BRPI0701172B1 - composições e métodos para modificar a expressão de genes usando o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de soja - Google Patents

Abstract

composições e métodos para modificar a expressão de genes usando o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de soja. a presente invenção compreende a descrição de uma nova seqúência regulatória provida para melhorar a expressão de uma seqúência de nucleotídeo, tal como genes estruturais, em plantas, incluindo monocotil edôneas e dicotiledôneas. mais especificamente, a invenção refere-se a seqúências regulatórias de polinucleotideos isoladas de plantas de soja, que são capazes de iniciar e acionar a transcrição de polinucleotídeos, e ao uso destas seqúências regulatórias na modificação de transcrição de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos e produção de polipeptídeos. a invenção descreve ainda construções de dna que contém o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de soja que está operacionalmente ligado a um gene heterólogo e/ou endógeno. além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. a invenção ainda descreve um método utilizando tais construções contendo o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de soja para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgénicos.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO DE GENES USANDO O PROMOTOR DO GENE DA PROTEÍNA DE CONJUGAÇÃO À UBIQUITINA DE PLANTAS DE SOJA

Campo da Invenção

A presente invenção está relacionada a um novo promotor de expressão de genes em plantas. Mais especificamente, a invenção refere-se a seqüências regulatórias de polinucleotídeos isoladas de plantas de soja, que são capazes de iniciar e acionar a transcrição de polinucleotídeos, e ao uso destas seqüências regulatórias na modificação de transcrição de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos e produção de polipeptídeos. A -10 invenção descreve ainda construções de DNA que contém o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de soja que está operacionalmente ligado a um gene heterólogo e/ou endógeno. Além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. A invenção ainda descreve um método utilizando tais 15 construções contendo o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de soja para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos.

Fundamentos da Invenção

A expressão de um gene é regulada, em parte, pelos processos celulares envolvidos na transcrição. Durante a transcrição, um RNA de filamento único, complementar à 20 seqüência de DNA a ser transcrita é formado pela ação de polimerases de RNA. A iniciação de transcrição em células eucarióticas é regulada por interações complexas entre motivos de DNA cis-atuantes, localizados dentro do gene a ser transcrito, e fatores de proteína trans-atuantes. Dentre as regiões regulatórias cis-atuantes estão as seqüências de DNA, chamadas promotores, às quais a RNA polimerase é primeiramente ligada, direta ou 25 indiretamente. Para efeitos da presente invenção, o termo '‘promotor” se refere à seqüências específicas de DNA, usualmente à montante (5’) da região codifícadora de um gene estrutural, que controla a expressão desta região codifícadora devido a sua capacidade de prover um sítio de reconhecimento para a RNA polimerase e/ou outros fatores necessários para o início da transcrição, e que para esta se inicie no local correto do gene 30 estrutural.

Tipicamente, um promotor possui um “TATA box” e uma região de ativação à montante. Este TATA box é o responsável pela localização do início da transcrição, aproximadamente 25 pares de base na direção do início da seqüência codificadora do gene (3’). >3Existem dois tipos básicos de promotores, os induzíveis e os não induzíves, também chamados constitutivos. Um promotor induzível é um promotor capaz de ativar (direta ou indiretamente) a transcrição de uma ou mais seqüências de DNA ou genes em resposta a um determinado indutor. Na falta deste indutor, as seqüências de DNA ou genes não serão transcritos. O indutor pode ser um componente químico (descrito, por exemplo, no documento de patente WO9519443), um estresse de origem fisiológica (como no caso de ferimentos, que é descrito, por exemplo, no documento de patente US6677505), ou um composto endógeno gerado em resposta à mudanças no desenvolvimento da planta.

Existem inúmeros promotores tecido-específicos descritos para plantas, como é o caso da expressão específica em semente (WO8903887), tubérculo (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323:1330), folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth et al., 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), fruta (Edwards and Coruzzi (1990) Annu.Rev.Genet. 24, 275 a 303 e US5753475), caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369 e Schmülling et al. (1989) Plant Cell 1, 665-670), raiz (US20060143735 e como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devei. 3:1639-1646), estames (WO8910396, WO9213956), promotores específicos da zona de deiscência (WO9713865) e meristema (Ito et al. (1994) Plant Molecular Biology, 24, 863 a 878).

Os promotores constitutivos, por sua vez, são capazes de dirigir a expressão de seqüências de DNA durante todo o desenvolvimento de uma planta, além de não possuir uma especificidade quanto ao local de expressão desta seqüência, sendo esta, então, expressa em uma grande variedade de células e tecidos da planta. Apesar disso, o termo “constitutivo” não implica que a seqüência é expressa nos mesmos níveis em todas as células vegetais.

Com as técnicas de recombinação, é possível ativar o local de início da transcrição de uma seqüência nucleotídica de interesse, como a de uma seqüência heteróloga ou de ocorrência não natural, numa célula hospedeira vegetal.

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Os promotores que conduzem a expressão constitutiva de genes controlados por eles podem ser utilizados, por exemplo, para selecionar as células vegetais transformadas, na expressão de um gene marcador de seleção em plantas transgênicas, na geração de células vegetais resistentes a antibióticos, ou para geração de vegetais tolerantes a herbicidas,resistentes a insetos e patógenos, visto que os produtos dos genes controlados por estes estão presentes em todas as partes do vegetal.

Os genes exógenos de importância agronômica, medicinal ou outra podem ser expressos em uma variedade de vegetais, por exemplo, para a geração de proteínas recombinantes heterólogas e para a geração de vegetais que contenham polipeptídeos de mamíferos. A quantidade dos níveis de expressão espacial e temporal de genes endógenos de vegetais, também podem ser vantajosamente alterados com o auxílio de promotores constitutivamente ativos.

Os primeiros promotores utilizados na expressão de genes em plantas foram de origem viral ou bacteriana, no caso, de bactérias do gênero Agrobacterium. Ambos os sistemas apresentam vantagens no caso de expressão heteróloga em plantas, pois esse principio constitui a base de seu mecanismo de infecção. Muitos destes promotores vêm sendo amplamente utilizados na produção de plantas geneticamente modificadas, expressando proteínas de interesse.

Além dos promotores derivados do T-DNA de Agrobacterium, como o responsável pela síntese de manopina (mas), octopina (ocs) e de nopalina (nos), existem os promotores derivados de vírus, no qual mais amplamente utilizado é o CaMV35S, correspondendo ao fragmento promotor 35S do vírus do mosaico da couve flor. Posteriormente, este mesmo promotor teve sua região regulatória duplicada e fundida a um sequência enhancer do vírus do mosaico da alfafa, gerando um promotor de plantas recombinante bastante eficiente na indução da expressão de seqüências codificadoras a ele associadas.

Outros promotores constitutivos de origem viral incluem, por exemplo, o promotor do vírus mosaico de escroíulária (PI1101063-0), do badnavírus que infecta a banana australiana (US6391639) e o promotor do vírus baciloforme da cana-de-açúcar (US6489462). No entanto, os promotores virais e de Agrobacterium possuem problemas podendo ser particularmente instáveis e propensos a transferência horizontal de genes e a recombinação gênica em relação a sua capacidade regulatória, ressaltando a importância da busca de promotores de origem vegetal.

Os promotores constitutivos intrínsecos de vegetais são, por exemplo, o promotor da alfa tubulina de café (US6441273), o promotor da proteína trealose 6-fosfato sintase de

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A. thaliana (US20020115850), promotores da actina-2, enolase, Gos-2 e L41 de milho (US6670467), promotor da V-ATPase de Beta vulgaris (PI0013537-2), promotor hsp80 de Brassica (P19300296-3).

ijp

Apesar de muito desses promotores vegetais apresentarem capacidade de dirigir forte níveis de expressão, os dados mostrados do presente promotor se referem basicamente a uma análise qualitativa. A presente invenção, no entanto, além de apresentar dados qualitativos também apresenta dados quantitativos por meio de ensaio fluorimétrico demonstrando, por meio das análises, níveis alto de expressão.

Os promotores acima descritos foram alinhados com a presente invenção, não apresentando identidade significativa entre eles O melhor alinhamento obtido foi com o promotor de alfa tubulina de café, com 42,7% de identidade. Esse alinhamento pode ser feito utilizando softwares existentes na internet, um deles é o BLASTN, que está disponível na página do National Center for Biotechnology Information/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

O promotor da proteína trealose 6-fosfato sintase de A. thaliana (US20020115850) mostra uma diminuição da atividade em raiz com o tempo de desenvolvimento da planta. A presente invenção, no entanto, apresentou uma alta atividade de expressão nos diferentes tecidos de plantas de Arabidopsis transgênica com 3 meses, mostrando assim, capacidade de conduzir níveis alto de expressão, não só no período de desenvolvimento, como também na planta madura. Os dados obtidos com o promotor uceS8.3 demonstram que o promotor uceS8.3 possui um alto potencial tecnológico, uma vez que a maioria das plantas são atacadas por insetos-pragas e patógenos ao longo do desenvolvimento da planta

Para expressar os genes de seleção e os genes de resistência, é desejável ter promotores disponíveis que apresentem uma atividade constitutiva forte e uniforme, se possível, em todos os tecidos vegetais ou tipos de células que, além disso, apresentem atividade ainda maior ou que não sejam reprimidos sob condições de estresse.

Mesmo que os promotores supracitados tenham sido caracterizados como constitutivos, os padrões de expressão temporal e espacial se diferem, tomando-os inapropriados para determinadas aplicações. Portanto, faz-se necessária a prospecção e o estudo de outros promotores de plantas. Além disso, para determinadas aplicações na produção de plantas geneticamente modificadas, são desejáveis altos níveis de expressão, aumentando, assim, os níveis do produto protéico de interesse. Altos níveis da expressão da proteína auxiliam na geração de plantas, exibindo propriedades fenotípicas importantes comercialmente, tais como resistência a insetos-praga e doenças, tolerância a estresse ^5/36 : ·* · abióticos (por exemplo, seca, altas temperaturas, frio, intensidade luminosa, comprimento do dia, químicos, entre outros), qualidade melhorada (por exemplo, alta produção de frutos, extensão do ciclo de vida, uniformidade da forma e da cor, alto conteúdo de açúcar, alto conteúdo de vitamina C e A, baixa acidez, entre outros).

Promotores podem ser mais efetivos se isolados da mesma espécie da planta transgênica a ser gerada. A expressão da β-glucuronidase (GUS), sob o controle do promotor da actina de arroz (Actl) em protoplastos de arroz transformados, foi aproximadamente 6 vezes maior do que a expressão sob o controle do promotor constitutivo da álcool desidrogenase (Adhl) de milho (US658701). Portanto, além de poder ser utilizado como promotor constitutivo em diversas espécies vegetais, o promotor da presente invenção apresenta grandes vantagens com relação a geração de plantas transgências de soja.

Ubiquitina é uma das proteínas mais conservadas em eucariotos. Uma função fisiológica para ubiquitina é se conjugar com uma proteína alvo, como um sinal de reconhecimento para degradação protéica. A degradação seletiva de proteínas anormais é realizada em muitas proteínas regulator!as de vida curta, incluindo proteínas do ciclo celular, moduladores de crescimento celular e fatores de transcrição. Em organismos mais complexos, a ubiquitina tem sido codificada por duas pequenas famílias de genes, denominadas de “genes poliubiquitina” e “genes de fusão de ubiquitina”. Genes poliubiquitina compreendem uma repetição em tandem da cabeça para cauda de 228pb, com cada repetição codificando 76 aminoácidos de um monômero de ubiquitina. O número de repetições em tandem é variado entre genes e dentro dos genomas e entre organismos, de 3 em Dictostylium a aproximadamente 50 em Trypanosoma cruzi. Por outro lado, a família de gene de fusão de ubiquitina codifica uma repetição simples fusionada com um a dois polipeptídeos com 52 ou 76-80 aminoácidos cada (Callis et al., “Ubiquitin and Ubiquitin Genes in Higher Plants”, Oxford Surveys of Plant Molecular & Cell Biology, (1989), vol.6, pp. 1-30). Estudos de genes de ubiquitina em diferentes plantas indicam que os genes de ubiquitina são expressos em todos os tecidos; no entanto, a expressão diferencial dos genes de ubiquitina também é visualizada entre a a família gênica de ubiquitina. Cada repetição em tandem ou gene de ubiquitina pode ser expressa diferencialmente em células ou tecidos e temporalmente.

Promotores de genes da ubiquitina têm mostrado dirigir a expressão de genes, usualmente GUS ou cloranfenicol acetil transferase (CAT), em células ou plantas transformadas. Tais promotores têm sido isolados de Arabidopsis (Callis et al., “Ubiquitin

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Extension Proteins of A. thaliancT, The Journal of Biological Chemistry (1990), vol. 265,n°21, pp. 12486-12493); girassol (Binet et al., “Analysis of a sunflower polyubiquitin promoter by transient expression” (1991) Plant Science, vol 79, pp. 87-94); tabaco (Genschick et al., “Structure and promotoer activity of a stress and developmentally regulated polyubiquitin encoding gene of Nicotiana tabacum”, Gene, (1994) vol. 148, pp.195-202); milho (US20030066108; US6020190; US5614399; US5510474; Christensen et al., “Maize polyubiquitin genes: structure, thermal pertubation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation”, Plant Molecular Biology, (1992) vol. 18, pp. 675-689); arroz (US6528701); cana-de-açúcar (US6706948); salsa (W02003102198); Pinus e eucalipto (PI0309870-2). Tais promotores foram alinhados no BLASTN com a presente invenção, não apresentando similaridade.

Os documentos de patente US20030066108; US6020190; US5614399 eUS5510474 descrevem versões engenheiradas do promotor da ubiquitina de milho para aumentar os níveis de expressão quando comparados aos níveis de expressão do promotor de ubiquitina nativo. A invenção relata que o promotor regula a expressão do gene poliubiquitina de milho contendo 7 repetições em tandem. A expressão deste gene de ubiquitina se mostrou constitutiva a 25°C, e foi induzida pelo calor a 42°C. O promotor foi utilizado com sucesso para transformar outras plantas monocotiledôneas além do milho, incluindo trigo, cevada e arroz. Porém, o promotor da presente invenção apresentou ser um excelente promotor constitutivo, não sofrendo alterações no seu nível de expressão, quando submetido a diferentes temperaturas, além de possuir uma alta expressão ao longo de todo o ciclo da planta.

O controle de insetos-praga da soja é uma prioridade, já que essa cultura é de extrema importância para o Brasil, que hoje é o segundo maior produtor mundial, com uma produção de cerca de 60 milhões de toneladas.

Visando o controle desses insetos-praga, a produção de plantas geneticamente modificadas, expressando proteínas que confiram à planta resistência, vem sendo utilizada com bastante sucesso. Porém, para a obtenção destas plantas, é necessário o controle e o direcionamento da expressão das proteínas entomotóxicas. Para a obtenção de plantas transgênicas com níveis adequados de proteínas que confiram resistência a insetos nas plantas, a escolha de promotores que direcionem a expressão é extremamente importante. No entanto, existem poucos promotores efetivos para expressão em plantas de soja

7/36 disponíveis no mercado atualmente, e nenhum tem demonstrado uma eficiência maior de expressão, comparado com o promotor da presente invenção.

Sumário da invenção

A presente invenção compreende a descrição de uma nova seqüência regulatória provida para melhorar a expressão de uma seqüência de nucleotídeo, tal como genes estruturais, em plantas, incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas. De acordo com a presente invenção é descrito um promotor constitutivo de plantas de soja {Glycine max) denominado de uceS8.3 junto com um método para uso dessa região regulatória de polinucleotídeo para modificação de expressão de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos em plantas transgênicas.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma seqüência de polinucleotídeo isolada de plantas de soja (Glycine max) que possua 40%, preferencialmente 60%, mais preferencialmente 75%, mais preferencialmente ainda 90% de identidade com a SEQ ID NO1; seqüência reversa de SEQ ID NO1; sondas e iniciadores correspondendo à SEQ ID NO1.

Em outro aspecto, a presente invenção provê genes quiméricos compreendendo o polinucleotídeo da presente invenção, ou sozinho, ou em combinação com um ou mais polinucleotídeos conhecidos, junto com células e organismos compreendendo estes genes quiméricos.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê vetores recombinantes compreendendo, na direção 5’-3’, uma seqüência de promotor de polinucleotídeo da presente invenção, um polinucleotídeo a ser transcrito, e uma seqüência de terminação de genes. O polinucleotídeo a ser transcrito pode compreender uma armação de leitura aberta de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, ou pode ser uma região de não codificação, ou não traduzida, de um polinucleotídeo de interesse. A matriz de leitura aberta pode ser orientada em uma direção “sense” ou “antisense”. Preferivelmente, a seqüência de terminação de genes é funcional em uma planta hospedeira. Mais preferivelmente, a seqüência de terminação de genes é a do gene de interesse, mas podendo ser outras descritas no estado da técnica (Benjamin Lewin, GenesVIII, capítulo 9) como o terminador da nopalina sintase de Agrobacterium tumefasciens. Os vetores recombinantes podem ainda incluir um marcador para a identificação de células transformadas.

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Em outro aspecto, as células de plantas transgênicas compreendendo o vetor recombinante da presente invenção são providas, junto com organismos, como plantas, compreendendo estas células transgênicas, e frutos, sementes e outros produtos, derivados, $ ou progênie destas plantas. Os propágulos das plantas transgênicas inventivas são incluídos na presente invenção.

Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para modificar a expressão de genes em um organismo, como uma planta, incluindo a incorporação estável no genoma do organismo contendo o vetor recombinante da presente invenção.

Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para produzir um organismo transformado, como uma planta, tendo a expressão de um polipeptídeo modificada. Esse método compreende transformar uma célula de planta com o vetor recombinante da presente invenção para prover uma célula transgênicas sob condições que conduzem à regeneração e crescimento da planta madura.

Ainda em outro aspecto da presente invenção é provido um método para identificação de um gene responsável por uma função ou fenótipo desejado. O método compreende: 1) a trans fonuação de uma célula de planta contendo um vetor recombinante compreendendo uma seqüência de promotor de polinucleotídeos da presente invenção ligada operacionalmente a um polinucleotídeo a ser testado, 2) cultivar a célula de planta sob condições que conduzem a regeneração e crescimento da planta madura de modo a prover uma planta transgênica, e 3) comparar o fenótipo da planta transgênica com o fenótipo de plantas não transformadas, ou de tipo selvagem.

Os aspectos acima mencionados e adicionais da presente invenção e o modo de obter os mesmos se tornarão evidentes, e a invenção será melhor entendida por referência na “Descrição Detalhada da Invenção”.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 - Gel de agarose mostrando resultado da amplificação com o primer arbitrário AD3 produzindo um fragmento de aproximadamente 1.2kb. (A) reação com os primers AD3 e uce2; (B) reação controle apenas com o primer AD3; (C) reação controle apenas com o primer uce2; (D) marcador de massa molecular (1 kb DNA-ladder, Gibco-BRL) 30 indicado em kb. A seta indica o fragmento amplificado potencialmente positivo de aproximadamente 1.2 kb.

Figura 2 - Vetor pGEM-T ligado ao fragmento de 1.2kb.

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Figura 3 -Gel de agarose da clonagem do fragmento potencialmente positivo de aproximadamente 1.2 kb de soja no vetor pCR2.1. Os números indicam o número dos clones analisados. Os clones 1, 2, 5, 8, 9, 11, 14, 16, 17, 18, 19, 21 e 22 são positivos. O marcador de massa molecular (1 kb DNA-ladder, Gibco-BRL) está indicado em kb ⁷ '

Figura 4 - Vetor pCAMBIA 1391Xc ligado ao inserto de 1.2kb. A figura mostra uma representação esquemática do plasmídeo pCAMBIA 1391Xc: (a) contendo o Promotor 35S duplicado com o enhancer do AMV (Alfafa Mosaic Vírus) junto ao gene GUS como controle positivo e (b) contendo o promotor de soja uceS8.3 (SEQ ID NO:1) de 1 kb, para a tranformaçao em A. thaliana. Afim de analisar a atividade promotora de soja uceS8.3

Figura 5 - Gel de agarose mostrando subclonagem do promotor de soja (clone uceS8) no vetor pCAMBIA1391Xc. Os números indicam o número dos clones analisados. Os clones 3 e 8 são positivos. O marcador de massa molecular (1 kb DNA-ladder, Gibco-BRL) está indicado em kb. A seta indica o fragmento amplificado de aproximadamente 1.2 kb

Figura 6 - Ensaio fluorimétrico da atividade específica de GUS em diferentes partes da planta de A. thaliana (folha, caule e botão floral) sob controle dos promotores 35Sd e uceS8.3,

Descrição Detalhada da Invenção

No contexto dessa descrição, inúmeros termos serão utilizados e por isso serão melhor detalhados a seguir:

Um “gene quimérico” é um gene compreendendo um promotor e uma região codifícadora de diferentes origens. No caso da presente invenção, o gene quimérico compreende o polinucleotídeo da presente invenção ligado a regiões codificadoras de genes endógenos e/ou exógenos.

Uma “seqüência consenso” é uma seqüência artificial na qual a base em cada posição representa a base freqüen tem ente mais encontrada na seqüência atual comparandose diferentes alelos, genes ou organismos.

Um “promotor” é aquela porção do DNA acima da região codifícadora que contém sítios de ligação para RNA polimerase II para iniciar a transcrição do DNA.

“Expressão” é a transcrição ou tradução de um gene estrutural, endógeno ou heterólogo.

10/36 “GC box” é um elemento comum no promotor que pode aumentar a atividade do promotor.

“TATA box” é um elemento no promotor, localizado aproximadamente 30 bases acima do sítio de início da transcrição. O TATA box está associado com fatores de transcrição em geral, incluindo a RNA polimerase II.

O termo “gene” significa uma unidade física e funcional da hereditariedade, representada por um segmento de DNA que codifica uma proteína funcional ou molécula de RNA.

Um “gene endógeno” é um gene próprio da célula ou do organismo.

Um “gene heterólogo” é um gene isolado de um organismo doador e recombinado no organismo receptor transformado. É um gene que não é próprio da célula ou do organismo.

Um “gene repórter” é uma unidade codifícadora cujo produto é facilmente testado, por exemplo, genes CAT, GUS, GAL, LUC e GFP. A expressão de um gene repórter pode ser usada para testar a função de um promotor ligado a esse gene repórter.

O termo “propágulo” como usado na presente invenção significa qualquer parte de uma planta que pode ser usada na reprodução ou propagação, sexual ou assexual, incluindo as mudas.

“Sense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na mesma orientação 5’3’ com relação ao promotor.

“Antisense” significa que a seqüência de polinucleotídeo está na orientação contrária com relação a orientação 5’-3’ do promotor.

Como usado aqui, o termo “x-mero”, como referência a um valor específico de “x”, referese a uma seqüência compreendendo pelo menos um número específico (“x”) de resíduos do polinucleotídeo identificado como SEQ ID NO1. De acordo com formas de realização preferidas, o valor de x é preferivelmente pelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 40, mais preferivelmente ainda pelo menos 60 e mais preferivelmente pelo menos 80. Assim, polinucleotídeos da presente invenção compreende um polinucleotídeo de 20 meros, 40 meros, 60 meros, 80 meros, 100 meros, 120 meros, 150 meros, 180 meros, 220 meros, 250 meros, 300 meros, 400 meros, 500 meros ou 600 meros identificados como SEQ ID NO1 e variantes dos mesmos. O termo “polinucleotídeo (s)” como usado aqui, significa um polímero de filamento único ou duplo de bases de deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotídeo e inclui moléculas correspondentes de RNA e DNA, incluindo moléculas

11/36 de HnRNA e mRNA, de filamentos tanto “sense” como “antisense”, e compreende cDNA, DNA genômico, e DNA recombinante, assim como polinucleotídeos completamente ou parcialmente sintetizados. Uma molécula de HnRNA contém introns e corresponde a uma molécula de DNA em um modo geralmente um a um. Uma molécula de RNAm 5 corresponde a uma molécula de DNA e HnRNA da qual os introns foram excisados. Um polinucleotídeo pode consistir de um gene completo, ou qualquer porção do mesmo. Os polinucleotídeos “anti senso” operáveis podem compreender um fragmento do polinucleotídeo correspondente, e a definição de “polinucleotídeo” inclui assim todos esses fragmentos antisense operáveis. Os polinucleotídeos antisense e técnicas envolvendo 10 polinucleotídeos antisense bsão bem conhecidos no estado da técnica. (Sambrook, J.;

nd

E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.)

Os polinucleotídeos descritos na presente invenção são preferencialmente cerca de 80% puros, mais preferencial mente pelo menos cerca de 90% puros, e mais 15 preferencialmente pelo menos cerca de 99% puros.

O termo “oligonucleotídeo” refere-se a um segmento relativamente curto de uma seqüência de polinucleotídeo, geralmente compreendendo entre 6 a 60 nucleotídeos. Esses oligonucleotídeos podem ser usados como sondas ou iniciadores (“primers”), onde as sondas podem ser usadas para uso em testes de hibridização e iniciadores para uso na 20 amplificação de DNA por reação de cadeia polimerase.

O termo “sonda” utilizado na presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou ácido nucléico, sendo RNA ou DNA, se ocorrendo naturalmente como em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sinteticamente, que seja capaz de se anelar com ou especificamente hibridizando com um 25 ácido nucléico contendo seqüências complementares à sonda. Uma sonda pode ser ainda de cadeia simples ou cadeia dupla. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da seqüência alvo, a sonda de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos, embora ela possa conter menos nucleotídeos. As 30 sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma seqüência de um ácido nucléico particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser capaz de “hibridizar especificamente” ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas.

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Conseqüentemente, a seqüência da sonda não necessita refletir exatamente a seqüência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nucleotídeo não complementar pode ser ligado ao final 5’ ou 3’ da sonda, com o restante da seqüência da sonda sendo áX complementar à cadeia alvo. Altemativamente, bases não complementares ou sequências longas podem estar intercaladas dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a seqüência do ácido nucléico alvo para anelar especificamente com ele.

O termo “primer” como utilizado aqui se refere a um oligonucleotídeo, sendo RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que, quando colocado 10 em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um iniciador de uma síntese de ácido nucléico dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nucléico apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos nucléicos, uma enzima polimerase, cofatores adequados e condições tais como temperatura e pH adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3* pela adição de 15 nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade similar para produzir uma primeira extensão do produto. O ‘primer’ pode variar em comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnósticos, o ‘primer’ oligonucleotídeo possui tipicamente de 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O ‘primer’ deve ter complementaridade suficiente com o molde desejado para iniciar a síntese da extensão do produto desejado. Isso não significa que a seqüência do ‘primer’ deva representar um complemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma seqüência de nucleotídeo não complementar pode ser ligada ao final 5’ de um ‘primer’ complementar. Altemativamente, bases não complementares podem estar intercaladas dentro da seqüência de oligonucleotídeo do ‘primer’, desde que o ‘primer’ 25 tenha complementaridade suficiente com a seqüência da cadeia molde desejada para prover funcionalmente um complexo molde-primer para a síntese da extensão do produto.O termo “hibridizando especificamente” diz respeito à associação entre duas moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples que possuam seqüências suficientemente complementares para permitir tal hibridização sob condições pré-determinadas geralmente descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 1,2003)

Em particular, o termo se refere à hibridização de um oligonucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementar contendo uma molécula de DNA ou RNA de

13/36 cadeia simples da presente invenção. Condições apropriadas necessárias para realização da hibridização específica entre moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples de complementaridade variada estão bem descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capítulo 4, 2003).

Uma fórmula comum para se calcular as condições de estringência requeridas para se ter uma hibridização entre moléculas de ácido nucléico segue abaixo (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^d ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press):

Tm = 81,5^0 + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (%G+C) - 0,63 (% formamida)-600/pb no duplex (sonda) . 10 Como ilustração da fórmula acima, usando [Na+] = [0,368] e 50% de formamida, com conteúdo de GC de 42% e um tamanho de sonda médio de 200 bases, a Tm será de 57°C.

Sondas ou primers são descritos como correspondendo ao polinucleotídeo da presente invenção identificado como SEQ ID NO1 ou uma variante do mesmo, se a sonda 15 de oligonucleotídeo ou primer, ou seu complemento, estiver contido dentro da seqüência especificada como SEQ ID NO1, ou uma variante desta.

O termo “oligonucleotídeo” é referido aqui como ‘primers’ e ‘sondas’ da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendendo de dois ou mais ribo ou deoxiribonucleotídeos, preferencial mente mais do que três. O tamanho exato 20 dos oligonucleotídeos dependerá de vários fatores e na aplicação particular e uso dos oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos preferidos compreendem 15-50 pares de base consecutivas complementares à SEQ ID NO 1. As sondas podem ser facilmente selecionadas usando procedimentos bem descritos no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), 25 levando em consideração estringência de hibridização DNA-DNA, recombinação e temperaturas de fusão, e potencial para formação de laços e outros fatores, que são conhecidos no estado da técnica.

A definição dos termos “complemento”, “complemento reverso” e “seqüência reversa”, como usados aqui, é ilustrada pelo seguinte exemplo. Para a seqüência 30 5’AGTGAAGT3’, o complemento é 3’TCACTTCA5’, o complemento reverso é 3’ACTTCACT5’ e a seqüência reversa é 5’TGAAGTGA3’.

Como usado aqui, o termo “variante” ou “substancialmente similar” compreende sequências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de seqüências especificamente

14/36 : ·.· : τ : ·.

identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado, substituído ou adicionado. As variantes podem ser variantes alélicas de ocorrência naturais, ou variantes de ocorrência não natural. As seqüências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nucléicos que podem ser caracterizados 5 pela porcentagem de similaridade de suas seqüências de nucleotídeos com a seqüências de nucleotídeo descrita aqui (SEQ ID NO 1), como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nucléicos preferidos são aqueles cujas sequências de nucleotídeos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de seqüência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de . 10 seqüência, mais preferencialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de seqüência, mais preferencialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de seqüência, ’ mais . preferencialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de seqüência, mais preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, çi_8% ou 99% de identidade de seqüência quando comparada com a seqüência de referência. A 15 identidade percentual é determinada por alinhamento de duas seqüências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na seqüência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de softwares existentes na internet, um deles é o BLASTN, que está disponível na página do National Center for 20 Biotechnology Information/NCBI (www.ncbi.nlm.nih.uoy-).

O termo “vetor” diz respeito a um replicon, tal como plasmídeo, cosmídeo, bacmtdeo, fago ou vírus, no qual outras seqüências genéticas ou elementos (seja DNA ou RNA) possam ser ligadas para serem replicadas juntas com o vetor. Preferencialmente o vetor derivado de vírus é selecionado entre os bacteriófagos, vaccinias, retrovirus ou vírus 25 do papiloma bovino. O “vetor recombinante” é resultante da combinação de um vetor comercial com genes quiméricos, ou o polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a um polinucleotídeo endógeno e/ou heterólogo de interesse que por sua vez está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif.), 30 Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly’ Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados a, são os vetores pGEM-T, pCAMBIA 1391

O termo “sequências acentuadoras de expressão” conhecidas como amplificadores ( enhancers), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, “upstream”

15/36 ou “downstream”) e que potenciam a taxa de transcrição. Estes amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua vizinhança. ~ „ A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das seqüências adjacentes.

O primeiro intensificador descoberto que estimulava a transcrição de genes eucariotos foi o SV40 (Presente no genoma do Vírus 40 de Símio) Após a descoberta do intensificador SV40 foram identificados centenas de outros enhancer como HSV-1, AMV, HPV-16 , em outros genomas virais no DNA de células eucarióticas. ( Lodish et al,

Biologia celular e molecular. 4^a edição pág 368)

O termo “operacionalmente ligado” significa que as seqüências regulatórias necessárias para expressão da seqüência codifícadora são colocadas na molécula de DNA em posições apropriadas relativa à seqüência codifícadora para efeito de expressão da seqüência codifícadora. Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de seqüências codifícadoras e elementos controladores da transcrição (por exemplo, 15 promotores, auxiliadores ou “enhancers” e elementos ou seqüências de terminação) no vetor de expressão. Uma região codifícadora exógena é tipicamente flanqueada por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão da região codifícadora exógena em uma célula transformada (podendo ser microorganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada a uma região codifícadora exógena 20 inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucléico que pode causar transcrição de regiões codifícadoras exógenas, posicionado na região 5’ da região codifícadora exógena. No caso da presente invenção a região regulatória diz respeito às regiões substancialmente similares à SEQ ID NO 1. Para auxiliar no aumento da transcrição de um determinado polinucleotídeo, a seqüência promotora da presente invenção poderá estar ligada a outras 25 seqüências regulatórias já descritas, tais como: ATATT (elemento de forte expressão na raiz), A AC A A AC and GCCACCTCAT (elementos relativos a expressão específica em sementes), CACGTG e CCTACC (ambas seqüências podem ser estimuladas ao um fator de estress), entre outros. (Ai-Min Wu et al, Isolation of a cotton reversibly glycosylated polypeptide (GhRGPl) promoter and its expression activity in transgenic tobacco, Journal 30 of Plant Physiology 163 (2006) 426—435)

Uma “seqüência de terminação” é uma seqüência de DNA que sinaliza o final da transcrição. São exemplos de seqüências de terminação, mas não estão limitados a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopal i na si nt et ase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da

16/36 octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do 5 vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes.

A presente invenção provê uma região regulatória de polinucleotídeos isolados que podem ser empregadas na manipulação de fenótipos de plantas, junto com polinucleotídeos isolados compreendendo estas regiões regulatórias. Mais especificam ente a presente 10 invenção está relacionada ao promotor ou seqüência regulatória que ocorre naturalmente em plantas de soja (Glycine max), responsável pela expressão da proteína de conjugação à ubiquitina nessa espécie vegetal. O promotor de soja foi isolado do gene responsável pela expressão da proteína de conjugação à ubiquitina foi denominado na presente invenção de uce S8.3 (SEQIDNO1).

¹⁵ A presente invenção, a quantidade de um polipeptídeo de interesse específico pode ser aumentada ou reduzida, por meio da incorporação de cópias adicionais de genes, ou seqüências de codificação, codificando o polipeptídeo, ligado operacionalmente a seqüência de promotor da presente invenção (SEQ ID NO 1), no genoma de um organismo, como uma planta. Similarmente, um aumento ou uma diminuição na 20 quantidade do polipeptídeo pode ser obtido por transformação de planta com cópias antisense destes genes.

O polinucleotídeo da presente invenção foi isolado de plantas de soja, mais especificamente de Glycine max, mas ele pode ser altemativamente sintetizado usando técnicas de síntese convencionais. Especificamente o polinucleotídeo isolado da presente 25 invenção inclui a seqüência identificada como SEQ ID NO1; o complemento reverso da seqüência identificada como SEQ ID NO1; complemento reverso da seqüência identificada como SEQ ID NO1.

Estudos da atividade do promotor da presente invenção são detalhados nos exemplos deste relatório. Dados experimentais feitos em plantas de Arabidopsis 30 quantificando a atividade GUS demonstraram que o vetor recombinante contendo o promotor uce S8.3 possui maior atividade GUS do que o promotor CaMV35Sd.

O polinucleotídeo da presente invenção pode ser identificado em seqüências de DNA genômico de plantas para as quais a informação da seqüência de genoma é disponível ao público, ou isolado de várias bibliotecas de polinucleotídeos, ou pode ser

9b

17/36 sintetizado usando técnicas que sâo bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). O polinucleotídeo pode ser sintetizado, por exemplo, usando sintetizadores automatizados de oligonucleotídeos (por exemplo, sintetizador de DNA OLIGO 1000M Beckman) para obter segmentos de polinucleotídeos de até 50 ou mais ácidos nucléicos. Uma pluralidade destes segmentos de polinucleotídeos podem ser então ligados usando técnicas de manipulação de DNA padrões que são bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) Uma técnica de síntese de polinucleotídeo convencional e exemplar envolve a síntese de um segmento de polinucleotídeo de filamento único, tendo, por exemplo, 80 ácidos nucléicos, e hibridizando este segmento a um segmento de 85 ácidos nucléicos complementar, sintetizados, para produzir um ‘overhang’ de 5 nucleotídeos. O próximo segmento pode ser então sintetizado de modo similar, como um ‘overhang’ de 5 nucleotídeos no filamento oposto. As extremidades “pegajosas” ou coesivas asseguram uma ligação apropriada quando as duas porções são hibridizadas. Deste modo, o polinucleotídeo desta invenção pode ser sintetizado completamente in vitro.

Como observado acima, a seqüência de promotor da presente invenção pode ser empregada em vetores recombinantes e/ou de expressão para acionar a transcrição e/ou expressão de um polinucleotídeo de interesse. O polinucleotídeo de interesse pode ser endógeno ou heterólogo para um organismo, por exemplo, uma planta, a ser transfonnada. Os vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção podem ser assim empregadas para modular níveis de transcrição e/ou expressão de um polinucleotídeo, por exemplo, um gene que está presente na planta de tipo selvagem, ou pode ser empregado para prover transcrição e/ou expressão de uma seqüência de DNA que não é encontrada na planta de tipo selvagem, incluindo, por exemplo, um gene que codifica um gene repórter, como gus.

Em algumas formas de realização da presente invenção, o polinucleotídeo de interesse compreende uma matriz de leitura aberta que codifica um polipeptídeo de interesse. A matriz de leitura aberta é inserida no vetor em uma orientação sense e a transformação com essa construção genética irá geralmente resultar em super-expressão do polipeptídeo selecionado. O polipeptídeo de interesse, que será regulado pelo promotor da presente invenção, poderá ser inserido no vetor na orientação sense, antisense ou em ambas as direções. A transformação com um vetor recombinante e/ou de expressão construção genética contendo o promotor da invenção regulando a expressão do polinucleotídeo de

18/36 interesse na orientação antisense ou em ambas as orientações (sense e antisense) irá geralmente resultar na expressão reduzida do polipeptídeo selecionado. g* $

O polinucleotídeo de interesse, como uma seqüência de codificação, é ligado de modo operativo em uma seqüência do promotor de polinucleotídeo da presente invenção de modo que uma célula hospedeira é capaz de transcrever um RNA acionado pela seqüência do promotor ligada ao polinucleotídeo de interesse. A seqüência do promotor de polinucleotídeo está geralmente posicionada na extremidade 5’ do polinucleotídeo a ser transcrito. O uso de promotor constitutivo, como a seqüência do promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de Glycine max identificada como SEQ ID NO1, irá afetar a transcrição do polinucleotídeo de interesse em todas as partes da planta transfonnada.

O vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção também pode conter um marcador de seleção que é eficaz em células do organismo, como uma planta, para permitir a detecção de células transformadas contendo a construção inventiva. Estes marcadores, que são bem conhecidos, tipicamente conferem resistência a uma ou mais toxinas. Um exemplo deste marcador é o gene nptll, cuja expressão resulta em resistência a canamicina ou neomicina, antibióticos que são geralmente tóxicos para células de plantas em uma concentração moderada. As células transformadas podem ser assim identificadas por sua capacidade de crescer em meio contendo o antibiótico em questão. Outros marcadores que podem ser utilizados para construir vetores recombinantes e/ou de expressão contendo o polinucleotídeo da presente invenção podem ser, mas não estão limitados ao gene hpt, que confere resistência ao antibiótico higromicina, gene manA e o gene bar.

O sistema que usa o gene manA (que codifica a enzima PMI - phosphomannose isomerase) de Escherichia coli (Miles e Guest, 1984 Complete nucleotide sequence of the fumarase gene fumA, of E. coli, Nucleic Acids Res. 1984 April 25; 12(8): 3631-3642)? tendo a manose como agente seletivo, é um dos novos sistemas sugeridos como alternativos aos dois primeiros descritos acima (Joersbo et al., 1998; Parameters interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet, Physiologia Plantarum Volume 105 Issue 1 Page 109 - January 1999 doi:10.1034/j.l3993054.1999.105117.x). As espécies vegetais que não metabolizam manose sofrem severa inibição de crescimento quando esta é oferecida como única fonte de carbono em meio de cultura. Os efeitos adversos e inibitórios do uso da manose são conseqüências do acúmulo de manose-6-fosfato, produto da fosforilação da manose por uma hexoquinase. PMI

19/36 promove a interconversão de manose-6-fosfato e frutose-6-fosfato, permitindo assim que a primeira possa ser catabolizada na via glicolítica (Ferguson e Street, 1958. Análise de sistemas gene marcador/ agente seletivo alternativos para seleção positiva de embriões somáticos transgênicos de mamoeiro Rev. Bras. Fisiol. Veg, 2001, vol.13, no.3, p.365-372. ISSN 0103-3131. Malca et al., 1967 Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes Physiologia Plantarum Volume 111 Issue 3 Page 269 - March 2001 doi:10.1034/j.1399-3054.2001.1110301.x).

O gene bar (que codifica a enzima PAT - phosphinothricin-N-acetyltransferase) de Streptomyces hygroscopicus (Murakani et al., 1986 - The bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopicus'. molecular cloning and characterization of the gene cluster. Molecular and General Genetics., 205: 42-50, 1986.), tendo o glufosinato de amônio (PPT) como agente seletivo, é, dentre os sistemas tipo gene de tolerância a herbicida, um dos mais amplamente empregados pela engenharia genética no desenvolvimento de OGMs vegetais. PAT inativa herbicidas que apresentam o PPT como composto ativo mediante detoxíficação deste. A detoxificação, que é resultante da acetilaçao do grupamento amino livre presente no PPT, toma este incapaz de competir de forma inibitória com a glutamina sintetase (GS), possibilitando assim a remoção da amônia tóxica da célula vegetal pela conversão de glutamato em glutamina, reação esta catalizada pela GS (Lindsey, 1992 Molecular cloning of ICAM-3, a third ligand for LFA-1, constitutively expressed on resting leukocytes Nature 360, 481 - 484 (03 December 1992); doi:10.1038/360481a0).

Alternativamente, a presença da construção desejada em células transformadas pode ser determinada por meio de outras técnicas conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), como Southern e PCR.

As técnicas para ligar de modo operativo os componentes dos vetores recombinantes ou de expressão inventivos são bem conhecidas no estado da técnica e incluem o uso de ligadores sintéticos contendo um ou mais sítios de endonuclease de restrição, como descrito, por exemplo, em Sambrook et al (“Molecular Cloning, a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Genes quiméricos da presente invenção podem ser ligados a um vetor tendo, pelo menos um sistema de replicação, por exemplo, E.coli, assim após cada manipulação, as construções resultantes podem ser clonadas e seqüenciadas.

Vetores recombinantes ou de expressão da presente invenção podem ser usados para transformar uma variedade de organismos incluindo, mas não limitando a plantas. As

20/36 : : : :: y :: ; j _φ· , : «:· *·* ♦ ··* ··· ··· * ·· plantas que podem ser transformadas usando vetores recombinantes ou de expressão da presente invenção incluem angiospermas monocotiledôneas (por exemplo gramíneas, milho, grãos, aveia, trigo e cevada), angiospermas dicotiledôneas (por exemplo Arabidopsis, tabaco, legumes, alfafa, aveia, eucalipto, bordo), e gimnospermas (por 5 exemplo pinheiro, espruce branco e lariço). Os protocolos de transformação de plantas já são bem conhecidos no estado da técnica Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEM, Capítulos 2 e 3, 1998). Em uma forma de realização preferida, os vetores recombinantes ou de expressão da presente invenção são empregados para transformar plantas dicotiledôneas. Preferivelmente, a 10 planta é selecionada da família das Malvaceae, mais preferivelmente da espécie Glicine max. Outras plantas podem ser transformadas de modo útil com o vetor recombinante ou de expressão da presente invenção incluem, mas não são limitadas a: Anacardium, Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, 15 Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum,

Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vi tis, Vigna, e Zea.

O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (nos), sinal de terminação do gene RNA 35S do CaMV, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de

Aspergillus nidulans, e outros semelhantes. Preferivelmente o terminador utilizado na presente invenção é o terminador do gene que codifica para a proteína de conjugação à ubiquitina de soja.

Os vetores recombinantes ou de expressão da invenção podem ser introduzidas dentro do genoma da planta hospedeira desejada através de uma variedade de técnicas 30 convencionais. Por exemplo, introdução mediada por Agrobacterium tumefasciens', eletroporação; fusão de protoplasto; injeção em órgãos reprodutivos; injeção em embriões imaturos; microinjeção de protoplastos de células de plantas; utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA e outros. A escolha da técnica irá depender da planta a ser transformada. Por exemplo, plantas

21/36 dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas e gimnospermas podem ser transformadas por tecnologia de plasmídeo Ti de Agrobacterium. Os vetores recombinantes ou de expressão podem ser combinadas com regiões flanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas dentro de vetor convencional hospedeiro A. tumefasciens. A função de virulência do 5 hospedeiro A. tumefasciens direcionara a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por A. tumefasciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501, Horsch et al. Science 233:496-498, 1984; e Fraley et al. Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 80:4803, 1983).

Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária. A introdução de vetores recombinantes ou de expressão utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. (Paszkowski et al.Embo J. 3:2717-2722, 1984,como mencionado no pedido de patente 15 US20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em From et al. Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 82:5824, 1985 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. Nature 327:70-73, 1987 (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A introdução dos vetores recombinantes ou de expressão da presente invenção podem ser feitas em tecidos, como 20 tecido de folha, células dissociadas, protoplastos, sementes, embriões, regiões meristemáticas, cotiledones, hipocotiledones, e outros. Preferencialmente a presente invenção utiliza a transformaçao através da introdução mediada por A. tumefasciens. A principio o método preferido para transformação contendo promotores da presente invenção foi através da introdução mediada por Agrobacterium tumefasciens utilizando a 25 A. thaliana com planta modelo (Clough at al, Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-vntâiateà transformation of A. thaliana. Plant J. 1998 Dec;l 6(6):735-43.). No entanto outros métodos de transformação podem ser utilizados para inserir vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção, tais como a biobalística, que consiste em uma técnica de transformação direta do DNA que utiliza microprojéteis 30 impulsionados em alta velocidade para carrear o DNA para dentro das células e apresenta alta eficiência para a transformação de soja (Mccabe et al, Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration.Biotechonoly, v.6, p.923-926,1988).

Uma vez que as células foram transformadas, por qualquer uma das técnicas mencionadas acima, as células tendo o vetor recombinante e/ou de expressão da presente

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invenção incorporada em seu genoma podem ser selecionadas por meio de um marcador, como o marcador de resistência a canamicina. As células de plantas transformadas podem então ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e, final mente, o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração contam com a 5 manipulação de certos fítohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a seqüência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al. (Evans et al, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New 10 York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press,

Boca Raton, 1985, como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são bem descritas no estado da técnica, tais como ·. em K.lee et al. (Klee et al., Ann. Ver. Of Plant Phys. 38:467-486, 1987 como mencionado 15 no pedido de patente US20020152501). As plantas transformadas resultantes podem ser reproduzidas de modo sexual ou assexual, usando métodos conhecidos no estado da técnica, para dar gerações sucessivas de plantas transgênicas. (C.B Banchero et al, Difusão da Biotecnologia na Argentina e no Brasil: o caso das plantas transgênicas 1999 Instituto de Pesquisa de relações Internacionais).

A produção de RNA em células pode ser controlada por escolha da seqüência do promotor, por seleção do número de cópias funcionais ou através do sítio de integração de polinucleotideos incorporados no genoma hospedeiro. Um organismo pode ser transformado utilizando um vetor recombinante ou de expressão da presente invenção contendo mais de uma matriz de leitura aberta de codificação para um polipeptídeo de 25 interesse.

O polinucleotídeo isolado da presente invenção também tem utilidade no mapeamento do genoma, em mapeamento físico e em clonagem posicionai de genes. A seqüência identificada como SEQ ID NO1 e suas variantes podem ser usadas para projetar sondas e iniciadores de oligonucleotídeos. As sondas de oligonucleotídeos projetadas 30 usando o polinucleotídeo da presente invenção podem ser usadas para detectar a presença do promotor da proteína de conjugação à ubiquitina em qualquer organismo tendo seqüências de DNA suficientemente similares em suas células usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica, como as técnicas de hibridização de DNA dot blot

23/36 (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning a laboratory manual, edition [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)

Os iniciadores de oligonucleotídeos projetados usando o polinucleotídeo presente invenção podem ser usados para amplificações de PCR.

O polinucleotídeo da presente invenção também pode usado para etiquetar identificar um organismo ou material reprodutivo do mesmo. Esta etiqueta pode ser obtida, por exemplo, por introdução estável de um identificador de polinucleotídeo heterólogo, não funcional, não disruptive, em um organismo, sob o controle do polinucleotídeo da presente invenção.

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Exemplos

A presente invenção é ainda definida nos seguintes exemplos. Deve ser entendido que esses exemplos, enquanto indicam parte da invenção, são colocados como forma de ilustração somente, não tendo, portanto, qualquer cunho limitante do escopo das presentes invenções.

Técnicas usuais de biologia molecular tais como transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos são referidos através de termos comuns para descrevê-los. Detalhes da prática dessas técnicas, bem conhecidos no estado da técnica, são descritos em Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press). Várias soluções utilizadas nas manipulações experimentais são referidas por seus nomes comuns tais como “miniprep”, “agarose”, “TBE”, etc. As composições dessas soluções podem ser encontradas na referência Sambrook, et al. (supracitada).

Exemplo 1

Isolamento da seqüência de DNA promotora do gene da proteína de conjugação à 25 ubiquitina de Glicine max

A extração do DNA em algodão foi realizado através do Kit DNeasy plant mini Kit 50 da QUIAGEN. A seqüência de DNA responsável pela expressão do gene da proteína de conjugação à ubiquitina foi isolada de plantas de soja utilizando a técnica de “Tail-PCR”. O “Tail-PCR” (Thermal Asymmetric linterLaced PCR) consiste numa aplicação da técnica 30 de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) que permite o isolamento de segmentos de DNA adjacentes a sequências conhecidas utilizando iniciadores específicos sequenciais junto com pequenos iniciadores arbitrários degenerados de modo a controlar termicamente a eficiência de amplificação relativa de produtos específicos e inespecíficos (Liu, Y. &

24/36

Whittier, R.F. (1995). Thermal asymmetric interlaced PCR: Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from Pl and YAC clones for chromossome walking. Genomics 25, 674-681.)

Intercalando-se ciclos de alta e baixa estringência, produtos específicos são preferencialmente amplificados sobre produtos não específicos. Foram feitas sequencialmente três reações de PCR utilizando três iniciadores seqüenciais específicos de um lado e um iniciador arbitrário do outro.

1) Reação primária:

Foram colocados 200 ng DNA genômico soja cv. Williams, em 20 μΐ de uma reação de PCR contendo 20 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, pH 8.4, (Gibco PCR buffer) 2 mM MgCl₂, 200 μΜ dNTPs, 400 nM primer UCE1 (5’ GCTTGCCAATGGAACAT 3’), 3 μΜ primer AD3 (5’ WGTGNAGWANCANAG 3’), 1 U Taq DNA polimerase (Gibco). A reação foi realizada em termociclador ( Eppendorf, Mastercycler gradient) progamado para 38 ciclos, com uma etapa inicial de 1 min a 93 °C, seguindo as seguintes etapas: Imin a 95 °C , 94 °C, 55 °C, 2,5 min 72 °C, voltar para o passo 3 ( 1 min a 94 °C) repetir 4 vezes, 3 min a 25 °C , 2,5 min a 72 °C, 30 segundos a 94 °C, 1 min a 60 °C, 2,5 min a 72 °C, voltar ao passo de 30 segundos a 94 °C repetir 1 vez, 30 segundos a 94 °C, 1 min a 44 °C, 2,5 min a 72 °C, voltar ao passo de 30 segundos a 94 °C e repetir 14 vezes, finalizando a 72 °C por 5 min

2) Reação secundária:

Foi adicionado 1 μΐ do produto da reação primária a 20 μΐ de uma reação de PCR contendo 20 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, pH 8.4, (Gibco PCR buffer) 2 mM MgCb, 200 μΜ dNTPs, 400 nM primer UCE2 (5’ AGRTCCTTIAGCTCCTT 3’), 2 μΜ primer AD3 (5’ WGTGNAGWANCANAG 3’), 0.6 U Taq DNA polimerase (Gibco). A reação foi 25 realizada em termociclador ( Eppendorf, Mastercycler gradient) progamado para 13 ciclos, com uma etapa inicial de 30 segundos a 94 °C, seguindo as seguintes etapas: 1 min a 55 °C , 2,5 min 72 °C, voltar para o passo inicial e repetir 1 vez, 94 °C por 30 segundos, 44 °C por 1 min, 72 °C por 2,5 min, voltar para o passo inicial e repetir 11 vezes, finalizando a 72° C por 5 min.

2) Reação terciária:

Foi adicionado 1 μΐ da diluição 1/50 do produto da reação secundária a 20 μΐ de uma reação de PCR contendo 20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.4, (Gibco PCR buffer) 2 mM MgCl₂, 200 μΜ dNTPs, , 400 nM primer UCE2 (5’ AGRTCCTTIAGCTCCTT 3’),

25/36· ·· ···· · · ··* · « ···· ··« ·*· • ··· * * · ··· «·· · ··

1.5 μΜ primer AD3 (5’ WGTGNAGWANCANAG 3’), 0.6 U Taq DNA polimerase (Gibco). A reação foi realizada em termociclador (Eppendorf, Mastercycler gradient) progamado para 24 ciclos, com uma etapa inicial de 1 min a 94 °C, seguindo as seguintes etapas: 1 min a 44 °C , 2,5 min 72 °C, voltar para o passo inicial e repetir 1 vez, voltar para o passo inicial e repetir 19 vezes, finalizando a 72° C por 5 min.

A amplificação com o primer arbitrário AD3 produziu um fragmento de aproximadamente 1.2 kb potencialmente positivo (Figura 1), baseado na intensidade de amplificação e ausência na reação primária do TAIL-PCR

O produto do PCR foi submetido a eletroforese em agarose-TBE e o fragmento amplificado de 1.2 kb foi purificado com o kit ‘Gene Clean' e ligado ao vetor pGEM-T (Promega). O vetor recombinante resultante (Figura 2) foi usado para transformar células de E. coli por eletroporaçao (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEM, 1998. 101. p.). Foram obtidos 53 clones transformados. Destes, 22 foram selecionados para analise por PCR com os primers T7 e reverso. 13 dos clones apresentavam um inserto do tamanho esperado de 1.2 kb (Figura 3). Nove clones foram selecionados para preparação de DNA plasmidial em pequena escala (miniprep - Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) e para sequenciamento. Os clones foram seqüenciados em um seqüenciador automático ABI usando os primers Ml3 reverse e M13 forward.na plataforma de sequenciamento da Embrapa-Cenargen.

Dois clones foram confirmados como positivos através do sequenciamento. A seqüência consenso do promotor uce de soja foi obtida pelo alinhamento dos clones positivos 5 e 8.

A analise da seqüência clonada do gene de soja correspondente a família do gene Leubc4 revelou a existência de segmento similar ao consenso TATA box presente usualmente em promotores de eucariotos. Adicionalmente, a comparação da seqüência obtida com outras seqüências depositadas nos bancos de dados não revelou qualquer similaridade significativa, assim como também não foram detectadas seqüências abertas de leitura significativas, indicando que a região nao corresponde a uma seqüência codifícadora.

Exemplo 2

A análise comparativa da seqüência promotora uceS8.3 do gene da proteína de conjugação de ubiquitina de algodão com outros promotores constitutivos de plantas,

26/36 mostrou que o promotor uceS8.3 é significativamente diferente dos promotores descritos na literatura, como mostra o alinhamento abaixo:

Arabidopsis -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_3 -----------------------------------------------------------Gos-2_zea -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_l -----------------------------------------------------------A-TubulinCof:fea_l --------------------------------------------AAAAGTTGTAGCGGGA 16

Uce_Oryza_4 -----------------------------------------------------------UBI9_Saccharum -----------------------------------------------------------Enolase_Zea -----------------------------------------------------------Actin-2_Zea -----------------------------------------------------------Uce_0ryza_2 CTGCAGAAATGCAAATTTCATAAAACAAACTACTAGTACTGTTTGTTCATTGGTCTTATC 6 0

UceAl.7 -----------------------------------------------------------UceS8.3 IIII_I_

A-Tubulin_Coffea_2 ------------------------------------------------------------35Sd_AMV UI

Arabidopsis -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_3 -----------------------------------------------------------Gos-2_Zea -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_l ------------------------------------------------------------A- Tubul in_cof fea_l GGGCTGGACGATGCGTGGAGCGGAAAATGCTGGAGTATTGGACCACCAACCAAACAAAAT 7 6

Uce_0ryza_4 -----------------------------------------------------------UBI9_Saccharum -----------------------------------------------------------Enolase_Zea -----------------------------------------------------------Actin-2_Zea -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_2 CAAAACTTAGCCACTGCAACAAGTTCTTGAACCTTAGCACAATCATATTGTGCATGCACT 12 0

UceAl.7 -----------------------------------------------------------UceSS.3 ---------------------------------------------------------H_

A-Tubulin_Coffea_2 -----------------------------------------------------------3 5Sd__AMV -----------------------------------------------------------Arabidopsis -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_3 -----------------------------------------------------------Gos-2_Zea -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_l -----------------------------------------------------------A-Tubulin_cof f ea_l AGTTTTAGTATATGGGGTTTCGAACTTTCCAGTCAACCTACAACAATCTGCTTCTATAAA 13 6

Uce_0ryza_4 -----------------------------------------------------------UBI9_Sacchar um -----------------------------------------------------------Enolase_Zea -----------------------------------------------------------Actin-2_Zea -----------------------------------------------------------Uce_0ryza_2 TGTTTATTGCAAAGAATGGTGCGTAGGGAACACGCATGATTTTTGAATTGCTGGCACATA 18 0

UceAl.7 -----------------------------------------------------------UceS8.3 ------------------------------------------------II____II__I_

A-Tubulin_Coffea_2 -----------------------------------------------------------3 5Sd_AMV ---------------------------------------------------------III

Arabidopsis -----------------------------------------------------------Uce_0ryza_3 -----------------------------------------------------------Gos-2_Zea -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_l -----------------------------------------------------------A-Tubu1in_cof fea_l CAATAATAAAAGAGTAATTAAATTACTGGTAGCGTTGGTGTATTTGGATTTGCCAGCTTT 196 Uce_Oryza_4 -----------------------------------------------------------UBI9_Saccharum -----------------------------------------------------------Enolase_Zea -----------------------------------------------------------Actin-2_Zea -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_2 ATTTTATCATTAGAAACTGGAATGCAACATGTACCCTTTGTCATGGTTTCTTTCCGAGAC 24 0

UceAl.7 -----------------------------------------------------------UceSS.3 -----------------------------------------------------------A-Tubulin_Coffea_2 -----------------------------------------------------------35Sd AMV -------------------------------------------------Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Cof fea 1

Uce_0ryza_4

UBI9 Saccharum

GCTTCCAAACTCATATCATCAATTTGATAGCACTTGGATACGGAGATCGCTTTTGTCTGC 256

27/36

Enolase_Zea

Actin-2__Zea

Uce_Oryza_2

UceAl.7

UceS8.3

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd_AMV

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce__Oryza_l

A-Tubulin_Cof fea_1

Uce_0ryza_4 UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_0ryza_2

UceAl.7

UceS8.3

A-Tubu1in_Cof fea_2 35Sd AMV attgcactgttttttttaatcctatcattatcataatgccaagaactggtcaccaaccag 3 0 0

CTTAGTATGATATGATTGCTCACCCGCTGTAGACATGATTTAAAGGAAAATAACACAAAT 316

CATTTTGCATCATGGTTAGTTGAGCTGTCCCCATGTATCAATAGGTGCATTGTATTGGTC 360

Arabidopsis -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_3 ----------------------------------------------------Gos-2_zea ----------------------------------------------------------Uce_Oryza_l -----------------------------------------------------A-Tubulin_coffea_l ATATATATATAAGACCAACAAATTATAACTGAAAACTTTTCAGTAATGTTAATTCTAACA 3 76

Uce_0ryza_4 -----------------------------------------------------------UBI9_Saccharum -----------------------------------------------------------Enolase_zea -----------------------------------------------------------Actin-2_Zea -------------------------------------------------Uce_0ryza_2 CAAAATATAAATGCAGTGGATGCAACCTATCTCATGGCCGTCAACAAAAGAAATCAAAAG 420

UceAl.7 ---------------------------------------------------UceS8.3 --------------------------------------------___

A-Tubulin_Coffea_2 -------------------------------------------------------3 5Sd_AMV --------------------------------------------Arabidopsis -------------------------------------------------------Uce_0ryza_3 ----------------------------------------------------------Gos-2_Zea -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_l ----------------------------------------------------------A-Tubulin_Cof f ea_l CATGTGACTAGACCTGCTATCATCAGCTGCAATTCTAGAGGAAACTTGGACCAGATCAGA 436

Uce_0ryza_4 -----------------------------------------------------------UBI9_Saccharum ----------------------------------------------------Enolase_Zea -----------------------------------------------------------Actin-2_Zea -----------------------------------------------Uce_0ryza_2 GGAAATGCACCATCTTATATCTCCAGTTTATATGAACAGATTGGATAAGATCATAAGATC 480

UceAl.7 ------------------------------------------------------UceS8.3 -------------------------------------------~____~_____Z____

A-Tubulin_Coffea_2 ------------------------------------------------35sd_AMv ------------------------------------------ΖΣ_Ξ_ΞΣΣ_Ξ_ΖΣΣ____

Arabidopsis -----------------------------------------------------------Uce_0ryza_3 -----------------------------------------------------------Gos-2_Zea -----------------------------------------------------------Uce_Oryza_l ----------------------------------------------------A-Tubulin_Coffea_l AGTTGTAAAGGGCTGCAGTCCATTCCTGCACTATTCAGTTTGCAGGTAGATGGGTGGACC 496

Uce_0ryza_4 ----------------------------------------------------UBI9_Saccharum -----------------------------------------------------------Enolase_Zea -----------------------------------------------------------Actin-2_Zea ------------------------------------------------------Uce_Oryza_2 AAGTGGTTTATATTATTTTGAGGAATATAACATGGATTCATCCTAATCACTCGTCTAGGC 540

UceAl.7 ------------------------------------------------------UceS8.3 -----------------------------------------------2ZZ___

A-Tubulin_Co f fea_2 ------------------------------------------------------------35Sd_AMV -----------------------------------------------------Ζ _ Σ ~Ξ _ Σ

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

28/36

Gos-2_Zea Uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l Uce_0ryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_zea Actin-2_Zea Uce_Oryza_2 UceAl.7

UceS8.3

A-Tubu1in_Co f f e a_2 35Sd_AMV

ATTATATGGATCTGGTCCAGCGTGAATGÇAÇTTGTAGTAAAGACATGTTGGATTTGTTAT 556

AGTATGTGTATTCATGATGGATATGGTACTATACTACGGAGTTTTTTCTTCACAAAATAA 600

--------------------------------------AGTGAAGTAGCAGAGATAATAG 22

Arabidopsis

Uce_Oryza_3 Gos-2_Zea Uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l Uce_0ryza_4

UBI9_Saccharum Enolase_Zea Actin-2_Zea Uce_0ryza_2 UceAl.7

UceS8.3

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd_AMV

GGATCAAACTACTACTAGTAGGGAAATGCTTCAAAGACTTCTCTTGTGATTTTCTCCCAG 616

GAATTCCGGCGTGGGCGCTGGGCTAGTGCTCCCGCAGCGA 4 0

CCTGTTATTTTGACCTCCAACCAAACACGAATTATACCAAAAATTGGGTTATTTCATCTA 66 0

TTATTACAGTAGCAGTAATAAAATAAAATACATTTTATTACAAAAAAACGTACAAGAGGT 8 2

-----------------------------TGTGTAGAAGCAGAGAAAACCAAAAGAGTAG 31

Arabidopsis

Uce_Oryza_3 Gos-2_Zea Uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l Uce_Oryza_4

UBI9_Saccharum Enolase_Zea Actin-2_Zea Uce_Oryza_2 UceAl.7

UceS8.3

A-Tubu1in_Co f f ea_2 35Sd_AMV

CCGAATGGTCCAAGTACACTAGCAAAAGAAGCACAAACGGTACCAATGACTCGAGCGAGC 676

GCGATCTGAGAGAACGGTAGAGTTCCGGCCGGGCGCGCGGGAGAGGAGGAGGGTCGGGCG 100

TAGTACAACTCTATTATAAACATGCAGTAAATTATCCTACACATATACCAAAATTCAAGT 72 0

CCGCGAAGATAGCCAATGAGAACGCAAGAAGACAACCCAATTCT-CCTATTTTTTTATTA 141

TGAGGAAGCCCACTTACTTCAAGGACTTTGTCTAAAGGGTGAAGTGTGTATTTCCATAAC 91

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_Zea Uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l Uce_Oryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_zea

Actin-2_Zea Uce_Oryza_2 UceAl.7

UceS8.3

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd AMV

TGACATTTTGGGCTTCAGATTAGCACAAGACAAAAGGATTTTTCACTTTTCTTCTGTAGG 73 6

GGGAGGATCCGATGGCCGGGAACGAGTGGATCAATGGGTACCTGGAGGCGATCCTCGACA 160

GTAATAATCCTAATACACAGACTTAAAAATCAAACTATTTCCTTTTTAAGATATGGAAAA 78 0

AATATTTCTAGAAGAAAGGGTAAATTACGCCCCACGGTCACAAAACTATTAATAAGATCA 2 01

AAAATCATCAACAAACAAATTCTGTTACTAGGATTACTATAAATACAATTGTAATAAACA 151 ----------------CATTTCTTGCCAGAAAGCACTAGTGAATATTCTATCCCTGTCAG 44

Arabidopsis

Uce_Oryza_3 Gos-2_Zea uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l Uce_Oryza_4

UBI9_Saccharum Enolase_Zea Actin~2_Zea Uce_Oryza_2 UceAl.7

UceSS . 3

A-Tubu1in_Coffea_2

---------------------GTCGACCTGATGATTATTTTGTTGATCATGATTTTCTTT 3 9

TGATCCTGGACTCGCAGGTTGGCATGCTCAATTCAGGAGCTTTTGAGATTGGATAGGGTG 796

GCCACACCTCGTCGCGGGGTGCCGGCGGCGGCGGCGGCGGGGGGGACCCCAGGTCGCCGA 220

CCATTTTTTTAACGGAAGGAAAACAAATTCGGGTCAAGGCGGAAGCCAGCGCGCCACCCC 840

TATATTTATCACTCAACTTCCAAAAGTTACAAAATGATTATTAAACTATTCAAAAGTTTT 261

AGCAAAGATATGAATGAATGAAATTTCCATATTTCTTACTTTTCTTCTTTGGAGGGTTCT 211

TCACTATAGATTCTGGAAGTCCATGTAATCTAAAAATGTTTCCAGGAAGAGTTGAGCCAC 104

29/36

5Sd_AMV

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_zea Uce_Oryza_l

A-Tubu1i n_Cof f ea_1 Uce_pryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea Uce_0ryza_2 UceAl.7

UceSe.3

A-Tubulin_Cof f ea_2 35Sd AMV

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l

Uce_Oryza_4 UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_0ryza_2

UceAl.7

UceS8.3

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd AMV

Arabidopsis

Uce_Oryza_3 Gos-2_zea Uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l Uce_0ryza_4 UB19_S ac cha rum Enolase_Zea Actin-2_Zea Uce_Oryza_2

UceAl.7

UceS8.3

A-Tubulin_Cof f ea_2 35Sd_AMV

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Co f f ea_l

Uce_Oryza_4 UBI9_saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_Oryza_2

UceAl.7

UceS8.3

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd_AMV

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Cof f ea_1

Uce_Oryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase Zea

GTGTTCATTTGATAGAGTCTAAAATCACCACTTACATTGACTAACCCCAA 50

TGGCTATTTGATTTTTTGAAAGATATTTTTTTCCCTGGGAAGACACCTATGGGACGAAGA 9 9

TTGGTTATGAATGCACCGCAGGTTGCATGCTCAATTCAGAGCCCTTCACATGTAACCGTG 856

CGAAGGCGGCGAGCCCCCGCGGC - GCGCACATGAACTTCAACCCCTCGCACTACTTCGTC 279

ACGTCAGCGAATACGGAGGCGCGGGGTTGACGGCGTCACCCGGTCCTAACGGCGACCAAC 900

ATTTCAAGTCATTGGATTGTTAAAATAGCATTTGTATGGATTTCCCTGTTCACATTGCCT 321

GGTCCTCGAAACCAAATTCTTAGTTCTCTTACCAATTTGTCTCTTTTTGGTTGGTTATTC 271

CTGTTTGGTTGTGAAGGGGTGAGCTAAGGCAAGCAAATGACCTACTTTGGACAACCTATC 164

AAATTTGTCCTAAACACTAATCAATCCGAAGATTATAAAATGTCGACAAAGAAAATAAAA 110

TATTATGTTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA 159

TGTAGCCCAGGCCCAAATGCCCCGGAAYTTTAAACTGAAATCTCGGAAYAGCAGATGGCA 916

GAGGAGGTGGTCAAGGGCGTCGACGAGAGCGACCTCCACCGGACGTGGATCAAGGTCGTC 339 TCATATATTTATG 13

TCAGT 5

AAACCAGCCAGAAGAAATTACAGTAAAAAAAAGTAAATTGCACTTTGACCCACCTTTTAT 960

ACATCAATCGAAGCCTCTCATTCCCCTTCTTTTTTATAGATTAAGTTTTTTTTTATAAAA 381

AGTGTAACAAAATAAAAAAAATAAGAATTATGAATCTAAATAATGGTATACATGACAAAG 331

AATCACGTATTATATCCTTGAGATTCTGGAAGGCTCTCTATGAAGTCCATGGTTAGGTGA 224

GGTCCGATCTGAG 13

TAAAATAGGAGTCTATGAGTCGATGGAACTTATCCAACTAAACTTTAATAAGAATGAACC 170

TATATATCACATCAGTCTCTGCACAAAGTGCATCCTGGGCTGCTTCAATTATAAAGCCCC 219 ACGGTCGTAATTCGTCAAGCAATCCGAAACGTCGCCACACCCCCACGCCAGCTGGAAAAT 976 --------------------------AAGCTTGTCTGTCTCTACTAGATACCAGGGTTTC 34 GCCACCCGCAACGCCCGCGAGCGCAGCACCAGGCTCGAGAACATGTGCTGGCGGATCTGG 399 AACGGAGATAGTGCATCTATCATGCGATTCTTCGACGGAGTCGACGTCTGATTGGACCAG 73 ATGATTGCTTTCAATATAGGCTGATGGAGCCTATGAATGATCTATAACTATGTGATTGGA 6 5 TACCCAAAGTTTCAATTTGGACCACCCTTAAACCTATCTTTTCAAATTGGGCCGGGTTGT 1020 CAATTTTAAACATCATGAATCTCTGAACTAAAATTTAAATAACTTTTTTCTTCGATCTTT 441 AGATATAGCTCACATTGACAACTAAAAATTGAATTACTAATCACTTGCATTTTCATTTAT 3 91 GTCCAAGCTAAACGAGGAATAGGTGATGGTTGTAGCAGTCCAAGGTAGGGTCCATGCTTT 284 ACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGT 73

AAACTCAATTTT- -GTAATAATATTTAAAATACGTT---TTTACTCTCTCCCAGA---AT 222

-------------------ATTATTGGCTGTAGGAT---TCTAAACCGAGCCTAA---AT 35 ATTCACCACATT--TGCGAGATAGTCGAAAAGCACCA--TCAATATTGAGCTTCAGGTAT 275 CAGTTCAAAATT--CAAAATTCATTTTGGAGCCGTTC-“AAACAAAATTGTTTCAGTTTT 1032 ATCTTTCGGTTT--GGTCATTTGGACCAGGGTGCCCG--AAATATCGAAATTTCAGAAAT 90 CACCTCGCGCGCAAGAAGAAGCAGCTGGAGCTGGAGG - -GCATCCAGAGAATCTCGGCAA 4 57 AATTTCAGATGGTGAGCAAAAGTGCCACTTGCCTGCC--TCCTTTTCTCGTGCCTGCCTC 131 TGTCTTAACTTGCGTAGCCAAGCTCGTATGAGCCTCT- -TTTACTGGGTACCACTAATTT 123 GGTTTGGACTACCATGAACAACTTTTCGTCATGTCTAACTTCCCTTTCGGCAAACATATG 1080 GACATTGAATGTTAAATTAACTTGAATCTAAGGTATG-TTCTACTTGTTGATAAATACAG 500 CTTTTACACCAGCGACAACCAAATTGATCATACAACATTTGAACCAACTTTTCATGTTTA 451 GACTTAAATCTTTGGCATATGTCACAAGCATGAATATACCTGATGATTTTCCCCAAATGT 344 CACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGAT 133

ATCCCATCTCTCTGATTCCAATTCCTCCTCTCTCTCT---TTCGTCTCTCTAC 272

-------------------AAGCTTTGCTCCGTGTCT---GCTTGGGCCATAT 31

AGCTGGAATAGCT--CTATAGCCCTCAATCCAAACTA---ATGATATCTATAC 83

TTTTGGTTGTGTTGTGGTTGGATTGAGTCCGATATAT---ACCAAATCAATATA----AT3 28

GCCCCTCGCCTGCTGCCCTAATCTTACCCCGCCATTG---GGGCTTGGATTACTC---GC 1086

TTCGGTTCGAAATTATATGAATTTTTGAACAAAATTT---GATTAAATTAAACAA---AA144

GAAGGAAGGAACAGGAGCAGGTGCGTCGTGAGGCGAC---GGAGGACCTGGCCGA- - -GG511

AAGGATAGAAAGAAAGGAGAAACAATATACTATTTAA---GATCAGATAAAATAT---TA185

30/36

Actin-2_zea

Uce_Oryza_2

UceAl.7

UceS8.3

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd_AMV

CTATATATTAGATACAGTTAAATA-“AGTCTAAATTA---CATCGGTGCGTGCG----TG 174

AACCATATATAGAGGAGATCGGCCGTATACTAGAGCT- - -GATGTGTTTAAGGTC GT 1134

ATCCATCGTGTTGATCATTGAATCGTCACTTGGAGCT- - -CACTCATCGGACTTAAA-AA 556

ATTTTCTATGTGTAACCATATACTGCATAGAGGACCA- - - TACATGTACCTTTTGCATGG 508

TTTTGAGGTTTTTAATACCGGGAATGGCCCAGGAAAAAGGGCCCTGGCTTTGCACCAAGG 404

AAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGAC---CC 190

Arabidopsis

Uce_0ryza~3 Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin~Cof f ea_1 Uce_0ryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_zea

Uae_0ryza_2 UceSS.3

A-Tubu1i n_Co f f e a_2 35Sd_AMV

CCCGAATTGATTGTTTTAACCCCCGGTGATCGGAGCAAACTCT--CTGACGGTGACCGCC 330

AC ACGGACCAGCCCAATAGCCAGAAGCCTGT- - -AGCTCT--CC-ATGG-----GCC 77

TTATGCAACTCTAAATTTTTATTCTAAAAGTAATATTTCATTT - - TTGTCAACGAGATTC 141

TCACTACGGAATATACCATAGCCATCACAACTTTATTAATTTTGGTAGCTTAAGATGGTA 3 8 8

TCCAGTCTATATATATAACTCCCTCCCGCATTGCCTCACCACACGACCCCAAGTCCTCTC 1146

TATTATCAGATTTGCAAAAAATATGAAAAAAAAATCGGTCGAAATAATGTCGTATCTGGG 204

ATCTGTCAGAA-GGCGAGAAGGGAGACACCATCGGCGAGCTTGCGCCGGTTGAGAC-GAC 569

TAAGTCAAGGATAGAAAGAAAGGAGAAACAATATACTATTTAAGATCAGATAAAAAAAGA 245

CCAGTACGACTAGATGTAGTGAACTAAACACAGGTTAAGCTGTGATCAATGTA---TGTA 231

TGATTGCACGAGAAAAAAAAATCCAAATCGCAACAATAGCAAATTTATCTAGTTCAAAGT 1194

TGCATACACCTCTAACTTATATTGTGAAAACAAGTTTAGTTTCTATTTGCTAGTGTTGTA 568

TCCCCTAAGAATTTCTGGCAAAAGTTCAAGCGGTTCCAAAGTGCCCCAATGGGACCTCTC 464

CCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTG 250

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l

Uce_Oryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_0ryza_2

UceS8.3

A-Tubulin_Cof fea_2 35Sd_AMV

GGTGATC--ATTT-TTTGTGAACTTCACTTT-- -TGGTAAGCAGCTT--TGACTTT-TGT 381 CGTACTC - - GTGC - CACGTG----TCAATCC TGTGGTTCGGTTTCGTGGCGGT - TGC 126

TCTACTCT - ATTC- CACAATCTTTTGAAGCTATATTTACCTTAAATCTGTACTCTA- TAC 198 TATATAAT-AACC-AATTAACAACTGATTCTAATTTTACTACGGCCCAGTATCTAC-CAA 445 CTTCTTCTCCTTT - CCCAGATCTCGGAGGTCTCTCACTCTTCCGATCCAGAGACGT - CTT 1204 TTCGATCCGAAAT-TTTGAACCCATGCTAGCTGCCAGGCTTTGGATTCTGAGCGTCACGT 263 CAAGAAGAAGTTC-CAGAGGAACTTCTCTGACCTTACCGTCTGGTCTGACGACAAT-AAG 62 7 GCTAATA- -ATTT-TTTGGGACACATATACTGGTTACATTGTTATAATCTGTATATATCA 302 GAGAGTCTGACTC - TTTATATGCGGACAACTAAACACACGATAAGTGTCGAGAATGATTG 290 GAAAAGATATGTT - TAAAGGTAGTCCAAAGTA---AAACTTAGGGGCTGTTTGGTTCCCA 1250

CACAATCAAATTTGTTCTTATCATTCTTTTTTTTTGTGTGAAAGTTACATTCTTAAATAA 628 CAAAAAAGGTGCCCCGGGGACAAGTTGTGCTCAGTTCGGCGCGTTTCAAGACAGGTTTTG 524 GATTGATGTGATGGTCCGATCTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCT 310

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Coffea_l uce_Oryza_4 UBI9_Saccharum

Eno2.ase_zea

Actin-2_zea

Uce_0ryza_2

UceSS.3

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd_AMV

TC-ATAATCCT-TCACTTTTACTTT----TCAATTTT-GCTTTTTCC-TCTG ATCT429

GT-TTCCTCCTCTCTCTTTTCTTTT----TCATCTTT-TTTTTTTCT-TACG ACAT175

CA-ATAATCAT- -ATATTCTATTAT----TTATTTTTATCTCTCTCC-TAAGGAGCATCC250

TACAAAACAACGAGTATGTTTTCTT----CCGTCGTAATCGTACACAGTACAAAAAAACC501

TGTATACGCCTCTGGTATCTCCATT----CCTCCTTTTTCCCTCTCTTCCAAAAATCTCC1260

CAGGCACAATAAAATATTTGGGCCT----CTAACTCTTCGTGGGCTGATCTGGGCCGTAG319

GAGAAGAAGCTTTACATTGTGCTCA----TCAGCGTG-CATGGTCTTGTTCGTGGAGAAA682

CG-TTGTTCGAATATATTCCAAATT----TTTACTATGATTCGTGCTCTACCGGAACTAC357

AGGAAATATTGGTCGTTCCACGTGA----TTGAGTAAGAATGAGAGGGAAATAAAAGGAT346

GCCATACTTTACCATTACTTGCCAA----CAAAAGTTGCCACACCTTGTCTAAGGTGAGG13 06

GTATTATGGAATAAGCTTTCATATTAC- -TTAACTTTATTTCTTACTCGTTATTTCAAAA686

GCCAGAAAGCAAAGGGGTTCCAAAGGG- -TGTCAGAGGGTCCATGTTTCAAAACTCCGGG582

CGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGG 370

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l

Uce_Oryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_zea

Uce_Oryza_2

UceS8.3

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd AMV

GATCTTAGTT-----ATTAAGCTGTTGAATCGCATGATCCTTTC----TTCTCTGATTGA480

T-TATAGGTT-----TCGTAGCGGCTGCGTTTCCTATTTTCCTT----TTCTTTTTCTAT225

CCCTATGTCT-----GCATGGCCCCCGGGTCGGGTCCCAATCTC----TTGCTCTGCTAG301

TGGCCAGCCT-----TTCTTGGGCTGGGGCTCTCTTTCGAAAGG----TCACAAAACGTA552

TATTCATTTC-----TCAAAACATCGCGAAAATGAGAGAGTGCA----TCTCCATCCATA13 11

CAGACGAGAG-----ACGCCATGACACGATCTCATCAATTCCGTAG - - TGGCCACGGAAC372

ACATGGAACT-----AGGTCGTGATTCTGATACAGGTGGCCAGGTGAAATATGTGGTCGA73 7

TTCTAGATTT-----TGAAAACTTTATGAGAATTTTCTTATTTAG---ATACACTAAGGC4 0 9

TTGGTGCGTTG---GTTTTGAAGGCAGGATTTGGTTAGGATGGGTGGACGTTTGAAGTGA 403

TGATCAAATTGTTAGCCACAACTTACTAAGCCTAAGGGAATCTTGCCACACTTTTTTGAG 13 66

GGTGAAAATTAC- - ATTTCTACCCAGACACACACTAAATACAGTACAAACTCGAAGCAAA 74 4

TGTCTTGGTCCCCCATAATTGACTTCGGCTAAGTAAAGGAAAACCT- -TAGCCGAGGCTG 64 0

CACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGA 43 0

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubu1in_Co f f e a_1

Uce_Oryza_4

UBI9 Saccharum

TTATTTCTAATCCTTC---ATGGGTT--TTATGACGAA-TCGTGTGTTAGGGATTCGTTT 534

TTATTTTTATGGGATA---TTCGCTT--TCGTGGCGG--CTGCGTTTCCTCG---CCCAT 275 TAGCACAGAAGGGACA---CTAGA--------AATGAC-TTGCTTGACTTAGAGTATCAG 349

CACGGCAGTAACGCCC---TTTGCTGCGTGTTAACGG--CCACCAACCCCGCCGTGACGA 607

TTGGTCAGGCCGGTAT-- -CCAGGTCGGAAATGCCTG- -CTGGGAGCTCTACTGCCTCGA 1366 TCACGTAGCGCAAATG CCGCTCCCGTTTCCGCATC-GTGCGATTTATCTCCTTTCTG 428 ACTTGCAAGAGCGATG TCAATGATGCCTGGAGTGT-ACAGGGTGGACCTCTTCACTC 7 93

31/36

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_Oryza_2

UceSS.3

A- Tubulin_Cof fea_2

35Sd_AMV

TAATTTTGGTTGGTTT---TTGGCTCGCTAGCTACCA--TTACCTCCTGCATCTAGACAT 464

TGAGTTTTTCAAGCGT-- -ATAGATTTTCTATTTGTCC-TTTTTAATTAACTTTCTCCCA 459 CCATTGACACGTGGGA---GTGAATTTGTTAGAGGGAA-AT-CTTGCCACAACTGTGGCT 1421 TGATTTGGATTGATTTAAATCAATTTTAGGTTCACAAGGGCAAGGGGTGGAATATAAAGA 804

TAATTAAGCCGAAGTC---CTAACGCGATGGCGAACGG-CCGAGGTGGTCGGAGCCTAAG 6 96 CAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCA - TCGTGGAAAAAGAAGACGTTC 48 9 \°

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l

Uce_0ryza_4

UB19_S ac cha rum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_0ryza_2 UceSS.3

A-Tubulin_Coffea_2 3 5Sd_AMV

TTTCTGGGTTGGGTTTCTAAATTTGTTGGT-CTAAGAACAGTGAAAT-----TGTTGTTT 588

ATATAAGAGCGGGTGACCACGACTGC--------GGCGCGGCGCA---------CCACTC 318

ATA-AACATCATGTTTACTTAACTTTAAAT-TTGTATCGGTTTCTAC-----TATTTTTA4 02

A-ACGGCATCAGCTTTCCACCTCCTCGATA-TCTCCGCGGCGCCGTC-----TGGACCCG66 0

GCACGGCATCCAGGTAAATTGCCTTCTATC - TAACCTCTTATATTTC-----AGATCTGC142 0

TTTCCGAATTTTATTAGTAGTTGCGATATTATTAATACAGGTCTCGT-----AGCGGCCG483

GTCAAGTGTCATCTCCTGACGTGGACTGGAGCTACGGTGAGCCAACCG----AGATGTTA849

TACAAATTTACAATAAATAAAGTTCCTAGATTTTGAACGAAACCAGC-----AGAGCGCA519

GCCGGGATGCGCGTATAAAAACCGGCGAAACCCTTGGCTCTCCTCATT-----CGGCCTAT515

ACAACCAAACACCTGTCAAATTTGCCTAACCTTAGGCGTGGCAAACTG----TGGCAAAG14 77

AGAAAGAAATGGATAAGGGTGTCATTTGGTGTGGGCATATATCCAAC-----CAAAAAGG859

AGACATAGGCGGGACCCCAGCTCTGCCGACCTGGAAATACCCTCCTCA----TATACCAT752

CAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACG 549

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_zea Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Co f fea_l Uce_0ryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_zea

Actin-2_Zea Uce_0ryza_2 UceSS.3

A- Tubulin_Cof f ea_2 35Sd AMV

CAGTGATC- -CCAGATTCT-ACACTCT-AAATTTGTTGGTCTAA-GAA-----------C632

CACCACCA--CCA---CCA-CCACTCC-A--ÇCGATCGGCGAGA-GCG-----------C357

TAATATTT- -TTGTCTCTATAGATACT-ACGTGCAACAGTATAA-TCAA--------CCT450

CCCCCTTT--CCGTTCCTTTCTTTCCT-TCTCGCGTTTGCGTGG-TGGGGACGGACTCCC 716 TGTTTCTC--TCATTTTTGTTCAAGGA-AATGATTCATCTTTGG-TTTGATTTTGGGTGT 1476 CGTCTCCT--CCTCCCTTATATAAAGG-CAGCGTTTCTGCAAGT-TATTACCCAATCTAC 539 TGCGCCGG--TTCCAATGATGGAGAGG-GGATGGGTGAGAGTGG-CGGAGCCTACATTGT 905 CACCGTCC--TTG-CCCCACGGAACAA-GAAAAATGGAATATGC-TCCCGCAGCCCTCGT 574 CACAACCG--CTT-ACTCTCGTGCGCT-CTCCGTGGGAGCGAGG-ACCCGCGGCCG--GC 568 TGTGGCTT--ACAACCAAACACACCCTTAGATAATAAAATGTGG-TCCAAAGCGTAATTC 1534 GACATTTT--GCGGGTATTTGTGAGTGTGTGAGAGAGAGAGCGAGCAGTTTCAGACACAG 917 TACTAGTTAGTAGTCACCACTGCTACTGCTTCAGTTCCTTTTATCACTTGCTTTACATGA 812 CACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGG 609

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Coffea_l

Uce_Oryza_4 UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_0ryza_2

UceSS.3

A-Tabu1in_Co f fea_2

5Sd AMV

A-GTGAAATTGTTGTTTCAGT-GATCCCAG660

G - GGG AGATCGTT - CGACGGC - GGC AAGATGC386

T - ATAATATTTTTGTCTCTATAGATACTACG480

C-AAACCGCCTCTCCCTCTCTTTATTTGTCTATATTCTCACTGGGCCCCACCCACCGCAC 775 T-GTGGAATAGCCTGATGGACAAATGCCGAGCGACCACACCGTCGGAGGCGGAGACGACG 153 5 ACGAGAGAGAGATCGTTCGACGCATATAGAGAGAGAGAGAGATAGGGCAAGATGC594

GCGCATACCGTGTGGGCCGCGGGATAAATACCTCAAGAAGGAAGCGTTGTGGCCTTACCT 965 GGAAACCAAGGGCGGACCTTCCCCTC600

GG CAG CGGC AGCTT C TCCTAGATCTCCGG CATC AT CAGTGG ATCC613

ACTAAAAAAAAAT-CAACGAGACGTGTACCAAACGGAGAGCAACGGCATCTTCTCGAAAT 15 93 AGAGAGGGGTTTGGGATTGGAGGGATTGACGCTGCGTCTCTTCCTCTTCTCTTTCGATCC 977 ATTAAGTCGATGCTCTTCCTTGAATAACTAGCGATTAGTTTCGTGGTGACCTATCTAGCC 872 AGAGGAGATCTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCAC----------------653

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_zea

Uce_Oryza_l A-Tubulin_Coffea_l

Uce_Oryza_4 UB19_Sac charum Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_0ryza_2

UceSS.3

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd_AMV

CCCTGGGCCCACTCACGAGTCCCCCCCTCCCGACCT------------------------811

CTTTCAACACCTTCTTCAGCGAAACCGGAGCCGGCAAACACGTTCCTCGTGCCGTGTTCG 1595

CCAAGAGTTTGTCGATGGAGCCCTTGCGCATATCCTGAACATGTCCAAGGCTCTGGGAGA 1025

TTCCCAACCGCTGGCTGGCCCGCCTCGTCTTCCCGGAAACCGCGGTGGTTTCAGCGTGGC 1653

ATCCCTCATTCCTAATCCTCCAATCCAACCACCTCAGCCCCACACTCACATATACACATG 1037

ATTTTTCTGTTTGGGTGGCATCAATCCTGAACACAGAAAGCTGCAAG-------------919

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubu1in_Coffea_1

Uce_0ryza_4

UBI9_Saccharum

TCGATCTGGAGCCCACTGTCATCGATGAAGTCCGAACCGGCACCTACCGCCAACTCTTCC 1655

GCAGGTTGGAAATGGGAGGCCAGTACTGCCTTACGTGATACATGGGCACTATGCC-----1080

32/36 • · « ··· · · ··· ·♦* * ·♦·

Enolase_Zea

Actin-2_Zea Uce_0ryza_2 UceS8.3

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd_AMV

GGATTCTCCAAGCAGACGGAGACGTCACGGCACGGACTCCTCCCACCACCCAACCGCCA- 1712

TCTCTCTCTATTTCCCTTTTCACTTTCACTTTCATTTCTAGGGTTCCGTTCTGATGGCTC 1097 1 &

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l A-Tubulin_Cof fea_l Uce_Oryza_4 UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_zea Uce_0ryza_2 UceS8.3

A-Tubulin_Coffea_2

35Sd_AMV

ACCCTGAGCAGCTCAT

1671

TTTCCCTTTCAGATCTGAACGCGTATCGTCCCTCCTATGGCTTCAAAGCGCATCCTCAAG 1157

Arabidopsis Uce_Oryza_3 Gos-2_Zea

-25 Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Coffea_i Uae_0ryza_4 UBl9_Saccharum Enolase_Zea

Actin-2_Zea Uce_0ryza_2 UceS8.3 A-Tubulin_Coffea_2 35Sd_AMV

GAGCTCAAGGACCT 1171

A tabela 1 indica identidades relativamente baixas entre os principais promotores constitutivos descritos na literatura e o promotor da presente invenção (uce S8.3). Os promotores foram escolhidos através da maior identidade, de acordo com as buscas no bancos de dados do NCBI (www.ncbi.nlm.mh.gov)

Promotores constitutivos	Organismo	UceS8.3 (Identidade %)
Trealose 6-fosfato sintase de A. thaliana	Arabidopsis thaliana	35,2
Uce_Oryza_3	Oryza sativa	21,4
Gos-2_Zea	Zea mays	24,3
Uce_Oryza_l	Oryza sativa	38,3
A-T ubulin_Coffea_l	Coffea	38,3
Uce_Oryza_4	Oryza sativa	29,4
UBI9Saccharum	Saccharum	41,5
EnolaseZea	Zea mays	31,2
Actin-2_Zea	Zea mays	32,2
UceOryza _2	Oryza sativa	40,6
A-Tubulin_Coffea_2	Coffea	42,7
35Sd AMV	Alfafa mosaic virus	33,1
Tabela 1. Identidade	entre o promotor uceS8.3 de soja e	os diferentes promotores constitutivos

existentes.

33/36 .·:

«* *··· · · · ·· · * ···· ··· * ·« « ··· * · · ······* ···

Α análise foi feita pelo alinhamento múltiplo de seqüências gerado pelo programa CLUSTAL_W e o pareamento pelo programa PAIRWISE.

Exemplo 3

Clonagem da seqüência promotora uceS8.3 do gene da proteína de conjugação à 5 ubiquitina de soja em vetor de plantas (pCAMBIA 1391).

O DNA da bactéria transformada contendo o vetor recombinante, ou seja, o promotor uce de soja clonado no vetor pGEM-T, foi digerido com a enzima de restrição ScoRI. Em geral, foram utilizados 5U de enzima para cada pg de DNA, no tampão OPA (One-Phor-All) da Pharmacia biotech numa concentração final de lx, a 37 °C por 3 horas. '10 A enzima flanqueia o sítio de clonagem no vetor, e o inserto de 1.2 kb purificado com o kit Gene Clean (Bio 101 Systema). O vetor pCAMBIA1391Xc (Figura 4) foi digerido com £coRI, tratado com fosfatase alcalina, CIP (Pharmacia) e purificado com o kit Gene Clean (Bio 101 Systema). O inserto de 1.2 kb foi ligado ao vetor pCAMBIA1391Xc (Figura 4) com T4 DNA ligase. A concentração de DNA (vetor pCAMBIA: promotor uce Al.7) 15 utilizadas no sistema de ligação foi efetuada através de uma razão molar de 1:3. A reação de ligação foi realizada em tampão ligase lx contendo 5U de T4 DNA e o vetor recombinante e/ou de expressão foi usado para transfonnar células competentes de E. coli por eletroporação (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPASPI/EMBRAPA-CENARGEM, 1998. 101. p.). De um total de 693 clones, oito foram 20 selecionados e analisados por PCR, com os primers AD3 e UCE2, para verificar a presença do inserto. Os clones 3 e 8 foram positivos conforme mostra as bandas de 1.2 kb da Figura 5. Para verificar a orientação do inserto, o DNA dos clones 3 e 8 foi obtido por preparação de DNA plasmidial em pequena escala (miniprep - Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^lld ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press) e digerido com 25 Hind III, que corta o inserto na posição 641 - Em geral, foram utilizados 5U de enzima para cada pg de DNA, no tampão OPA (One-Phor-All) da pharmacia biotech numa concentração final de lx, a 37 °C por 3 horas.. O clone uceS8.3 ( uceS refere-se a Ubiquitin conjugating enzyme de soja; o 8.3 ou 8.8 refere-se ao número dos clones positivos obtidos em cada etapa de clonagem. Ο 8 corresponde ao clone número 8 da 30 amplificação inicial do promotor; o 3 e 8 referem-se ao número dos clones obtidos na clonagem do clone 8 no vetor pCAMBIA 139lXc) apresentava o inserto na orientação ‘sense’ e o clone uceS8.8 na orientação ‘antisense’. O vetor pCAMBIA1391Xc foi selecionado para que o fragmento correspondente a extremidade 5’ do gene UCE presente

34/S& ·:· .·. *·: .·..: .: ··: .·. ·······«· · · · • · · « · · ··« ·· · • · · · · ·«· ·· · • ··· · · · ··· ··· · ··· no clone uceS8.3 fosse clonado em fase com a seqüência do gene gusA presente no vetor pCAMBIA 1391Xc.

Exemplo 4

Caracterização funcional da seqüência de DNA promotora do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de soja - uceS8.3.

Para validar o potencial da seqüência de DNA isolada, o vetor contendo a seqüência promotora SEQ ID NO1 foi introduzido em células de A. tumefasciens LBA 4404 por choque térmico. Para essa transformação foi adicionado Ipg de DNA plasmidial (vetor recombinante contendo o promotor da presente invenção) em lOOpL de suspensão de célula 10 competente de, A. tumefaciens LBA 4404, a reação foi incubada no gelo por 30 minutos. As células permaneceram em nitrogênio liquido até a solidificação, e foram transferidas imediatamente para 37°C para então serem incubadas por 5 minutos. Foi adicionado à reação 1 mL de meio YEB (5g de Extrato de Carne, Ig de Extrato de levedura, 5g de Peptona, 5g de Sacarose e 240mg de MgSO, completar o volume com água deionizada para 15 1 litro e ajutar o pH do meio para 6,8), e as células ficaram incubadas por 2 horas a 28°C. A solução foi plaqueada em meio YEB sólido (Meio YEB acrescido de ágar 1,6% p/v). Foi selecionada uma colônia positiva, crescida no meio YEB com o antibiótico de seleção (canamicina). Essas células tranformadas foram utilizadas para a transformação de plantas de A. thaliana-CoÁumbiâ pela técnica de infiltração de botões florais.(adaptações do Clough 20 S.J. & Bent A.F. (1998). Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediateã transformation of A. thaliana. Plant J. 16(6), 735-743). Esta técnica consiste no encharcamento de botões florais de A. thaliana com uma cultura de agrobactéria contendo 50 g/L (w/v) sacarose e 300 pL/L Silwet L-77. Para tai, as plantas de A. thaliana foram submersas de ponta-cabeça, por cinco minutos, na cultura de Agrobacterium transformada 25 com o vetor recombinante da presente invenção, de forma a atingir apenas os botões florais.

Em seguida, as plantas foram cultivadas em casa de vegetação até a coleta de sementes.

As sementes coletadas foram desinfestadas em álcool 70%, por 1 minuto e em hipoclorito de sódio 1% por 15 minutos e lavadas 4 vezes com água estéril. Em seguida, foram semeadas em meio de cultura MS (Murashige, T. & skoog, F. Physiol. Plant., 15: 30 473-497, 1962) contendo higromicina na concentração de 20 pg/ml, visando a seleção de transformantes (Anexo la). As plântulas germinadas e enraizadas foram transferidas para copos com terra estéril e cobertas de forma a preservar a umidade, e transferidas para casa de vegetação (Anexo 1b).

Após algumas semanas, dependendo do desenvolvimento das plantas aclimatadas, cortes de raízes, caules, folhas e botões florais foram realizados e os mesmo foram incubados em solução de X-Gluc preparado de acordo com Brasileiro & Carneiro (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPACENARGEM, 1998. 131. p.), com o objetivo de verificar a indução da expressão do gene gus.

A construção contendo o promotor CaMV35S (Cauliflower Mosaic Vírus 35S promoter) duplicado com seqüência enhancer do AMV (Alfafa Mosaic Vírus) (CaMV35SdAMV) foi capaz de promover a expressão do gene gus, nas (a) folhas, (b) Caule, (c) raiz e (d) botão floral em A. thaliana (Anexo 2 A-D), como o esperado, já que esse promotor tem sido descrito na literatura cientifica como um forte promotor constitutivo. Assim quando comparamos a presente invenção que contém a construção sense do promotor de soja uceS8.3 com CaMV35SdAMV observar-se que o promotor uceS8.3 é uma excelente ferramenta biotecnológica, já que esse promotor também possui uma forte expressão constitutiva promovendo uma grande atividade enzimática da βglucoronidase , (e) nas folhas, (f) caule, (g) raízes e (h) botão floral de Λ thaliana, (Anexo 2 E-H).

A estratégia utilizada na presente invenção para a caracterização funcional das seqüências de DNA, previamente isoladas de soja, foi eficiente para se avaliar o potencial desta seqüência. Os resultados obtidos mostram que a seqüência uceS8.3 é capaz de direcionar a expressão de β-glucoronidase (GUS) em níveis elevados, representando, assim, uma seqüência reguladora com potencial uso constitutivo na produção de plantas geneticamente modificadas.

Com o intuito de se determinar quantitativamente a expressão dirigida pela seqüência de DNA em estudo, foi realizado um ensaio fluorimétrico da atividade específica da enzima β-glucoronidase usando extratos protéicos das plantas de Arabidopsis, contendo as construções com promotor CaMV35S(controle positivo) e o promotor da soja uceS8.3. Para tal, os extratos protéicos foram obtidos de acordo com o Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPACENARGEM, 1998. 133. p) e foram quantificados pelo método de bradford (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEM, 1998. 255. p) e submetidos ao substrato MUG (methyl-umbelliferone-glucoronide) 2mM e, após 30 minutos de reação à 37°C, a atividade fluorimétrica da reação foi determinada

3ó«é ·:* .*. ··: .: .: ··:

········· · · * • · · · · · ··· ·· « • ««·· ··· ·· · • ··· · · · ··· ··* · ··· através do ensaio espectrofotométrico. O cálculo da atividade específica do GUS foi realizado de acordo com Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEM, 1998. 136. p (Figura 6 )

Pode-se observar que a seqüência de DNA contendo a região promotora uceS8.3 é capaz de dirigir a expressão de GUS em folhas em níveis similares ao promotor de plantas comercial mais forte e utilizado atualmente (CaMV35S duplicado com o enhancer do AMV). Além disso, a expressão dirigida por este fragmento em caule e, principalmente em botões florais de plantas de A. thaliana é consideravelmente superior àquela do promotor CaMV35Sd+AMV, tomando o promotor da presente invenção mais adequado para produção de plantas transgênicas expressando genes de interesse nesses tecidos vegetais.

Claims (13)

1/3

REIVINDICAÇÕES:

1. Um gene quimérico caracterizado por compreender:

a) um polinucleotídeo com a sequência conforme descrita em SEQ ID NO l, opcionalmente ligado a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a

b) uma sequência de polinucleotídeo heterólogo de interesse.

2. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a sequência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.

3. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a sequência de polinucleotídeo de interesse poder estar na orientação sense ou antisense.

4. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por as sequências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16 , entre outros.

5. Um vetor recombinante caracterizado por conter um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1.

6. Um vetor recombinante caracterizado por compreender:

a) um polinucleotídeo cuja seqüência compreenda a sequência descrita em SEQ ID NO l, opcionalmente ligado a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a

b) uma sequência de polinucleotídeo heterólogo de interesse; e

c) uma sequência de terminação.

7. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por a sequência de polinucleotídeo de interesse ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.

8. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por a sequência de terminação ser selecionada do grupo consistindo de sinal

Petição 870190098080, de 01/10/2019, pág. 7/13

2/3 de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes.

9. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 6 caracterizado pelo fato de as sequências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16 , entre outros.

10. Uma célula de microganismo transformada caracterizada pelo fato de conter um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9.

11. Método para modificar a expressão de genes em um organismo caracterizado por incorporar estavelmente no genoma do organismo um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

12. Método de acordo com reivindicação 11 caracterizado pelo fato de o organismo ser uma planta.

13. Método para produzir uma planta tendo a expressão de um gene modificada caracterizada pelo fato de compreender as seguintes etapas:

a) transformar uma célula de planta, tecido, órgão ou embrião um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4;

b) selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;

c) regenerar plantas maduras de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b);

Petição 870190098080, de 01/10/2019, pág. 8/13

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d) selecionar plantas maduras da etapa (c) tendo a expressão do gene modificada quando comparada com uma planta não transformada.