｆ５蛋白の発現はウィルスによる感染に対する抵抗性を付与することを開示している。

ビエトルサク；＋（Ｐｉｅｔｒｚａｋ　ｅｔ　ａｔ）（１９８６）は、ニー新しい植物発現ベクターでのプロトプラスト形質転換後における２種の細菌抗生物質耐性遺伝子の植物における発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ｏｆ　ｔｗ。

ｂａｃｔｅｒｉｓｌ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｔｒａｎ−ｓｆｏｒ＊ａｔｉｏｎ　ｔｖｉｔｈ　ａ　ｎｅｗ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｅｔｏｒ）Ｊ　、ヌクレイツク・アンズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　１４　：　５８５７〜５８６８、い（つかの唯一の制限部位を含有するポリリンカーによって分離したカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターおよび転写ターミネータ−よりなる移動可能発現力セクトを含有する発現ベクターを用いて植物に導入した外来性遺伝子の植物における発現を開示している。

ボウエルーアベルら（Ｐｏｗｅｌｌ−Ａｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ）（１９８６）は、［タバコモザイクウィルス外皮蛋白遺伝子を発現するトランスジェニック植物における病気発生の遅延（Ｄｅｌａｙ　ｏｆ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎｔｒａｎｓｇｅｒ＋ｉｃ　ｐｉａｎｔｓ　ｔｈａｔ　ｅｘｐｒ、ｅｓｓ　ｔｈｅ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ）　Ｊ　＋　サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２　：　７３８〜７４３、タバコモザイクウィルスかろの外皮蛋白遺伝子を含有するトランスジェニック植物におけるタバコモザイクウィルスによる感染に対する抵抗性の増大を開示している。

クエマダ・エイチ・ディらＣＱｕｅｍｓｄａ、　Ｈ，Ｄ、　ｅｔ　ａｌ）　（１９８９）は、「キュウリモザイクウィルス株ＣおよびＷＬのＲＮＡ３からのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ　ｆｒｏｙａ　ＲＮＡ３　ｏｆ　Ｃｕｃｕｍｂｅｒ　Ｍｏ５ａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　５ｔｒａｉｎｓ　ＣａｎｄＷＬ”）　Ｊ、ジャーナル・オブ・ジェネラル・パイロロジー（Ｊ、　ｃｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、）７０　：　１０６５〜１０７３、キュウリモザイクウィルス株ＣおよびＷ　Ｌ　ｉ７）　ＲＮ　Ａ　３からのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を報告し、それらを相同性について相互および他の株と比較している。

シニクラ・ディ・ディら（Ｓｈｕｋｌａ、　Ｄ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ）　（１９８６）は、「ボティウイルスの外皮蛋白（Ｃｏａｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ）Ｊ、パイクロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１５．２　：　Ｉ　１８〜ｌ　２５、ジーガイモＹ外皮蛋白のアミノ酸配列を開示している。

シニクラ・ディ・ディら（Ｓｈｕｋｌａ、Ｄ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ）　（１９８８）は、「ボティウイルスの外皮蛋白のＮおよびＣ末端は表面に位置し、該Ｎ末端は主要ウィルス特異的エピトープを含有する（Ｔｈｅ　Ｎ　ａｎｄ　Ｃｔｅｒｍ］ｎｉ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｏａｔ　Ｐｒｏｔｒｅｌｎｓ　ｏｆ　Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ　Ａｒｅ　５ｕｒｆａｃｅ−１ｏｃａｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　！ｆ　Ｔｅｒｍｉｒ＋ｕｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｔｈｅ　Ｍａｊｏｒ　Ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＥｐｉｔｏｐｅｇ）Ｊ　、ジャーナル・オブ・ジェネラル・パイロロジ−（Ｊ。

Ｇｅｎ、ｖｉｒｏｌ、）　６９　：　１４９７〜１５０８、いくつかのポティウイルス外皮蛋白のＮおよびＣ末端領域はウィルス粒子の表面に位置することを開示している。該ウィルス粒子をトリプシンで処理し、酵素処理により、Ｎ末端から３０〜６７個のアミノ酸が、Ｃ末端から１８〜２０個のアミノ酸が除去され：変化はウィルスに依存していたことが観察された。外皮蛋白、コアの残存する部分は種々のウィルスの間で高度に保存されていた。

トウマーら（Ｔｕｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ）（１９８７）は、「アルファルファモザイクウィルス外皮蛋白遺伝子の発現はトランスジエニ・／クタバコおよびトマト植物において交差保護を付与する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａａ＋ｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｃｏａｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ａｎｄ　ｔｏｍａｔｏ　ｐｌａｎｔｓ）、ＥＭＢＯＪ、６：　１１８１〜１１８８、アルファルファモザイクウィルスの外皮蛋白遺伝子で形質転換したトランスジェニックタバコおよびトマト植物はアルファルファモザイクウィルスによる感染に対する抵抗性の増大を開示している。

イエ−およびゴンサルベス（Ｙｅｈ　ａｎｄ　Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ）（１９８５）は、「ババヤリングスポノトウイルスＲＮＡのｉｎν１ｔｒｏ翻訳：カプシド蛋白、円筒状封入体蛋白、およびアモルファス状封入体蛋白についてプロセッシングされた可能なポリ蛋白の検出（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｏｒＰａｐａｙａ　Ｒｉｎｇｓｐｏｔ　Ｖｉｒｕｓ　ＲＮ、Ａ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｐｏ５ｓｉｂｌｅＰｏｌｙｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｈａｔ　ｉｓ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ　ｒｏｒ　Ｃａｐｓｉｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、　Ｃｙｒｉｎｄｒｉ−ｃａｌ−１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　、ａｎｄ　Ａｍｏｒｐｈｏｕｓ−Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）　Ｊ、バイｏｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１４３：２６０〜２７１、ＲＮ−Ａゲノムが、關訳後プロセッシングを営けてボティウイルス蛋白産物を形成する単一のプロ蛋白をコード付けする可能性を記載している。

以下の科学出版物は興味深いが、関連はない：アンら（Ａｎｅｔａｌ）（１９８５）は、１−高等植物の形質転換用クローニング搬入体（Ｎｅｗ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ　ｆｏｒ　ＴｒａｎＳｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｒｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ）Ｊ　、　ＥＭＢＯＪ、４　：　２７７〜２８５、イー・コリおよびエイ・フユメファシエンス双方で安定に複製され得る発現プラスミドの構築を開示している。

アン・シイ（Ａｎ、Ｇ、）（１９８８）は、「植物プロモーター発現ベクターの開発および形質転換タバコ細胞における異なる活性のツバリンシンターゼプロモーターの分析についての使用（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｒｐｌａｎｔ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｕｓｅ　ｆｏｒ　ａｎａＪ−ｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｉｎ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｃｅｌｌｓ）　４　、プラント・フイジオロジ−（Ｐｌａｎｔ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　）８１　：　８６〜９１　、同一細胞内に移入された遺伝子のプロモーター活性ならびに独立由来細胞系における相違を報ベバンら（Ｂｅｖａｎ　ｅｔ　ａｌ）（１９８３）は、７ｒ　 −Ｄ　Ｎ　Ａの７バリンシンターゼ遺伝子領域の構造および転写（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ−ＤＮＡ）ヨ、ヌクレイツク・アンズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｃｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　ｌ　１　：　３６９〜３８５、エイ・チェメファシェンス株Ｔ３７からのＤＮＡの一部のＤＮＡ配列および植物腫瘍転写パターンを開示している。

ディッカーら（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌＸ　１９８２　）は、「／バリンシンターゼ：転写産物マツピングおよびＤＮＡ配列（Ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）Ｊ、ジャーナル１オブ１モレキニラー・アンド・アプライド・ジェネティックス（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎｅｔ、）１　：　５６１〜５７３、エイ・チェメファシェンスで発見されたｎｏｓ遺伝子に対し５°および３゛側のＤＮＡ配列を開示している。

ヘブバーン・エイ：：＞　（Ｈｅｐｂｕｒｎ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ）（１９８５）は、「アグロバクテリウムＴｉ−プラスミドの遺伝子操作用中間体ベクターとしてのｐ　Ｎ　Ｊ　５０００の使用（ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｐＮＪ５０００　ａｓ　ａｎ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｕｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔｉ−ｐｌａｓｍｉｄｓ）」、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロハイ吋ロジー（Ｊ。

Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、）１３１　：　２９６０〜２９６９、イー・コリがらの狭小宿主範囲ベクターをエイ・チュメファシェンスに移入スるのに用いることができるベクターを記載している。

クラインら（ＫＩｅｉｎ　ｅｔ　ａｎ（１９８７）は、「核酸を生きた細胞に伝達するための高速マイクロプロジェクティール（Ｈｉｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　１ｎｔｏ　ｌｉｖｉｎｇｃｅｌｌｓ）　Ｊ　ｓネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２７　：　７０〜７３、生きた細胞を殺すことなく細胞に貫入する加速したタングステン小球を用いて当該細胞に核酸を伝達できることを開示している。

クラインら（Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８８）は、「高速マイクロプロジェクティールによるトウモロコシ細胞への遺伝子伝達に影響する因子（Ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　１ｎｔｏ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ　ｃｅｌｌｓｂｙ　ｈｉｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙ　ｍ１ｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）Ｊ、バイオテクノロジー（Ｂｉ。

／１ｅｃｈ、）６　：　５５９〜５６３、−プラスミド被覆マイクロプロジェクティールで植物細胞を衝撃した２日後に、酵素をフード付けする遺伝子の発現が検知できたことを開示している。

マス゛−ル・ビイ・ジェイおよびチ二−イ・シイ・エフ（Ｍａｚｕｒ、Ｂ。

Ｊ、ａｎｄ　Ｃｈｕｉ、Ｃ，−Ｆ、）　（１９８，５）は、１″タバコからのりブロースニリン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼの小サブユニ、トについてのゲノミックＤＮＡクローンの配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｏｍｉｅ　ＤＮＡｃｆｏｎｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｍａｌｌ　５ｕｂｕｎｉｔ　ｏｒ　ｒｉｂｕｌｏｓｅ　ｂｆｓ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｅａｒｂ−ｏｘｙｌａｓｅ −ｏｘｙｇｅｎａｓｅ　ｔｒｏｔｓ　ｔｏｂａｃｃｏ）Ｊ　、ヌクレイツク４アシズ１リサーチ（Ｎｕｃｉｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　１３　：　２３７３〜２３８６、タバコからのりブロースニリン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼの小づブユニットのＤＮＡ配列を開示している。

マクカー”Ｃ−ディ・イーら（ＭｃＧａｂｅ、　Ｄ、　Ｅ、　、　ｅｔ　ａｌ）（１９８８）は、「粒子加速による大豆（グリシン・マックス）の安定な形質転換（Ｓｔａｂｌｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｏｙｂｅａｎ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）　ｂｙ　ｐａｒｔｉｃｌｅａｃｃｅｌｅｒａｔ　１ｏｎ）コ、バイオテクノＣジー（Ｂｉｏ／１ｅｃｈ、　）ｆ’ｉ　：　９２３〜豆種子に導入された外来遺伝子の大豆苗条における発現を開示し５ている。

オルソン・エム・ケイら（Ｏｌｓｏｎ、Ｍ、に、ｅｔ　ａｎ（１９８９）は、「リポソーム結合部位配列における変更による異種ポリペプチド発現の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙａｌｔｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｓｉｔｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）Ｊ　、ジャーナル・オプ・バイオテクノロジー（Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、）９　：　１７９〜１９０、ＡＴ豊富５゛非翻訳領域の存在によるイー・コリにおける異種遺伝子の遺伝子発現の増加を開示している。

スライトムら（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ　ｅｔ　ａｌＸ　１９８３）は、「インゲン貯蔵蛋白遺伝子：ファゼオリンの完全なヌクレオチド配列（Ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａ　Ｆｒｅｓｎｃｈ　ｂｅａｎ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ：Ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）　Ｊ　、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンジズ（Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ　８０　：１８９７〜１９ｉ、特異的ファゼリンタイプのインゲンマメ主要貯蔵蛋白についてフード付けする遺伝子およびｍＲＮＡの完全なヌクレオチド配列を開示している。

ビライン・エフおよびカノセーデルバール・エフ（Ｖｉ　１ａｉｎｅ、　Ｆ、　ａｎｄＣａ５ｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ、　Ｆ、　）（１９８７）は、「アグロビン型アグロバクテリウム・リゾゲネスのＲｉプラスミドのＴＬおよびＴＲＱ域による形質転換根の独立誘導（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｒ＋ｔ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｒｏｏｔｓｂｙ　ｔｈｅ　ＴＬ　ａｎｄ　ＴＲｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｉ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｏｒ　ａｇｒｏｐｉｎｅ　ｔｙｐｅ＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）　Ｊ　＋　モレキユラー・アンド・ジェネラル・ジェネティノクス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）２０６　：　１７〜２３、アグロビン型アグロバクテリウム・リゾゲネスＲｉプラスミドによる根誘導におけるＴＩ−およびＴＲ−ＤＮＡの各々の役割を開示している。

これらの文献は、単独であるいは組み合わせても、ポテイウイルス外皮蛋白遺伝子およびそれで形質転換した植物に関する本発明を教示も示唆もしない。

Ｒ亘Ω１わ本発明はパパヤリングスボ、／トウイルス株ババヤリングスボノト（ＰＲＹ−１））、スイカモザイクウイルスＩｆ　（ＷＭＶ　ＩＩ）　、およびズノキーニイエローモザイクウイルス（ＺＹＭＶ）の外皮蛋白遺伝子に関する。

本発明はボティウイルス外皮蛋白をコード付けする組換えＤ　Ｎ　Ａ分子に関する。本発明は遺伝子発現に必要な遺伝子調節配列に作動可能に連結したボティウイルス外皮蛋白遺伝子よりなる組換えＤＮＡ分子に関する。

本発明はポティウイルスについての外皮蛋白遺伝子、およびさらに植物に移入された遺伝子の発現に必要な遺伝子調節配列を含有する発現ベクターに関する。また、本発明は該外皮蛋白遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した細菌または植物細胞に関する。さらに、本発明はボティウイルスからの該外皮蛋白遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した植物細胞から作出したトランスジェニック植物に関する。加えて、本発明はウィルス感染に対し増大した抵抗性を有するトランスジェニック植物の作出方法に関する。

発明の詳細な記載ｆ＋−）１．２および３は、各々、ＰＲＶ−ｐ、ＷＭＶｆｆおよびＺＹＭＶの外皮蛋白遺伝子のＤ　Ｎ　Ａヌクレオチド配列を含む。チャート４および５は種々の外皮蛋白遺伝子のヌクレオチド配列を比較する。チャート６〜１４は本発明の詳細な説明するために掲げる。以下の通り、プラスミドおよびＤＮＡ断片を説明するためにある種の約束を用いる。

（１）単一線の図は環状および線状二本鎖ＤＮＡを共に表す。

（２）星印（＊）は、表された分子が環状であることを示す。星印がないのは該分子が線状であることを示す。

（３）機能性成分の自然な境界間の結合は水平線に沿った垂直線によって表す。

（４）遺伝子または機能性成分は水平線の下方に示す。

（５）制限部位は水平線の上方に示す。

（６）遺伝子および制限部位間の距離はスケール通りではない。

図は特に断りのない限り相対的な位置を示す。

（７）以下の省略は機能お型び成分を示すために用いる。

ａ）Ｐｃａ＝ＣａＭＶ３，５Ｓプロモーター：ｂ）Ｉ　ｃ＝ＣＭＶ遺伝子間領域、該遺伝子開領域は開始コドンおよびＡＴ豊富５゛非翻訳領域よりなる。

ｃ）Ｓｃａ＝ＣａＭＶ３５Ｓポリ（Ａ）付加シグナル：およびｄ）Ｎｏｓ＝Ｎｏｓ　ｎｐｔＩＩ遺伝子。

本発明を実施するのに用いる組換えＤＮＡ法のほとんどは、当業者によく知られた標準的手法であって、例えば、ここに参照のために上げる１９８６年１１月２９日に公開された欧州特許出願２２３４５２号に詳細に記載されている。酵素は商業的源から得たものであり、販売業者の推奨法または当該分野で公知の他の変法に従って用いる。かかる標準的な技術を含有する一般的な文献は、すべて委照のために挙げる以下の；アール・ウー（Ｒ，Ｗｕ）　！（１９７９）、メンッズ・インーエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＪｏｇい、６８巻ニジエイ・エイチ・ミラー（Ｊ、　Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ）（１９７２）、分子遺伝学における実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　；ティー７０−ニング：ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍａｎｕａｌ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　；ディ・エム・グローバー（Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏｖｅｒ）ｍ（１９８Ｂ）、デイエヌエイ・クローニング（ＤＮＡ　Ｃｏｌｏｎｉｎｇ）、■巻：エイチ・シイ・ボリテスおよびケイ・アール・マロノティ（）１．　Ｇ。

Ｐｏ１ｉｔｅｓ　ａｎｄ　Ｋ、Ｒｊｌａｒｏｔｔｉ）　（１９８７）　ｒ　ｃ　ＤＮＡ合成についての段階的プロトコル（Ａ　ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆｏｒ　ｃＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｊ、バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　４　：　５１４〜５２０　：ニス・ビイ・ゲルビンおよびアール・エイ・シルベロールト（Ｓ、Ｂ、　Ｇｅ１ｖｉｎａｎｄ　Ｒ，Ａ、５ｃｈｉｌｐｓｒｏｏｒｔ）綱、「植物における遺伝子産物の導入、発現および分析（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＧｅｎｅＰｒｏｄｕｃｔｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ）を含む。

本発明の開示目的で、本明細書中で用いる用語の定義を適用する。

「プロモーターＪは宿主植物において機能的なプロモーターを意味する。

「開始領域ｊは開始コドンおよび該開始コドンの両側のヌクレオチドを包含する。

「作動可能に連結」とは、ヌクレオチド領域が近接し、該領域の機能性が維持され、かつ機能ユニ・７トの一部として他の領域に対して実行されるような特異的遺伝情報をコード付けするヌクレオチド領域の連結をいう。

ＦＡＴ豊富５′非翻訳領域」とは、少なくとも６０％アデニンまたはチミジンヌクレオチドよりなるヌクレオチド配列である。

「非翻訳フランキング領域」とは、終止コドンの３°側であってポリ（Ａ）付加シグナルで終わるヌクレオチド配列をいう。

「ベクターＪは、それによりＤＮＡ断片を宿主生物に導入できる運搬体である。

「発現ベクター」は、それにより、十分な遺伝情報を含有するＤＮＡ断片を宿主生物に導入でき、かつ、従って、該宿主によって発現され得る運搬体である。

「抗病原性遺伝子」は、病原遺伝子のアンチセンス配列または生物体におけるその存在により病原に対する増大した耐性を付与するペプチドをコード付けする抗芦原遺伝子いずれかであるＤＮＡ配列をコード付けする遺伝子である。

本発明を実施するには、ウィルスの外皮蛋白遺伝子をウィルスゲノムから単離し、挿入遺伝子のを発現するのに必要な遺伝子調節配列を含有するベクターに挿入しなければならない。従って、調節配列が所望の遺伝子を挿入に際して機能的するようにそれらを提供するベクターを構築しなければならない。発現ベクター／インサート構築体を組み立てた場合、それを用いて植物細胞を形質転換し、次いで植物を再生させるのに用いる。これらのトランスジェニック植物は発現ベクター／インサート構築体中にウィルス遺伝子を担持する。該遺伝子は植物で発現され、ウィルス感染に対する抵抗性の増大がそれにより付与される。

いくつかの異なるコースが外皮蛋白遺伝子を単離するのに存在する。それをなすのに、当業者はボティウイルスのゲノム構築についての情報を甲いて外皮蛋白遺伝子を位置例けし単離できる。外皮蛋白遺伝子はＲＮＡの３°末端、約２００〜３００のアデニンヌクレオチド残基のストレッチの直前に位置する。加えて、蛋白分解切断部位に関する情報をポティウイルス外皮蛋白遺伝子のＮ−末端を決定するのに用いる。プロテアーゼ認識部位はボティウイルスで保存されており、ジペプチドＧ１ｎ−３ｅｒ、Ｇｉｎ−ＧｌｙまたはＧｉｎ−Ａｈａいずれかであると決定されている。これろのジペプチドをフード付けするヌクレオチド配列は決定することができる。

当該分野でよく知られた方法を用い、大量のウィルスを増殖させ、収穫される。

次いで、ウィルスＲＮＡを分離し、多数の公知手法を用いて外皮蛋白遺伝子を単離することができる。該ウィルスＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを作成する。これに続いての方法は当該分野でよく知られている。該ウィルスＲＮＡを逆転写酵素で処理し、相補ＤＮＡ分子を得る。該相補ＤＮＡ分子のＤＮＡ相補体を得、その配列はもとのウィルスＲＮＡのＤＮＡコピーを表す。かくして、二本鎖ＤＮＡ分子が得られ、これはウィルスＲＮＡの配列情報を含有している。ＤＮＡＮカリーによる制限酵素リンカ−の付加の後、これらのＤＮＡ分子をイー・フリプラスミドベクターにりいで、これを用いてイー・コリを形質転換し、ｃＤＮＡライブラリーを得る。

外皮蛋白遺伝子はポリＡ領域の丁度５′側に位置するので、該ポリＡ１；Ｊｊ域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼー／曹ンブローブとして用いて該ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、形質転換細菌のいずれがポリＡ領域についてコードする配列を持つＤＮＡ断片を含有するのか決定できる。この領域を含有するいずれの細菌コロニーにおけるｃＤＮＡインサートも配列決定できる。外皮蛋白遺伝子は、前記蛋白分解切断部位をコード付けする配列の５″まで伸びる配列を有するコロニーにその全体として存在する。

別法として、ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入することができる。

対外皮蛋白抗体を用いてｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、該遺伝子を該蛋白を発現するコロニーから単離できる。

チャート１．２および３に開示した配列を用い、各ウィルスについての外皮蛋白遺伝子を当該分野でよく知られた方法によって化学的に合成することができる。

別法として、チャート１．２および３における情報を用いてオリゴヌクレオチドを合成することができ、これをプローブとして用いてｃＤＮＡをスクリーニングすることができる。

ＷＭＶ−ＩＩ、ＰＲＶ−ｐおよびＺＹＭＶについて外皮蛋白遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、該遺伝子を発現ベクターに挿入した。該発現ベクターは挿入遺伝子の発現に必要な遺伝子調節領域を含有する。該外皮蛋白遺伝子が植物ゲノムに組み込まれた場合に発現され得るように、該遺伝子はそれらの調節配列が機能するように挿入する。

ウィルス遺伝子を発現させるには、必要な遺伝子調節配列を供しなければならない。ボティウイルスの外皮蛋白はポリ蛋白の關訳後プロセッシングによって生産されるので、ウィルスＲＮＡから単離した外皮蛋白遺伝子は遺伝子発現に必要な遺伝子調節配列を含有しない。外皮蛋白遺伝子は、一旦植物ゲノムに移入され組み込まれたら、その発現に必要な転写お、よび翻訳シグナルを含有しない。従って、植物発現可能プロモーター、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）およびその翻訳終止コドンの３゛側の植物機能的ポリ（Ａ）付加シグナル（Ａ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　’）を含有するように設計しなければならない。本発明においては、開始コドンの３′側かつポリ（Ａ）シグナルの５′側挿入用の暗号部位を含有するベクターに外皮蛋白を挿入する。構造遺伝子が該暗号部位に挿入された場合、機能単位が、挿入遺伝子が種々の遺伝子調節配列の制御下で発現されるように該プロモーターは該開始コドンの５°側にある。

本発明の好ましい具体例においては、付加遺伝子調節配列を供する。前記したごとく、発現ベクターは、プロモーター、開始コドンおよびポリ（Ａ）付加シグナルを含有しなければならない。高レベルの発現を得るには、挿入遺伝子に５“および３”側非關訳領域を供する。さらに、開始コドンの両側の非翻訳領域のある種の配列が発現を最適化する。用いるプロモーターは高レベル発現用に選択したものである。

ターの下流であってかつ該開始コドンの上流になければならない。

この領域はアデニンおよびチミンが少なくとも６０％の配列を含有する。かかるＡＴ領領域該プロモーターおよび開始コドンの間に位置する場合、発現の統計的偏りがある。この選択は、プロモーターおよび開始コドンのＡＴ豊富５°非翻訳領域中間体を包含させることによって本発明の好ましい具体例で利用する。

また、本発明の好ましい具体例は開始コドンの両側にある特異的ヌクレオチド配列を含有する。コザク（Ｋｏｚａｋ）要素なる語のこの好ましい配列はＡＡＸＸＡＴＧＧであり、ここにＸは４種のヌクレオチドのいずれかを表す。コザク（Ｋｏｚａｋ）則に従う開始コドンの存在の結果、発現で用いた場合に高レベル発現が得られる。本発明の好ましい具体例において、ＳＳ　ＲＵＢＵＳＣＯからの小サブユニ７）はコザク（Ｋｏｚａｋ）要素が用いられている開始コドンを含有する。

さらに、本発明の好ましい具体例は外皮蛋白遺伝子を挿入した暗号部位の下流であってポリ（Ａ）付加／グナルの上流にある３′非翻訳領域を含有する。この３ ″悲翻訳領域の配列の結果、蛋白生産について統計的偏りが生じる。該配列は高レベルの発現を促進する。

ポリ（Ａ）付加シグナルは３″非翻訳領域から下流に直接見い出され、同一資源かる由来し得る。本発明の好ましい具体例において、３′非躬訳領域およびボッ（Ａ）付加シグナルはＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子またはファゼオリン種子貯蔵蛋白遺伝子に由来する。

Ｃａ　Ｍ　Ｖからのポリ（Ａ）付加シグナル、ツバリンシンターゼ、オクトビンシンターゼ、豆類貯蔵蛋白、およびＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子もまたこの構築に適する。植物で機能するいくつかのプロモーターが入手可能であるが、最良のプロモーターはカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ、植物ＤＮＡウィルス）およびリブロースニリン酸カルボ牛シラゼーオキシケナーゼ（ＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子の小サブユニ、トからの構成的プロモーターである。

当業者によく知られた方法を用い、植物細切をベクター構築体で形質転換し、植物粗略を誘導して再生させる。得られ１こ植物は外皮蛋白遺伝子を含有し、該外皮蛋白を産生ずる。該蛋白の産生は、該７１支蛋白遺伝子か由来Ｉまたウィルスによる感染に対する増大した抵抗性を植物に付与する。

寒湾！Ｄエ　ＷＭＶＩＴＲＮＡの単離スイカモザイクウィルスＩＩ（ＷＭＶ［）をズ、ヰーニスクヮノシ、、（ククルビタ・ベボーｘル（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ　ｐｅｐｏ　Ｌ）植物中で増殖させ、イエ−およびゴンサルベス（Ｙｅｈ　ａｎｄ　Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ）　（パイロロジー（ｆｉｒｏｌｏｇｙ）　１４３　：　２６０．１９８５）によって記載されてパパヤリングスポットウィルス（ｐａｐａｙａ　ｒｊｎｇｓｐｏｔ　ｖｉｒｕｓ）株ｐｒｖ　（ＰＲＶ　Ｐ）をゼリーメロン、ククミス・メチウリフェルス（Ｃｕｃｕｍｉｓ　ｍｅｔｕｌｉｆｅｒｕｓ）　（Ｎａｎｄ、　）Ｍｅｙ、　Ａｃｅ、　２５４９植物体中で増殖させ、ＲＮＡをイエ−およびゴンサルベス（Ｙｅｈ　ａｎｄ　Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ）（パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１４３　：　２６０．１９８５）によって記載されている方法によって単離した。

実施例３　ＺＹＭＶ　ＲＮ、Ａの単離ズソ牛−ニイエローモザイクウィルス（ｚｕｃｃｈｉｎｉ　ｙｅｌｌｏｗ　ｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＸＺ　ＹＭＶ）をス゛ノ半−二スクワノシニ（ククルビタ・ベボ・エル（Ｃｕｅｕｒｂｉｔａ　ｐｅｐｏ　Ｌ）植物中で増殖させ、ＲＮ　Ａをイエ−およびコンサル・＼ス（Ｙｅｈ　ａｈｄ　Ｇｏｎｓａｉｖｅｓ）　（バイａａジー（Ｖｉｒｃｌｏｇｙ）１４３　：　２６０．１９８５）によって記載されている方法によって単離した。

及鞭燃４　二本鎖ｃＤＮＡの合成単離したライ２レスＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを作成する方法は前記単離つ・イルスＲＮＡ以外は同一である。精製したＲ　Ｎ　Ａ　’５＝　４リテスおよびマロノティ（Ｐｏｌｉｔｅｓ　ａｎｄ　Ｍａｒｏｔｔｉ）（バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｒｉｑｕｅｓ）４　：　Ｂ　１４．　１９８６）によって記載さねでいるＣ　Ｄ　Ｎ　、、＼ｊ）族プロト：ｌ・１．・；、−付１−２このＲＮ　Ａは（多くの立核生物ｎｌ　ＲＮへについで見い出されているのと同様に）その３”末端にＡ豊７”’；’ｆ’ＫＩ堝：を汽何するので、該手法；よ直接的である。また、丁檜、鎖（：ＤＮ、へ〇合、Ｉ）父はボ１，１テスおよびマ；ｌテｒ　（Ｐａ！ｉすｅｓ　ａｎｄ、Ｘ１ａｒｃｙｔｔｔ）に、よぜごａ３　Ｑ　５　ｐ、−７い７）、−シくに行った。ニ本ｊｍ　ＣＤ　Ｎ　、Ａの合１戊を行ったｉ安、それをＧ−１００セフ丁テ゛ノクスカラムを通して精製し、エタノールで沈叶させ、１０゜（ＥｃｏＲＩメチラーセ緩衝液（ｌｏｏｍＭ　ＮａＣＱ、１００ｍＭトリス−）（Ｃ（、ｐＨ８０，１ｍ％ｉ　ＥＤＴＡ、８０μＭ　Ｓ−アゾ／シルメチオニン、および１００μｇ／ｍＱウシ血清アルブミン）２０μρに懸濁した。Ｓ−アデノシルメチオニン（３２ｍＭ溶液１μａ）をさらに反応混合物に添加し、続いてＥｃｏＲＩメチラーゼ１μｌ２（２０単位）を添加した。

反応物を３７°Ｃで３０分間インキュベートし、７０°Ｃにおける１分間のインキュベーションによって停止した。次いで、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ）Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩクレノー断片１μ＆（５単位）を添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、フェノール／′クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。ベレットを７０％エタノール、次いて７０％エタノール／　０　、３　Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄した。該べ１．・、トを乾燥し、０５μｇ／μＣリン酸化ＥｃｏＲ１リンカ−（フルラボラティブ・リサーチ・インコーポレイテッドレキシントン、スプリング・ストリート（Ｓｐｒｉｎｇ　Ｓｔ、）＋　２８）　８μ （Ｌ４’、濁した。ｌＯ×リガーゼ緩衝液（８００ｍＭトリス−ＨＣｆ７、ｐ）（８，０，２００ｍＭ　％ｉｇ　Ｃｌ２ｔ、１５０ｍＮＩ　ＤＴＴ、１０ｒｔ＋：ｖｉＡＴＰ）１μＣおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼ（４単位）１μＣを添加し、反応物を１５°Ｃで一晩インキコベートした。結ぶ反応を６５°Ｃでの１０分間のインキ二ベーションによって停止した。水６０μｅ１１０ＸＥｃｏＲＩ塩（９００ｍＭ）リス−ＨＣｃ！、ｐＨ８，０、］、０００ｍＭＭｇＣ（ｂ、１００ｍＭＮａＣ＋２　）１０μ（１、およびＥｃｏＲＩ　（ｔｏ単位／ａ（ｎ１０ｔｔＱを添加し、反応物を３７°Ｃで１時間インキュベートした。フェノール／クロコロホルムおよびクロロホルム抽已によって反応を停止し１こ。次いで、反応混合物をセファテ、クスＧ−１００カラムを通してサイズ分別し、最大二本鎖ｃＤＮＡ分子を含有する画分をブタンール抽出によって濃縮し、。

エタノールで沈顧させ、水１０μＣに再懸濁した。二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの５μ ρを（予めホスファターゼで処理して５′リン酸を除去した）ｐＵｃ１９　ＤＮＡ０．５μｇ、、ＩＯＸリガーセ緩衝液ｌμＣ４およびＴ４　リガーゼ１μＱに添加し、反応物を１５°Ｃて１６時間インキュベートした。得られた結紮ｐＵｃ１９−外皮蛋白遺伝子二木鎖ｃＤＮＡ分子を製造業者（ベラスダ・リサーチ・ラボラトリーズ拳インコーポレイテッド（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｃｒａｔｏｒｉｅｓ、　！ｎｃ、　）、メリーランド２０８７７、ガイセルスブルグ）によって記載されているごとくにイー・コυ宿主細胞に形質転換し、５０μρ／ｍρアンピシリン、０．０４ｍＭ　Ｉ　ＰＴＧ、および０．００４％Ｘ−Ｇａ１を含有する培地上で平板培養した。青色を示さない細菌コロニーをさらに分析用に選択した。３′領域および恐らく外皮蛋白遺伝子を含有するクローンを３２ｐ−標識オリゴ−ｄＴに対するハイブリダイゼーシタンによって同定した。このプローブに対してハイブリタイモー／ジンを示す細菌コロニーは少なくとも特定のボテイウイルスゲノムのポリ（Ａ）領域を含有するはずである。ハイブリダイズする細菌コロニーのいくつかを選択し、プラスミドＤ　Ｎ　Ａを当業者に公知の方法に従って単離（７た。

実施例５　ＰＲＶ　ｐ外皮蛋白遺伝子の同定マキサムおよびギルバート（ｌｌａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）　（メリンス・オブ・エノ′サイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６５　：　４９９゜１９８０）によって記載されている化学ＤＮＡ配列決定法によって、ｐｖｐ−ｐ　ＲＮＡのクローン化ｃＤＮＡのいくつかを配列決定した。この情報および他のポティウイルスクローン数との比較分析に基づき、ｐＰＲＶ−１１７はＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子の完全なコピーを含有することが判明した。該外皮蛋白のＮ末端はジペプチド配列Ｇ１ｎ−５ｅｔの位置によって同定した。該ＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子暗号領域の長さは約３３ｋＤａ　ｉの蛋白をコード付けする遺伝子に合致する。

該ＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子および蛋白の配列をチャート１に示す。加えて、この配列と、ナゲルおよびハイパー）　（Ｎａｇｅｌ　ａｎｄ　Ｈｅ１ｂａｅｒｔ）　（パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１４３　：４３５．１９８５）によって記載されている類縁ウィルスＰ　ＲＶ　−Ｗとの比較により、２の外皮蛋白遺伝子は９８％ヌクレオチドおよびアミノ酸同様性を占める（チャート４）。これらの２のウィルスはその外皮蛋白で広範な同一性を有するので、Ｐ　ＲＶ　− ｐかろの外皮蛋白遺伝子の発現はＰＲＶ−ｐおよびＰ　ＲＶ　−ｗ双方に対して耐性な植物を生じると予測される。

実施例６　Ｃａ　ＭＶ　３５　Ｓプロモーターおよびポリアデニル化シグナルおよびＣＭＶ５’　非翻訳領域および転写開始Ａ　Ｔ　Ｇを持つ植物発現可能ｐＲｖ−ｐ外皮蛋白遺伝子カセ７１−の構築必要な植物調節シグナルをＰ　ＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子に結合させるのは、クローンｐＵｃ１８１３／ＣＰ１９を用いる本来ＣＭＶ外皮蛋白遺伝子用の発現用に設計したクローンとの翻訳融合を構築することによって達成した。プラスミドｐＵｃ、１８１３／ＣＰ１９はアグロバクテリウム媒介遺伝子移入に適１．たベクターである。

ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＤＨ５ｉ／ＣＰ１９から取り出し、（ロバート・ケイ（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｋ、）、ワシントン、フルマン、ワシントン州立大学、化学学部から入手可能な）プラスミドｐＵｃ　１８１３のＥｃｏＲ１部位に入れ、プラスミドｐＩＪＣ１８１３／ＣＰ１９を得た。プラスミドｐＵＣＩ　８１３／ＣＰ　１．９は１９８７年１２月２１日出願の米国特許８願０７．／１３５５９１号に記載されておｊ）、ここに参照のために挙げる。この転写融合クローンは、まずクロ−によって構築した。１の部位（Ｔｔｈｌｌｌｌ）をアミノ＠１３〜１７間に位置し、一方、他の部位（ＢｓｔＸＩ）はｃＭ〜′外皮蛋白遺伝子の３″非翻訳領域の末端近くに位置する。

これらの特異的制限酵素部位をＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子への付加は、パー牛ン・エルマー−セタス（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）、エメリービル（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）、カリフォルニア州から購入した装置およびＴａｑポリメラーゼを用い、ポリメラーゼ鎖反応技術によって達成した。特に、ＰＲＶ− ｐ外皮蛋白遺伝子に関し少なくとも２０ヌクレオチドを占める、２の各５°および３゛オリゴマー（ＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＳＴ　ｔ　ｈ　ｌ　Ｉ　＋　１部位含有、および、ＣＣＣＡＣＧＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＧへＧＴＣＡＧ、　Ｂ　ｓ　ｔ　Ｘ　ｉ部位含有）を用いて外皮蛋白遺伝子の合成および遺伝子増幅を開始させ１こ。

合成の後、増幅し１こ断片をＴｔｈｌｌｌＩおよびＢｓｔＸＩ″：ｃｌＪ化して部位を暴露させた。

チャート６に示すごとく、ｐＵｃ１８１３／ＣＰ１９はＣＭ〜′外皮蛋白遺伝子を含有する発現ヘクターである。プラスミドｐＵＣ１８１３／ＣＰ１．９はＴｔｈ！ＩＩＩおよびＢｓｔＸ　！部位を含有する。

消化し増幅した断片をｐＵｃ１８１３／ＣＰ１９の各暴露部位に結び、当業者に公知の方法を用いて予定した新構築体を同定した。

ポリメラーゼ鎖反応技術を用いてＴｔｈｌｌｌｆおよびＢｓ　ｔＸ■１部位を含有するＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子を増幅した。プラスミドｐＵＣ１８１３／ＣＰ　１９およびＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子断片をＴｔｈｌｌｌＩおよびＢｓｔＸＩで消化し、相互に結んだ。

ｐＵＣ１８１３／ＣＰ１９−ＰＲＶｅｘｐと命名した得られたクローンをヌクレオチド配列決定に付してクローニングおよび遺伝子増幅によりいずれの有害な人工物も導入されなかったことを確認した。配列は人工物を示さず、この植物発現カセットが、さらにそのＮ末端にＣＭＶ外皮蛋白の１６個のアミノ酸を含有するＰ　ＲＶ　−るミクＯＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａプラスミドの構築体チャート７に示すごとく、アグロバクテリウムからの移入および植物ゲノムへの組込み用に必要なアグロバクテリウムＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ移入シグナル、および（アグロバクテリウムにおける復製用の）広宿主範囲複製始点を含有する適当なミクｏＴ−ＤＮＡベクターに、ＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子用の植物発現力セントを移入した。プラスミドＴ）ＵＣｌ、８１３／ＣＰ１９−ＰＲＶｅｘｐをＨｉｎｄｌＩＩて消化し、該植物発現可能カセットを含有する得られた２、２ｋｂのインサート断片を取り出し、修飾したアグロバクテリウム由来ミクロベクターｐＧＡ４８２　（修飾はβ −グルクロニダーゼ遺伝子の付加を包含するものであった）のＨｉｎｄＩ［ｒ部位に結んだ。該ミクロニーＤＮＡベクターｐＧＡ　４８２はシイ・アン（Ｇ、Ａｎ）、インスティテユート・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ワシントン州立大学、プルマン、ワシンＣＰ１９−ＰＴＶｅｘｐと命名し、チャート２に示す。

このプラスミド（またはその誘導体）をＡ２０８、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８Ｚ７０７、Ａ４Ｒ５，、Ａ４Ｒ３（１）ＲｉＢ２７８ｂ）等のごトキアグロバクテリウム・チコメファシエンスまたはリゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｏｒ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）のビルレントまたはアビルレント株に移入した。株Ａ２０８、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、およびＡ４Ｒ３はアメリカン・タイプ・カルチャー・フレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（Ａ　Ｔ　ＣＣ）、メリーランド州、ｏ７クヒ゛ル、バークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）　１２３０１から入手可能である。細菌Ａ４Ｒ３（ｐＲ１Ｂ２７８ｂ）はフランス国、ベルサイユ、Ｆ７８０００．ルテドゥ・セーノ・シール（Ｒｏｕｔｅｄｅ　５ａｉｎｔ　Ｃｙｒ、）、Ｃ，Ｎ、　Ｒ，Ａ、、エフ・カッセーデルバール（Ｆ。

Ｃａ５ｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ）博士から入手できる。株Ｃ５８Ｚ７０７はイリ、ノイ州、ウルバナ（Ｕｒｂａｎａ）、イリノイ州立大学、農学部、エイ・シイ・ヘブバーン（，４，Ｇ、　Ｈｅｐｂｕｒｎ）博士から入手できる。

の前記掲載アグロバクテリウム株いずれかへの移入の後、これらのアグロバクテリウム株を用いて、そのＴ　ＤＮＡ領域内に含有される植物発現可能ＰＲＶ−ｐ外皮蛋白遺伝子を植物ゲノム内に移入しおよび組込むことができる。この移入は当業者に公知のＴ−ＤＮＡ移入についての標準的な方法を用いて達成できるが、あるいはこの移入は、ここに参照のために挙げる「発芽植物種子のアグロバクテワウム媒介形質転換（ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕＩｌｌＡ（ｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆＧｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　Ｐｌａｎｔ　５ｅｅｄｓ）Ｊなる標題の１９８７年１２月２１日付出願の米国特許出願０７／１３５６：＋５号に記載されている方法を用いて達成できる。

実施例８　種々の遺伝子のトランスジェニック植物における発現用植物発現カセットの構築本発明の好ましい具体例において、インサートの高１７ベル発現を達成するために、遺伝子インサートに（プロモーター、５′非翻訳領域、転写開始コドン、およびポリアデニル化シグナルの付加を包含する）必要な植物調節ングーナルを洪するのに以下の発現カセットを構築した。該発現カセットは挿入されたいずれの遺伝子を発現するのにも使用できる。従って、発現カセットの適用可能性は外皮蛋白遺伝子を発現するにおけるその使用を超える。むしろ、該発現カセットはトランスジェニック植物においていずれの所望の蛋白を発現するのにも使用できる。該発現カセットはウィルス外皮蛋白遺伝子を植物で発現させるのに好ましい発現系である。

好ましい具体例の発現カセｙｒ−は；構成的プロモーター；遺伝子発現を促進する５′非翻訳領域；コザク（Ｋｏｚａｋ）要素よりなる開始コドン；発現させるべき遺伝子が機能的発現ユニットを生じるように挿入できるクローニング部位１および高レベル発現を生じるポリ（Ａ）付加シグナルおよび非翻訳フランキング領域よりなる３″非翻訳領域を含有する。

特別には、本発明の好ましい具体例の発現カセットはカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写プロモーター、キニウグモザイクウイルス（ＣＭ　Ｖ　）の５゛−非翻訳領域、ＣＭυ翻訳開始フドコドおよびＣａ　Ｍ　Ｖボリアテニル化シグナルよりなる。植物調整／グナルの正しい位置、ならびに外皮蛋白遺伝子の容易な付加および完成されたカセットの切り出しを可能とし、従って他のプラスミドに移入できる都合良い制限酵素部位の付加を達成するために、この発現カセットの構築てはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用した。

この発現カセットの構築を達成するために、以下のオリゴマーを合成した・１、　５’−ＧＡＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＴＴＣＣ−３ ’は、その５“末端にＨ＋ｎｄｌ１７部位を含有し、ＣａＭＶの５゛−フランキング領域にお；ブる２１塩基に同一である２１塩基を含有する。

２．５“−ＧＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＣＴＣＧＡＣＴＣＡＡＴＴＣＴＡＣＧＡＣ− ３”は、コザク（Ｋｏｚａｋ’）則に連合する翻訳開始コドンを含有するその５ °末端にＮｃｏｒ部位を含有し、ＣＭ〜１５゛−非＃！Ｉ択領域のアニチセンス鎖？二お１する２１塩基に同一で、ｂる：２１塩基を有ζる４、別５　’−ＧＣＣＡＴＧＧＴＴＧＣＧＣＴＧ、ＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣ３’は、（オリコマ−２と同一の翻訳開始二１くを含有」°る）モレ）こ−よ端；こン、ＣＱ　！部位２倉ｑし、Ｃａ八・１ｖの、３°−非紅訳領域における２０塩基と同一である一≧０塩基を有する。

４５“−ＧＡＡＧＣＴＴＧＧＴへＣＣへＣＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＴ−３°は、そ０３″末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を念有し、（アンチセンス鎖上の）Ｃａ、” 、１ＶボＩＪアデニル化部位の３′側のフランキングＤ　Ｎ　Ａ領域に対合する２０塩基を有する。

これらのオリゴマーを用いて、チャート６に示し前記で言及したｐＵＣ１８Ｉ３／ＣＰＩ９なるＣＭＶ発現りσ−ン内？ご含有された配列を増幅した。チャート８に示Ｉ７たごとく、ＰＣＲ技術を用いてｐＵｃ１８１３／ＣＰ１９にお（する遺伝子調節領域を増幅した。

５゛−フランキング、ＣＭＶ５’−非翻訳領域、および（コザク則Ａ　Ａ　Ｘ　Ｘ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　１．：適合させるべく修飾した）ＣＭＶ開始コドンの増幅の結果、長さ約４００塩基対の断片か得られ、Ｃａ　＞、Ｑ　Ｖ　３−非翻訳およびフラニ・・キング領域の噌妬の結果、長さ約２００塩基対の断片か得られた。、−れらの断片をさ：Ｃｃ）ｉおよびＨｉｎｄｌｌ？で消化し、″ｊ！ｔノアク＋）ｉニアミドケルから中雛ｉ＋１１７ぐいで、Ｈｉ　ｒ〕ｄ　ＩＩＩ消化しホスファターゼ処理（，７こｐＬＸｃ１８に結んだ。得らＩＮだクローンをｐ　１８ＣａＭＶ／ＣＭＶ−ｅｘｐといい、チャート８に示す。

実施例９ＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子の同定化学法（マキサムおよびギルバート（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）、メリンス・オワ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｒ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　６５　：　４９９．１９８０）および酵素法（サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）　、　プロシーディングズ・オワ・ナシ曹ナル・アカデミ−・オワ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　）υ５Ａ７４：５４６３，１９７７）双方を用いて、前記したごとくに生成したクローンｐＷＭＶＩＩ−４１−３，２からのクローン化ＷＭＶＩ［ＣＤＮＡインサートを配列決定した。この情報および他のポティウイルスとの比較分析に基づき、クローンｐＷＭＶＩ［−４１−３，２のヌクレオチド配列はＷＭＶＩ［外皮蛋白遺伝子の完全なコピーを含有することが判明した。外皮蛋白のＮ−末端はジペプチド配列Ｇ１ｎ−３ｅｒの位置によって示唆された。ＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子暗号領域（２８１アミノ酸）の長さは約３３ｋＤの蛋白をコード付４けする遺伝子と矛盾しない。加えて、この配列とエゲンベルガーら（Ｅｇｇｅｎｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）によって記載されている類縁ウィルス大豆モザイクウィルス（ＳＭＶ）株Ｎから得られにものとの比較により、全体で約８８％の同一性を有することを示し、それらが約９２．５％の同一性を有するＮ−末端炎を排除する。これらの２のウィルス外皮蛋白は広範囲のアミノ酸同一性を有するので、ＷＭＶＩＩからの外皮蛋白遺伝子の発現は、ＷＭＶＩ［感染に耐性の植物を生じることが予測され、ＳＭＶ感染に対し耐性な化シグナルならびにＣＭＶ遺伝遺伝子板領域び翻訳イニシエータ−ＡＴＧをもつ植物発現可能ＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子カセットの構築チャート９に示すごとく、必要な植物調節シグナルをＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子に結合させるのは、必要な部位をその５°および３°配列に付加させるオワゴマ−を用いてＷＭＶ■外皮蛋白遺伝子を増幅させるためのＰＣＲ技術を使用することにより達成した。この増幅に続き、得られた断片を適当り制限酵素で消化し、プラスミドｐ　１８ＣａＭＶ／ＣＭＶ−ｅｘｐを含有する前記発現カセットのＮｃｏ１部位にクローン化した。該ＷＭＶＩ！外皮蛋白遺伝子インサートを含有するクローンはＣａ　Ｍ　Ｖプロモーターに関して正しい向きであるか否かをチｚ　’７りするのみでよい。

しかしながら、ＰＣＲ増幅の間に人工物が取込まれなかったことを確認するために、全外皮蛋白遺伝子領域をヌクレオチド分析によってチェ’７りした。

両末端にＮｃｏＩ制限酵素部位をもつ増幅されたＷＭＶＩ［外皮蛋白遺伝子を得るために、以下の２種のオリゴマーを合成した。

１、　５’　−ＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧＡＡＡＡＧ− ３°、これはＮｃｏＩ部位をＷＭＶ！Ｉ外皮蛋白遺伝子の５′末端に付加し、発現カセットｐ１８ＣａＭＶ７ＣＭＶ−ｅｘｐに存在する同−ＡＴＧ翻訳開始コドンを保持する。

２、　５’　−ＡＣＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＣＧＡＡＡＴＧＣＴＡＡＣＴＧＴＧ− ３’、これはＮｃｏ１部位をＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子の３′末端に付加し、この部位は発現カ七ノドＩ）１８ＣａＭＶ／ＣＭＶ−ｅＸｐに結ぶことができる。

遺伝子のｐｌ　８ＣａＭＶ／ＣＭＶ−ｅｘｐへのクローニングにより、（ｐ　１８ＷＭＶＩＩ−ｅｘｐという）植物発現可能ＷＭＶＩＩ遺伝子が得られ、転写および翻訳の後、Ｖｔ７ＭＶ］ｌ外皮蛋白遺伝子ヌクレオチド配列に由来するのと同一のＷＭＶ■外皮蛋白が生成する（チテート２参照）。しかしながら、この外皮蛋白は、ＡＴＧ開始フドコド付加するための必要な遺伝子設計のため、および（Ｇｌｕ−８ｅｒプロテア一ゼ切断部位に隣接している）５４ｋＤ核封入体蛋白の最後の４個のアミノ酸を包含させることにより異なり；付加されるアミノ酸はＶａ　］　−３ｅ　ｒ−Ｌｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｎ−末端　ＷＭＶＩＩである。

これらの４個のアミノ酸残基の付加は、この外皮蛋白がＷＭＶ■感染に耐性の植物体を生じる能力に影響しないはずである。

何故なら、ボティウイルス外皮蛋白のＮ末端領域は長さまたはアミノ酸同一性いずれかについてよく保存されていないようだからである。しかしながら、これが問題であることが判明したら、その置き換えは、ＷＭＶｎ外皮蛋白遺伝子のＮ末端変化を得るための異なるオリゴマーの使用を含むであ−ろう。植物発現可能ＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子のクローン化構築体はｐ１８ＷＭＶｎ−ｅｘｐといい、チャート９に示す。

実施例１１　植物発現可能ＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子構築体を含有するミクロＴ　ＤＮＡプラスミドの構築チャートｌＯに示すごとく、ＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子についての植物発現カセ・７トを（アグロバクテリウムから植物ゲノムへの媒介移入および取り込みを行うために）必要なアグロバクテリウムニーＤＮＡ移入シグナルおよび（アグロバクテリウム中での複製用の）広宿主範囲の複製始点を含有する適当なミクロ−Ｔ−ＤＮＡに移入してプラスミドｐＧＡ４８２／Ｇ／ＣＰＷＭＶＩ［−ｅｘｐを得た。このプラスミドを構築するために、プラスミドｐ１８ＷＭＶＩＩ−ｅｘｐを（発現カセットの十分外部で、ｐＵｃ１８のポリクローニング部位内で切断する）ＨｉｎｄｌＩＩで消化し、植物発現可能カセットを含有する１、８ｋｂ断片を取り出し２、修飾したアグロバクテリウム由来のミクロベクターｐＧＡ４８２（修飾はβ−グルクロニダーゼ遺伝子の付加を包含する）のＨ，ｉ　ｎ　ｄ　ｍ部位に結んだ。該ミクロニーＤＮＡベクターｐＧＡ４８２をチイート７に示すが、これはシイ・アン（Ｇ、　Ａｎ）、ワシントン、プルマン、ワンントン州立大学、インスティチュート、オブ、バイオロジカル・ケミストリー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）から入手できる。得られたプラスミドをｐＧＡ４８２／Ｇ／ＣＰＷＭＶＩＩ −ｅｘｐと命名し、チャート１０に示す。このプラスミド（またはその誘導体）をＡ　２０８、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８Ｚ２０７、Ａ４Ｒ５，Ａ４ＲＳ（ｐＲｉ８２８７ｂ）等のごときアグロバクテリウム・チュメファシエンスまたはりゾゲネスのビルレントまたはアビルレント株に移入した。株Ａ２０８、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、およびＡ４Ｒ３はアメリカン・タイプ・カルテ丁−・コレクシ甘ン（ＡＴＣＣ）、メリーランド州、ロックビル、バークローンドライブ（Ｐａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ）１２３０１から入手できる。細菌Ａ４Ｒ８（ｐＲｉＢ２７８ｂ）はエフ・力、セーデルバール（Ｆ、　Ｃａ５ｓｅ−Ｄｅｌｂａｒｔ）、フランス国、ベルサイユ、ルティドウ・セーノ・シル（Ｒｏｕｔｅｄｅ　５ａｉｎｔ　Ｃｙｒ、）博士、Ｃ，ｌｉＲ，Ａ、から入手できる。細！ＩＣｊ８Ｚ２０７はエイ・シイ・ヘプバーン（Ａ、Ｇ、）Ｉｅｐｂｕｒｎ）を専士、イリノイ州、ウルバナ（Ｕｒｂａｎａ）、イリノイ州立大学、農学部から入手できる。

設計したプラスミドｐＧＡ４８２／Ｇ／ＣＰＷＭＶＩＩ−ｅｘｐの前記掲載アグロバクテリウム株のいずれかへの移入の後、これるのアグロバクテリウム株を用いて、そのＴ−ＤＮＡ領域内に含有される植物発現可能ＷＭＶｎ外皮蛋白遺伝子を植物ゲノム内に移入し組み込むことができる。この移入は当業者に公知のＴＤＮ、Ａ移入についての標準的な方法を用いて達成できるか、あるいはこの移入は「発芽植物種子のアグロバクテリウム媒介移入（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　Ｐｌａｎｔ　５ｅｅｄｓ）コなる標題の１９８７年１２月２１日付は出願の米国特許出願０７／１３５６５５号に記載されている方法によって達成できる。加えて、最近、かかるアグロバクテリウムはそれらのＴ−ＤＮＡ領域を大豆植物のゲノムに移入し２組込むことができることが判明した。かくして、これらの株は植物発現可能〜い４ＶＩＩ外皮蛋白遺伝子を大豆のゲノムに移入して大豆モザイクウィル３株からの感染に耐性である大豆植物系を開発するのに用いることができる。

エフティール移入最近、ＤＮＡの植物ゲノムへの移入および組込みについて別のアプローチが開発された。この技術はＤＮＡ　（プラスミド形態）が付着するマイクロプロジエクテイールの使用による。これらのマイクロプロジェクティールを高速度まで加速し、そのモーメントを用いて植物細胞壁および膜を貫通させる。植物細胞への貫入の後、付着ＤＮＡがマイクロプロジェクティールから漉し取られ、ＤＮＡ修復酵素が「遊離Ｊ　ＤＮＡを植物ゲノムに組込む場所たる核に移入される。その現在の形態において、該プロセスは全くランダムではあるが、プラスミド（またはその部分）によって首尾よく形質転換された植物組織は、（細菌ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子ＮＰＴＩＩのごとき）選択可能なマーカー遺伝子、または（細菌ベータグルクロニダーゼ遺伝子Ｇｕｓのごとき）レポーター遺伝子の使用によって同定でき、か？均質に培養できる。植物を形質転換するための粒子加速の成功し１こ使用は、最近、大豆について示されており、ｐ１８ＷＭＶＩＩ−ｅｘｐのゲノムへの移入により、大豆モザイクウイルス株からの感染に耐性である大豆植物を得ることができる。

ｐ１８ＷＭＶＩＩ−ｅｘｐにこのプロセスを使用するのは、植物発現可能遺伝子ＮＰＴｎまたはＧｕｓ遺伝子いずれかあるいは双方の付加の後達成できる。ｐ１８ＷＭＶＩ［−ｅｘｐに対するｎｐｔ［およびＧｕｓ遺伝子を有するプラスミドをチャート１１に示し、ｐ　１８ＧＷＭＶｆｆ−ｅｘｐおよびｐ　１８ＮＧＷＭＶＩ［−ｅｘｐと命名する。加えて、実施例１１に記載した構築体は、すでにｐＷＭＶＩ［ｅＸＰに結合したｎｐｔｌＩおよびＧｕｓ遺伝子を共に有するので（チャート１０参照）、マイクロプロジェクティール移入で用いることができる。

ｐＧＡ４８２ＧＧ／ｃｐＷＭＶＩＩ−ｅｘｐの使用がマイクロブロジェクティールのプロセスによる移入の間に遭遇しうる唯一の困難はその大きなサイズ約１８ｋｂによるものであり、低効率移入となりかねず、かかる大きなプラスミドは一般に増殖の間にＤＮＡを少ししか生じない。

プラスミドｐ　１８ＧＷＭＶｉｉ−ｅｘｐを構築するためには、プラスミドｐ１８ＷＭＶｉｉ−ｅｘｐｆｃＢａｍＨＩで消化し、Ｇｕｓ遺伝子を含有する３、０キロベースのＢａｍＨＩ単離断片で結ぶ。プラスミドｐ　１８ＮＧＷＭＶｉｉ− ｅｘｐを構築するためには、プラスミドＩ）１８ＧＷＭＶｉｉ−ｅｘｐをＳｍａ　Ｉで消化し、Ｄｒａ　Ｉおよび５ｔｕｉでの消化によって生成したＮｏ５−ｎｐｔＩ［遺伝子を含有する２、４に、ｂ単離断片で結ぶ。

実施例１３　ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子の同定前記した方法を用いてクローン化したクローンｐＺＹＭＶ−１５からのクローン化ＺＹＭＶ　ｃＤＮＡインサートを化学法（マキサムおよびギルバート（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）、メソッズ・オブ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６５　：　４９９．１９８０）および酵素法（サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サンエンシズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａ目、Ａｃａｅｄ、Ｓｅｉ、）Ｕ　Ｓ　Ａ　７４−：　５４６３．１９７７）によって配列決定した。この情報および他のポティウイルスとの比較分析に基づき、クローンｐＺＹＭＶ−１５のヌクレオチド配列はＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子の完全なコピーを含有することが判明した。該外皮蛋白のＮ−末端は、ボティウイルスにおける切断部位に特徴的な（ドウゲルティら（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ　ａｔ　ａｌ）、　ＥＭＢＯＪ、７　：　１２８１．　１９８８参照）ジペプチド配列Ｇ１ｎ−３ｅｔの位置によって示唆された。

ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子暗号領域（２８ｏアミノ酸）の長さは約３１．３ｋＤの蛋白をコード付けする遺伝子に合致する。このＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子および蛋白の配列をチャート３に示す。

叉範男ユ１Ｃａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓプロモーターおよびポリアデニル化シグナルならびにＣＭＶ遺伝遺伝子間合域び翻訳イニシエータ−ＡＴＧをもつ植物発現可能ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子カセットの構築チャート１２に示すごとく、必要な植物調節シグナルのＺ　ＹＭＶ外皮蛋白遺伝子への結合は、必要な部位をその５° および３′側配列に付加するであろうオリゴマーを用いてＺ　Ｙ　Ｍ　Ｖ外皮蛋白遺伝子を増幅するためのＰＣＲ技術を用いることによって達成した。この増幅に続き、得られた断片を適当な制限酵素で消化し、プラスミドｐＵｃ１８ｃＰ− ｅｘｐを含有する前記発現カセットのＮｃｏＩ部位にクローン化した。ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子インサートを含有するクローンはＣａ　Ｍ　Ｖプロモーターに関する正しい向きを決定するためのチェックだけでよい。しかしながら、ＰＣＲ増幅の間に人工物が取り込まれなかったことを確認するために、全外皮蛋白遺伝子領域をヌクレオチド配列分析によってチェックした。

両末端にＮｃｏｌ制限酵素部位をもつ増幅されたＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子を得るために、以下の２樺のオリゴマーを合成した。

１、　５’−ＡＴＣＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＧＧＣ−３’、これはＮｃｏ１部位をＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子の５″末端へ付加し、発現カセットｐＵＣ１８ｃｐｅｘｐに存在する同一のＡＴＧ翻訳開始コドンを保持する。

２、　５’−ＡＧＣＴＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＡ、ＡＴＡＡＡＧＣＴＧ−３″、これはＮｃｏ１部位をＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子の３′末端に付加し、この部位は発現カセノ）ｐＵｃ１８ｃｐｅｘｐに結ぶことができる。

これらの２種のオリゴマーを用いるこのＰＣＲｚＹＭＶ外皮蛋白遺伝子のｐＵＣ１８ｃｐｅｘｐへのクローン化により、植物発現可能ＺＹＭＶ遺伝子（ｐＵｃ１８ｃｐＺＹＭＶという）が得られ、続いての転写および翻訳によりＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子ヌクレオチド配列に由来するのと同一のＺＹＭＶ外皮蛋白を生じる。

しかしながら、この外皮蛋白は、ＡＴＧ開始コドン、続いてのＧｌｙ（これはポリ蛋白切断部位のＳｅｒに隣接する３゛側のアミノ酸である）（チャート３参照ンを付加するための遺伝子工学が必要なため異なる。該Ｇｌ、Ｙアミノ酸残墓は可能なＮ−末端アミノ酸について選択した。何故ならば、多（のボティウイルス外皮蛋白はＳｅｔ。

ＧｌｙｌまたはＡｌａいずれかをそのＮ−末端に有するからである。

しかしながら、これが問題であることが判明したならば、その置き換えは、ＺＹＭＶ外皮蛋白についての異なるＮ−末端アミノ酸を得るための異なるオリゴマーの使用を含む。植物発現可能ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子のクローン化構築体をｐＵｃ　ｌ　８ｃ　ｐＺＹＭＶと命名するミクロＴ−ＤＮＡプラスミドの構築適当に修飾した実施例１１の教示により、植物発現可能ＺＹＭＶ外皮蛋白を含有するミクロＴ−ＤＮＡプラスミドの構築体を構築した。プラスミドｐＵＣｌ　８ｃ　ｐＺＹＭＶ（チャート１２）を（発現カセットの十分外部で、ｐＵｏ　１８の多重クローン化部位内を切断する）　Ｈｉ　ｎｄＩ［Ｉで消化し、植物発現可能カセットを含有する１、６ｋｂ断片を取り出し、ミクロ−ベクターｐＧＡ４８２（チャート７ンのＨｉｎｄＩ１１部位に結んだ。得られたプラスミドは、１）ＧＡ４８２ＣＧ／ｃｐＺＹＭＶと命名し、チャート１３に示す。

設計したプラスミドｐＧＡ４８２０Ｇ／ｃｐＺＹＭＶのアグロバクテリウム株への移入の後、該アゲバクテリウム株を用いて、そのＴ−ＤＮＡ領域内に含有される植物発現可能ＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子を植物ゲノム内に移入し組込むことができる。

実施例１６　ｐＵｃ１８ｃｐＺＹＭＶの植物組織へのマイクロプロジェクティール移入実施例１２の教示により、該マイクロプロジェクティール移入技術を用いて適当な遺伝子調節配列と共にＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子を植Ｐ／Ｊ組轍に導入することかできる。

このプロセスをｐＵＣ１８ｃ　ｐＺＹＭＶの移入に用いるのは、植物発現可能遺伝子ＮＰＴＩＩまたはＧｕｓ遺伝子いずれかあるいは双方の付加の後に達成することができる。ｐＵｃ　１８ｃｐＺＹＭＶに対するｎｐｔｆｆおよびＧｕｓ遺伝子を有するプラスミドをチャート１４に示し、ｐＵＣ１８ＧｃｐＺＹＭＶおよびｐＵＣｌ　８ＮＧｃｐＺ’　Ｙ　Ｍ　Ｖと命名する。加えて、実施例１５に記載した構築体も、それがｐＵＣ１８ｃｐＺＹＭＶカセットに結合したｎｐｔｒｌおよびＧｕｓ遺伝子を共に既に有するので（チャート１３参照）、マイクロプロジェクティール移入に用いることができる。ｐＧＡ４８２ＧＧ／ｃｐＺＹＭＶの使用がマイクロプロジエクテイールプロセスの間に遭遇する唯一の困難はその大きなサイズ約１８ｋｂによるものであり、これは低効率の移入となりかねず、かかる大きいプラスミドは一般に増殖の間にＤＮＡを生じるのが少ない。

プラスミドｐＵＣ１８ＧＣＰＺＹＭＶを構築するには、プラスミドｐ［Ｊｃ　１８ＣＰＺＹＭＶをＢａｍＨｌで消化し、Ｇｕｓ遺伝子を含有する３、ＯＢａｍＨＩ単離断片に結ぶ。プラスミドｐＵｃ１８ＧＣＰＺＹＭＶを構築するには、プラスミドｐＵＣ１８ＧＣＰＺＹＭＶをＳｍａ　Ｉで消化し、Ｄｒａ　Ｉおよび５ｔｕｌでの消化によって単離したＮＯ５ｎｐｔＩ［遺伝子を含有する２、４に単離断片で結ぶ。

千−一ト１テーート１　（つつき）ｃｃＡｃｃｃｙａｙｖ丁ＣＡＣＣＴＴＡＴ（：ＣＴＡ（ＴＡＴＡ丁＾＾Ｃ【＾ＴＴＡＣＡ＾Ｔ＾（＾ＧＡＣ；ＴＣ；ＧＣＩＣＣＧＣＣｋＣＣ９＠１　−−−−− −−−−−−−−−−−−−−、−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− −−−−−−−−、−−−−−−−−−A９６８ＣＣＴＴＣＴＡＴＴＴＴＡ（ＡＣＴＣＡ（：ＣＣＴＡにＣＣ（ＴＣ（にＴＣ（ＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＡＴＴＣＣＡＣＴＴ（Ｔ（ＴにＡＣｉ９６１　−−−−−、 −−−々−−−−−−−−−噂−−−−−−−一一中一−−−−−−−−・−− −−−−−−一時一一−−−−−−−■@ＩＣ２０丁ＣＴＣＣＡＴＡＣ＾ＣＴＣＴＣＣＣＴにＣＣ（ＣＡ（ＣＴＣＡＴ＾丁Ｔ（ＣＡＣＣ（ＴＣＴＴＡＣＡＡＴＣＡＣＡＡＡ＾＾＾＾＾＾＄１！１２３　−＝＝＝− −・−−−−−−−一一路−−−−−−−−−φ−−−−−−−−−ゆ−−−− −−−一−→−−−−−−−−−C１８０チヤート２テーート２（つづき）＾＾ｖＡｃｃｃｃＡｃｃ丁＾ＣＧＧＩ＾＾ＴＣｍＧＴＴＣＣＣＴ＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾１ｅｌｌ：ｋ　−−−−−−−−−峰−− −−−−−−−、−−−−−−−−−、−−−−−−−−−、−−−−−−−− −、−−−−−Ｉk３Ｓチイート３テーート３（つつき）チイート４チャート４　（つつき）チで一ト５チで一トロｐＰＲＶ１１７Ｈ１ｎｄＩエエ　ＮｅｏＩ　Ｔｅｈｌｌｌｌ　ＢｓｔＸＸ　ＮｅｏＩ　Ｈ１ｎｄ工ＩＩｐＵｃ１８１３／ＣｐＬ９−ＰＲＶｎｃｐＨ１ｎｄＩエエ　Ｎｃｏｌ　丁セｈｌｌｌＩ　ＢｓヒＸＩ　ＮｃｏＩ　Ｈ１ｎｄＩエエチャート７ＧＡ４８２Ｈ１ｎｄエエエ遺伝子ｐＧＡＡ１１２７に／ＣＰＬ９−ＰＲＶ＠）ＨｐＨ１ｎｄエエエ　Ｔｅｈｌｌｌｌ　Ｂｓｔｎ　Ｈ１ｎｄエエエチイート８ｐ１８ｃａＭＶ／ＣＫＶ−＊ｘｐＨ１ｎｄエエエ　ＨｃｏＸ　Ｈ１ｎｄＩＩＩチーート９ｐＩＪＫＶＩニー４１−３．２ＰＣＲより生じた遺伝子ＮｃｏＩ　Ｎｅｏ工ｐ１８ＷＭＶＨ−＠砕チーート１０ｐＧ１４８２７Ｇ／ＣＦＪＫＪＸＸ−ａｘｐＨ１ｎｄ工１１　Ｎｃｏｌ　ＮｃｏＸ　Ｈ１ｎｄエエエチーート１１ｐ１８ＧＷＭＶ！Ｉ−ｅｘｐｐ１８Ｎα博エエ檀印テヂート１２ＰτＭ−１，５ α累外皮蛋白遺伝子ＮｃｏＩ　ＮｃｏＩｐＵｃ１８ｃｐＺＹＫＶ）ｆｉｎｄ工Ｉ工Ｎｅｏ工　ＮｃｏＩ　）（ｉｎｄ工ＸＸ　Ｂａｗｌ（Ｉ　Ｓ！ＩＩＪＩＩテヂート１３テーート１４国際調査報告ＰＣＴ／１；Ｓ　８９１０３０９４国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ボデイウイルス外皮蛋白をコード付けする組換えＤＮＡ分子であって、該組換えＤＮＡ分子がパパヤリングスポットウイルス株パパヤリングスポットＰＲＶ −ｐ外皮蛋白遺伝子、スイカモザイクウイルスＩＩＷＭＶＩＩ外皮蛋白遺伝子、およびズッキーニイエローモザイクウイルスＺＹＭＶ外皮蛋白遺伝子から選択されることを特徴とする該組換えＤＮＡ分子。
２．該組換えＤＮＡ分子がパパヤリングスポットウイルス株パパヤリングスポットＰＲＶ−ｐ外皮蛋白をコード付けし、該組換えＤＮＡ分子がチャート１に示したヌクレオチド配列を有する請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子。
３．該組換えＤＮＡ分子がスイカモザイクウイルスＩＩＷＭＶＩＩ外皮蛋白をコード付けし、該組換えＤＮＡ分子がチャート２に示したヌクレオチド配列を有する請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子。
４．該組換えＤＮＡ分子がズッキーニイエローモザイクウイルスＺＹＭＶ外皮蛋白をコード付けし、該組換えＤＮＡ分子がチャート３に示したヌクレオチド配列を存する請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子。
５．さらに、ａ）プロモーター；ｂ）開始領域；およびｃ）ポリ（Ａ）付加シグナルよりなり、該プロモーターは該開始領域の上流にあってそれに作動可能に連結し、該開始領域は外皮蛋白をコード付けする該組換えＤＮＡ分子の上流にあってかつそれに作動可能に連結し、かつ外皮蛋白をコード付けする該組換えＤＮＡ分子は該ポリ（Ａ）付加シグナルの上流にあってかつ該ポリ（Ａ）付加シグナルに作動可能に連結している請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子。
６．該プロモーターがカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである請求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡ分子。
７．該開始領域がキュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子の該５′非翻訳領域に由来する開始領域およびＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の５′非翻訳領域に由来する開始領域よりなる群から選択される請求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡ分子。
８．該開始領域が配列ＡＡＸＸＡＴＧＧよりなる請求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡ分子。
９．該ポリ（Ａ）付加シグナルが；カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；ファゼオリン貯蔵蛋白遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；ノパリンシンターゼ遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；オクトピンシンターゼ遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；豆類貯蔵蛋白遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；およびＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯに由来するポリ（Ａ）シグナルよりなる群から選択される請求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡ分子。
１０．該開始領域がキュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子の５′非翻訳領域に由来し、該ポリ（Ａ）付加シグナルがカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子に由来する請求の範囲第６項記載の組換えＤＮＡ分子。
１１．さらにＡＴ豊富５′非翻訳領域を含有し、ここに、ａ）該ＡＴ豊富領域が該プロモーターの下流であって該開始領域の上流にあり；ｂ）該開始領域が配列ＡＡＸＸＡＴＧＧよりなり；ｃ）該ポリ（Ａ）付加シグナルが非翻訳フランキング配列を含有する請求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡ分子。
１２．該プロモーターがカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである請求の範囲第１４項記載の組換えＤＮＡ分子。
１３．核ＡＴ−豊富５′非翻訳領域がキュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子およびＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の５ ′非翻訳領域に由来する請求の範囲第１１項記載の組換えＤＮＡ分子。
１４．該開始領域がキュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子およびＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の５′非翻訳領域に由来する請求の範囲第１１項記載の組換えＤＮＡ分子。
１５．該開始領域が配列ＡＡＸＸＡＴＧＧよりなる請求の範囲第１１項記載の組換えＤＮＡ分子。
１６．該ポリ（Ａ）付加シグナルが：カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；ファゼオリン貯蔵蛋白遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；ノパリンシンターゼ遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；オクトピンシンターゼ遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；豆類貯蔵蛋白遺伝子に由来するポリ（Ａ）シグナル；およびＳＳ　ＲＵＢＩＳＣＯに由来するポリ（Ａ）シグナルよりなる群から選択される請求の範囲第１１項記載の組換えＤＮＡ分子。
１７．ａ）該ＡＴ豊富５′非翻訳領域および該開始領域がキュウリモザイクウイルスＣＭＶ外皮蛋白遺伝子の５′非翻訳領域に由来し；ｂ）該開始領域が配列ＡＡＸＸＡＴＧＧよりなり；ｃ）該ポリ（Ａ）付加シグナルがカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ３５Ｓ遺伝子に由来する請求の範囲第１２項記載の組換えＤＮＡ分子。
１８．請求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡ分子を含有する形質転換植物細胞。
１９．請求の範囲第１０項記載の組換えＤＮＡ分子を含有する請求の範囲第１８項記載の形質転換植物細胞。
２０．請求の範囲第１１項記載の組換えＤＮＡ分子を含有する請求の範囲第１８項記載の形質転換植物細胞。
２１．請求の範囲第１７項記載の組換えＤＮＡ分子を含有する請求の範囲第２０項記載の形質転換植物細胞。
２２．請求の範囲第１８項記載の形質転換細胞よりなるウリ科、パパイア科、ナス科、およびアメ科よりなる群から選択されるトランスジェニック植物。
２３．請求の範囲第１９項記載の形質転換植物よりなる請求の範囲第２２項記載のトランスジュニック植物。
２４．請求の範囲第２０項記載の形質転換植物よりなる請求の範囲第２２項記載のトランスジェニッタ植物。
２５．請求の範囲第２１項記載の形質転換植物細胞よりなる請求の範囲第２４項記載のトランスジェニック植物。
２６．ａ）請求の範囲第５項記載の組換えＤＮＡ分子を構築し；ｂ）該組換体ＤＮＡで植物細胞を形質転換し；次いで、ｃ）該形質転換植物細胞から植物を再生する工程よりなるウイルス感染に対して耐性であるトランスジェニック植物の生産方法。