DE10224889A1

DE10224889A1 - Verfahren zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen

Info

Publication number: DE10224889A1
Application number: DE10224889A
Authority: DE
Inventors: Gunnar Plesch; Marcus Ebneth
Original assignee: Metanomics GmbH
Current assignee: BASF Metabolome Solutions GmbH
Priority date: 2002-06-04
Filing date: 2002-06-04
Publication date: 2003-12-18
Also published as: NO20044949L; IL165206A; US8030539B2; CA2486392C; AU2003238437A1; EP1513938A1; CA2486392A1; WO2003102198A1; US20070006347A1; IL165206A0

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen. DOLLAR A Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren, transgene Pflanzen sowie die Verwendung dieser transgenen Pflanzen zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen.
Weiterhin betrifft die Erfindung Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren, transgene Pflanzen sowie die Verwendung dieser transgenen Pflanzen zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
Verschiedene Methoden zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sind bekannt (Halford NG, Shewry PR, Br Med Bull 2000; 56(1): 62-73). Ziel ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteilhaften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No: 487-96).
Zudem sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze zum Beispiel gegen Pathogene unzureichend.
Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen kann beispielsweise die Abwehr verstärken. Beispiele sind der Schutz gegen Insektenfraß in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al., Nature 1987, 328, 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des 35SCaMV Promotors (Broglie et al., Science 1991, 254, 1194-1197).
Ferner kann durch die Einführung fremder Gene eine Herbizidresistenz erzielt werden, was die Anbaubedingungen optimiert und Ernteverluste verringert (Ott KH et al., J Mol Biol. 1996; 263(2): 359-368).
Auch kann die Qualität der Erzeugnisse verbessert werden. So kann die Haltbarkeit und Lagerfähigkeit von Ernteerzeugnissen zum Beispiel durch Inaktivierung bestimmter Reifungsgene erhöht werden. Gezeigt wurde dies zum Beispiel an der Tomate durch Inaktivierung der Polygalacturonase (Hamilton AJ et al., Curr Top Microbiol Immunol 1995; 197: 77-89).
Weiterhin können durch das Einführen weiterer Gene vorteilhaft von Stoffwechselgenen in Pflanzen bestimmte Produkte und Nebenprodukte natürlich vorkommender Stoffwechselprozesse für ein breites Spektrum an Industrien, einschließlich der Futtermittel-, Nahrungsmittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie, nutzbar gemacht werden. Zu diesen gemeinsam als "Feinchemikalien" bezeichneten Molekülen gehören beispielsweise Vitamine, Aminosäuren, Kohlenhydrate oder Lipide und Fettsäuren, unter denen eine beispielhafte Klasse die mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Polyunsaturated fatty p cids, PUFAs) sind. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren werden beispielsweise Nahrungsmittel für Kinder zugegeben, um einen höheren Nährwert dieser Nahrungsmittel zu erzeugen. PUFAs haben zum Beispiel einen positiven Einfluss auf den Cholesterinspiegel im Blut von Menschen und eignen sich daher zum Schutz gegen Herzkrankheiten. Fettsäuren und Triglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich.
Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter Gene in Pflanzen ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer Promotoren. Verschiedene pflanzliche Promotoren sind bekannt. Dabei kann zwischen konstitutiven Promotoren, die eine lokal und zeitlich nur wenig beschränkte Expression in verschiedenen Teilen einer Pflanze ermöglichen, und spezifischen Promotoren, die eine Expression nur in bestimmten Teilen oder Zellen einer Pflanze (z. B. Wurzel, Samen, Pollen, Blättern etc.) oder nur zu bestimmten Zeitpunkten der Entwicklung gestatten, unterschieden werden. Konstitutive Promotoren werden vorteilhaft für die Expression sogenannter Selektionsmarker verwendet. Selektionsmarker (z. B. Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene) erlauben es, das Transformationsereignis aus der Vielzahl der nicht transformierten, aber ansonsten identischen pflanzlichen Individuen herauszufiltern.
In allen Fällen ist es notwendig die Expression der zu exprimierenden Gene abhängig von der Aufgabe der Gene gezielt zu steuern. Alle exprimierten Gene in allen Organismen besitzen 5' der kodierenden Sequenz eine Promotorregion. Diese Region ist für den Start der Transkription selbst verantwortlich als auch für die Regulation der Transkription. Diese Regulation findet in der Regel statt durch Bindung von Transkriptionsfaktoren an regulatorische Sequenzen innerhalb der Promotorregion. Promotoren sind in der Regel innerhalb einer Spezies frei portierbar, d. h. man kann einen Promotor von einem Gen verwenden, um die Transkription eines anderen Gens zu steuern. Diese Steuerung des neuen Gens ist dann in der Regel identisch zur Steuerung der originären Gens von dem der Promotor stammt.
Man kann somit mit einem bekannten Promotor, dessen Regulation man kennt, die Expression eines beliebigen Gens in bekannter Weise steuern. Dies gilt nicht mehr generell, sobald man den Promotor in anderen Spezies verwendet. So werden beispielsweise Promotoren aus dem Bakterium Streptomyces nicht oder nur schlecht in dem Bakterium E. coli erkannt. Gleiches gilt für Promotoren tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, die nicht ohne weiteres wechselseitig oder in Mikroorganismen verwendet werden können.
Konstitutive in Pflanzen aktive Promotoren sind bislang relativ selten beschrieben. Zu nennen sind der TR-Doppelpromotor aus Agrobacterium tumefaciens, die Promotoren der vakuolären ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) sowie der Ppc1 Promotor aus Mesembryanthemum crystallinum (Cushman et al. (1993) Plant Mol Biol 21: 561-566).
Die derzeit in Pflanzen überwiegend verwendeten konstitutiven Promotoren sind fast ausschließlich viralen oder bakteriellen Ursprungs beispielsweise aus Agrobacterium. Dabei handelt es sich im einzelnen um den Nopalinsynthase (nos) Promotor [Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846], den Mannopinsynthase (mas) promotor [Comai et al. (1990) Plant Mol Biol 15 (3): 373-381] und den Octopinsynthase (ocs) Promotor [Leisner and Gelvin (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553-2557] aus Agrobacterium tumefaciens oder der CaMV35S Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus (US 5,352,605). Dieser ist der am häufigsten verwendete Promotor in Expressionssystemen mit ubiquitärer und andauernder Expression [Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527-538; Benfey et al. (1990) EMBO J 9(69): 1677-1684; US 5,612,472]. Der häufig als konstitutiver Promoter angewandte CaMV 35S Promotor zeigt jedoch Variationen in der Aktivität in unterschiedlichen Pflanzen und in unterschiedlichen Geweben derselben Pflanze [Atanassova et al. (1998) Plant Mol Biol 37: 275-85; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527-538; Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-646; Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907]. Ein weiterer Nachteil des 35S Promotors ist, das er beispielsweise bei einer Infektion mit dem Blumenkohlmosaikvirus und seinen typischen pathogenen Varianten die Expression des Transgens verändert wird. So sind Pflanzen, die das BAR Gen (Bialaphos- Resistenzgen, Alanylalanylphosphinothricin) unter der Kontrolle des 35S Promotors exprimieren nicht mehr resistent nach Infektion mit dem Virus, der in der Natur typischerweise vorkommt [Al-Kaff et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 995-99].
Als Alternative zum CaMV 35S Promotor aus dem Bereich viraler Promotoren wurde der Sugarcane bacilliform badnavirus (ScBV) beschrieben [Schenk et al. (1999) Plant Mol Biol 39(6): 1221-1230], der ein dem CamV ähnliches Expressionsmuster vermittelt. Die Aktivität des ScBV Promotors wurde in transienten Expressionsanalysen mit verschiedenen zweikeimblättrigen Pflanzen, darunter Nicotiana tabacum und N. benthamiana, Sonnenblume und Raps, und einkeimblättrigen Pflanzen, wie Banane, Mais und Hirse, analysiert. In den transienten Analysen in Mais war das ScBV Promotor vermittelte Expressionsniveau vergleichbar mit dem des Ubiquitin-Promotors aus Mais (s. unten). Weiterhin wurde die ScBV Promotor-vermittelte Expressionsrate in transgenen Bananen- und Tabakpflanzen getestet und zeigte in beiden Pflanzenspezies im wesentlichen konstitutive Expression.
Als gängige Promotoren zur Expression von Selektionsmarkern in Pflanzen werden vor allem der nos-Promotor, aber auch der mas- und ocs-Promotor verwendet, die allesamt aus Agrobacterium- Stämmen isoliert wurden.
Der Verwendung viraler Sequenzen wird seitens des Verbrauchers oft mit großem Vorbehalt begegnet. Diese Bedenken werden nicht zuletzt durch Untersuchungen genährt, die die Sicherheit des 35S CaMV Promotors - aufgrund eines möglichen horizontalen Gentransfers bedingt durch einen Rekombinations-"Hot Spot" - in Frage stellen [Ho MW et al. (1999) Microbial Ecology in Health and Disease 11: 194-197; Cummins J et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 363]. Ein Ziel künftiger biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist daher der Ersatz viraler genetischer Elemente durch regulatorische pflanzliche Elemente, um so nah wie möglich am pflanzlichen System zu bleiben.
Aufgrund der herrschenden Bedenken hinsichtlich viraler Promotoren gibt es umfangreiche Bemühungen, diese durch pflanzliche Promotoren zu ersetzen. Ein den viralen Elementen vergleichbarer Promotor pflanzlicher Herkunft ist bislang jedoch noch nicht beschrieben worden.
Beschrieben wurde ein pflanzlicher Ubiquitin-Promotor aus Arabidopsis thaliana [Callis et al. (1990) J Biol Chem 265: 12486-12493; Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-747]. Eigene Untersuchungen zeigten jedoch, dass der Arabidopsis Ubiquitin Promotor für die Expression von Selektionsmarkergenen ungeeignet ist.
Von Christensen et al. wurden mit den beiden Mais-Ubiquitin Promotoren Ubi-1 und Ubi-2 weitere Promotoren beschrieben, die neben einer konstitutiven Grundexpression eine Hitzeinduzierbarkeit zeigen (US 5,510,474; US 6,020,190 und US 6,054574). Das Expressionsmuster der beiden Promotoren Ubi-1 und Ubi-2 aus Mais wird in Plant. Mol. Biol., (1992), 18(4): 675-689 beschrieben. Während der Ubi-1 Promotor in Mais und anderen monokotylen Pflanzen gute Expressionsaktivität aufweist, zeigt er in der dikotylen Tabakpflanzen nur 10% der Aktivität, die in vergleichbaren Experimenten mit dem viralen 35S Promotor erzielt worden waren. Der Mais Ubi-1 Promotor ist damit für die Überexpression von Genen in monokotylen Pflanzensystemen geeignet. Er ist darüber hinaus auch hinreichend stark genug, um eine Herbizid- Resistenz durch Expression von Selektionsmarkern zu vermitteln [Christensen and Quail (1996) Transgenic Res 5(3): 213-218]. Für dikotyle Expressionssysteme erwies sich der Ubi-1 promotor jedoch als ungeeignet.
In WO 01/18220 wird ein Ubiquitin Regulatorsystem beschrieben, dem die Heatshock-Elemente fehlen, das heißt, dass nicht mehr hitzeinduzierbar ist. Diese Regulatorsystem wurde ausgehend von dem Mais Ubi-Promotorsystem durch entfernen der hitzeinduzierbaren Elemente entwickelt.
Ubiquitine sind omnipresente Proteine, die in allen bisher analysierten Eukaryonten gefunden wurden. So werden von Kawalleck et al. [Plant Molecular Biology, 21, 1993: 673-684] zwei Petersilie (Petroselinum crispum) Ubiquitine ubi4-1 und ubi4-2 beschrieben. Von ubi4-2 konnte der Promotor isoliert werden. Unter den von Kawalleck et al. untersuchten Bedingungen konnte keine Hitzeinduzierbarkeit von ubi4-1 und ubi4-2 gezeigt werden.
Ein Vergleich der Organspezifität und Stärke verschiedener konstitutiver Promotoren wurde von Holtorf [Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29(4): 637-6469] anhand stabil transformierter Arabidopsis-Pflanzen durchgeführt. Die Studie umfasste u. a. den CaMV35S-Promotor, den blattspezifischen Thionin-Promotor aus Gerste und den Arabidopsis Ubiquitin-Promotor (UBQ1). Die höchste Expressionsrate zeigte der CaMV35S-Promotor. Anhand der Verwendung eines zusätzlichen translationalen Enhancers (TMV omega element) konnte die Expressionsrate des Promotors bei unveränderter Organspezifität um das Zwei- bis Dreifache gesteigert werden. Der blattspezifische Thionin-Promotor aus Gerste war in der Mehrzahl der transformierten Linien inaktiv, während der UBQ1 Promotor aus Arabidopsis mittlere Expressionsraten ergab.
McElroy und Mitarbeiter berichteten von einem auf dem Reis Actin 1 (Act1) Promotor basierenden Konstrukt zur Transformation monokotyler Pflanzen [McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231: 150-1609]. Insgesamt wurde aus den zuvor beschriebenen Untersuchungen geschlussfolgert, dass die auf dem Act1-Promotor basierenden Expressionsvektoren dazu geeignet sind, eine hinreichend starke und konstitutive Expression von Fremd-DNA in transformierten Zellen monokotyler Pflanzen zu steuern.
Als konstitutiver Promotor ist ferner der Promotor einer S-Adenosyl-L-Methionin Synthetase beschrieben (WO 00/37662). Nachteilig ist hier vor allem eine Abhängigkeit der Expressionsstärke von der Methioninkonzentration.
WO 99/31258 beschreibt chimäre, konstitutive pflanzliche Promotoren, die sich aus verschiedenen Elementen verschiedener Promotoren mit komplementären Expressionsmustern zusammensetzen, so dass die Kombination einzelner Gewebespezifitäten additiv zu einem konstitutiven Expressionsmuster führt. Dies ist ein sehr aufwendiges Verfahren zur Herstellung von scheinbar konstitutiven Promotoren.
Weiterhin sind Promotoren mit Spezifitäten für die Antheren, Ovarien, Blüten, Blätter, Stengel, Wurzeln und Samen beschrieben worden. Die Stringenz der Spezifität, als auch die Expressionsaktivität dieser Promotoren ist sehr unterschiedlich. Zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten, wie der Promotor der zytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase), der ST-LSI Promotor aus Kartoffel [Stockhaus et al. (1989) EMBO J 8: 2445-2245], der vorwiegend blattspezifische Ferredoxin NADPH Oxidoreduktase-Promotor (FNR-Promotor), der ein lichtinduzierbares Element besitzt [Oelmüller et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 237: 261-72] oder der blattspezifische Promotor des Triose-Phosphat-Translokators (TPT).
Weitere Promotoren sind beispielsweise Promotoren mit Spezifität für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruchtreifungsspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifungspezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794), blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen-Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593).
Ein entwicklungsabhängig regulierter Promotors ist unter anderem bei Baerson et al. beschrieben (Baerson SR, Lamppa GK (1993) Plant Mol Biol 22(2): 255-67).
Es sind Promotoren beschrieben mit Gewebespezifität für das Mesophyll und die Pallisadenzellen in Blättern (Broglie et al. (1984) Science 234: 838-845), den sich teilenden Spross und das Wurzelmeristem [Atanassova et al. (1992) Plant J 2: 291-300], Pollen [Guerrero et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 161-168], Samenendosperm [Stalberg et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 671-6839, Wurzelepidermis [Suzuki et al. (1993) Plant Mol Biol 21: 109-119], sowie für das Wurzelmeristem, Wurzelgefäßgewebe und Wurzelknötchen [Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2: 633-641].
Bekannt sind ferner Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins [US 5,504,200, Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1(9): 839-53], des 25 Albumingens [Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201], des Legumins [Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331], des USP [unknown seed protein; Bäumlein H et al. (1991) Molecular & General Genetics 225(3): 459-67] des Napin Gens [Stalberg K, et al. (1996) Planta 199: 515-519], des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor [Bäumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225: 121-128]. Diese steuern eine samenspezifische Expression von Speicherproteinen.
Viele der vorgenannten Promotoren zeigen neben der Haupaktivität noch sogenannte Nebenaktivitäten in anderen Geweben.
Aufgrund des gewebeabhängigen Expressionsmusters sind die vorgenannten gewebespezifischen Promotoren schlecht geeignet für die Expression von Selektionsmarkern. Hier ist eine Selektion in möglichst allen Gewebeteilen erforderlich, um eine effiziente Selektion zu gewährleisten.
Die im Stand der Technik beschriebenen, sogenannten "konstitutiven" Promotoren weisen einen oder mehrere der nachfolgenden Nachteile auf:

1. Mangelhafte Homogenität der Expression

Die bekannten, sogenannten "konstitutiven" Promotoren zeigen vielfach eine unterschiedliche Expressionshöhe je nach Gewebe- oder Zelltyp. Zudem ist die Expressionseigenschaft oft stark von dem Insertionsort des Wirtsgenoms abhängig. Dies zeigt, dass die durch heterologe Expression zu erzielenden Effekte nicht in dem gleichen Ausmaß homogen in der Pflanze erreicht werden können. Es kann zu Unter- oder Überdosierungen kommen. Dies kann sich nachteilig auf das Pflanzenwachstum oder den Pflanzenwert auswirken.

2. Mangelhaftes Zeitprofil

Die im Stand der Technik bekannten sogenannten "konstitutiven" Promotoren zeigen oft eine nicht konsistente Aktivität während der Entwicklung eines Gewebes. Damit können zum Beispiel in der frühen Phase der somatischen Embryogenese keine wünschenswerten Effekte (wie Selektion) erzielt werden, was gerade hier - aufgrund der Empfindlichkeit des Embryos gegen in vitro Bedingungen und Stressfaktoren - vorteilhaft wäre.

3. Mangelnde Anwendbarkeit auf viele Pflanzenarten

Die im Stand der Technik beschriebenen sogenannten "konstitutiven" Promotoren sind oft nicht in allen Arten in gleicher Weise aktiv.

4. Gene Silencing

Beim Vorliegen mehrerer Expressionskassetten mit jeweils dem gleichen "konstitutiven" Promotor in einem Organismus kann es zu Wechselwirkungen zwischen denselben und sogar zum Abschalten ("Gene Silencing") einzelner Expressionskassetten kommen [Mette et al. (1999) EMBO J 18: 241-248].

5. Virale und bakterielle Promotoren

Promotoren viralen Ursprungs können durch Virusinfektionen der transgenen Pflanze beeinflusst werden und die gewünschte Eigenschaft dann nicht mehr ausprägen [Al-Kaff et al. (2000) Natur Biotechnology 18: 995-99].
Die öffentliche Akzeptanz gegenüber der Verwendung von Promotoren und Elementen aus pflanzlichen Systemen ist höher als bei viralen Systemen.
Die Zahl der für die Expression von Selektionsmarkern in Pflanzen geeigneten Promotoren ist gering und sie sind gewöhnlicher Weise viralen oder bakteriellen Ursprungs.
Ein idealer konstitutiver Promotor sollte möglichst zahlreiche der nachfolgenden Eigenschaften haben:

a) Möglichst homogene lokale und zeitliche Genexpression d. h. eine Expression in möglichst vielen Zelltypen oder Geweben eines Organismus während der verschiedenen Phasen des Entwicklungszyklus. Eine wünschenswerte Expression sollte schon im Embryonalstadium erfolgen. Gewünscht wird ferner eine effiziente Selektion in dedifferenzierten Zellen (verschiedenen Kallus-Phasen) aus einer Gewebekultur und weiteren Entwicklungsstadien, die für die Gewebekultur geeignet sind.
b) Möglichst breite Anwendbarkeit auf verschiedene Pflanzenarten bzw. Anwendbarkeit auf Arten, in denen mit den bisher bekannten "konstitutiven" Promotoren keine Expression erreicht werden kann.
c) Um eine Kombination von mehreren Transgenen in einer Pflanze zu realisieren, ist es wünschenswert, mehrere Transformationen hintereinander zu schalten oder Konstrukte mit mehreren Promotor-Kassetten zu verwenden, ohne dass durch die mehrmalige Verwendung identischer regulatorischer Sequenzen Silencing-Effekte erzeugt werden.
d) Einen pflanzlichen Ursprung zur Vermeidung von Akzeptanzproblemen beim Konsumenten und eventuellen zukünftigen Zulassungsproblemen.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand daher in der Bereitstellung eines Verfahrens zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen unter der Kontrolle eines pflanzlichen Promotors, der möglichst viele der oben genannten Eigenschaften erfüllt, vor allem eine ubiquitäre und entwicklungsunabhängige (konstitutive) Expression einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz - vorteilhaft kodierend für einen Selektionsmarker - vermittelt. Weiterhin bestand die Aufgabe darin ein Nukleinsäurekonstrukt für das Expressionsverfahren zur Verfügung zu stellen, das ein möglichst breite Expression der exprimierten Nukleinsäure in verschiedenen pflanzlichen Geweben einer Pflanzenart ermöglicht und breit in verschiedenen Pflanzen anwendbar ist.
Diese Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen unter der Kontrolle eines Petersilie-Ubiquitin-Promotors gelöst, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) Verknüpfung der zu exprimierenden Nukleinsäure mit einem Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder
b) einem funktionellen Äquivalent oder äquivalenten Fragment, das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie a) besitzt und
c) Einbringen des Nukleinsäurekonstrukts in eine Pflanze, das aus der zu exprimierenden Nukleinsäure, die unter der Kontrolle der 5'-Region des unter a) oder b) genannten Promotors liegt, und dem Promotor gebildet wird, unter Bedingungen die die stabile Integration der Nukleinsäure in das Pflanzengenom ermöglicht.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren zu exprimierende Nukleinsäure kann vorteilhaft mit weiteren regulatorischen Sequenzen funktionell verknüpft sein.
Expression im Sinne des Verfahrens umfasst die Transkription der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz, kann aber - im Falle eines offenen Leserasters in "sense"-Orientierung - auch die Translation der transkribierten RNA der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in ein korrespondierendes Polypeptid umfassen.
Eine Promotoraktivität wird im wesentlichen als gleich bezeichnet, wenn sich die Transkription/Translation beispielsweise des im folgenden beschriebenen GUS-Gens [= β-Glucuronidasegen, uidA, Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. V. (1987) GUS fusions: β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907; Martin, T., Wöhner, R. V., Hummel, S., Willmitzer, L., Frommer, W. B. (1992) The GUS reporter system as a tool to study plant gene expression. In: Gallagher (Hrsg.): GUS Protocols: Using the GUS gene as a reporter of gene expresion. Academic Press, 23-43] um nicht mehr als 50%, vorteilhaft um nicht mehr als 40%, bevorzugt um nicht mehr als 30%, besonders vorteilhaft um nicht mehr als 20%, ganz besonders vorteilhaft um nicht mehr als 10% von einem Vergleichswert, der mit dem unter SEQ ID NO: 1 ermittelt wurde, unterscheidet.
Dabei kann die Expressionshöhe sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Vergleichswert abweichen.
Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50, bevorzugt 25%, besonders bevorzugt 10% von einem Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1 beschriebenen Promotor unterscheidet. Bevorzugt ist ferner als Vergleichswert die Expressionshöhe erhalten mit einer beliebigen, aber bestimmten Nukleinsäuresequenz, bevorzugt solchen Nukleinsäuresequenzen, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren. Vorteilhaft werden dabei Reporter- Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997), die Chloramphenicoltransferase oder eine Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414) oder die β-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) verwendet.
Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete vorgenannte Petersilie-Ubiquitin-Promotor zeigte im Nukleinsäurekonstrukt eine vorteilhafte starke Expression der exprimierten Nukleinsäuren in nahezu allen pflanzlichen Geweben, einschließlich dem der Samen. Vorteilhafterweise führt das erfindungsgemäße Verfahren zu einer stabilen starken Expression der Nukleinsäuren in einer sehr großen Zahl an Individuen. Das heißt die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimierte Nukleinsäure bzw. die exprimierten Nukleinsäuren (der Singular soll für die Anmeldung den Plural und umgekehrt umfassen) wird/werden sehr gleichmäßig innerhalb der transgenen Pflanzen unabhängig von ihrem Insertionsort und unabhängig vom Gewebe exprimiert. Das sogenannte Gene Silencing bei dem die zu exprimierenden Nukleinsäuren bzw. Gene durch Interaktionen im Genom des Wirtsorganismus im Falle des vorliegenden Verfahrens innerhalb der transgenen Pflanze in ihrer Expressionsaktivität herunterreguliert oder sogar ganz abgeschaltet werden, tritt nicht oder nur sehr unwesentlich auf. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird damit eine starke Expression der Nukleinsäuren in mindestens 60%, vorteilhaft mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% der im Verfahren erzeugten transgenen Pflanzen erreicht. Das Verfahren bzw. das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt ist damit unempflindlich gegenüber epigenetischen Einflüssen. Fig. 2 zeigt diese vorteilhafte Eigenschaft des erfindungsgemäßen Verfahrens an der GUS-Färbung von Blättern transgener C24 Arabidopsis Pflanzen, die das GUS-Gen (= β-Glucoronidase-Gen, uidA) unter Kontrolle des PcUbi4-2 Promotors aus P. crispum wieder. Es wurden 48 unabhängige T1-Linien untersucht. Fig. 1 ist der Aufbau eines vorteilhaft verwendeten Vektors zu entnehmen. Ein Vergleich mit dem Stand der Technik, bei dem das GUS-Gen hinter den d35S-Promotor geschaltet wurde, ist Fig. 3 zu entnehmen. Es zeigen sich deutlich die vorteilhaften Eigenschaften des Verfahrens. Fig. 3 gibt die GUS-Färbung von Blättern transgener C24 Arabidopsis Pflanzen enthaltenden das GUS-Gen unter Kontrolle des d35S-Promotors wieder. Es wurden ebenfalls 48 unabhängige T1-Linien untersucht. Der d35S-Promotor zeigte außerdem noch eine unterschiedliche Expressionsstärke innerhalb eines Blattes einer Pflanze, das heißt er zeigt eine mosaikartige Expression abhängig von der verschiedenen Situation innerhalb eines Blattes einer Pflanze. Dem gegenüber ist das Expressionsverhalten unter Kontrolle des PcUbi4-2 Promotors innerhalb eines Blattes einer Pflanze sehr homogen, das heißt es zeigt sich keine mosaikartige Expression. Das Verfahren ermöglicht damit die starke gleichmäßige Expression von Genen in stabil transformierten Pflanzen.
Unter gleichmäßig starker Expression im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass innerhalb eines pflanzlichen Gewebes mindestens 60%, vorteilhaft mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, der Zellen eines Gewebes eine Expression der Nukleinsäure aufweisen.
Neben der starken Expression im Blatt wird im erfindungsgemäßen Verfahren auch in anderen Geweben eine starke Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren erreicht. So wird ebenfalls eine starke Expression in der Knospe, in der Blüte, in der Wurzel, im Stengel und im Samen erreicht. Fig. 4 gibt die Expression einer transgenen C24 Arabidopsis Pflanze, die das GUS-Gen unter Kontrolle des Pc-Ubi4-2 Promotors aus P. crispum enthält, in der Knospe wieder. Die dunkelgrauen Bereiche zeigen die Expression der β-Glucoronidase. In Fig. 5 wird die GUS- Färbung der Blüte einer transgenen C24 Arabidopsis Pflanze, die das GUS-Gen unter Kontrolle des Pc-Ubi4-2 Promotors aus P. crispum enthält, wiedergegeben. Die dunkelgrauen Bereiche sind auf die enzymatische Aktivität der exprimierten β-Glucoronidase zurückzuführen. Auch in der Wurzel ist eine starke Expression in transgenen C24 Arabidopsis Pflanzen, die das GUS-Gen unter Kontrolle des Pc-Ubi4-2 Promotors aus P. crispum enthalten, zu beobachten, wie Fig. 6 zu entnehmen ist. Auch hier geben die dunkelgrauen Bereiche die Aktivität der β-Glucoronidase wieder. Gleiches gilt auch für die Expression in Samen wie Fig. 7 zu entnehmen ist. Fig. 7 zeigt die GUS-Färbung von Samen transgener C24 Arabidopsis Pflanzen, die das GUS-Gen unter Kontrolle des Pc-Ubi4-2 Promotors aus P. crispum (mitte und rechts) oder unter Kontrolle des d35S-Promotors (links) enthalten. Der dunkelgraue Überstand spiegelt die β-Glucoronidase-Aktivität wieder. Es ist klar zu erkennen, das der Pc-Ubi4-2 Promotor eine stärkere Aktivität im Samen aufweist, als der d35S-Promotor.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird damit eine starke Expression der verwendeten Nukleinsäuren in fast allen transgenen Pflanzen erreicht. Außerdem erfolgt diese starke Expression vorteilhaft in allen untersuchten pflanzlichen Geweben. Das Verfahren und die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte sind daher vorteilhaft zur Expression einer praktisch unbegrenzten Zahl von Genen in Pflanzen wie monokotyle oder dikotyle Pflanzen vorteilhaft dikotyle Pflanzen geeignet. Vorteilhaft können Selektionsgene unter Kontrolle des vorteilhaften Promotors im Verfahren exprimiert werden. Die Expression erfolgt vorteilhaft konstitutiv, eine Induktion über beispielsweise eine Hitzeeinwirkung ist jedoch denkbar. Fig. 8 gibt die für die Funktion des Promotors wichtigen Elemente wie ein mögliches putatives Hitzeschock induzierbares Element (= HSE, Position 534-547) wieder. Dies kann die Expression noch verstärken. Das HSE liegt innerhalb des Intron-Bereiches. Dieses Hitzeschock induzierbare Element stimmt nicht mit den von Mycogen angegebenen Consensus- Sequenzen 5'-CTNGAANNTTCNAG-3' bzw. CTGGAATNTTCTAGA-3' (US 5,510,474) oder mit dem von Drosophila (US 6.054,574, Spalte 18, Zeile 59-64) überein und wurde bei einer Promtoranalyse auf pflanzliche cis-aktive Elemente mit der Internetseite PLACE nicht als HSE erkannt. Außerdem befindet sich das Intron im Unterschied zu den in den Mycogen-Patenten annotierten HSE im Intron und nicht wie von Mycogen beschrieben 5'relativ und damit upstream zum Intron.
Fig. 8 sind außerdem folgende weitere Elemente zu entnehmen, die mit dem von Higo et al. [(1999) Plant cis-acting regulatory DNA elements (PLACE) database: 1999, Nucl. Acid. Res., Vol. 27, No. 1, 297-300] gefunden wurden:

a) Zwei CAAACAC-Elemente, Position 264 bis 270 und 716 (Gegenstrang), konserviert in vielen Speicherproteinpromotoren, notwendig für die Expression des napA-Promotors in Samen [Stalberg K, Ellerstom M, Ezcurra I, Ablov S, Rask L Disruption of an overlapping E-box/ABRE motif abolished high transcription of the napA storage-protein promoter in transgenic Brassica napus seeds. Planta 199: 515-519 (1996)]
b) Zwei AACAAAC-Elemente, Position 140 bis 146 und 461 (Gegenstrang), wichtig für endosperm-spezifische Expression [Wu C, Washida H, Onodera Y, Harada K, Takaiwa F Quantitative nature of the Prolamin-box, ACGT and AACA motifs in a rice glutelin gene promoter: minimal cis-element requirements for endosperm-specific gene expression Plant J 23: 415-421 (2000)]
c) Eine TATA-Box (TATATATA) im Bereich 291 bis 297 und damit im erwarteten Abstand zum Transkriptionsstart bei Position 237. [Joshi CP. An inspection of the domain between putative TATA box and translation start site in 79 plant genes. Nucleic Acids Research. 15(16): 6643-53, 1987 Aug 25.]

Die unter a) bis c) genannten Elemente sind in Fig. 8 durch Boxen markiert, wobei die AACAAAC- und CAAACAC-Boxen des Gegenstranges extra hervorgehoben sind. Der Transkriptionsstart ist mit einem Pfeil markiert. Außerdem enthält der Promotor unmittelbar vor dem Translationsstart ein Intron (Position 396 bis 982, siehe Fig. 8). Auf das Intron folgt (nicht angegeben) unmittelbar das Startkodon ATG.
Mit dem Programm wurden außerdem folgende weitere putative Elemente des Promotors identifiziert:
Insgesamt vier ACGTA-Boxen (Positionen 214, 674, 692, 880) wichtig u. a. auch für Zuckerrepression und die Expression in Samen. Abzisinsäure-responsives Element (227) [Hattori T, Totsuka M, Hobo T, Kagaya Y, Yamamoto-Toyoda A Experimentally Determined Sequence Requirement of ACGT-Containing Abscisic Acid Response Element Plant Cell Physiol 43: 136-140 (2002)]; Mehrere "Amylase- Boxen", Positionen 139, 421 (Gegenstrang), 462 (Gegenstrang), 789 (Gegenstrang) und 871 (Gegenstrang) [Huang N, Sutliff TD, Litts JC, Rodriguez RL Classification and characterization of the rice alpha-amylase multigene family. Plant Mol Biol 14: 655-668 (1990)]; Ein CACGTG-Motif in Position 565, u. a. in lichtregulierten Promotoren vorhanden [Menkens AE, Schindler U, Cashmore AR The G-box: a ubiquitous regulatory DNA element in plants bound by the GBF family of bzip proteins Trends in Biochemistry 20: 506-510 (1995)]; Insgesamt 16 GATA-Boxen, beteiligt an starker lichtabhängiger Expression [Gilmartin PM, Sarokin L, Memelink J, Chua N-H Molecular light switches for plant genes. Plant Cell 2: 369-378 (1990)]; 5 GT1-Consensus-Bindestellen (GRWAAW), die in vielen lichtregulierten Genen vorhanden sind, finden sich in Position 395, sowie auf dem Gegenstrang die Positionen 52, 387, 504 und 647 [Villain P, Mache R, Zhou DX The mechanism of GT element-mediated cell type-specific transcriptional control. J Biol Chem 271: 32593-32598 (1996)]; Eine Ibox (GATAAG) findet sich in Position 474 auf dem Gegenstrang. Dabei handelt es sich um ein konserviertes Element in lichtregulierten Promotoren [Rose A, Meier I, Wienand U The tamato Ibox binding factor LeMYBI is a member of a novel RT class of Myb-like proteins Plant J 20: 641-652 (1999)]; Ein LTRE (lowtemperature-responsive element), CCGAAA, findet sich in Position 632 [Dunn MA, White AJ, Vural S, Hughes MA Identification of promoter elements in a lowtemperature-responsive gene (blt4.9) from barley (Hordeum RT vulgare L.) Plant Mol Biol 38: 551-564 (1998)]; Mehrere Bindestellen für verschiedene Klassen von myb-Transkriptionsfaktoren [Jin H. Martin C. Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene family. Plant Molecular Biology. 41(5): 577-85, 1999 Nov.]; Mehrere W-Box-Bindungsstellen (549, 61, 550, 919), welche durch WRKY-Transkriptionsfaktoren gebunden werden. Die Faktoren sind an unterschiedlichen physiologischen Prozessen, wie Pathogenabwehr, Seneszens und Trichombildung beteiligt [Eulgem T, Rushton PJ, Robatzek S, Somssich IE RT The WRKY superfamily of plant transcription factors RL Trends Plant Sci (2000) 5: 199-206].
Für die Funktion des Promotors ist die angegebene TATA-Box (siehe Fig. 8) wesentlich. Sie sollte vorteilhaft in einem Bereich von -20 bis -50, bevorzugt von -25 bis -35, zum Transkriptionsstart liegen.
Ein Sequenzvergleich zwischen PcUbi4-2 und den Ubi-Promotor aus Mais zeigt, dass die Gene von Mais und P. crispum auf Nucleotidebene zu 66,1% identisch sind, während die Promotoren zu 26% identisch sind, das heißt es besteht für AT-reiche Promotoren keine signifikante Identität (Gap opening penalty 15, Gap extension penalty 6,66) [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410, Altschul et al., 1997, Nucl. Acid Res., 25: 3389-3402]. In Blast werden die Promotoren gegenseitig nicht gefunden.
Der im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft verwendete Ubiquitin-Promotor erwies sich als hinreichend stark, um Nukleinsäuresequenzen insbesondere Selektionsmarkergene in Dikotyledonen und Monokotyledonen erfolgreich stabil integriert im Genom der Pflanze zu exprimieren. Dies ist umso überraschender als sich der Arabidopsis thaliana Ubiquitin-Promotor [Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-646] als nicht geeignet erwies.
Dieser vorteilhaft verwendete Ubiquitin-Promotor kann mit Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, weiter für seine Aufgabe optimiert werden. Der Fachmann kann über den in den Beispielen gegebenen Assay mit Hilfe der β-Glucuronidase leicht verbesserte Mutanten des Promotors isolieren.
Mutationen umfassen dabei Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation des Ubiquitin-Promotors gemäß SEQ ID NO: 1 erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen essentiellen Promotor-Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein.
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid- Primer kommen.
Funktionelle Äquivalente oder funktionelle Fragmente, abgeleitet von SEQ ID NO: 1 zum Beispiel durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 30%, bevorzugt 50%, vorzugsweise mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, und zeichnen sich durch im wesentlichen gleiche Eigenschaften wie der Petersilie Ubiquitin Promotor gemäß SEG ID NO: 1 aus.
Diese funktionellen Äquivalente lassen sich künstlich erzeugen oder aber aus verschiedenen Organismen wie Pflanzen durch Homologievergleiche und biochemische Tests isolieren.
Alternativ können nicht-essentielle Sequenzen des Petersilie Promotors deletiert werden ohne die Promotor Eigenschaft wesentlich zu beeinträchtigen. Derartige Deletionsvarianten stellen funktionell äquivalente Teile des Promoters beschrieben durch SEQ ID NO: 1 dar.
Vorteilhaft werden im erfindungsgemäßen Verfahren zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen verwendet, die für ein Gen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Selektionsmarker, einem Reportergen, einem RNAi-Konstrukt, einem Enzym, einem Protein das Insekten-, Virus-, Bakterien-, Pilz- oder Nematodenresistenz vermittelt, einer Nukleinsäuresequenz oder einem Protein, das Trocken-, Kälte-, Hitze- oder Salzresistenz in Pflanzen vermittelt, einem Inhibitor, einem Lektin, einer RNAase, einem Ribozym, einem Antikörper, einem Vaccin, einem Pharmazeutikum, einem "antifreezing"-Protein, einem Cytochrom P-450-Protein, einem Transkriptions-Aktivator oder -Repressor oder einem Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist, codieren.
Bevorzugt ist das Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist, ein Protein aus dem Fettsäurestoffwechsel, dem Aminosäurestoffwechsel, dem Vitamin-Stoffwechsel, dem Carotinoidstoffwechsel oder dem Kohlenhydratstoffwechsel.
Sollen neben den vorgenannten Genen weitere Gene bzw. Nukleinsäuren im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden, so können diese ebenfalls unter der Kontrolle des Ubiquitin- Promotors aus Petersilie exprimiert werden, oder aber vorteilhaft unter Kontrolle weiterer Promotoren. Diese können konstitutiv, induzierbar und/oder gewebespezifisch sein.
Die im Verfahren zu exprimierende Nukleinsäure kann in sense oder antisense-Richtung oder sense- und antisense-Richtung (= dsRNAi) zum Promotor orientiert sein und damit exprimiert werden.
Vorteilhaft wird das im Verfahren verwendete Nukleinsäurekonstrukt zwischen zwei T-DNA-Abschnitte inseriert. Dies erleichtert die stabile Integration ins Pflanzengenom.
Bei der im Verfahren verwendeten transgenen Pflanze handelt es sich um eine monokotyle oder dikotyle Pflanze, vorteilhaft um eine dikotyle Pflanze.
Als monokotyle Pflanzen seien beispielsweise Monokotyledonen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Reis, Triticale, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Ryegras oder Hirse genannt.
Als dikotyle Pflanzen seien beispielsweise Dikotyledonen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Raps, Nachtkerze, Canola, Erdnuss, Königskerze, Distel, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Wildrosen, Kürbis, Pistazien, Sesam, Lein, Sonnenblume, Färberdistel, Soja, Borretsch, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Zuckerrübe, Tomate, Kartoffel, Tabak, Karotte, Pappel, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Aubergine, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss oder Arabidopsis genannt.
Wie oben genannt, können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren konstitutiv oder induzierbar exprimiert werden. Eine konstitutive Expression ist bevorzugt.
Werden im Verfahren beispielsweise Feinchemikalien hergestellt, so können die durch die Expression der Nukleinsäuren in den transgenen Pflanzen entstandenen Produkte nach Kultivierung der Pflanzen aus diesen isoliert werden. Dabei können die Produkte aus Kalluskulturen, aus Fermentationskulturen oder aus kultivierten und geernteten Pflanzen oder Pflanzenteilen wie Blätter, Stengel, Wurzel, Blüte oder Samen über dem Fachmann bekannte Methoden isoliert werden.
Als ein Beispiel für eine Feinchemikalie, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt und isoliert werden kann, seien beispielhaft Fettsäureester mit mehrfach ungesättigten C₁₈-, C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuremolekülen genannt. Diese können in Form eines Öls oder Lipids beispielsweise in Form von Verbindungen wie Sphingolipide, Phosphoglyceride, Lipide, Glycolipide wie Glycoshingolipid, Phospholipide wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phoshatidylserin, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol oder Diphosphatidylglycerol, Monoacylglyceride, Diacylglyceride, Triacylglyceride oder sonstige Fettsäureester wie die AcetylCoenzymA-Ester, die die mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit mindestens zwei bevorzugt drei Doppelbindungen enthalten, isoliert werden. In der Regel liegen die verschiedenen vorgenannten Verbindungen (Fettsäureester und frei Fettsäuren) in der Pflanze in einer ungefähren Verteilung von 80 bis 90 Gew.-% Triglyceride, 2 bis 5 Gew.-% Diglyceride, 5 bis 10 Gew.-% Monoglyceride, 1 bis 5 Gew.-% freie Fettsäuren, 2 bis 8 Gew.-% Phospholipide vor, wobei sich die Summe der verschiedenen Verbindungen zu 100 Gew.-% ergänzt.
Vorteilhaft können im erfindungsgemäßen Verfahren Linolsäure (C18:2), Linolensäure (C18:3), Arachidonsäure (ARA) oder Eicosapentaensäure (EPA) hergestellt und isoliert werden.
Vorteilhaft werden dabei im erfindungsgemäßen Verfahren Pflanzen verwendet, die zu den Öl-produzierenden Pflanzen gehören, das heißt die für die Herstellung von Ölen verwendet werden, wie Ölfruchtpflanzen, die große Mengen an Lipidverbindungen enthalten, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis, Lein, Soja, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss oder Walnuss) oder Feldfrüchte, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa oder Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Bevorzugte Pflanzen sind Ölfruchtpflanzen, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Safflor (Färberdistel), Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis, Lein, Soja, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Besonders bevorzugt sind C18:2- und/oder C18:3-Fettsäure reiche Pflanzen wie Sonnenblume, Färberdistel, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein, Hanf, Distel oder Färberdistel. Ganz besonders bevorzugt sind Pflanzen wie Färberdistel, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Lein oder Hanf.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden bei der Herstellung von PUFAS Nukleinsäuren exprimiert, die beispielsweise für Polypeptide mit Δ-5-, Δ-6-Desaturase- oder A-6-Elongaseaktivität codieren. Je nach Auswahl der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Pflanze lassen sich Mischungen der verschiedenen vorgenannten Verbindungen oder einzelne Verbindungen wie EPA oder ARA in freier oder gebundener Form herstellen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren sind unter transgenen Pflanzen auch Pflanzenzellen, -gewebe, -organe oder ganze Pflanzen zu verstehen, die zur Expression von Nukleinsäuren geeignet sind. Unter Anzucht ist beispielsweise die Kultivierung der transgenen Pflanzenzellen, -gewebe oder -organe auf einem Nährmedium oder der ganzen Pflanze auf bzw. in einem Substrat beispielsweise in Hydrokultur oder auf einem Ackerboden zu verstehen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können prinzipiell alle Nukleinsäuren verwendet werden. Vorteilhaft Stammen diese Nukleinsäuren aus Pflanzen wie Algen, Diatomeen, Moosen oder höheren Pflanzen, sie können aber auch von Mikroorganismen wie Pilzen, Hefen oder Tieren wie Nematoden, Insekten oder dem Menschen stammen.
Unter transgener Pflanze im Sinne der Erfindung ist zu verstehen, dass die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrer natürlichen Stelle im Genom einer Pflanze stabil integriert sind, dabei können die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Tansgen bedeutet aber auch, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an ihrem natürlichen Platz im Genom eines Organismus sind, dass jedoch die Sequenz gegenüber der natürlichen Sequenz verändert wurde und/oder das die Regulationssequenzen, der natürlichen Sequenzen verändert wurden. Bevorzugt ist unter transgen die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren an nicht natürlicher Stelle im Genom zu verstehen, das heißt eine homologe oder bevorzugt heterologe Expression der Nukleinsäuren liegt vor.
Transgene Pflanzen, die die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimierten Nukleinsäuren enthalten, können direkt vermarktet werden ohne die synthetisierten Verbindungen zu isolieren. Unter Pflanzen im erfindungsgemäßen Verfahren sind alle Pflanzenteile, Pflanzenorgane wie Blatt, Stiel, Wurzel, Knollen oder Samen oder die gesamte Pflanze zu verstehen. Der Samen umfasst dabei alle Samenteile wie die Samenhüllen, Epidermis- und Samenzellen, Endosperm oder Embyrogewebe. Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen können aber auch aus den Pflanzen in Form der freien Produkte beispielsweise ihrer Öle, Fett, Lipide und/ oder freien Fettsäuren isoliert werden. Durch dieses Verfahren hergestellte Verbindungen lassen sich durch Ernten der Organismen entweder aus der Kultur, in der sie wachsen, oder vom Feld ernten. Dies kann beispielsweise im Falle von Ölen in dem Fachmann bekannter Weise über Pressen oder Extraktion der Pflanzenteile bevorzugt der Pflanzensamen erfolgen. Dabei können die Öle, Fette, Lipide und/oder freien Fettsäuren durch sogenanntes kalt schlagen oder kalt pressen ohne Zuführung von Wärme durch Pressen gewonnen werden. Damit sich die Pflanzenteile speziell die Samen leichter aufschließen lassen, werden sie vorher zerkleinert, gedämpft oder geröstet. Die so vorbehandelten Samen können anschließend gepresst werden oder mit Lösungsmittel wie warmen Hexan extrahiert werden. Anschließend wird das Lösungsmittel wieder entfernt. Auf diese Weise können mehr als 96% der im Verfahren hergestellten Verbindungen isoliert werden. Anschließend werden die so erhaltenen Produkte weiter bearbeitet, das heißt raffiniert. Dabei werden zunächst die Pflanzenschleime und Trübstoffe. Die sogenannte Entschleimung kann enzymatisch oder beispielsweise chemisch/physikalisch durch Zugabe von Säure wie Phosphorsäure erfolgen. Anschließend werden die freien Fettsäuren durch Behandlung mit einer Base beispielsweise Natronlauge entfernt. Das erhaltene Produkt wird zur Entfernung der im Produkt verbliebenen Lauge mit Wasser gründlich gewaschen und getrocknet. Um die noch im Produkt enthaltenen Farbstoffe zu entfernen werden die Produkte einer Bleichung mit beispielsweise Bleicherde oder Aktivkohle unterzogen. Zum Schluss wird das Produkt noch beispielsweise mit Wasserdampf noch desodoriert.
Unter dem Begriff "Öl" oder "Fett" wird ein Fettsäuregemisch verstanden, das ungesättigte, gesättigte, vorzugsweise veresterte Fettsäure(n) enthält. Bevorzugt ist, dass das Öl oder Fett einen hohen Anteil an ungesättigter, unkonjugierter veresterter Fettsäure(n), insbesondere Linolsäure, γ-Linolensäure, Dihomo-γ- linolensäure, Arachidonsäure, α-Linolensäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure oder Eicosapentaensäure hat. Vorzugsweise ist der Anteil an ungesättigten veresterten Fettsäuren ungefähr 30%, mehr bevorzugt ist ein Anteil von 50%, noch mehr bevorzugt ist ein Anteil von 60%, 70%, 80% oder mehr. Zur Bestimmung kann. z. B. der Anteil an Fettsäure nach Überführung der Fettsäuren in die Methylestern durch Umesterung gaschromatographisch bestimmt werden. Das Öl oder Fett kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren enthalten. Insbesondere kann je nach Ausgangspflanze der Anteil der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett schwanken.
Aus den so im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen der allgemeinen Formel I lassen sich die enthaltenden mehrfach ungesättigten Fettsäuren beispielsweise über eine Alkalibehandlung beispielsweise wässrige KOH oder NaOH oder saure Hydrolyse vorteilhaft in Gegenwart eines Alkohols wie Methanol oder Ethanol oder über eine enzymatische Abspaltung freisetzen und isolieren über beispielsweise Phasentrennung und anschließender Ansäuerung über z. B. H₂SO₄. Die Freisetzung der Fettsäuren kann auch direkt ohne die vorhergehend beschriebene Aufarbeitung erfolgen.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verwendung der transgenen Pflanze oder der aus den Pflanzen gewonnenen Produkte in Futtermitteln, Nahrungsmitteln, Saatgut, Feinchemikalien, Kosmetika oder Pharmazeutika.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Nukleinsäurekonstrukt zur stabilen transgenen Expression von Nukleinsäuren im erfindungsgemäßen vorgenannten Verfahren enthaltend

a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder
b) funktionelle Äquivalente oder äquivalente Fragmente, das im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzt,

Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt mindestens ein weiteres Element ausgewählt aus der folgenden Gruppe:

a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder
b) das Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche Funktionselemente enthält, oder
c) das zwischen dem Promotor und der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ein Polylinker vorhanden ist, oder
d) das Nukleinsäurekonstrukt mindestens eine weitere Nukleinsäure unter Kontrolle des Promotors gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines funktionellen Äquivalents oder äquivalenten Fragments oder eines weiteren Promotors enthält.

Zur vorteilhaften Integration des Nukleinsäurekonstrukt in das Genom der transgenen Pflanze wird das Nukleinsäurekonstrukt zwischen zwei T-DNA-Abschnitten (= T-DNA-Borders) inseriert.
Unter T-DNA-Abschnitten (= T-DNA-Borders) versteht der Fachmann einen Abschnitt, der die Übertragung von DNA in eine Pflanze ermöglicht. Die T-DNA besitzt eine sogenannte rechte und linke T-DNA-Border, die den Transfer des zwischen ihnen liegenden Bereiches vermitteln. Wichtig für diese Übertragung sind zwei nahezu identische ca. 25 bp lange Sequenzen (rechte und linke T-DNA-Border), die die T-DNA auf dem T1-Plasmid flankieren und die von einer T1-Plasmid codierten Nuklease erkannt werden. Diese Nuklease ist in der Lage, einen Einzelstrang der T-DNA aus dem Plasmid herauszuschneiden, der dann in das Pflanzengenom an einer beliebigen Stelle stabil inseriert wird. So können beliebige Nukleinsäuresequenzen ins Pflanzengenom inseriert werden.
Die im Nukleinsäurekonstrukt transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz wird ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäuren bestehend aus einem Selektionsmarker, einem Reportergen, einem RNAi-Konstrukt, einem Enzym, einem Protein das Insekten-, Virus-, Bakterien-, Pilz- oder Nematodenresistenz vermittelt, einer Nukleinsäuresequenz oder einem Protein, das Trocken-, Kälte-, Hitze- oder Salzresistenz in Pflanzen vermittelt, einem Inhibitor, einem Lektin, einer RNAase, einem Ribozym, einem Antikörper, einem Vaccin, einem Pharmazeutikum, einem "antifreezing"-Protein, einem Cytochrom P-450-Protein, einem Transkriptions-Aktivator oder -Repressor oder einem Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäurekonstrukte sind nach Einbringung in eine Pflanzenzelle bzw. Pflanze stabil in das Genom der Wirtszelle integriert. Bei der Integration in das Genom kann die Integration zufallsgemäß sein oder durch derartige Rekombination erfolgen, dass das native Gen durch die eingebrachte Kopie ersetzt wird, wodurch die Produktion der gewünschten Verbindung durch die Zelle moduliert wird, oder durch Verwendung eines Gens in trans, so dass das Gen mit einer funktionellen Expressionseinheit, welche mindestens eine die Expression eines Gens gewährleistende Sequenz und mindestens eine die Polyadenylierung eines funktionell transkribierten Gens gewährleistende Sequenz enthält, funktionell verbunden ist. Vorteilhaft werden die Nukleinsäuren in einem Nukleinsäurekonstrukt in Form von sogenannten Multiexpressionskassetten oder Konstrukte zur multiparallelen Expression von Genen in die Pflanzen gebracht.
Wie oben beschrieben, ist für die vorliegende Erfindung eine Integration der Nukleinsäuren bzw. der kodogenen Genabschnitte im Genom der Pflanzen angestrebt. Dabei kann ein bestimmter kodogener Genabschnitte als fortlaufende kodierende Sequenz (ORF) integriert sein oder ein oder mehrere Introns beinhalten. Ist letzteres der Fall, werden derartige Sequenzen im Zuge der Expression durch die Pflanze in der Regel gespleißt, wobei das Spleißmuster dem des Spenderorganismus entsprechen kann, aber nicht muss.
Grundsätzlich können die Nukleinsäuren in das extranukleare Genom, z. B. dem Plastidengenom, einer Pflanze integriert sein. Erfindungsgemäß bevorzugt ist allerdings die Integration in das nukleare Genom.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, die Sequenzen, welche die heterologen kodogene Genabschnitte umfassen, stabil in das Genom der Pflanzen zu integrieren. Dies ist verbunden mit einem oder mehreren der folgenden Aspekte:

- die Anzahl an Kopien einer bestimmten Nukleinsäure bzw. eines bestimmten kodogenen Genabschnitts pro Zelle ist während des Lebenszyklus einer Pflanze im Wesentlichen konstant;
- die Anzahl an Kopien einer Nukleinsäure bzw. eines bestimmten kodogenen Genabschnitts pro Zelle ist bestimmbar;
- die Nukleinsäure bzw. der kodogene Genabschnitt ist als Merkmal der Pflanze vererbbar, bei nuklearer Integration nach den Mendelschen Regeln.

In der Regel beträgt die Anzahl an integrierten Kopien einer Nukleinsäure bzw. eines bestimmten kodogenen Genabschnitts pro Zelle weniger als 20 und in den meisten Fällen weniger als 10. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Pflanzen mit Zellen, die etwa 1 bis 5 Kopien und insbesondere 1 Kopie einer Nukleinsäure bzw. eines bestimmten kodogenen Genabschnitts umfassen. Die Anzahl an Kopien pro Zelle können in an sich bekannter Weise mittels "Southern-Blot"-Analyse (Extraktion der genomischen DNA, restriktionsenzymatischer Verdau, elektrophoretische Auftrennung, Membrantransfer, Hybridisierung mit markierter DNA-spezifischer Sonde) oder quantitativer PCR bestimmt werden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die vorteilhaft heterologen Nukleinsäuren bzw. kodogenen Genabschnitte im Genom der transgenen Pflanzen von T-DNA- Sequenzen, insbesondere von Agrobakterium-T1-Plasmidsequenzen, einseitig oder vorzugsweise beidseitig flankiert. Dies ist ebenfalls Ausdruck der erfindungsgemäßen stabilen Integration der kodogenen Genabschnitte in das Genom der Pflanzen.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt kann dann zum Einbringen in die transgenen Pflanze in einen Vektor inseriert werden. Es kann aber auch direkt in die Pflanze eingebracht werden.
Unter der Verwendung von Klonierungsvektoren in Pflanzen und bei der Pflanzentransformation, wie denjenigen, die veröffentlicht sind in und dort zitiert sind: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15-38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)), lassen sich die Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäurekonstrukte zur gentechnologischen Veränderung eines breiten Spektrums an Pflanzen verwenden, so dass diese ein besserer oder effizienterer Produzent eines oder mehrerer der vorgenannten Produkte, wird. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz der Produktion kann durch direkte Wirkung der Manipulation oder eine indirekte Wirkung dieser Manipulation hervorgerufen werden.
Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen werden im Verfahren vorteilhaft in Form eines Nukleinsäurekonstrukts, die die stabile Expression der Nukleinsäuren in Pflanzen ermöglicht, in die Pflanze eingebracht.
Vorteilhafte für die Konstruktion der Nukleinsäurekonstrukte (= Expressionskonstrukt = Genkonstrukt) verwendbare Promotor/Terminator-Konstrukte in pUC19 werden in SEQ ID NO: 2 bis 6 wiedergegeben. Dabei werden Nukleinsäuren beispielsweise die für die bei der Herstellung von PUFAS verwendeten Desaturasen und/oder die für die Elongasen codierenden Nukleinsäuresequenzen mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft. Der vorgenannte Upiquitin-Promotor kann in diesen Konstrukten vorteilhaft Anstelle eines oder aller der angegebenen und vorhandenen Promotoren oder in Kombination mit den genannten oder anderen Promotoren verwendet werden. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die zu exprimierenden Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein. Vorteilhaft liegt nur jeweils eine Kopie der Gene in der Expressionskassette vor. Dieses Genkonstrukt oder die Genkonstrukte können zusammen im Wirtsorganismus exprimiert werden. Es ist vorteilhaft für die Insertion weiterer Gene im Wirtsgenom, wenn die zu exprimierenden Gene zusammen in einem Genkonstrukt vorliegen.
Die vorgenannten Promotor/Terminator-Konstrukte bestehen vorteilhaft aus wenigstens zwei funktionellen Einheiten wie einem Promotor und einem Terminator. Zwischen Promotor und Terminator können neben der im Verfahren zu exprimierenden Nukleinsäure weitere gewünschte Gensequenzen wie Targetting-Sequenzen, Kodierregionen von weiteren Genen oder Teilen davon etc. eingefügt werden. Zum Aufbau von Expressionskassetten werden Promotoren und Terminatoren (USP Promotor: Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67); OCS Terminator: Gielen et al. EMBO J. 3 (1984) 835ff.) mithilfe der Polymerasekettenreaktion isoliert und mit flankierenden Sequenzen nach Wahl auf Basis von synthetischen Oligonukleotiden maßgeschneidert.
Folgende Oligonukleotide können beispielsweise verwendet werden:
Die Methoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind allgemein literaturbekannt.
In einem ersten Schritt werden ein Promotor und ein Terminator über PCR amplifiziert. Dann wird der Terminator in ein Empfängerplasmid kloniert und in einem zweiten Schritt der Promotor vor den Terminator inseriert. Mithin erhält man eine Expressionskassette auf einem Trägerplasmid vorteilhaft kann hierfür pUC19 verwendet werden, jedoch ist auch die Verwendung jedes anderen gängigen Vektors möglich.
Die Promotor/Terminator-Konstrukte sind in SEQ ID NO: 2 bis 6 (pUT1 = SEQ ID NO: 2, pUT2 = SEQ ID NO: 3, pUT3 = SEQ ID NO: 4, pUT12 = SEQ ID NO: 5, pUT123 = SEQ ID NO: 6) wiedergegeben. Sie enthalten beispielhaft den USP-Promotor und den OCS Terminator. Auf Basis dieser Plasmide lassen sich in dem Fachmann bekannterweise Nukleinsäurekonstrukte herstellen, die die zu exprimierenden Nukleinsäuren enthalten. Auf diese Weise wird ein Set von Multiexpressionskassetten geschaffen, dass für die Insertion gewünschter Nukleinsäuren genutzt werden kann und in Tabelle 1 beschrieben wird und zudem noch weitere Expressionskassetten aufnehmen kann.
Diese enthalten folgende Elemente: Tabelle 1
Weiterhin lassen sich wie beschrieben und wie in Tabelle 2 näher spezifiziert weitere Multiexpressionskassetten mithilfe des

a) USP-Promotors oder mithilfe des
b) 700 Basenpaare 3'-Fragmentes des LeB4-Promotors oder mithilfe des
c) DC3-Promotors erzeugen und für samenspezifische Genexpression einsetzen.

Der DC3-Promotor ist beschrieben bei Thomas, Plant Cell 1996, 263: 359-368 und besteht lediglich aus der Region -117 bis +26 weshalb er mithin einer der kleinsten bekannten samenspezifischen Promotoren darstellt. Die Expressionskassetten können mehrfach den selben Promotor enthalten oder aber über drei verschiedene Promotoren aufgebaut werden. Tabelle 2 Multiple Expressionskassetten
Analog lassen sich weitere Promotoren für Multigenkonstrukte erzeugen insbesondere unter Verwendung des

a) im erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Ubiquitin- Promotors (siehe SEQ ID NO: 1) und/oder
b) des 2,7 kB Fragmentes des LeB4-Promotors und/oder
c) des Phaseolin-Promotors und/oder
d) des konstitutiven v-ATPase c1-Promotors.

Es kann weiterhin wünschenswert sein, weitere geeignete Promotoren zum Aufbau samenspezifischer Multiexpressionskassetten wie z. B. den Napin-Promotor oder den Arcelin-5 Promotor zu verwenden.
Die im Nukleinsäurekonstrukt vorteilhaft vorhanndenen zusätzlichen regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Genetische regulatorische Sequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente vorteilhaft die stabile Expression heterologer Gene verstärken können.
Vorteilhafte weitere Regulationssequenzen für das neue Verfahren, die zusätzlich im Nukleinsäurekonstrukt vorhanden sein können, liegen beispielsweise in Promotoren vor, wie in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor vor. In diesem Zusammenhang vorteilhaft sind ebenfalls induzierbare Promotoren, wie die in EP-A-0 388 186 (Benzylsulfonamid- induzierbar), Plant J. 2, 1992: 397-404 (Gatz et al., Tetracyclin-induzierbar), EP-A-0 335 528 (Abzisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschriebenen Promotoren. Weitere geeignete Pflanzenpromotoren sind der Promotor von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI-Promotor der Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase-Promotor aus Glycine max (Genbank-Zugangsnr. U87999) oder der in EP-A-0 249 676 beschriebene nodienspezifische Promotor. Vorteilhaft sind auch samenspezifische Promotoren, wie der ausführungsgemäße USP Promotor aber auch andere Promotoren wie der LeB4-, DC3, Phaseolin- oder Napin-Promotor. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und in US 5,608,152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin- Promotor aus Arobidopsis), US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica), von Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233-239 (LeB4- Promotor aus einer Leguminose) beschrieben sind, wobei sich diese Promotoren für Dikotyledonen eignen. Die folgenden Promotoren eignen sich beispielsweise für Monokotyledonen lpt-2- oder lpt-1-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), Hordein-Promotor aus Gerste und andere, in WO 99/16890 beschriebene geeignete Promotoren.
Es ist im Prinzip möglich, alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen, wie die oben genannten, für das neue Verfahren zu verwenden. Es ist ebenfalls möglich und vorteilhaft, zusätzlich oder alleine synthetische Promotoren zu verwenden, besonders wenn sie eine Samen-spezifische Expression vermitteln, wie z. B. beschrieben in WO 99/16890.
Weitere vorteilhafte Samen-spezifische Promotoren können prinzipiell sowohl aus dikotyledonen als auch aus monokotyledonen Pflanzen isoliert werden. Im folgenden sind vorteilhafte bevorzugte Promotoren aufgeführt: USP (= unknown seed protein) und Vicilin (Vicia faba) [Bäumlein et al., Mol. Gen Genet., 1991, 225(3)], Napin (Raps) [US 5,608,152], Acyl-Carrier Protein (Raps) [US 5,315,001 und WO 92/18634], Oleosin (Arabidopsis thaliana) [WO 98/45461 und WO 93/20216], Phaseolin (Phaseolus vulgaris) [US 5,504,200], Bce4 [WO 91/13980], Leguminosen B4 (LegB4- Promotor) [Bäumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992], Lpt2 und lpt1 (Gerste) [WO 95/15389 u. WO 95/23230], Samen-spezifische Promotoren aus Reis, Mais u. Weizen [WO 99/16890], Amy32b, Amy 6-6 und Aleurain [US 5,677,474], Bce4 (Raps) [US 5,530,149], Glycinin (Soja) [EP 571 741], Phosphoenol-Pyruvatcarboxylase (Soja) [JP 06/62870], ADR12-2 (Soja) [WO 98/08962], Isocitratlyase (Raps) [US 5,689,040] oder β-Amylase (Gerste) [EP 781 849].
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure- induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Um eine stabile Integration der Nukleinsäurekonstrukte in die transgene Pflanze über mehrere Generation sicherzustellen, sollte jede der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines eigenen bevorzugt eines unterschiedlichen Promotors exprimiert werden, da sich wiederholende Sequenzmotive zu Instabilität der T-DNA bzw. zu Rekombinationsereignissen oder Gene Silencing führen können. Die Expressionskassette ist dabei vorteilhaft so aufgebaut, dass einem Promotor eine geeignete Schnittstelle zur Insertion der zu exprimierenden Nukleinsäure folgt vorteilhaft in einem Polylinker anschließend gegebenenfalls ein Terminator hinter dem Polylinker liegt. Diese Abfolge wiederholt sich mehrfach bevorzugt drei-, vier- oder fünfmal, so dass bis zu fünf Gene in einem Konstrukt zusammengeführt werden und so zur Expression in die transgene Pflanze eingebracht werden können. Vorteilhaft wiederholt sich die Abfolge bis zu dreimal (siehe Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 2 bis 6). Die Nukleinsäuresequenzen werden zur Expression über die geeignete Schnittstelle beispielsweise im Polylinker hinter den Promotor inseriert. Vorteilhaft hat jede Nukleinsäuresequenz ihren eigenen Promotor und gegebenenfalls ihren eigenen Terminator. Es ist aber auch möglich mehrere Nukleinsäuresequenzen hinter einem Promotor und ggf. vor einem Terminator zu inserieren. Dabei ist die Insertionsstelle bzw. die Abfolge der inserierten Nukleinsäuren in der Expressionskassette nicht von entscheidender Bedeutung, das heißt eine Nukleinsäuresequenz kann an erster oder letzter Stelle in der Kassette inseriert sein, ohne dass dadurch die Expression wesentlich beeinflusst wird. Es können in der Expressionskassette vorteilhaft unterschiedliche Promotoren wie beispielsweise der Petersilie-Ubiquitin-Promotor, der USP-, der LegB4- oder der DC3-Promotor und unterschiedliche Terminatoren verwendet werden. Es ist aber auch möglich nur einen Promotortyp in der Kassette zu verwenden. Dies kann jedoch zu unerwünschten Rekombinationsereignissen führen.
Homologe Rekombination zur stabilen Integration ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US 6,110,736 beschrieben. Dieses besteht aus drei Elementen: zwei Paaren von spezifischen Rekombinationssequenzen und einer sequenzspezifischen Rekombinase. Diese Rekombinase katalysiert eine Rekombination lediglich zwischen den beiden Paaren von spezifischen Rekombinationsequenzen. Das eine Paar dieser spezifischen DNA-Sequenzen wird außerhalb der zu integrierenden DNA-Sequenz, d. h. außerhalb der beiden homologen DNA-Sequenzen lokalisiert. Im Falle einer korrekten homologen Rekombination werden diese Sequenzen nicht mit in das Genom übertragen. Im Falle einer zufälligen Integration insertieren sie in der Regel zusammen mit dem Rest des Konstruktes. Unter Einsatz einer speziellen Rekombinase und eines Konstruktes enthaltend ein zweites Paar der spezifischen Sequenzen können die zufällig insertierten Sequenzen herausgeschnitten oder durch Inversion inaktiviert werden, während die korrekt über homologe Rekombination insertierten Sequenzen im Genom verbleiben. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen P1, das FLP/FRT System der Hefe, die Gin Recombinase des Mu Phagen, die Pin Rekombinase aus E. coli und das R/RS System des pSR1 Plasmids genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen P1 Cre/lox und das Hefe FLP/FRT System. Hier interagiert die Rekombinase (Cre oder FLP) spezifisch mit ihren jeweiligen Rekombinationssequenzen (34bp lox-Sequenz bzw. 47bp FRT-Sequenz) um die zwischengelagerten Sequenzen zu deletieren oder zu invertieren. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990.)
Wie oben beschrieben sollte die Transkription der eingebrachten Gene vorteilhaft durch geeignete Terminatoren am 3'-Ende der eingebrachten Biosynthesegene (hinter dem Stoppcodon) abgebrochen werden. Verwendet werden kann hier z. B. der OCS1 Terminator. Wie auch für die Promotoren, so sollten hier für jedes Gen unterschiedliche Terminatorsequenzen verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz und/oder dem Promotor ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. Methods. 1998; 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Das Nukleinsäurekonstrukt kann, wie oben beschrieben, auch weitere Gene umfassen, die in die Organismen eingebracht werden sollen. Es ist möglich und vorteilhaft, in die Wirtsorganismen Regulationsgene, wie Gene für Induktoren, Repressoren oder Enzyme, welche durch ihre Enzymaktivität in die Regulation eines oder mehrerer Gene eines Biosynthesewegs eingreifen, einzubringen und darin zu exprimieren. Diese Gene können heterologen oder homologen Ursprungs sein. Weiterhin können vorteilhaft im Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt weitere Biosynthesegene des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels enthalten sein oder aber diese Gene können auf einem weiteren oder mehreren weiteren Nukleinsäurekonstrukten liegen. Vorteilhaft werden als Biosynthesegene im Falle des Fettsäure- oder Lipidstoffwechsels ein Gen ausgewählt aus der Gruppe Acyl-CoA-Dehydrogenase(n), Acyl-ACP[= acyl carrier protein]-Desaturase(n), Acyl-ACP- Thioesterase(n), Fettsäure-Acyl-Transferase(n), Fettsäure- Synthase(n), Fettsäure-Hydroxylase(n), Acetyl-Coenzym A-Carboxylase(n), Acyl-Coenzym A-Oxidase(n), Fettsäure-Desaturase(n), Fettsäure-Acetylenasen, Lipoxygenasen, Triacylglycerol-Lipasen, Allenoxid-Synthasen, Hydroperoxid-Lyasen oder Fettsäure- Elongase(n) oder deren Kombinationen verwendet.
Dabei können die vorgenannten Desaturasen in Kombination mit Elongasen und anderen Desaturasen in die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kloniert werden und zur Transformation von Pflanzen mithilfe von Agrobakterium eingesetzt werden. Weitere Transformationsmethoden sind die Protoplasten Polyethylenglycol-(PEG)Methode, die Protoplasten-Elektroporation, die Protoplasten-Mikroinjektion oder die balistischen Methoden.
Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker in das Nukleinsäurekonstrukt zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen beispielsweise eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
Weitere Selektionsmarker sind beispielsweise selektionierbaren Marker wie Biozide wie Phosphinotricin, Glyphosat, Sulfonylurea und Imidazolinon oder Bromoxynil; Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat oder Antibiotika wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin.
Neben den vorgenannten Selektionsmarkern lassen sich im erfindungsgemäßen Verfahren auch vorteilhaft Pathogenresistenz- Gene wie Insekten-, Pilz-, Bakterien- und/oder Virenresistenz- Gene exprimieren. Diese sollten möglichst gleichmäßig innerhalb der Pflanze und/oder Pflanzengeweben exprimiert werden.
Als Selektionsmarker eignen sich auch sogenannte Metabolismusinhibitoren wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456).
Vorteilhafte weitere Gene im Nukleinsäurekonstrukt sind Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz, des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Gene codierend für Reporter-Proteine (siehe auch Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie dem "green fluorescence protein" (GFP) [Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997; Sheen et al. (1995) Plant Journal 8(5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12): 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228], der Chloramphenicoltransferase, der Luziferase [Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414; Ow et al. (1986) Science, 234: 856-859], die eine Bioluminescenzdetektion erlaubt; die β-Galactosidase, kodiert für ein Enzym für das verschiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen, die in Pflanzen aufgrund einer hohen Grundaktivität weniger bevorzugt sind; die β-Glucuronidase (GUS) [Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907, uidA Gen], die ein Enzym für verschiedene chromogene Substrate kodiert. Weitere Gene sind beispielsweise das xylE, die Alpha-Amylase, Tyrosinase oder Aequorin.
Weitere vorteilhafte Gene sind Gene für Enzyme wie den Oxidoreductasen, den Transferasen, den Hydrolasen, den Lyasen, den Isomerasen oder Ligasen bevorzugte Enzyme sind die Hydrolasen.
Auch Gene für Pharmazeutika wie für Insulin oder für die verschiedenen Mediatoren wie EPO oder Interferone können enthalten sein.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. Die Expressionskassetten können prinzipiell direkt zum Einbringen in die Pflanze verwendet werden oder aber in einen Vektoren eingebracht werden.
Diese vorteilhaften Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, enthalten die im Verfahren verwendeten Nukleinsäurekonstrukte, die die verwendeten Nukleinsäure allein oder in Kombination mit weiteren Genen enthalten. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (z. B. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikationsursprung). Andere Vektoren werden vorteilhaft beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben Expressionsvektoren, die für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren, die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen. Ferner soll der Begriff Vektor auch andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, wie Phagen, Viren, wie SV40, CMV, TMV, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA, umfassen.
Die im Verfahren vorteilhaft verwendeten rekombinanten Nukleinsäurekonstrukt, die sich zur stabilen Expression der verwendeten Nukleinsäuren in einer Wirtszelle eignen, umfassen eine oder mehrere Regulationssequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist. In einem rekombinanten Nukleinsäurekonstrukt bzw Vektor bedeutet "funktionsfähig verbunden", dass die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die Regulationssequenz(en) gebunden ist, dass die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist und sie aneinander gebunden sind, so dass beide Sequenzen die vorhergesagte, der Sequenz zugeschriebene Funktion erfüllen (z. B. in einem In-vitro- Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird). Der Begriff "Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z. B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese Regulationssequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, Hrsgb.: Glick und Thompson, Kapitel 7, 89-108, einschließlich der Literaturstellen darin. Regulationssequenzen umfassen solche, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw., abhängen kann.
Die verwendeten rekombinanten Nukleinsäurekonstrukte und Vektoren können zur stabilen Expression in Algen (Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology. 1, 3: 239-251) sowie bevorzugt in Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.: 583-586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71-119 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-43; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225 (und darin zitierte Literaturstellen)) nach den vorgenannten Methoden verwendet werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens können die verwendeten Nukleinsäuresequenzen in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 und darin zitierte Literaturangaben, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z. B. Spermatophyten, wie Feldfrüchten) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; und Bevan, M. W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.
Eine Pflanzen-Expressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, welche die Genexpression in Pflanzenzellen steuern können und funktionsfähig verbunden sind, so dass jede Sequenz ihre Funktion, wie Termination der Transkription, erfüllen kann, beispielsweise Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-t-DNA stammen, wie das als Octopinsynthase bekannte Gen 3 des T1-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835ff.) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind geeignet.
Da die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf Transkriptionsebenen beschränkt ist, enthält eine Pflanzen-Expressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verbunden Sequenzen, wie Translationsenhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leader-Sequenz aus Tabakmosaikvirus, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711).
Die Pflanzengenexpression muss wie oben beschrieben funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein, der die Genexpression auf rechtzeitige, zell- oder gewebespezifische Weise durchführt. Nutzbare Promotoren sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294), 195 CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913) oder Pflanzenpromotoren, wie der in US 4,962,028 beschriebene der kleinen Untereinheit der Rubisco. Diese können vorteilhaft mit dem Ubiquitin-Promotor aus Petersilie im erfindungsgemäßen Verfahren kombiniert werden.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung zur funktionsfähigen Verbindung in Pflanzengenexpressions-Kassetten sind Targeting-Sequenzen, die zur Steuerung des Genproduktes in sein entsprechendes Zellkompartiment notwendig sind (siehe eine Übersicht in Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285-423 und darin zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
Die Pflanzengenexpression lässt sich auch wie oben beschrieben über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtern (siehe eine Übersicht in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108). Chemisch induzierbare Promotoren eignen sich besonders, wenn gewünscht wird, dass die Genexpression auf zeitspezifische Weise erfolgt. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäureinduzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397-404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor.
Auch Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind geeignete Promotoren, beispielsweise der pathogeninduzierte PRP1-Gen-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) 361-366), der hitzeinduzierbare hsp80- Promotor aus Tomate (US 5,187,267), der kälteinduzierbare Alphaamylase-Promotor aus Kartoffel (WO 96/12814) oder der durch Wunden induzierbare pinII-Promotor (EP-A-0 375 091).
Es sind insbesondere solche zusätzlichen Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in Geweben und Organen herbeiführen, in denen die Lipid- und Ölbiosynthese stattfindet, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos. Geeignete Promotoren sind der Napingen-Promotor aus Raps (US 5,608,152), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), der Oleosin- Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Legumin-B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9) sowie Promotoren, welche die samenspezifische Expression in Monokotyledonen-Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete beachtenswerte Promotoren sind der lpt2- oder lpt1-Gen-Promotor aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die in WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Gersten-Hordein-Gen, dem Reis-Glutelin-Gen, dem Reis-Oryzin-Gen, dem Reis-Prolamin-Gen, dem Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin- Gen, dem Mais-Zein-Gen, dem Hafer-Glutelin-Gen, dem Sorghum- Kasirin-Gen, dem Roggen-Secalin-Gen).
Insbesondere kann die multiparallele Expression der im Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen allein oder in Kombination mit anderen Genen gewünscht sein. Die Einführung solcher Expressionskassetten kann über eine simultane Transformation mehrerer einzelner Expressionskonstrukte erfolgen oder bevorzugt durch Kombination mehrerer Expressionskassetten auf einem Konstrukt. Auch können mehrere Vektoren mit mit jeweils mehreren Expressionskassetten transformiert und auf die Wirtszelle übertragen werden.
Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, welche die plastidenspezifische Expression herbeiführen, da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer sowie einige Endprodukte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, sind beschrieben in WO 95/16783 und WO 97/06250, und der clpP- Promotor aus Arabidopsis, beschrieben in WO 99/46394.
Die Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren lassen sich in Pflanzen über herkömmliche Transformationstechniken einbringen. Der Begriff "Transformation", wie hier verwendet, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (z. B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich chemisch vermittelter Transfer, Elektroporation oder Teilchenbeschuss, umfassen. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, lassen sich finden in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsgb: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.
Wirtszellen, die im Prinzip zum Aufnehmen der Nukleinsäure, des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts oder des erfindungsgemäßen Vektors geeignet sind, sind alle Pflanzen oder Teile davon, bevorzugte Pflanzen sind dikotyle oder monokotyle Pflanzen wie Raps, Nachtkerze, Hanf, Diestel, Erdnuss, Canola, Lein, Soja, Safflor, Sonnenblume, Borretsch, oder Pflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Buschpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölplame, Kokosnuss) sowie ausdauernde Gräser und Futterfeldfrüchte. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße transgene Pflanzen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Reis, Triticale, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Ryegras, Hirse, Raps, Nachtkerze, Canola, Erdnuss, Königskerze, Distel, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Wildrosen, Kürbis, Pistazien, Sesam, Lein, Sonnenblume, Färberdistel, Soja, Borretsch, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Zuckerrübe, Tomate, Kartoffel, Tabak, Karotte, Pappel, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Aubergine, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss oder Arabidopsis.
Der im Verfahren vorteilhaft verwendete Promotor mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1, einem funktionellen Äquivalent oder eines äquivalenten Fragments, kann unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Auch kann mithilfe von Vergleichsalgorithmen beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA oder Aminosäureebene identifiziert werden. Diese können als Hybridisierungssonde sowie Standard-Hybridisierungstechniken (wie z. B. beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) zur Isolierung weiterer im Verfahren nützlicher Promotorsequenzen verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz oder von Teilen davon, verwendet werden (z. B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständigen Sequenz oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz erstellt worden sind). Methoden zur Isolierung von genomischer DNA aus Pflanzen sind dem Fachmann bekannt.
Für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafte Promotoren können auf der Grundlage ihrer Homologie zu der hier offenbarten Nukleinsäuren unter Verwendung der Sequenzen oder eines Teils davon als Hybridisierungssonde gemäß Standard-Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. Dabei können beispielsweise isolierte Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die mindestens 18 Nukleotide lang sind und unter stringenten Bedingungen mit den Nukleinsäuremolekülen, die eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 umfassen, hybridisieren. Es können auch vorteilhaft Nukleinsäuren mindestens 25, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide verwendet werden. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie hier verwendet, soll Hybridisierungs- und Waschbedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60% homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65%, stärker bevorzugt mindestens etwa 70% und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 75% oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6., finden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (sodium chloride/sodiumcitrate = SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C. Dem Fachmann ist bekannt, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich je nach dem Typ der Nukleinsäure und, wenn beispielsweise organische Lösungsmittel vorliegen, hinsichtlich der Temperatur und der Konzentration des Puffers unterscheiden. Die Temperatur unterscheidet sich beispielsweise unter "Standard- Hybridisierungsbedingungen" je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42 und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Falls organisches Lösungsmittel im obengenannten Puffer vorliegt, zum Beispiel 50% Formamid, ist die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride zum Beispiel 0,1 × SSC und 20 bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30 und 45°C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride zum Beispiel 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die vorstehend genannten Hybridisierungstemperaturen sind beispielsweise für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern, wie dem vorstehend erwähnten oder aus den folgenden Lehrbüchern Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames und Higgins (Hrsgb.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie (= Identität) von zwei Sequenzen (z. B. SEQ ID NO: 1) werden die Sequenzen zum Zweck des optimalen Vergleichs untereinander geschrieben (z. B. können Lücken in die Sequenz eines Promotors eingefügt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Protmotor und dessen für die Funktion wesentlichen Elemente wie den Transkriptionsstart oder die TATA-Box zu erzeugen). Die Nukleotide an den entsprechenden Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz durch das gleiche Nukleotid wie die entsprechende Stelle in der anderen Sequenz belegt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d. h. Nukleinsäure-"Homologie", wie hier verwendet, entspricht damit Nukleinsäure-"Identität"). Die prozentuale Homologie zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind (d. h. % Homologie = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen × 100).
Die Begriffe Homologie und Identität sind damit als Synonym anzusehen.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand sind transgene Pflanzen, die das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder den erfindungsgemäßen Vektor enthalten.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme auf genommen.

Beispielteil

Beispiel 1

Isolierung genomischer DNA aus Petroselinum crispum var. Hamburger Schnitt

Blattmaterial von 3 Wochen alten Petersiliepflanzen var. Hamburger Schnitt wurde geerntet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. 100 mg Material wurden im Mörser homogenisiert und aus dem Homogenat genomische DNA (gDNA) isoliert mit Macherey und Nagel NucleoSpin Plant-Kit nach Herstellerangaben. Die gDNA wurde in 100 µl TE-Puffer aufgenommen. Anschließend wurde die Konzentration photometrisch bestimmt. Die Ausbeute betrug 1,05 µg/µl.

Beispiel 2

Isolierung des Promotors aus genomischer DNA mittels PCR

Von der Sequenz mit der NCBI-Accessionsnummer X64345.1 [Kawalleck et al., (1993) Polyubiquitin gene expression and structural properties of the ubi4-2 gene in Petroselinum. Plant Molecular Biology. 21(4): 673-84] wurden Oligonukleotide abgeleitet. Die Oligos wurden abgeleitet von der Sequenz von Basenpaar 1 bis 22 sowie 982 bis 959. Zur Klonierung des Promotors wurden an die Oligonukleotide Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen angefügt. Die Sequenz der Oligos lautete:
Die Oligos wurden eingestellt auf eine Konzentration von 20 µM und eingesetzt in einer PCR.
Der PCR-Ansatz enthielt:
5,0 µl Puffer für Pfu-Polymerase (Stratagene)
0,4 µl dNTPs (25 mM each) (Amersham)
0,5 µl Primer PcUbi4-2fw
0,5 µl Primer PcUbi4-2rev
0,5 µl Pfu Polymerase (Stratagene)
0,5 µl gDNA
42,6 µl Wasser
Das Programm der PCR-Reaktion (NJ-Cycler Tetrad, BioZym) lautete:
4 min 94°C
1 min 94°C
1 min 50°C
2 min 72°C
10 min 72°C
25°C
Der mittlere Zyklus wurde 30 mal wiederholt.

Beispiel 3

Klonierung des Promotor PCR-Fragments

Für die Klonierung des 982 bp großen PCR-Fragments wurde der PCR-Ansatz nach Herstellerangaben mit Qiagen PCR-Reinigungskit gereinigt. Die DNA wurde anschließend in 30 µl TE-Puffer aufgenommen und vollständig mit XbaI (MBI-Fermentas) verdaut. Der Restriktionsansatz enthielt: 30 µl DNA, 4 µl Wasser, 4 µl Puffer und 2 µl Enzym (MBI Fermentas). Inkubiert wurde über Nacht bei 37°C.
Nach der Reinigung wurde das Fragment in einen binären Vektor mit Expressionskassette und uidA als Reportergen kloniert, der zuvor mit den Restriktionsenzymen XbaI, SmaI (MBI Fermentas) geöffnet worden war. Es entstand das Konstrukt 1bxPcUbi4-2GUS (Fig. 1) enthaltend den Promotor PcUbi4-2 vor dem GUS-Gen, welches zur Promotoranalyse geeignet ist [Jefferson et al., (1987) GUS fusions: β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907].

Beispiel 4

Transformation des Konstrukts 1bxPcUbi4-2GUS in Arabidopsis

Das Konstrukt 1bxPcUbi4-2GUS wurde in den Agrobakterienstamm pGV3101 enthaltend das Plasmid pMP90 mittels Elektroporation transformiert und die Kolonien auf TB-Medium (QBiogen, Deutschland) enthaltend die Selektionsmarker Kanamycin, Gentamycin und Rifampicin platiert und 2 Tage inkubiert bei 28°C.
Es wurde mit Hilfe eines Zahnstochers eine Kolonie von der Agarplatte gepickt und in 3 ml TB Medium flüssig mit den oben genannten Antibiotika aufgenommen.
Die Vorkultur wuchs 48 h bei 28°C und 120 rpm im Schüttelinkubator. Zur Hauptkultur wurden 400 ml LB Medium mit den entsprechenden Antibiotika verwendet. Die Vorkultur wurde überführt in die Hauptkultur, diese wuchs 18 h bei 28°C und 120 rpm.
Nach dem Zentrifugieren bei 4000 rpm wurde das Pellet in Infiltrationsmedium (M & S Medium mit 10% Saccharose) resuspendiert.

Beispiel 5

Anzucht der Pflanzen

Schalen (Piki Saat 80, grün mit Siebboden, 30 × 20 × 4,5 cm, Firma Wiesauplast, Kunststofftechnik, Deutschland)) wurden mit einem GS 90 Substrat (Einheitserde, Werkverband E. V., Deutschland)) bis zur Hälfte gefüllt. Die Schalen wurden über Nacht mit 0,05% Previcur Lösung (Previcur N, Aventis CropScience) gewässert. Arabidopsis thaliana, C24 Samen wurden auf die Schale gestreut, ca 1000 Samen je Schale. Die Schalen wurden mit einer Haube abgedeckt und in die Stratifizierung gestellt (8 h 110 µE, 5°C; 16 h Dunkel 6°C). Nach 5 Tagen wurden die Schalen in das Kurztag Phytotron gestellt (8 h 130 µE, 22°C; 16 h Dunkel 20°C). Hier blieben sie 10 Tage, bis die ersten Laubblätter gebildet waren.
Die Keimlinge wurden in Töpfe, die das gleiche Substrat enthielten transferiert (Teku-Töpfe, 10 cm ∅, Serie LC, Hersteller Pöppelmann GmbH & Co, Deutschland). Es wurden 9 Pflanzen in einen Topf pikiert. Die Töpfe wurden dann wieder zum weiteren Wachstum in das Kurztag Phytotron gestellt.
Nach 10 Tagen kamen sie dann in eine Gewächshauskabine 16 h 340 µE 22°C und 8 h dunkel 20°C. Hier wuchsen sie noch 10 Tage weiter.

Beispiel 6

Methode Transformation

7 Wochen alte gerade blühende Arabidopsis Pflanzen wurden für 10 sec in die oben beschriebene Agrobakterien Suspension getaucht. Diese wurde vorher mit 10 µl Silwett L77 (Crompton S.A., Osi Specialties, Schweiz) versetzt. Die Methode ist beschrieben in Bechtold N. und Pelletier G. [In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology, 82: 259-66, 1998]. Anschließend wurden die Pflanzen für 18 h in eine feuchte Kammer gelegt, danach stellte man die Töpfe zum weiteren Wachstum wieder ins Gewächshaus. Hier verblieben die Pflanzen noch 10 Wochen, bis die Samen geerntet wurden.

Beispiel 7

Selektion

Je nach verwendetem Resistenzmarker für die Selektion der transformierten Pflanzen wurden die geernteten Samen im Gewächshaus ausgebracht und der Sprühselektion unterworfen, oder aber nach Sterilisation auf Agarplatten mit dem respektiven Selektionsagens angezogen. Nach ca. 10 bis 14 Tagen unterschieden sich die transformierten resistenten Pflanzen deutlich von den abgestorbenen Wildtypkeimlingen und konnten in 6-cm-Töpfe pikiert werden.

Beispiel 8

Qualitative Bestimmung der GUS Aktivität in Geweben transgener Arabidopsis Pflanzen

Transgene Arabidopsispflanzen wurden pikiert und im Gewächshaus angezogen. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde von unterschiedlichen Geweben Proben genommen. Mit diesen Proben wurden GUS- Färbungen durchgeführt [Martin et al., (1992) The GUS reporter system as a tool to study plant gene expression. In: Gallagher (Hrsg.): GUS Protocols: Using the GUS gene as a reporter of gene expresion. Academic Press, 23-43] um zu untersuchen, in welchen Geweben der PcUbi4-2 Promotor aktiv ist. Zum Vergleich wurden Pflanzen analysiert, die bei gleichem Vektor vor dem GUS-Gen den doppelten 35S-Promotor (d355) enthielten [Kay et al. 1987, Science, 236, 1299-1302. Hierbei handelt es sich um einen bereits sehr gut charakterisierten konstitutiven Promotor [Comai et al., 1990, Plant Molecular Biology 15, 373-381, 1990] In Blättern 3 Wochen alter individueller, unabhängiger Pflanzen zeigte sich eine starke, einheitliche Färbung aller Gewebe (Fig. 2). Im Vergleich dazu waren die Blätter der mit d35S:GUS transformierten Pflanzen sehr variabel in der Färbung und zeigten teilweise ein fleckiges Färbungsmuster (Fig. 3). In Samen zeigte der d35S kaum Aktivität, wohingegen der PcUbi4-2 eine starke Aktivität aufwies (Fig. 7).

Beispiel 9

Quantitative Bestimmung der Menge GUS mRNA in Blättern transgener Arabidopsis Pflanzen

Blätter 3 Wochen alter transgener Arabidopsispflanzen wurden geerntet und gesamt RNA extrahiert mit dem Invisorb Plant Kit (Invitek, Deutschland). Die RNA wurde eingesetzt um daraus die Menge GUS mRNA zu bestimmen. Die Reagenzien für cDNA-Synthese und Q-PCR Reaktion stammten von Applied Biosystems und wurden nach Herstellerangaben eingesetzt. Die Analyse erfolgte mit quantitativer PCR, TaqMan Sonden und dem ABIPrism7700 (PE Aplied Biosystems) [Gibson et al., (1996) A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001; Lie Y. S. and Petropulos C. J. (1998) Advances in quantitative PCR technology: 5'nuclease assays].
Zur Detektion der GUS mRNA wurde folgendes Sondensysthem verwendet:
Die Sonde war mit FAM (Fluorescein) markiert, der Quencher war TAMRA (Rhodamin)
Zum Abgleich der Menge eingesetzter gesamt RNA wurde ein Sondensystem verwendet, das die mRNA des Ubiquitin-conjugatingenzyme 18 (Ubi18) detektiert:
Die Sonde war mit VIC (Tradename) markiert, der Quencher war TAMRA.
Der für jede Pflanze ermittelte Ct-Wert für Ubi18 mRNA wurde vom aus dem gleichen Reaktionsansatz bestimmten Ct-Wert für GUS mRNA abgezogen. Der daraus berechnete delta Ct Wert ist ein relativer Wert und ein Maß für die Menge GUS mRNA die in einer bestimmten Menge mRNA enthalten war (Tab. 3). Die Q-PCR wird über 40 Zyklen verfolgt. Proben, bei denen ein Ct-Wert von 40 angezeigt wird sind negativ, da sie auch beim 40 Zyklus keine Fluoreszenz oberhalb des Hintergrundes entwickelt haben.
Beide Promotoren zeigen in einem vergleichbaren Bereich Expression. Die Varianz in der Menge GUS mRNA ist beim PcUbi4.2 Promotor allerdings niedriger als bei d35S. Der Median der Expression in T1 Pflanzen exprimierend GUS unter Kontrolle des PcUbi4-2 Promotors war 2.25, der Range aller Pflanzen 10.47. Beim Promotor d35S war der Median 2.38, der Range 13.44 Tabelle 3 Ct Werte für T1 Pflanzen enthaltend die Konstrukte D35S35SGUS oder PcUbi4-2GUS

Beispiel 10

Untersuchung der Stabilität der GUS-Expressionshöhe in Blättern transgener T2 Arabidopsis Pflanzen

12 T1 Linien wurden von jedem Konstrukt ausgewählt um die Expression von GUS in den Nachkommenschaften zu ermitteln. Dazu wurden von jeder Linie 10 Nachkommen angezogen und 3 Wochen nach Aussaat Blätter geerntet und wie beschrieben die Transkriptmenge von GUS mittels qPCR bestimmt.
Die Schwankungsbreite innerhalb der T2 einer Linie ist geringer in den Nachkommenschaften der 1bxPcUbiGUS Pflanzen (Tab. 4). Tabelle 4 Bestimmung der GUS Expression in Nachkommenschaften transgener Arabidopsispflanzen. Angegeben ist der Median der delta Ct Werte aus der Messung von jeweils 10 T2 Pflanzen jeder Linie sowie der Range der Messwerte

Äquivalente

Der Fachmann erkennt oder kann viele Äquivalente der hier beschriebenen erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen, indem er lediglich Routineexperimente verwendet. Diese Äquivalente sollen von den Patentansprüchen umfasst sein. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen unter der Kontrolle eines Petersilie-Ubiquitin- Promotors dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:

a) Verknüpfung der zu exprimierenden Nukleinsäure mit einem Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder

b) einem funktionellen Äquivalent oder äquivalenten Fragment, das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie a) besitzt und

c) Einbringen des Nukleinsäurekonstrukts in eine Pflanze, das aus der zu exprimierenden Nukleinsäure, die unter der Kontrolle der 5'-Region des unter a) oder b) genannten Promotors liegt, und dem Promotor gebildet wird, unter Bedingungen die die stabile Integration der Nukleinsäure in das Pflanzengenom ermöglicht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu exprimierende Nukleinsäure mit weiteren regulatorischen Sequenzen funktionell verknüpft ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure für ein Gen codiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Selektionsmarker, einem Reportergen, einem Enzym, einem Protein das Insekten-, Virus-, Bakterien-, Pilz- oder Nematodenresistenz vermittelt, einer Nukleinsäuresequenz oder einem Protein, das Trocken-, Kälte-, Hitze- oder Salzresistenz in Pflanzen vermittelt, einem Inhibitor, einem Lektin, einer RNAase, einem Ribozym, einem Antikörper, einem Vaccin, einem Pharmazeutikum, einem "antifreezing"-Protein, einem Cytochrom P-450-Protein, einem Transkriptions-Aktivator oder -Repressor oder einem Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist, ein Protein aus dem Fettsäurestoffwechsel, dem Aminosäurestoffwechsel, dem Vitaminstoffwechsel, dem Carotinoidstoffwechsel oder dem Kohlenhydratstoffwechsel ist.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass im Nukleinsäurekonstrukt weitere Gene unter der Kontrolle des Petersilie-Ubiquitin-Promotors oder eines anderen Promotors enthalten sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in sense oder antisense-Richtung oder sense- und antisense-Richtung exprimiert wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt zwischen zwei T-DNA-Abschnitte inseriert ist.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der transgenen Pflanze um eine monokotyle oder dikotyle Pflanze handelt.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der transgenen Pflanze um eine monokotyle Pflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Reis, Triticale, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Ryegras oder Hirse handelt.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der transgenen Pflanze um eine dikotyle Pflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Raps, Nachtkerze, Canola, Erdnuss, Königskerze, Distel, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Wildrosen, Kürbis, Pistazien, Sesam, Lein, Sonnenblume, Färberdistel, Soja, Borretsch, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Zuckerrübe, Tomate, Kartoffel, Tabak, Karotte, Pappel, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Aubergine, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss oder Arabidopsis handelt.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der Nukleinsäuren konstitutiv erfolgt.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Expression der Nukleinsäuren in den transgenen Pflanzen entstandenen Produkte nach Kultivierung der Pflanzen isoliert werden.

13. Nukleinsäurekonstrukt zur stabilen transgenen Expression von Nukleinsäuren in einem Verfahren gemäß Anspruch 1 enthaltend

a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder

b) funktionelle Äquivalente oder äquivalente Fragmente, das im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzt,

wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.

14. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein weiteres Element ausgewählt aus der folgenden Gruppe enthält

a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder

b) das Nukleinsäurekonstrukt zusätzliche Funktionselemente enthält, oder

c) das zwischen dem Promotor und der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ein Polylinker vorhanden ist, oder

d) das Nukleinsäurekonstrukt mindestens eine weitere Nukleinsäure unter Kontrolle des Promotors gemäß SEQ ID NO: 1 oder eines funktionellen Äquivalents oder äquivalenten Fragments oder eines weiteren Promotors enthält.

15. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurekonstrukt zwischen zwei T-DNA-Abschnitten inseriert ist.

16. Nukleinsäurekonstrukt nach den Ansprüchen 13 bis 15, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäuren bestehend aus einem Selektionsmarker, einem Reportergen, einem RNAi-Konstrukt, einem Enzym, einem Protein das Insekten-, Virus-, Bakterien-, Pilz- oder Nematodenresistenz vermittelt, einer Nukleinsäuresequenz oder einem Protein, das Trocken-, Kälte-, Hitze- oder Salzresistenz in Pflanzen vermittelt, einem Inhibitor, einem Lektin, einer RNAase, einem Ribozym, einem Antikörper, einem Vaccin, einem Pharmazeutikum, einem "antifreezing"-Protein, einem Cytochrom P-450-Protein, einem Transkriptions-Aktivator oder -Repressor oder einem Protein, das an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt ist.

17. Vektoren enthaltend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß den Ansprüchen 13 bis 16.

18. Transgene Pflanze transformiert mit einem Nukleinsäurekonstrukt gemäß den Ansprüchen 13 bis 16 oder einem Vektor gemäß Anspruch 17.

19. Transgene Pflanze nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine dikotyle oder monokotyle Pflanze ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Reis, Triticale, Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Ryegras, Hirse, Raps, Nachtkerze, Canola, Erdnuss, Königskerze, Distel, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Wildrosen, Kürbis, Pistazien, Sesam, Lein, Sonnenblume, Färberdistel, Soja, Borretsch, Mohn, Senf, Hanf, Rhizinus, Olive, Calendula, Punica, Zuckerrübe, Tomate, Kartoffel, Tabak, Karotte, Pappel, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Aubergine, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss oder Arabidopsis handelt.

20. Verwendung einer transgenen Pflanze nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Kosmetika, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.