JP2002238564A - 強力な構成的遺伝子発現のための発現カセットおよびプラスミドならびにその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】本発明は、トランスジェニック植物組織中
で、所望のポリペプチドをエンコードする異種核酸に作
動的に結合する植物の強力な構成的プロモーターを含
む、単離された核酸構成体を提供する。 【効果】本発明の核酸構成体は、キメラ遺伝子中の異種
コード配列のための構成体として使用したときは、植物
根組織および植物葉組織中で、所望のポリペプチドを高
度に発現し得る。キメラ遺伝子が、該構成体に結合され
た後、得られるベクターは、植物細胞に導入でき、その
結果、植物を改変することができ、得られる植物に外来
物質を製造させ得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術的背景】本発明は、植物細胞中で所望のポ
リペプチドを高度に発現するための構成的細胞非特異的
プロモーターを含む核酸構成体およびその利用方法に関
し、特に、トランスジェニック植物の根組織および葉組
織中で極めて高度なレベルで構成的に発現され得る遺伝
子のためのプロモーターに関する。上記構成体による遺
伝子発現は、35Sプロモーターのものよりかなり強い。
本発明は、遺伝子発現を構成的に制御するためのシロイ
ヌナズナTPS3プロモーターの使用によって例証され、こ
れにより所望の形質転換植物が産生できる。

【０００２】交雑（crossinng）をするためには、常法
による品種改良では、導入される遺伝子型が近縁の交雑
のためのものに限られ、かつ所望の雑種を得るには長期
間かかるという問題がある。しかし、遺伝子工学技術と
いった最近の生物工学的発展の成果を利用することによ
り、所望の遺伝子を植物に直接導入することができ、こ
のようなシステムは、常法による品種改良における問題
を解決することができるものと期待されている。植物遺
伝子工学によれば、改良された特性を有する植物を産生
する際においてもまた、極めて有利である。植物疾病、
昆虫および環境的ストレスに対する耐性を改良するた
め、あるいはトランスジェニック植物の栄養的特性を向
上するためには、遺伝子の発現を制御する強力な構成的
プロモーターを所望の遺伝子と結合させるとよく、それ
によって、該プロモーターの制御下でその遺伝子が発現
される。また、生物活性なポリペプチドの経済的な生産
は、薬剤および栄養物の製造ならびに植物バイオファー
ムにおけるその他の特別な化学薬品の製造業にとっても
重要である。強力な構成的プロモーターを含む組み換え
核酸構成体を利用して生み出された発現宿主としてトラ
ンスジェニック植物細胞を用いる組み換えＤＮＡ技術
は、大量のポリペプチドを産生するために特に有益な手
段である。

【０００３】植物で異種遺伝子を発現するのに有用ない
くつかのプロモーターがすでに同定されている。最も広
く使用されるプロモーターは、カリフラワーのモザイク
ウイルス由来の35Sプロモーター（CaMV35Sプロモータ
ー）である。35Sプロモーターは、トランスジェニック
植物の全ての組織において遺伝子発現を引き起こす、強
力な、構成的プロモーターである。同定されているその
他の構成的プロモーターには、アグロバクテリウム・ツ
メファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のT-DNA
のマンノピン（mannopine）シンターゼ遺伝子およびノ
パリン（nopaline）シンターゼ遺伝子由来のものを含
む。商業的利用を意図した組み換えポリペブチドを産生
するには、特に、ホスト細胞が所望のポリペプチドを高
レベルで発現させる必要がある。したがって、発現特性
を維持する植物組織中で、所望のポリペプチドを高レベ
ルで、強く構造的に発現させることのできる発現制御シ
グナルが必要とされる。このような構成的プロモーター
を利用すれば、商業的に重要な穀物の遺伝子工学が可能
になるであろう。本発明は、この技術を完成させた。

【０００４】シロイヌナズナTPS3遺伝子に関し、2,583
塩基からなるシロイヌナズナのcDNAの完全配列が報告さ
れており、861残基からなるそのアミノ酸配列も導き出
されている（GenBank AC004473参照）。しかしながら、
上記TPS3遺伝子の転写を制御するために作用するプロモ
ーター領域に関しては、所望の遺伝子の強力な構成的遺
伝子発現を引き起こし、トランスジェニック植物の根組
織および葉組織において、発現特性を維持するシロイヌ
ナズナのTPS3プロモーターの同定に言及する何らの報告
および／または発明も現在のところなされていない。

【０００５】したがって、本発明によれば、所望の外来
遺伝子およびターミネーターを、得られたシロイヌナズ
ナのTPS3プロモーター領域の下流部位に結合させて、植
物に導入することができ、それによって、所望の遺伝子
をトランスジェニック植物組織中で発現させることがで
きる。このプロモーター領域は、生物的あるいは非生物
的ストレスに関係する転写、および植物を改良するため
の所望の遺伝子を発現させるのに利用することができ、
また、植物組織中で生物活性な物質を製造するためにも
利用することができる。

【０００６】

【発明の概要】本発明によれば、植物の根組織および葉
組織中で、所望のポリペプチドを最高レベルで発現させ
るための、異種遺伝子に作動的に結合した植物プロモー
ターを含む単離された核酸構成体物を提供し得る。該植
物プロモーターは、トレハロース代謝で必要とされるト
レハロース6-リン酸シンターゼをエンコードするシロイ
ヌナズナ遺伝子由来の、CaMV 35Sプロモーターより強力
な構成的プロモーターを含む。また、本発明によれば、
所望のポリペプチドをエンコードする異種遺伝子に作動
的に結合したシロイヌナズナTPS3プロモーターを含む発
現ベクターを提供し得る。

【０００７】発現ベクターは、さらに選択マーカーのよ
うな他の成分を含んでもよい。また、この構成体は、植
物または他のホスト細胞中で機能し得る複製開始点（or
i領域）の配列を含んでいてもよい。本発明の好ましい
構成体として、プラスミドpLES99010を、ブダペスト条
約の下、#52 Oun-dong, Yusong-ku, Taejon 305-333,大
韓民国にあるKorean Collection for Type Cultures(KC
TC)に、accession No.KCTC 0811BPで2000年7月1日に寄
託した。プラスミドpLES99011は、ブダペスト条約の
下、Korean Collection for Type Cultures(KCTC)に、a
ccession No. KCTC 0812BPで寄託した。プラスミドpLES
99014は、ブダペスト条約の下、Korean Collection for
Type Cultures(KCTC)に、accession No. KCTC 0813BP
で寄託した。プラスミドpLES99015は、ブダペスト条約
の下、Korean Collection for TypeCultures(KCTC)に、
accession No. KCTC 0814BPで寄託した。

【０００８】本発明は、また異種遺伝子に作動的に結合
したシロイヌナズナTPS3プロモーターを含む発現カセッ
トを含有する植物細胞を提供するものである。発現カセ
ットは、ホスト細胞のゲノムに組み込まれていてもよ
く、また独立に複製プラスミド上に存在していもよい。
該発現カセットを用いると、植物の遺伝子操作が可能と
なり、それにより商業的に重要な植物内での、所望の遺
伝子発現の構成的制御が可能となる。好ましい植物細胞
としては、双子葉植物および単子葉植物の両方が挙げら
れる。

【０００９】本発明者らは、広範にわたる研究を行い、
植物組織中で機能し得るプロモーターを見出すことによ
り、所望の遺伝子を非常に強力に構成的に発現させるこ
とを可能とし、これにより本発明を完成したものであ
る。

【００１０】

【発明の具体的説明】本発明は、植物において、高レベ
ルで所望のポリペプチドの構成的発現をするのに有用な
発現カセットおよびベクターを提供するものである。本
発明に係るプロモーターおよびベクターは、特に、病原
体耐性、環境的ストレス耐性あるいは植物バイオファー
ミングのための、大豆および米などを含む植物ホスト内
でのタンパク質の発現に好適であり、高レベルで組み換
えタンパク質の発現が得られる。上記プロモーターは、
CaMV35Sプロモーターにより与えられるよりも高レベル
での発現を提供するものである。

【００１１】本明細書中で必要とされる一般的な実験手
順は、Sambrookらによる”Molecular cloning：A Labor
atory Manual”(2^ndEd.), Vol.1-3, Cold Spring Harbo
r Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989で知る
ことができる。本明細書で用いられるすべての技術的お
よび科学的用語は、本発明の属する当該技術分野におい
て通常の技術を有する者（以下、「当業者」ともいう）
によって常識的に理解されているものと同様の意味を有
する。ここに記載されているものと類似のあるいは等価
ないかなる方法および原料も、本発明を実施あるいは試
験するために使用することが可能であるが、より好まし
い方法および原料について記載する。

【００１２】「核酸」という用語は、デオキシリボヌク
レオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、一本
鎖あるいは二本鎖型であってもよく、もし他に限定がな
ければ、自然発生するヌクレオチドと同様の方法で核酸
とハイブリッド形成する天然ヌクレオチドの公知のアナ
ログも包含するものとする。もし、指示がない場合は、
特定の核酸配列は、その相補的配列をも含む。

【００１３】「作動的に結合された」という用語は、核
酸の発現制御配列（たとえば、プロモーター、シグナル
配列、または転写因子結合部位の配列（array））と第
二の核酸配列との間の機能的な結合をいい、その点で発
現制御配列は、第二の配列に相当する核酸の転写および
／または翻訳に影響を及ぼす。「組み換え」という用語
は、細胞に関して使用するときは、細胞が異種核酸を複
製すること、または異種核酸によってエンコードされる
ペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組み
換え細胞は、細胞の生得の型には見られない遺伝子を発
現し得る。組み換え細胞は、細胞の生得の型には見られ
ない遺伝子を発現することもできるが、その中で遺伝子
は修飾されかつ人工的方法によって細胞中に再導入され
ている。

【００１４】ここで用いられる「異種遺伝子」とは、外
来種由来の遺伝子をいうか、もしくは同じ供給源由来の
ものであれば、その原型由来の修飾された遺伝子をい
う。したがって、プロモーターに作動的に結合している
異種遺伝子は、プロモーターを得たのと異なる供給源由
来のものであるか、もしくは同じ供給源由来のものであ
れば、その原型由来の修飾された遺伝子である。たとえ
ば、トレハロース6-リン酸シンターゼ遺伝子プロモータ
ーは、生得のトレハロース6-リン酸シンターゼ以外のポ
リペプチドをエンコードする構成体的遺伝子に結合され
得る。たとえば、プロモーターに作動的に結合し得るDN
A断片を生じる制限酵素を用いてDNAを処理することによ
り、異種配列の修飾が生じてもよい。特定部位の突然変
異誘発は、異種配列を修飾するのにもまた有用である。

【００１５】ここでいうプロモーターは、関心あるタン
パク質の遺伝子を該プロモーターの下流に結合したと
き、植物細胞中でタンパク質の発現を制御し得るプロモ
ーターを意味する。また、本発明のプロモーターは、他
の転写−翻訳を活性化する配列に結合することでさらに
修飾されてもよい。「発現カセット」は、後述の核酸エ
レメントの配列に和合性のあるホスト中で、構造的遺伝
子の発現に影響を与え得る核酸エレメントによって生じ
る、あるいは合成される核酸構成体をいう。発現カセッ
トは、少なくともプロモーターと必要に応じて、転写終
結シグナルを含む。典型的には、発現カセットは、転写
される核酸とプロモーター（たとえば、シロイヌナズナ
TPS3プロモーター）を含む。発現が起きる際に補助する
付加的因子もまた本明細書で記載するように使用するこ
とができる。たとえば、発現カセットは、ホスト細胞由
来の発現されたタンパク質の分泌を支配するシグナル配
列をエンコードするヌクレオチド配列も含むことができ
る。このような構成体を含む形質転換細胞を選択できる
ように、発現ベクター中に、選択マーカー遺伝子を便宜
的に含有してもよい。当業者であれば、このベクター成
分は、実質的にその機能に影響を与えることなく、修飾
され得ることができることを理解されるであろう。

【００１６】本発明の実施は、核酸構成体および形質転
換植物細胞における遺伝子の発現を必要とする。このよ
うな目的を達成するための分子クローニング技術は、こ
の技術分野において公知である。たとえば発現ベクター
といった組み換え核酸の構築に最適の、広汎なクローニ
ングおよびインビトロの増幅方法が、当業者のあいだで
よく知られている。多くのクローニング実習を通して熟
練者を指導するのに充分な技術および知識の例を、Jose
M. Martinez-ZapaterおよびJulio SalinasのArabidops
is protocols（Humana Press）に見ることができる。

【００１７】本発明の第一の面は、シロイヌナズナ・ト
レハロース6-リン酸シンターゼ（AtTPS3）遺伝子由来の
プロモーター（SEQ ID NO:1）のヌクレオチド配列（約
1.0kb）を含む核酸構成体である。所望の特性を有する
プロモーターの同定は、多くの方法により達成しうる。
たとえば、ゲノムのまたはcDNAライブラリーは、たとえ
ばシロイヌナズナ、Myrothamnus flabellifoliusおよび
イーストのような既知の供給源のTPS3遺伝子より準備し
うる。与えられた種由来のライブラリーは、他の既知の
遺伝子のコード領域と相補性のある配列を含むように設
計されたオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニング
される。代わりに、オリゴヌクレオチドプローブは、精
製したTPS3タンパク質より得られるアミノ酸配列情報を
基に設計してもよい。アミノ酸配列を基にしたオリゴヌ
クレオチドプローブは、縮退していてもよく、供給源植
物の望ましいコドンが有利になるように偏ってもよい。
オリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングおよび
配列決定用のPCR断片を増幅するために、逆転写ポリメ
ラーゼ連鎖反応（RT-PCR）での利用のために設計しても
よい。PCR断片の配列は、相当するクローンを同定する
ために所望する遺伝子の既知コード領域と比較すること
ができる。たとえば、病原体応答遺伝子のcDNAは、病原
体に感染した植物細胞および遺伝子特異的プライマーか
ら調製した全RNAを用いて、RT-PCRにより得られる。

【００１８】次に、cDNAを、入れ子状に重なったプライ
マーを用いて連続PCR反応により植物細胞から得たゲノ
ム制限ライブラリーを用いてプロモーター領域を単離す
るためのおとり(bait)として使用した。PCR増幅生産物
は、クローンされ、配列決定された。プロモーター領域
は、生得であるかあるいはホストと同種、または外来あ
るいは目的とするホストと異種であってもよい。「外
来」という用語は、転写開始領域が、それが導入された
植物ホスト内では、通常見出せないことを意味するであ
ろう。シロイヌナズナトレハロース6-リン酸シンターゼ
1遺伝子（Blazquez et al., 1998. The Plant Journal
13(5):685-689）あるいはサッカロミセスセレビシィ（S
accharomyces cerevisiae）トレハロース6-リン酸シン
ターゼ2遺伝子（De Virgilio et al., 1993. Eur. J. B
iochem. 212:315-323）は、本発明で有用なプロモータ
ーを得ることができる遺伝子の特別な例である。当該構
成体は、結果的に得られる配列が有効に該プロモーター
および発現調節活性を保持する限り、いくつかの塩基が
欠失、挿入あるいは置換されているSEQ ID NO: 1より誘
導される塩基配列を含んでいてもよい。さらに、このよ
うな欠失、挿入あるいは置換された塩基をいくつか有す
る配列は、上記プロモーター活性を有効に維持する限
り、上記塩基配列と機能上、本質的に同じである。

【００１９】もっとも好ましいプロモーターのヌクレオ
チド配列を、SEQ ID NO: 1に示す。示されるように、こ
のプロモーターは、pLES99014発現ベクターのXbaI部位
に挿入されている。プロモーターのTATAボックス配列
は、ヌクレオチド918-923にある。プロモーターの下流
で発現される遺伝子の挿入を可能とするために、SmaI部
位はpLES99014配列においてXbaI部位のちょうど3'側に
存在する。

【００２０】所望のプロモーター断片のヌクレオチド配
列は、技術文献（Carruthers et al., 1982. Cold Spri
ng Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418）中に記載
されているような周知の技術によって合成可能である。
適当な条件下で、相補鎖を合成しかつその鎖をともにア
ニーリングすることで、二本鎖DNA断片を得ることがで
きる。

【００２１】本発明の第二の面は、発現カセット、ある
い発現ベクターとして用いることができるように発現カ
セットを組み込んだベクターである。本発明のプロモー
ターを含むプラスミドは、本発明のプロモーターの下流
に所望の遺伝子を切り出したり又は挿入するための制限
酵素部位を有するように構成される。所望の遺伝子は、
上記プロモーターとの関係では異種であってもよい。本
プラスミドは、植物根および葉組織中で所望のタンパク
質を発現させるための上記プロモーターに、所望の構成
体的遺伝子を結合することにより調製され、また、自律
的に複製、遺伝などをするキメラ遺伝子も含む。本発明
のプロモーターは、植物根および葉組織中で所望のタン
パク質を発現することができるため、本発明のGUSレポ
ーター遺伝子を切り出すことができ、生物的／非生物的
ストレスに対する耐性、あるいはトランスジェニック植
物における生物活性な物質の産生を増強することのでき
る所望の遺伝子により置換することができる。

【００２２】関心あるヌクレオチド配列を、本発明のプ
ロモーターより下流に挿入し、本発明のプロモーターの
制御下に置くことができる。関心あるヌクレオチド配列
は、内因性産物の生産量を変えることにより、あるいは
機能的に新規な遺伝子産物をエンコードすることによ
り、表現型の特徴を修飾しうる。ヌクレオチド配列は、
酵素をエンコードする任意のオープンリーディングフレ
ームまたはゲノム配列に相補的な配列を有していてもよ
く、このようなゲノム配列は、相補的配列が、転写、メ
ッセンジャーRNAプロセシングを阻害するようなオープ
ンリーディングフレームまたは任意の他の配列であって
もよい。関心あるヌクレオチド配列は、合成されたもの
であっても、天然起源のものでも、これらの組合わせで
あってもよい。関心あるヌクレオチド配列の特質に依存
するために、植物にとり好ましいコドンを持った配列を
合成することが望ましい。

【００２３】ベクターは、所望の構成体を持つホスト細
胞を選択させるために、選択マーカー遺伝子を含んでも
よい。これらの遺伝子は、選択的培養培地で育成される
形質転換ホスト細胞の生存または成長のために必要なタ
ンパク質をエンコードする。選択遺伝子を含むベクター
によって形質転換されていないホスト細胞は、媒地中で
生き残らないであろう。典型的選択遺伝子は、たとえば
カナマイシンやヒグロマイシン（hygromycin）といった
抗生物質または他の毒物に対する耐性を付与するタンパ
ク質をエンコードする。一連の選択マーカーが当業者の
あいだで知られており、たとえば、Sambrook他に記載さ
れている。上述した成分のうち1以上を含む好ましいベ
クターの構築には、上に引用されている参考文献に記載
されている標準技術が使用される。

【００２４】多数の植物ホスト細胞が本発明のベクター
とともに使用し得る。このような植物の例としては、大
豆、トマト、ジャガイモ、タバコ、米、トウモロコシ、
小麦、大麦、ストロベリー、および菜種が含まれる。こ
れらの例は、例示であって、制限するものではない。形
質転換は、使用するホスト細胞に依存するため、このよ
うな細胞に適切な標準技術を用いて行われる。

【００２５】本発明のプロモーターは、非常に高レベル
で、植物ホスト細胞において所望のタンパク質を発現さ
せるのに有用である。そうしたタンパク質は、植物ホス
ト細胞と同種であってもよく、好ましくは、ホスト細胞
と異種である。具体的には、該プロモーターを使用する
ことで、非常に高レベルで哺乳類、菌類、および植物の
タンパク質を発現させることができる。上記プロモータ
ーを使用して発現し得る典型的タンパク質には、トレハ
ロース6-リン酸シンターゼ、ABA-応答エレメント結合因
子（ABF）、病原体応答遺伝子（R遺伝子）、糖質代謝酵
素、カロテン合成酵素、フラボノイド合成酵素、成長ホ
ルモン、インシュリン、インターロイキン、コロニー刺
激因子などが含まれる。本発明の上記プロモーターは、
該プロモーターと作動的に結合する核酸の発現の転写を
得るために有用であるが、上に掲げた酵素は、例示であ
って、制限するものではない。該プロモーターが導入さ
れたホスト植物細胞としては、植物根および葉組織が、
外来遺伝子の発現が特異的に高められる点で好ましい。
したがって、再生能力を有する植物細胞中への該プロモ
ーターを含む発現ベクターの形質導入は、たとえば、米
のような穀物をつくる植物に、生物的／非生物的耐性お
よび／または高い植物生産性を付与するといった商業的
および農業的に望ましい特性を組み込むための効果的な
手段を提供する。

【００２６】感染およびストレスに対する構成的耐性を
有するか、生物活性な物質の生産を高められたトランス
ジェニック植物を得るために、本発明の構成体を提供す
る。特に、本発明の構成体を用いて形質転換された植物
細胞は、通常の植物組織培養技術によって再生させるこ
とができる（Jose M. Martinez-Zapater and Julio Sal
inas, Arabidopsis protocols, Humana press,1998）。
非常に興味あることに、関心あるDNA配列の発現は、ス
トレス部位、特に根および葉組織で構成的に発現され
る。この構成体は、植物で外因性産物の生産のみならず
内因性産物の発現の調節をするための必要物を提供す
る。DNA構成体は、ゲノムに融合させ、転写させるため
に植物細胞ホストに導入される。このような方法では、
高レベルのRNAおよび適切であればポリペプチドが世代
期間で獲得し得る。本発明を用いて植物あるいは植物組
織を形質転換することにより、所望の遺伝子の非常に強
力で、構成的な発現を確実にすることができる。

【００２７】トレハロース6−リン酸シンターゼ3(TPS3)
は、グルコース6−リン酸およびウリジン−二リン酸グ
ルコース由来のα−D−グルコピラノシルα−D−グルコ
ピラノシド（非還元性二糖類トレハロース）の合成を触
媒している。還元末端の欠如は、トレハロースに熱、p
H、メイラード反応（ジャガイモの加工中に変色が生じ
るといった炭水化物とアミノ酸の間の反応）に対する高
い耐性を与える。さらに、トレハロースは、脱水後に、
ガラス様構造を形成して、生物構成体に対し強力な安定
化効果を有する。これらの特徴のため、トレハロースの
代謝は、穀物に環境ストレス耐性を実現する手段とし
て、また、トレハロースは、乾燥食品または冷凍食品を
保存するために有用な安定化剤として、また化粧品およ
び医薬品の添加剤として注目が増しつつある。

【００２８】TPS1の遺伝子のうち、シロイヌナズナから
誘導されるようなcDNAの完全配列が報告されている［Bl
azquez et al,. The Plant Journal (1998) 13:685-68
9］。しかしながら、たとえばTPS3遺伝子の転写を制御
するために機能するプロモーター領域に関しては、プロ
モーター遺伝子の単離およびその利用に言及するような
報告はいまだ何もされていない。上記のような知識を有
していれば、本発明は、農業的に重用な植物に外来遺伝
子を発現させるのに用いることができる。本発明の構成
体は、発現後15分以内に活性化され、活性を維持する。
したがって、本発明の構成体によって与えられる遺伝子
発現の誘導の迅速性および強さは、病原体に対する植物
耐性応答を引き起こしあるいは非常に高めること、非生
物的ストレスに対する保護メカニズムの効果を上げるこ
と（たとえば、環境ストレス応答酵素）、または生物活
性な物質を製造すること（たとえば、生物活性の物質を
生産する酵素）が望まれる分野においては、非常に有利
である。このような方法で、関心あるDNA配列は、トラ
ンスジェニック植物根および葉組織で構成的に発現さ
れ、その特異性は、このような配列の構成的発現が生じ
てもよい植物に対して潜在的で有害な影響を回避するか
もしれない。

【００２９】植物耐性に対する所望の効果は、たとえ
ば、菌類あるいはネマトーダ（線虫）に対する耐性のた
めの遺伝子を発現することにより達成されるだろう。疾
病耐性を高めるため、本発明の構成体の調節的コントロ
ール下で発現されてもよい遺伝子の例が、Hammond-Kosa
ck, K. E. and Jones, J. G. D. ("Plant disease resi
stance genes", Annu. Rev. Plant Pathol. (1997) 48:
575-607)に記載されている。

【００３０】トランスジェンの発現を高レベルで達成す
る能力は、「分子農業（molecularfarming）」において
もまた非常に重要であり、そこでは植物は、工業的また
は製薬的ポリペプチド、および植物にとって外来異物で
ある他のバイオポリマーを生産するために用いられる。
本発明のプロモーターは、環境的および農業的モニタリ
ングのための感度のよい迅速な細胞ベースのスクリーン
を開発するために、周知の遺伝子構成体における使用に
は有利となるだろう。

【００３１】植物根および葉組織中で活発に発現されて
いるTPS3遺伝子のプロモーター領域を単離し、これによ
り、植物の疾病耐性、環境的ストレス耐性の改良あるい
は植物の根および葉組織において生物活性な物質の製造
に使用することを目的として、本発明者らは、当該目的
を達成するために研究を行った結果、本発明を完成させ
たものである。

【００３２】以下の実施例は、植物根および葉組織で強
力な、特にCaMV35Sプロモーターよりも強力な、構成的
遺伝子発現をするための制御配列を含むDNA配列を有す
る発現カセットの調製法を例示したものである。プラス
ミドへの配列の導入もまた、植物細胞の形質転換が可能
である点において例示されている。さらに、トランスジ
ェニック植物の再生およびトランスジェニック植物中の
発現カセットの機能の研究が示されている。この実施例
でのプロトコルの範囲あるいは意図から外れなければ、
本明細書に記載の成分、条件、および方法は、置換およ
び変更されてもよいことは、当業者であれば認識し得る
であろう。

【００３３】

【実施例】以下の実施例は、説明のためであって本発明
の限定を示すものではない。

【００３４】

【実施例１】プロモーターの単離 １）シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からの全
RNAの単離 １月齢のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の葉
10ｇを液体窒素で凍結後、乳鉢の中ですり潰して微粉末
とした。粉砕した材料を、冷却したCorexチューブに移
し、pH7.0の200ｍＭ Tris、5ｍＭ EDTA、0.1Ｍ ＬｉC
l、1％ SDSを含有する氷冷抽出緩衝液10ｍｌを加え、次
に65℃で10分間加熱した。懸濁液を、20℃で20分間、1
5,000rpmで遠心分離し、その上清画分が集められた。フ
ェノールとクロロホルム0.5容量部を添加して、全RNAを
沈殿させ、次に２Ｍ ＬｉClで処理した。水に溶解後、
２容量部のエタノールを−20℃で添加して、全RNAを沈
殿させ、次に12,000rpm、4℃で10分間、遠心分離した。
すべてのガラス器具と溶液は、前もって0.1％ジエチル
ピロカーボネートで処理され、滅菌された。 ２）シロイヌナズナからのmRNAの単離 Poly−A⁺ RNAは、製造者の指示書に従い、Oligotex^TM m
RNA Midiキット（QIAGEN、ドイツ）を用いて、単離、精
製された。全RNAは、65℃で5分間加熱された後、2x結合
緩衝溶液により平衡化されたOligotex^TMカラムに入れら
れ、Oligotex^TMカラムは0.5ｍｌの洗浄緩衝液で2回洗わ
れ、次に20μｌの溶出緩衝液で処理された。得られたPo
ly−A⁺ RNAは、−20℃の無水エタノール2.5容量部によ
り沈殿させてから、12,000rpm、4℃で10分間遠心分離し
た。沈殿したPoly−A⁺ RNAは、70％エタノールで洗浄し
た後、pH8.0の10ｍＭ Tris−Cl、1ｍＭ EDTAを含有する
TE緩衝液20μｌに溶解した。Poly−A⁺ RNA濃度は、260
ｎｍで分光学的に決定した。すべての操作は、mRNA調製
物のヌクレアーゼ汚染を最小限にするために、外科手術
用ゴム手袋を付けたオペレーターが行った。 ３）シロイヌナズナからのcDNAの合成とクローニング シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からのcDNAラ
イブラリーは、製造者マニュアルに従い、Uni−ZAP^TM c
DNAライブラリーキット（Stratagene，アメリカ）を用
いて生成された。1本鎖cDNAは、Poly−A⁺ RNA5μｇ、オ
リゴ（dT）_12-18、ネズミ逆転写酵素、dNTP、BSA、DTT
の反応混合物から合成された。2本鎖cDNAを合成するた
めに、合成された１本鎖cDNAは、E.coli RNaseH、E.col
i DNAポリメラーゼＩ、dNTPを16℃で3時間添加して、cD
NA末端を平滑にして、次にdNTP混合物をPfu DNAポリメ
ラーゼで、65℃で10分間処理された。 ４）Uni−ZAP^TM ZAPベクターへのcDNAの結合 cDNAをベクターに挿入するため、合成されたcDNAの末端
には、EcoRIアダプターが結合された。EcoRIアダプター
の結合のため合成されたcDNAに、EcoRIアダプター、AT
P、T4 DNAリガーゼを添加して反応させ、次に３７℃で
３０分間、T4 DNAキナーゼとATPを添加して反応をさら
に行った。cDNAはSephacrylS−500スピンカラムで精製
され、そのシグナルは、1.0％アガロースゲル電気泳動
で確認された。上記のcDNAの１kb分画が、さらに実験に
使われた。200ｎｇのcDNA、1μｇのベクターDNA（Strat
agene）、T4 DNAリガーゼを含む混合物を4℃で48時間反
応させることで、cDNAの挿入が生じた。 ５）cDNAライブラリーの構築と増幅 Uni−ZAP^TMベクターDNAは、ファージゴースト（Stratag
ene）を含有するGigapackIIパッケージング抽出物を使
うことによりパッケージングされた。パッケージング抽
出物は、組み換えベクターの添加により、22℃で2時間
反応させられた。反応溶液は、10μｌのクロロホルムを
追加したSM緩衝液で最終的な容量が500μｌになるよう
に調製され、直ちに使用されるか、使用されるまで4℃
で保存された。組み換えcDNAライブラリーの全プラーク
形成単位（Pfu）は、10^-2−10
^{-6倍希釈溶液から得られた。200μｌのXL1−Blue MRF’
株E.coliは、cDNAライブラリーとともに37℃、15分間イ
ンキュベートされ、直径150ｍｍのプレート上に10 6}ｐｆ
ｕになるように置かれた。5ｍｌのSM緩衝液が補充され
たプレートは、37℃で12時間反応させた後、4℃で一夜
インキュベートされた。上清は、反応させたSM緩衝液を
12,000ｒｐｍで10分間、遠心分離することによって得ら
れ、100μｌのクロロホルムを加えて−4℃で保管され
た。プラーク形成単位は、上記に述べたようにして計算
された。

【００３５】６）プロモータークローニングのためのポ
リメラーゼ連鎖反応 ライブラリースクリーニングをさらに進めるため部分cD
NA片を単離する目的で、ラージスケールの全ファージミ
ドDNA調製物がPCR増幅のため作成された。全cDNAライブ
ラリーを含有するファージストックは、プラスミドの形
態で、E.coli XL1−B MRF’細胞からExAssistヘルパー
経由でXL1−B SOLR細胞に移された。このファージミド
調製物は、鋳型として使われ、PCRは、ベクタープライ
マーと2個の縮退したプライマーの組み合わせを用い
て、10X Taq緩衝液5μｌ、25ｍＭ MgCl₂ 2μｌ、10ｐmo
l 各プライマー 2μｌ、2ｍＭ dNTP 4μｌ、cDNAプール
0.25μｌ、水33.75μｌを含有するカクテル混合物とと
もに、95℃／30秒、50℃／30秒、72℃／30秒の30サイク
ル行われた。

【００３６】７）cDNAライブラリーの選択 ファージ付着のためのホスト細胞として、大腸菌XL1−B
lue MRF’株は、20％マルトース、1Ｍ MgSO₄ 0.5ｍｌ、
テトラサイクリン50μｇ／ｍｌを含有したLB培地50ｍｌ
で培養された。培養した細胞は、A₆₀₀でO.D.0.5になる
ように10ｍＭMgSO₄に懸濁された。E.coliの培養したXL1
−Blue MRF’株とcDNAライブラリーは、37℃で30分間培
養後、0.7％LB寒天3ｍｌと混合した培養細胞は、さらに
1.5％LB寒天プレート上で、37℃で12時間インキュベー
トされた。第１選択に5×10⁴、第２の選択に1×10³個の
細胞が使われた。ファージプラークが形成されたプレー
トは、4℃で1時間静置されHybond−Cメンブラン（Amers
ham、アメリカ）で複製された。 ８）1.0kb TPS3遺伝子プロモーターのPCRクローニング TPS3プロモーターのクローニングのため、遺伝子特異的
なプライマーセットが、トレハロース−６−リン酸シン
ターゼホモログT13D8.4を含有するシロイヌナズナBAC T
13D8のゲノム配列に基づいて設計された。TPS3プロモー
ター約1.0kbは、T13P3（５’−ＴＣＣＡＡＡＴＧＡＴＴ
ＴＴＧＡＣＣＣＣＡＴ−３’）［SEQ ID NO.3］とT13P5
−2（５’−ＧＴＧＴＴＣＡＴＴＴＧＡＴＡＧＡＧＴＣ
ＴＡ−３’）［SEQ ID NO.4］プライマーを用いて、ゲ
ノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増
幅させられた。PCR反応混合物は、500ｎｇのゲノムDN
A、10x Taqポリメラーゼ緩衝液（ｐＨ8.0）5μｌ、1ｍ
Ｍ MgCl₂ 、200μＭ dNTP、20ｐmoleの各プライマー、5
UのTaqポリメラーゼを含有する。反応は高温で開始さ
れ、以下の条件で増幅された；95℃、5分間の1サイクル
をポスト変性とし；95℃で30秒、50℃で30秒、72℃で1
分間を30サイクル；72℃、10分間の1サイクルをポスト
−伸長として、Perkin−Elmer 9800サーモサイクラーで
行った。PCR反応で増幅した主たる生成物はQIAクイック
ゲル抽出キット（Qiagen,アメリカ）を用いて、ゲルで
精製され、その後、製造者のガイドに従って、pGEM−T
イージーベクター（Promega、アメリカ）中にクローン
化され、プラスミド構成物pLES99010（図1A）を得て配
列決定した。上流1kbの配列［SEQ ID NO.1］を含有する
クローンは、１kb TPS3プロモーターとして名づけられ
た。

【００３７】９）2.0kb TPS3遺伝子プロモーターのPCR
クローニング 約2.0kbのTPS3プロモーターは、遺伝子特異的なプライ
マーセット、T13P3（５’−ＴＣＣＡＡＡＴＧＡＴＴＴ
ＴＧＡＣＣＣＣＡＴ−３’）［SEQ ID NO.3］とT13P5−
1（５’−ＣＧＡＣＧＧＣＡＴＴＡＡＣＡＴＡＡＡＣＣ
−３’）［SEQ IDNO.5］を用いて、ゲノムDNAからのPCR
反応によって増幅された。PCR反応は、上記と同じ緩衝
液、同じ増幅条件を用いて行われた。PCR反応で増幅し
た主たる生成物は、その後製造者ガイドに従って、pGEM
−Tイージーベクター（Promega、アメリカ）中にクロー
ン化され、プラスミド構成物pLES99011（図1B）を得て
配列決定した。上流２kbの配列［SEQ ID NO.2］を含有
するクローンは、２kb TPS3プロモーターとして名づけ
られた。

【００３８】

【実施例2】発現ベクターの構成 Ａ）TPS3プロモーター-GUSレポーター遺伝子構築物と発
現ベクターの調製 β−グルクロニダーゼ（GUS）をエンコードするレポー
ター遺伝子を有するプロモーターのDNA融合構築物は、
以下のようにしてつくられた。バイナリ−ベクターpBI1
01中への簡便なクローニングのために、プラスミドpLES
99010とpLES99011は、EcoRIを作用させ、pBluescript K
SのEcoRI 部位でサブクローンされた。これらのクロー
ンは、それぞれpLES99012とpLES99013と名づけられた。
1.0kb TPS3プロモーターを生成させるため、pLES99012
は、XbaIとEcoRVで消化され、その後、pBI101.2のXbaI/
SmaI部位中でサブクローンし、pLES99014発現ベクター
を得た（図2A）。pLES99015発現ベクター構築のために
（図2B）、pLES99013はHindIIIとSmaIで消化され、pBI1
01.2のHindIII/SmaI部位中でサブクローンされた。すべ
ての構築物の正確さは、配列決定によって証明された。
TPS3プロモーター/GUS遺伝子融合物を含有するベクター
pLES99014およびpLES99015は、Jose M.Martinez−Zapa
terとJulio Salinasの方法、すなわちArabidopsisプロ
トコル（Humana press、1998）により、それぞれAgroba
cterium tumefaciens、 GV3101株中に形質転換させられ
た。

【００３９】

【実施例3】トランスジェニック植物の世代と組み換え
植物中でのTPS3プロモーター機能の評価 Ａ）Arabidopsis植物の形質転換 ベクターpLES99014およびpLES99015は、Jose M.Martine
z−ZapaterとJulio Salinasの方法、すなわちArabidops
isプロトコル（Humana press、1998）に従い、Agrobact
erium−仲介減圧浸透法により、シロイヌナズナ（Arabi
dopsis thaliana）(L.)Heynh．、生態型Co1−0に導入さ
れた。

【００４０】カナマイシン耐性に陽性の形質転換体を選
択するために、T₁種子は表面を70％エタノール、次にTw
een20を含む50％の家庭用漂白剤で滅菌され、次いで滅
菌水で4回洗浄された。苗木は、1％スクロースと50ｍｇ
/ｍｌのカナマイシンを含有するMurashigeとSkoog（Ｍ
Ｓ）の寒天培地プレートで、垂直または水平方向に置か
れて育成された。植物は、22℃〜24℃で16時間の日照期
間の下で育てられた。ある複製が挿入されたトランスジ
ェニック系統は、T₂苗木についてRT−PCR法を用いるこ
とで証明された、そして、それらの同型接合体の後代
は、GUS活性のために分析された。

【００４１】Ｂ）GUS分析 １時間または日中の時点で、5−ブロモ−４−クロロ−3
−インドール−β−Dグルクロニド（X−Gluc）を用い
て、形質転換された苗木を染色することにより、垂直な
プレートで育成した陽性の形質転換体は、TPS３プロモ
ーター機能のために分析された。形質転換された苗木ま
たは小植物は、GUS反応緩衝液（2ｍＭ5−ブロモ−４−
クロロ−3−インドール−β−Dグルクロニド（X−Glu
c）、1％ジメチルホルムアミド、0.1ｍＭヘキサシアノ
鉄（III）酸カリウム、0.1ｍＭヘキサシアノ鉄（II）酸
カリウム、1ｍＭ EDTA、50ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ7.0）に浸漬され、次に短時間、減圧浸透され
た。組織は、37℃で1〜3時間インキュベートされた。イ
ンキュベーションの後、苗木または小植物は、70％エタ
ノールを用いて1時間洗浄して脱色され、より良い視覚
化のために100％エタノールを用いて48時間以上洗浄す
ることにより、着色を取り除かれ、その後撮影された
（図3）。

【００４２】5つのカナマイシン耐性Arabidopsis系列
が、GUS活性の誘導のために分析された。3系列が15分間
のポストインキュベーションでGUS発現の強い誘導を示
した、2系列は中位の誘導を示した。誘導の強さは、GUS
染色後、相対的な色の強度の視覚検査により決定され
た。図４は、Arabidopsis TPS3プロモーター、またはC
aMV 35S プロモーターにより誘導されるGUSレポーター
遺伝子の量的な活性を示す。

【００４３】垂直プレート上で５、７、１０および１４
日間育成させた発育中の苗木のGUS発現レベルは、それ
ぞれ、GUS基質として、4-MUG（4-メチルウムベリフェロ
ン、4-methylumbelliferone）溶液の添加により測定し
た。GUS活性は、３回の実験の平均であり、１ｍｇタン
白量当たり毎分の４ＭＵ、ピコモル数として表される。

【００４４】

【参考文献】

【００４５】

【表１】

【００４６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KOREA KUMHO PETROCHEMICAL CO., LTD. <120> EXPRESSION CASSETTE AND PLASMID FOR STRONG CONSTITUTIVE GENE EXPRESSION AND THE USE THEREOF <130> <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1013 <212> cDNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 gtgttcattt gatagagtct aaaatcacca cttacattga ctaaccccaa aaatttgtcc 60 taaacactaa tcaatccgaa gattataaaa tgtcgacaaa gaaaataaaa taaaatagga 120 gtctatgagt cgatggaact tatccaacta aactttaata agaatgaacc aaactcaatt 180 ttgtaataat atttaaaata cgtttttact ctctcccaga atatcccatc tctctgattc 240 caattcctcc tctctctctt tcgtctctct acttcgaatt gattgtttta accgccggtg 300 atcggagcaa actctctgac ggtgaccgcc ggtgatcatt ttttgtgaac ttcacttttg 360 gtaagcagct ttgacttttg ttcataatcc ttcacttttc cttttcaatt ttgctttttc 420 ctctgatctg atcttagtta ttaagctgtt gaatcgcatg atcctttctt ctctgattga 480 ttatttctaa tccttcatgg gttttatgac gaatcgtgtc ttagggattg gttttttctg 540 ggttgggttt ctaaatttgt tggtctaaga acagtgaaat tgttgtttca gtgatctcag 600 attctacact tctagtgatt gaactgttat ggaaaattac aaaatatgtg gctctgcttt 660 catttaaatt caatcatcat catctctgct acttgatgat caggtcacct tctctgtgtt 720 ttgtaatctc cataacgtaa gagtttgttt gatattgcaa ttttgaataa gatgattagc 780 atccaatcca atagctgatg ttgaaaccta actctgtaaa gactttaaat ttgttttctc 840 tggctttgtg ctcgttgaag ggtaacctaa agatttgacc tttttgatcc aacacctctc 900 tttttgtact gtaggtgtat aaagcatagt tcgttgggaa ctttttttta cagctttgga 960 gtaactacct ttcatggttt ttggttccaa caatggggtc aaaatcattt gga 1013 <210> 2 <211> 1943 <212> cDNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 cgacggcatt aacataaacc ataacgctag aaatcttaaa gtattctaat agcctaattt 60 ggtttttatt agaattaaaa ccctacataa tcctggatgt gcgtaacgta gtagttgagc 120 tctattctta tacaccagta aagtaaataa ataaaaagaa cagaaaattt catgagcatg 180 cagtagaaaa atcagtcgaa tgttataaaa atagggttac agctaagttc gacgaggtgc 240 tatttcattg gatatcacga aacttgatcg tcaatatgtt ttctttttgt cttttttgtt 300 tttgggtcaa cagatgtata aatgtatttg tatatagctt acatgaagaa cacttggtta 360 gctaaaaaga aaagctaaaa gaaacaaaag aggaggcagc taaaaaacga aaaaagagcc 420 agcattatag atgagcctct tcgtgagcaa gtgagtcgtt tattgtaaga tttgcctctt 480 ctaatttttt tctttaaagc cttataattg tatttaaaca aatatcttca taagaaaaaa 540 tatcaaatag atatcaatgt acttttcttt gaaataggat ttcgctatta atccttattt 600 taacattcat ataactgacc aattatattg gtatacagaa aaaaagaatt gtatttgttt 660 ttttcacatt ttagtaaatc tcattttttt ctttctaaat tatgattaat atgaaaatta 720 aaatagaaag tgacatgtcc ttattttaac tccttttatt tcattcattg gtttaatgtt 780 atttacctaa ggatactaat cattggtttt tgaaagataa caataaaaat tcattccaaa 840 catgtggtgc aattatatat aattacaaag tggatagagt atagaactac aaaatggata 900 gagtttagtt ataacaacta atttaaaaaa gtgttcattt gatagagtct aaaatcacca 960 cttacattga ctaaccccaa aaatttgtcc taaacactaa tcaatccgaa gattataaaa 1020 tgtcgacaaa gaaaataaaa taaaatagga gtctatgagt cgatggaact tatccaacta 1080 aactttaata agaatgaacc aaactcaatt ttgtaataat atttaaaata cgtttttact 1140 ctctcccaga atatcccatc tctctgattc caattcctcc tctctctctt tcgtctctct 1200 acttcgaatt gattgtttta accgccggtg atcggagcaa actctctgac ggtgaccgcc 1260 ggtgatcatt ttttgtgaac ttcacttttg gtaagcagct ttgacttttg ttcataatcc 1320 ttcacttttc cttttcaatt ttgctttttc ctctgatctg atcttagtta ttaagctgtt 1380 gaatcgcatg atcctttctt ctctgattga ttatttctaa tccttcatgg gttttatgac 1440 gaatcgtgtc ttagggattg gttttttctg ggttgggttt ctaaatttgt tggtctaaga 1500 acagtgaaat tgttgtttca gtgatctcag attctacact tctagtgatt gaactgttat 1560 ggaaaattac aaaatatgtg gctctgcttt catttaaatt caatcatcat catctctgct 1620 acttgatgat caggtcacct tctctgtgtt ttgtaatctc cataacgtaa gagtttgttt 1680 gatattgcaa ttttgaataa gatgattagc atccaatcca atagctgatg ttgaaaccta 1740 actctgtaaa gactttaaat ttgttttctc tggctttgtg ctcgttgaag ggtaacctaa 1800 agatttgacc tttttgatcc aacacctctc tttttgtact gtaggtgtat aaagcatagt 1860 tcgttgggaa ctttttttta cagctttgga gtaactacct ttcatggttt ttggttccaa 1920 caatggggtc aaaatcattt gga 1943 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 3 tccaaatgat tttgacccca t <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Aritificial sequence <400> 4 gtgttcattt gatagagtct a <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Aritificial sequence <400> 5 cgacggcatt aacataaac c

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、E. coliの形質転換のための、1.0kbの
シロイヌナズナTPS3プロモーター(SEQ ID NO: 1)を含む
プラスミド（A）pLES99010および2.0kbのシロイヌナズ
ナTPS3プロモーター(SEQ ID NO: 2)を含むプラスミド
（B）pLES99011の模式図である。

【図２】図２は、植物の形質転換のための、1.0kbのシ
ロイヌナズナTPS3プロモーター(SEQ ID NO: 1)を含むプ
ラスミド（A）pLES99014および2.0kbのシロイヌナズナT
PS3プロモーター(SEQ ID NO: 2)を含むプラスミド（B）
pLES99015の模式図である。

【図３】図３は、シロイヌナズナTPS3プロモーターまた
はCaMV35Sプロモーターにより誘導されるGUSレポーター
遺伝子活性の発現を示す図である。それぞれ5、10、お
よび21日間、垂直プレート上で育成した発育中の苗木
を、1-3時間X-Gluc溶液中でインキュベートした。

【図４】図４は、シロイヌナズナTPS3プロモーターまた
はCaMV35Sプロモーターにより誘導されるGUSレポーター
遺伝子の定量的活性を示す図である。それぞれ5、7、1
0、および14日間、垂直プレート上で育成した発育中の
苗木を、4-MUG溶液を用いてアッセイした。

フロントページの続き (72)発明者 チョー ジェオング ウー 大韓民国 クワングジュ クワングサン− グ ウォルジ−ドング クムホタウン 106−804 (72)発明者 チュング チャング ホー 大韓民国 クワングジュ セオ−グ ファ ジュング−ドング ヒュンダイ エーピー ティー 100−1003 Ｆターム(参考） 2B030 AA00 AD08 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 AA20 BA80 CA04 DA01 DA05 DA06 EA04 FA02 GA11 HA09 4B065 AA11X AA26X AA89X AA89Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA53

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】SEQ ID NO:1に示したヌクレオチド配列
   （約１kbp）を含み、植物で機能し得る単離されたプロ
   モーター。
2. 【請求項２】下記の特徴を有するプロモーターであっ
   て、SEQ ID NO:2に示したヌクレオチド配列（約２kbp）
   を含み、植物で機能し得る単離されたプロモーター： i)シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)から単離さ
   れ、 ii)SacI(0.12kb)、BspHI(0.17kb)、SauI(0.78kb)および
   SalI(1.0kb)に対する制限酵素部位を有し、 iii)SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含む。
3. 【請求項３】請求項１に記載のプロモーターを含むプラ
   スミド。
4. 【請求項４】請求項２に記載のプロモーターを含むプラ
   スミド。
5. 【請求項５】請求項１に記載の植物プロモーターおよび
   所望のポリペプチドをエンコードする異種核酸を含み、
   該プロモーターが１kb長のシロイヌナズナのトレハロー
   ス6−リン酸シンターゼ3プロモーターであることを特徴
   とするキメラ遺伝子。
6. 【請求項６】請求項２に記載の植物プロモーターおよび
   所望のポリペプチドをエンコードする異種核酸を含み、
   該プロモーターが２kb長のシロイヌナズナのトレハロー
   ス6−リン酸シンターゼ3プロモーターであることを特徴
   とするキメラ遺伝子。
7. 【請求項７】請求項５に記載のキメラ遺伝子を含むプラ
   スミド。
8. 【請求項８】請求項6に記載のキメラ遺伝子を含むプラ
   スミド。
9. 【請求項９】上記プロモーターが、CaMV35Sプロモータ
   ーよりも、植物細胞中で所望のポリペプチドをより高い
   レベルで発現させることを特徴とする請求項７または８
   に記載のプラスミド。
10. 【請求項１０】上記異種核酸が植物ポリペプチドをエン
    コードしていることを特徴とする請求項９に記載のプラ
    スミド。
11. 【請求項１１】上記異種核酸が細菌のポリペプチドをエ
    ンコードしていることを特徴とする請求項９に記載のプ
    ラスミド。
12. 【請求項１２】上記異種核酸が菌類のポリペプチドをエ
    ンコードしていることを特徴とする請求項９に記載のプ
    ラスミド。
13. 【請求項１３】上記異種核酸が哺乳類のポリペプチドを
    エンコードしていることを特徴とする請求項９に記載の
    プラスミド。
14. 【請求項１４】転写のセンス方向にある上記プロモータ
    ー、所望の構成体遺伝子、および植物で機能し得る転写
    終結領域をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載
    のプラスミド。
15. 【請求項１５】所望のポリペプチド遺伝子が、アミノ酸
    配列をエンコードするオープンリーディングフレームで
    あることを特徴とする請求項９に記載のプラスミド。
16. 【請求項１６】所望のポリペプチド遺伝子が、植物細胞
    に内在するmRNAに相補的であることを特徴とする請求項
    ９に記載のプラスミド。
17. 【請求項１７】微生物が請求項１に記載のプロモーター
    を含むE.coliDH5@/pLES99010 (KCTC 0811BPとして寄託)
    株または請求項２に記載のプロモーターを含むE.coliDH
    5@/pLES99011 (KCTC 0812BPとして寄託)株であって、請
    求項３または４に記載のプラスミドを含むことを特徴と
    する微生物。
18. 【請求項１８】請求項１に記載のプロモーターを含むAg
    robacterium tumefaciens GV3101/pLES99014 (KCTC 081
    3BPとして寄託)株または請求項２に記載のプロモーター
    を含むAgrobacterium tumefaciens GV3101/pLES99015
    (KCTC 0814BPとして寄託)株であり、請求項７または８
    に記載の構成体を含むことを特徴とする微生物。
19. 【請求項１９】請求項１に記載のプロモーターの調節下
    で、植物中、所望のDNA配列の発現を示すトランスジェ
    ニック植物の製造方法。
20. 【請求項２０】上記植物が双子葉植物であることを特徴
    とする請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
21. 【請求項２１】上記植物が単子葉植物であることを特徴
    とする請求項１９に記載のトランスジェニック植物。