CN102356157A - 具有改变的氮代谢的转基因植物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多核苷酸，其能够增强转化有此种多核苷酸的植物的产量。也提供了使用此种多核苷酸的方法和含有此种多核苷酸作物转基因的转基因植物和包括种子的农产品。
Description
本申请主张2009年1月28日递交的美国临时专利申请系列号61/147,772的优先权，在此将其整个内容全部引用作为参考。
发明领域
本发明总体涉及在特定的植物组织和器官中过表达分离的多核苷酸从而提高所述植物产率的转基因植物，所述多核苷酸编码在氮代谢中有活性的多肽。
发明背景
人口增长和气候变化使得全球食品、饲料以及燃料短缺的可能性引起近年的巨大关注。农业消耗人类用水的70％，而现今，全球众多地区的降雨量下降。此外，随着土地使用从耕种转至城乡用地，更少公顷的耕地可用于种植农作物。农业生物技术试图通过能增加作物产量的植物遗传修饰，例如通过赋予植物对于非生物胁迫应答更好的耐受性或者通过增加生物量来满足人类日益增长的需要。
作物产量在此定义为每英亩收获的相关农产品(例如谷物、饲料或种子)的蒲式耳数。作物产量受到非生物胁迫如干旱、热、盐度、和冷胁迫，以及植物大小(生物量)的影响。传统的植物育种策略是相对慢的并且通常对于赋予对非生物胁迫的增加的耐受而言是不成功的。在玉米中，通过常规育种提高谷物产量几乎达到了平台期。在过去的一百年间，对于谷物产量的选择性育种，玉米的收获指数(即，收获时的生物量产量与总累计生物量的比)基本上没有改变。因此，近年来在玉米中发生的产量提高是每单位土地面积上总生物量生产增加的结果。这一增加的总生物量是通过增加种植密度而实现的，这造成适应性表型的改变，例如叶角度的减小，这可降低下层叶的遮光、以及雄花穗大小而可增加收获指数。
当土壤水分缺乏或者干旱期间没有水分时，作物产量受限。如果从叶的蒸腾超过根的水分供给，那么就产生植物水分缺乏。可用的水分供给与土壤中含有的水分量以及植物以其根系接触水分的能力相关。水分从叶的蒸腾与光合作用通过气孔的二氧化碳固定相关联。这两个过程是正相关的，使得通过光合作用的高二氧化碳流入与蒸腾作用的水分损失紧密相关联。随着水分从叶蒸腾，叶水势降低并且气孔趋于关闭，以水压过程的方式限制光合作用的量。由于作物产量取决于光合作用中的二氧化碳固定，水分摄取和蒸腾是作物产量的贡献因子。能使用较少水分来固定相同量的二氧化碳或者能够在较低水位下发挥正常功能的植物有进行更多光合作用并因此在多种农业体系下产生更多的生物量和经济作物产量的潜能。
农业生物学家致力于使用模式植物体系的检测、作物的温室研究以及大田实验来开发通过增加对于非生物胁迫的耐受或者通过增加生物量而展现增加的产量的转基因植物。例如，水分利用效率(WUE)通常是与干旱耐受相关的参数。也使用关于植物对脱水、渗透性冲击以及极端温度的应答的研究来测定植物对于非生物胁迫的耐受或抗性。
在低水分利用时的生物量增加可能是由于相对提高的生长效率或者降低的水分消耗。在筛选改善作物的性状时，不改变生长而水分利用减少将对于输水成本很高的灌溉农业体系尤为重要。水分利用没有相应增加而生长增加将可应用于所有农业体系。在供水不受限的许多农业体系中，生长增加，即使是以水分利用的增加为代价，也会增加产量。
农业生物学家也使用表示转基因对作物产量的潜在影响的其他参数的测量。对于饲料作物，如苜蓿、青贮玉米和干草，植物生物量与总产量相关联。然而，对于谷物作物，使用诸如植物大小的其他参数来预测产量，参数由总植物干重、地上干重、地上湿重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座(rosette)直径、叶长、根长、根重、分蘖数、和叶数所测量。早期发育阶段的植物大小通常将与随后发育期的植物大小相关联。具有较大叶面积的较大植物通常可以比较小植物吸收更多的光和二氧化碳并因此将可能在相同的时间内获得更大的质量。对于植物大小和生长速率存在强的遗传组分，因此，对于一些不同基因型，在一种环境条件下的植物大小可能与另一种条件下的大小相关联。以此方式，使用标准环境来模拟作物在大田的不同位置和时间所经历的不同且动态的环境。
收获指数在许多环境条件下都是相对稳定的，并因此在植物大小和谷物产量之间稳健的相关性是可能的。植物大小和谷物产量是内在关联的，因为多数谷物生物量取决于当前的或由植物叶和茎储存的光合生产率。对于非生物胁迫耐受，在生长室或温室中的标准化条件下，在早期发育时测量植物大小是测量由于转基因存在而赋予的潜在产量优势的标准实践。
氮在植物生长中起关键作用。它是多数植物物种生长的限制营养。从种子生存力通过萌发和生长的植物发育的成功直接与氮含量相关。氮是基础结构要素的关键组分，例如氨基酸和产生的蛋白质、含氮核苷以及信号分子。植物中的氮代谢不可分地关联碳代谢和光合。用于生长的氮的三种来源包括1)来自土壤的无机N同化成氨基酸；2)氨基或其他有机形式的N从一个分子转移到另一个分子；以及3)从蛋白质、氨基酸和其他含氮化合物分解的N的再利用。
全世界将尿素广泛用作氮肥。然而，尿素中的氮只能通过尿素酶的酶促水解而成为植物可用的，尿素酶将尿素转变成二氧化碳和氨。土壤微生物含有具两个或三个亚基的尿素酶，这些亚基被称作α、β和γ，并且形成六聚物。植物也含有六聚体尿素酶，但是植物尿素酶的六聚物是由六个相同的亚基形成的。每个植物尿素酶亚基含有与微生物尿素酶α、β和γ亚基同源的区域。
土壤中来自有机物和/或商品化化肥的氮被根摄取而遍布植物分布。来自土壤的氮通常是硝酸盐的形式，并且必须被还原成氨用于氨基酸和蛋白质合成。氨对于植物细胞是有毒的，并且必须被迅速地转变成氨基酸，氨基酸参与植物的多种功能。例如，氨基酸在根、叶、茎、果实等等之间转运氮。此外，氨基酸是含氮化合物如叶绿素和酶辅因子如辅酶A的合成前体。此外，氨基酸是蛋白质的结构单元、以及是二级化合物如生物碱、酚酸和含氰化合物的氮源。
氨基酸合成途径是分支且交织的；根据细胞在特定时间的需求，氮必须被分配到若干不同的氨基酸化合物中。细胞中的代谢条件可能需要多种氨基酸的合成，使得必须有高度调控的途径来建立并维持氨基酸池。参与氨基酸合成的酶被调控至不同程度。此外，使用来自现有蛋白质的氨基酸通过蛋白水解酶的作用形成新合成的蛋白质。蛋白质水解对多种细胞持家功能是重要的，所述持家功能包括分解由于非生物胁迫产生的异常蛋白质，非生物胁迫例如脱水、突变、极端温度和自由基引起的损伤。
芳香氨基酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸不仅是植物蛋白质合成所需的，而且它们也是许多对于木质部的结构支撑重要的芳香次级代谢物的前体，所述芳香次级代谢物例如植物生长调节物生长素，抗微生物生物碱、紫外吸收黄酮类化合物，和多酚化合物如木质素。在胁迫植物组织中，芳香次级代谢物的增加与芳香次级代谢途径中的酶活性增加(以及诱导的基因)相关，该途径包括莽草酸途径。莽草酸途径可以含有20％的植物光合固定碳，其中多数通过苯丙氨酸和酪氨酸穿梭用于次级代谢物。
分支酸变位酶(EC 5.4.99.5)催化芳香氨基酸的生物合成的第一步。分支酸变位酶被鉴定为单功能的(有或没有别构控制)或双功能的。当分支酸变位酶是双功能的，突变酶活性可与预苯酸脱氢酶或3-脱氧阿糖庚酮醛酸(deoxyarabinoheptulosonate)7-磷酸合成酶结合。三种分支酸变位酶基因(CM-1、CM-2和CM-3)在拟南芥中的差异表达于不同组织类型中观察到，并且是应答环境胁迫。CM-1和CM-3被游离氨基酸别构调节，而CM-2没有。此外，CM-1和CM-3都具有假质体靶向序列，而CM-2似乎是胞浆酶，并且是在根中最高表达的CMRNA。
氮也是包括遗传物质DNA、RNA的核苷酸以及辅因子如NADH，(NAD+)的关键组分。核苷酸可以从多种氨基酸分类中从头合成，或者可以通过核苷酸补救途径被再利用，后者可以节省能量。NAD+(一种二核苷酸)可以从色氨酸或天冬氨酸从头合成。NAD+的主要功能是在细胞代谢的多种氧化还原反应中携带电子。
尽管迄今已表征了参与植物中的胁迫应答、水分利用和/或生物量的一些基因，但是在开发产量提高的转基因作物方面的成功有限，并且尚未有这样的植物被商业化。因此，需要鉴定具有增加作物产量的能力的其他基因。
发明概述
本发明人发现为了通过修饰氮代谢来实现植物产量的提高，存在三种必须被优化的关键组分：蛋白质的亚细胞靶向、蛋白质的基因表达水平和蛋白质的调控性质。当如在此所表达时，表1中列出的氮代谢多核苷酸和多肽能够提高转基因植物的产量。
表1
在一个实施方式中，本发明提供转化有表达盒的转基因植物，该表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸以及编码包括尿素酶β亚基且具有尿素酶活性的全长多肽的分离多核苷酸，其中相比于不包括该表达盒的相同品种的野生型植物而言，该转基因植物证明有增加的产量。
在另一实施方式中，本发明提供转化有表达盒的转基因植物，该表达盒包括有效结合的编码能增强叶中基因表达的启动子的分离多核苷酸；编码线粒体转运肽的分离多核苷酸；以及编码全长分支酸变位酶多肽的分离多核苷酸，其中相比于不包括该表达盒的相同品种的野生型植物而言，该转基因植物证明有增加的产量。
在另一实施方式中，本发明提供增加植物产量的方法，该方法用表达盒转化野生型植物细胞；从转化植物细胞再生转基因植物；以及从再生植物中筛选较高产量的植物，所述表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸以及编码全长天冬氨酸激酶多肽的分离多核苷酸。
在另一实施方式中，本发明提供增加植物产量的方法，该方法用表达盒转化野生型植物细胞；从转化植物细胞再生转基因植物；以及从再生植物中筛选较高产量的植物，所述表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸；编码线粒体转运肽的分离多核苷酸；以及编码包括乙醇脱氢酶GroES-样结构域的全长蛋白酶多肽的分离多核苷酸。
在另一实施方式中，本发明提供转化有表达盒的转基因植物，该表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸以及编码包括PF01571结构域和PF08669结构域的全长氨甲基转移酶多肽的分离多核苷酸，其中相比于不包括该表达盒的相同品种的野生型植物而言，该转基因植物证明有增加的产量。
在另一实施方式中，本发明提供转化有表达盒的转基因植物，该表达盒包括有效结合的编码能够增强叶、根或苗中表达的启动子的分离多核苷酸；编码线粒体转运肽的分离多核苷酸；以及编码全长植物尿苷/胞苷激酶的分离多核苷酸，其中相比于不包括该表达盒的相同品种的野生型植物而言，该转基因植物证明有增加的产量。
在另一实施方式中，本发明提供增加植物产量的方法，该方法用表达盒转化野生型植物；从转化植物细胞再生转基因植物；以及从转基因植物中筛选较高产量的植物，所述表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸；以及编码全长植物L-天冬氨酸氧化酶的分离多核苷酸。这一实施方式中使用的表达盒可任选地包括编码线粒体转运肽的分离多核苷酸。
在又一实施方式中，本发明提供上述转基因植物生产的种子，其中该种子对于包括上述表达载体的转基因是纯种的。相比于野生型品种的植物，源自本发明种子的植物证明对于环境胁迫的增加的耐受，和/或在正常或胁迫条件下增加的植物生长和/或增加的产量。
在又另一实施方式中，本发明提供由本发明的转基因植物、它们的植物部分或它们的种子生产的或来自其的产物，例如食品、饲料、食品补充物、饲料添加物、纤维、化妆品或药物。
本发明还提供某些在表1中鉴定的分离多核苷酸以及某些在表1中鉴定的分离多肽。本发明也体现在包括本发明分离多核苷酸的重组载体。
在又另一实施方式中，本发明涉及生产前述转基因植物的方法，其中该方法包括用表达盒转化植物细胞，该表达盒包括本发明的分离多核苷酸，以及从该植物细胞产生表达该多核苷酸编码的多肽的转基因植物。相比于野生型品种的植物，该多肽在植物中的表达使得增加对于环境胁迫的耐受，和/或增加在正常和/或胁迫条件下的生长和/或产量。
在又另一实施方式中，本发明提供增加植物对于环境胁迫的耐受和/或增加植物生长和/或产量的方法。该方法包括下述步骤：用包括表1的分离多核苷酸的表达盒转化植物细胞，以及从该植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物包括该多核苷酸。
附图简要说明
图1示出被称作sll0420(SEQ ID NO：2)和ZM07MC17684(SEQ IDNO：4)的尿素酶多肽的氨基酸序列的比对。该比对使用Vector NTIAdvance 10.3.0的Align X产生。
图2示出被称作YPR060C(SEQ ID NO：20)和GM06MC36749(SEQ ID NO：22)的分支酸变位酶蛋白的氨基酸序列的比对。该比对使用Vector NTI Advance 10.3.0的Align X产生。
图3示出编码被称作YMR152W(SEQ ID NO：32)、GM06MC00335(SEQ ID NO：34)和ZM07MC01243(SEQ ID NO：36)的蛋白酶多肽的氨基酸序列的比对。该比对使用Vector NTI Advance 10.3.0的Align X产生。
图4示出编码被称作b2066(SEQ ID NO：42)、GM06MC13058(SEQID NO：44)、OS07MC01669(SEQ ID NO：46)、ZM07MC11423(SEQ IDNO：48)和ZM07MC23131(SEQ ID NO：50)的尿苷/胞苷激酶多肽的氨基酸序列的比对。该比对使用Vector NTI Advance 10.3.0的Align X产生。
优选实施方式的详细说明
贯穿这一申请，参考多篇出版物。所有这些出版物和那些出版物中引用的那些参考的公开内容都在此整体引用到本申请作为参考以便更全面地描述本发明所属领域的现有技术。在此使用的术语仅仅是为了描述特定实施方式的目的而并不旨在作为限制。如在此使用，“一”可以根据使用它的上下文而意指一或多。因此，例如，对于“一个细胞”的引用可以意指可以使用至少一个细胞。
在一个实施方式中，本发明提供在本文所示的亚细胞区室和组织中过表达表1所鉴定的分离多核苷酸的转基因植物。本发明的转基因植物证明比野生型品种植物有提高的产量。如在此使用，术语“提高的产量”意指任何所测量的植物产品，例如谷物、果实或纤维产量的任何提高。根据本发明，不同表型性状的改变可以提高产量。例如，诸如花器官发育、生根、根生物量、种子数、种子重、收获指数、对于非生物环境胁迫的耐受、叶形成、趋光性、顶端优势和果实发育的参数是适于测量提高的产量的参数，但不限于此。根据本发明，产量的任何增加都是提高的产量。例如，产量提高可以包括任何所测参数的0.1％、0.5％、1％、3％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的增加。例如，根据本发明，相比于来自相同条件下耕种的未处理的大豆或玉米的蒲式耳/英亩(bu/acre)产量，来自转基因作物的大豆或玉米的蒲式耳/英亩产量的增加是提高的产量，所述转基因作物包括转基因有表1的核苷酸和多肽的植物。
如在此所定义，“转基因植物”是使用重组DNA技术而被改变以含有本来不存在于植物中的分离核酸的植物。如在此使用，术语“植物”包括整个植物、植物细胞和植物部分。植物部分包括但不限于茎、根、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子等。本发明的转基因植物可为雄性不育的或者雄性可育的，并且可进一步包括除了含在此所述的分离多核苷酸以外的转基因。
如在此使用，术语“品种”指在物种中共享稳定特性的一群植物，所述特性将它们与该物种中的典型形式和其他可能的品种分开。尽管具有至少一种不同的性状，但是品种也由该品种内的个体间的一些差异所表征，主要基于连续世代的后代间性状的孟德尔分离。品种如果对于特定性状在遗传上纯合到如下程度，那么认为其是对于所述性状为“纯种的”，所述程度为当纯种的品种自花授粉时，不会在后代之间观察到显著量的性状的独立分离。在本发明中，性状来自被导入植物品种的一或多种分离多核苷酸的转基因表达。也如在本发明中使用，术语“野生型品种”指作为对照用于比较目的而进行分析的一群植物，其中该野生型品种植物与转基因植物(转化有根据本发明的分离多核苷酸的植物)相同，只是野生型品种植物没有被本发明的分离多核苷酸转化。术语“野生型”如在此使用指没有被根据本发明的分离多核苷酸遗传修饰的植物细胞、种子、植物部分、植物组织、植物器官或整个植物。
如在此使用，术语“对照植物”指用于与转基因或者遗传改造的植物进行比较来鉴定转基因或者遗传改造的植物的增强的表型或者想要的性状的植物细胞、外植体、种子、植物组分、植物组织、植物器官、或者整个植物。“对照植物”在一些情形下可以是包括空载体或者标记基因的转基因植物系，但其不含待评估的转基因或者遗传改造的植物中存在的目的重组多核苷酸。对照植物可以是与待测转基因或遗传改造的植物相同的系或者品种的植物，或者该对照植物可以是另外的系或品种，例如已知具有特定表型、特征或者已知基因型的植物。适当的对照植物应包括用于产生本文的转基因植物的亲本系的遗传未改变的或者非转基因植物。
如在此限定，术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的并且指线性或分支、单链或双链的RNA或DNA或它们的杂交体。该术语也包含RNA/DNA杂交体。“分离的”核酸分子是基本上与存在于天然核酸来源中的其他核酸分子(即，编码其他多肽的序列)相分离的分子。例如，克隆的核酸被认为是分离的。核酸如果经人类干涉而改变、或者被放在并非其天然位点的座位或位置、或者通过转化被导入到细胞中，那么也被认为是分离的。此外，分离的核酸分子如cDNA分子可以不含与其天然相关的一些其他细胞物质，或者不含用重组技术生产时的培养基或者化学合成时的化学前体或其它化学品。尽管可任选地包含位于基因编码区的3’和5’端的非翻译序列，但是优选的可以是除去其天然发生的复制子中编码区的天然侧翼序列。
如在此使用，术语“环境胁迫”指与盐度、干旱、氮、温度、金属、化学品、病理、或氧化胁迫或者它们的任何组合相关的次佳条件。如在此使用，术语“干旱”指可用于支持植物生长或发育的水的量小于最优值的环境条件。如在此使用，术语“鲜重”指植物中包括水的任何部分。如在此使用，术语“干重”指植物除水以外的任何部分，并且包括，例如碳水化合物、蛋白质、油和矿物营养。
可转化任何植物物种以产生根据本发明的转基因植物。本发明的转基因植物可以是双子叶植物或者单子叶植物。例如但非限制地，本发明的转基因植物可来自下述双子叶植物科中任一：豆科(Leguminosae)，包括植物如豌豆、苜蓿和大豆；伞形科(Umbelliferae)，包括植物如胡萝卜和芹菜；茄科(Solanaceae)，包括植物如番茄、马铃薯、茄子、烟草和胡椒；十字花科(Cruciferae)，特别是芸苔属(Brassica)，其包括植物如油菜、甜菜、甘蓝、花椰菜和绿花椰菜)；以及拟南芥(A.thaliana)；菊科(Compositae)，包括植物如莴苣；锦葵科(Malvaceae)，包括棉花；豆科(Fabaceae)，包括植物如花生，等等。本发明的转基因植物可来自单子叶植物，例如小麦、大麦、高粱、黍、黑麦、黑小麦、玉米、稻、燕麦和甘蔗。本发明的转基因植物也体现为树，如苹果、梨、榅桲、李子、樱桃、桃、油桃、杏、木瓜、芒果和其他木本物种包括针叶和落叶树木如白杨、松树、红杉、雪松、橡树，等等。特别优选拟南芥、烟草(Nicotiana tabacum)、稻、油菜、卡诺拉(canola)、大豆、玉米、棉花和小麦。
在一个实施方式中，本发明提供具有表达盒的转基因植物，该表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸以及编码全长尿素酶β亚基多肽的分离多核苷酸。在第二步中，从转化植物细胞再生转基因小植株。在第三步中，对转基因小植株进行产量相关的检测，并且从再生的转基因植物筛选较高产量的植物。
如下表2所示，当在pcUbi启动子控制下表达集胞蓝细菌属(Synechocystis)尿素酶基因sll0420(SEQ ID NO：1)时，植物证明在水分受限的条件下有提高的产量。sll0420尿素酶多肽(SEQ ID NO：2)包括SEQ ID NO：2的氨基酸5至氨基酸104的尿素酶β亚基结构域(PF00699)。SEQ ID NO：4中提出的玉米尿素酶包括SEQ ID NO：4的氨基酸132至氨基酸231的尿素酶β结构域、氨基酸268至氨基酸385的尿素酶α结构域(PF00449)以及氨基酸1至氨基酸100的尿素酶γ结构域(PF00547)各者。SEQ ID NO：6的拟南芥尿素酶包括SEQ ID NO：6的氨基酸133至氨基酸232的尿素酶β结构域、氨基酸270至氨基酸390的尿素酶α结构域以及氨基酸1至氨基酸100的尿素酶γ结构域各者。SEQ ID NO：8的苜蓿中华根瘤菌尿素酶包括氨基酸2至氨基酸101的尿素酶β结构域。SEQ ID NO：10的解淀粉芽孢杆菌尿素酶包括氨基酸2至氨基酸101的尿素酶β结构域。SEQ ID NO：12的根瘤农杆菌尿素酶包括氨基酸2至氨基酸101的尿素酶β结构域。SEQ ID NO：14的豌豆根瘤菌(R.leguminosarum)尿素酶包括氨基酸2至氨基酸101的尿素酶β结构域。SEQ ID NO：16的大豆尿素酶包括SEQ ID NO：16氨基酸133至氨基酸232的尿素酶β结构域、氨基酸270至氨基酸390的尿素酶α结构域以及氨基酸1至氨基酸100的尿素酶γ结构域各者。SEQ IDNO：18的嗜谷氨酸棒状杆菌尿素酶包括氨基酸2至氨基酸101的尿素酶β结构域。
根据本发明，在这一实施方式的方法中可使用包括尿素酶β亚基结构域的任何尿素酶多肽。优选地，这一实施方式的方法使用编码包括β亚基结构域的全长尿素酶多肽的多核苷酸。更优选地，这一实施方式中使用的多核苷酸编码包括β亚基结构域的尿素酶多肽，该β亚基结构域选自SEQ ID NO：2的氨基酸5至氨基酸104；SEQ ID NO：4的氨基酸132至氨基酸231；SEQ ID NO：6的氨基酸133至氨基酸232；SEQ IDNO：8的氨基酸2至氨基酸101；SEQ ID NO：10的氨基酸2至氨基酸101；SEQ ID NO：12的氨基酸2至氨基酸101；SEQ ID NO：14的氨基酸2至氨基酸101；SEQ ID NO：16的氨基酸133至氨基酸232；和SEQ IDNO：18的氨基酸2至氨基酸101。更优选地，这一实施方式的方法中使用的多核苷酸编码具有下述序列的尿素酶，该序列包括SEQ ID NO：2的氨基酸1至105；SEQ ID NO：4的氨基酸1至氨基酸385；SEQ ID NO：6的氨基酸1至氨基酸838；SEQ ID NO：8的氨基酸1至氨基酸101；SEQID NO：10的氨基酸1至氨基酸124；SEQ ID NO：12的氨基酸1至氨基酸101；SEQ ID NO：14的氨基酸1至氨基酸101；SEQ ID NO：16的氨基酸1至氨基酸837；或SEQ ID NO：18的氨基酸1至氨基酸162。
在另一实施方式中，本发明提供转化有表达盒的转基因植物，该表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸；编码线粒体转运肽的分离多核苷酸；以及编码全长分支酸变位酶多肽的分离多核苷酸，其中相比于不包括该表达盒的相同品种的野生型植物而言，该转基因植物证明有增加的产量。
如下表3所示，当在USP启动子控制下将酿酒酵母分支酸变位酶基因YPR060C(SEQ ID NO：19)靶向线粒体时，植物证明对水分受限的条件下有提高的应答。YPR060C分支酸变位酶多肽包括SEQ ID NO：20的氨基酸16至氨基酸85的CM_2特征序列。SEQ ID NO：22的大豆分支酸变位酶多肽包括SEQ ID NO：22的氨基酸21至氨基酸88的CM_2特征序列。
根据本发明，这一实施方式中的表达盒可包括编码分支酸变位酶多肽的任何多核苷酸。优选地，这一实施方式中的表达盒包括编码分支酸变位酶多肽的多核苷酸，该多肽包括选自SEQ ID NO：20的氨基酸16至85和SEQ ID NO：22的氨基酸21至88的CM_2结构域。更优选地，这一实施方式的方法使用编码分支酸变位酶多肽的多核苷酸，该多肽包括SEQ ID NO：20的氨基酸1至256或SEQ ID NO：22的氨基酸1至261。
在另一实施方式中，本发明提供增加植物产量的方法，该方法用表达盒转化野生型植物细胞；从转化植物细胞再生转基因植物；以及从再生植物中筛选较高产量的植物，所述表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸以及编码全长天冬氨酸激酶多肽的分离多核苷酸。
如下表4所示，集胞蓝细菌属天冬氨酸激酶基因slr0657(SEQ IDNO：23)在pcUbi启动子控制下，转基因植物证明有比对照植物更高的生物量。氨基酸激酶家族模体(PF00696)存在于slr0657中，在SEQ ID NO：24的残基2-232处。此外，ACT结构域(PF01842)存在于slr0657中，在SEQ ID NO：24的氨基酸残基272-338、359-417、447-517和531-589处。
优选地，这一实施方式的方法使用编码具有天冬氨酸激酶活性且包括PF00696结构域的多肽的多核苷酸。更优选地，这一实施方式的方法使用编码天冬氨酸激酶多肽的多核苷酸，该多肽包括SEQ ID NO：24的氨基酸2至232以及至少一个PF01842结构域，该结构域选自SEQ IDNO：24的氨基酸195-264，SEQ ID NO：24的氨基酸359-417，SEQ IDNO：24的氨基酸447-517和SEQ ID NO：24的氨基酸531-589。更优选地，这一实施方式的方法使用编码天冬氨酸激酶蛋白的多核苷酸，该激酶蛋白具有包括SEQ ID NO：24的氨基酸1至600；SEQ ID NO：26的氨基酸1至527；SEQ ID NO：28的氨基酸1至569或SEQ ID NO：30的氨基酸1至569的序列。
在另一实施方式中，本发明提供增加植物产量的方法，该方法用表达盒转化野生型植物细胞；从转化植物细胞再生转基因植物；以及从再生植物中筛选较高产量的植物，所述表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸；编码线粒体转运肽的分离多核苷酸；以及编码包括乙醇脱氢酶GroES-样结构域的全长蛋白酶多肽的分离多核苷酸。
如下表5所提出，当酿酒酵母基因YMR152W(SEQ ID NO：31)在USP启动子控制下靶向线粒体时，植物证明对于周期干旱条件有增强的应答。基因YMR152W编码一种蛋白酶，该蛋白酶包括在SEQ ID NO：32的氨基酸35至123处，被称作PF08240的乙醇脱氢酶GroES-样(ADH_N)结构域。SEQ ID NO：34中提出的大豆蛋白酶包括在氨基酸111至202处的ADH_N结构域。SEQ ID NO：36中提出的玉米蛋白酶包括在氨基酸28至119处的ADH_N结构域。
根据本发明，这一实施方式的方法可使用任何编码包括ADH-N结构域的蛋白酶多肽的多核苷酸。优选地，本方法中使用的多核苷酸编码蛋白酶多肽，该多肽包括选自SEQ ID NO：32的氨基酸35至123、SEQID NO：34的氨基酸111至202，以及SEQ ID NO：36的氨基酸28至119的ADH_N结构域。最优选地，这一实施方式的方法中使用的多核苷酸编码蛋白酶，该蛋白酶具有包括SEQ ID NO：32的氨基酸1至365、SEQID NO：34的氨基酸1至392，或SEQ ID NO：36的氨基酸1至251的序列。
在另一实施方式中，本发明提供转化有表达盒的转基因植物，该表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸以及编码包括PF01571结构域和PF08669结构域的全长氨甲基转移酶多肽的分离多核苷酸，其中相比于不包括该表达盒的相同品种的野生型植物而言，该转基因植物证明有增加的产量。
如下表6所提出，当大肠杆菌基因b2905(SEQ ID NO：37)在Super启动子控制下没有亚细胞靶向信号的情况下，在拟南芥中表达时，植物证明对于周期干旱和充分给水条件有增强的应答。基因b2905编码氨甲基转移酶，该酶包括两个结构域：在SEQ ID NO：38的氨基酸46至254处称作PF01571的氨甲基转移酶叶酸结合结构域；以及在SEQ IDNO：38的氨基酸262至354处称作PF08669的甘氨酸裂解T蛋白C端桶形结构域。
这一实施方式的转基因植物可包括任何编码氨甲基转移酶多肽的多核苷酸。优选地，这一实施方式的转基因植物中表达的氨甲基转移酶多肽包括选自SEQ ID NO：38的氨基酸46至254；SEQ ID NO：40的氨基酸81至296的PF01571结构域；和选自SEQ ID NO：40的氨基酸305至397的PF08669结构域。更优选地，这一实施方式的转基因植物包括编码氨甲基转移酶的多核苷酸，该氨甲基转移酶具有包括SEQ ID NO：38的氨基酸1至364；SEQ ID NO：40的氨基酸1至408的序列。
在另一实施方式中，本发明提供转化有表达盒的转基因植物，该表达盒包括有效结合的编码能够增强叶、根或苗中表达的启动子的分离多核苷酸；编码线粒体转运肽的分离多核苷酸；以及编码全长植物尿苷/胞苷激酶的分离多核苷酸，其中相比于不包括该表达盒的相同品种的野生型植物而言，该转基因植物证明有增加的产量。
如下表7所提出，当大肠杆菌基因b2066(SEQ ID NO：41)与线粒体靶向信号在USP启动子或者Super启动子的控制下表达时，植物证明在水分受限的条件下有增强的应答。基因b2066编码尿苷激酶，该激酶包括SEQ ID NO：42的氨基酸28至218处，被称作PF00485的磷酸核酮糖激酶/尿苷激酶家族结构域。
这一实施方式的转基因植物可包括编码植物尿苷激酶多肽的任何多核苷酸。优选地，这一实施方式的转基因植物包括编码尿苷激酶多肽的多核苷酸，该多肽包括选自SEQ ID NO：42的氨基酸55至242；SEQ IDNO：46的氨基酸1至121，SEQ ID NO：48的氨基酸67至241，SEQ IDNO：50的氨基酸52至228的、被称作PF00485的结构域。更优选地，这一实施方式的转基因植物包括编码植物尿苷激酶的多核苷酸，该尿苷激酶具有包括SEQ ID NO：42的氨基酸1至231，SEQ ID NO：44的氨基酸1至476，SEQ ID NO：46的氨基酸1至496，SEQ ID NO：48的氨基酸1至251或SEQ ID NO：50的氨基酸1至228的序列。
在另一实施方式中，本发明提供增加植物产量的方法，该方法用表达盒转化野生型植物；从转化植物细胞再生转基因植物；以及从转基因植物中筛选较高产量的植物，所述表达盒包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸；以及编码全长植物L-天冬氨酸氧化酶的分离多核苷酸。这一实施方式中使用的表达盒可任选地包括编码线粒体转运肽的分离多核苷酸。
如下表8所提出，在水分受限的条件下，表达在PCUbi启动子控制下的集胞蓝细菌属基因sll0631(SEQ ID NO：52)的植物比不表达sll0631基因的对照植物明显更大。这一效应在水分受限条件的胁迫下，在没有亚细胞靶向的转基因植物中观察到。基因sll0631编码L-天冬氨酸氧化酶，其特征在于具有在SEQ ID NO：52的氨基酸7至381处发现的被称作PF00890的FAD结合结构域。
这一实施方式的方法可使用包括编码L-天冬氨酸氧化酶多肽的任何多核苷酸的表达盒。优选地，这一实施方式的方法中使用的多核苷酸编码包括PF00890结构域的L-天冬氨酸氧化酶多肽。更优选地，这一实施方式的方法中使用的多核苷酸编码包括SEQ ID NO：52的氨基酸7至381的L-天冬氨酸氧化酶多肽。更优选地，这一实施方式的方法中使用的多核苷酸编码具有包括SEQ ID NO：52的氨基酸1至553的序列的L-天冬氨酸氧化酶。
本发明还提供一种种子，其对于在此所述的表达盒(在此也称作“转基因”)是纯种的，其中由所述种子生长的转基因植物证明相比于野生型品种植物的产量增加。本发明也提供由表达所述多核苷酸的转基因植物、它们的植物部分或者它们的种子生产的或者来自其的产品。该产品可以使用本领域公知的多种方法来获得。如在此使用，措词“产品”包括食物、饲料、食物补充剂、饲料补充剂、纤维、化妆品或药物，但不限于它们。食物被当作用于营养或用于补充营养的组合物。特别地，动物饲料和动物饲料补充剂被当作食物。本发明还提供由转基因植物、植物部分和植物种子中任一所生产的农产品。农产品包括植物提取物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂肪、油、多聚物、维生素等等，但不限于它们。
本发明也提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸具有选自SEQ IDNO：3；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：33，SEQ IDNO：35，SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：45，SEQ IDNO：47和SEQ ID NO：49的序列。本发明还包括一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有选自SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，和SEQ ID NO：50的氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸可以使用标准分子生物学技术以及在此提供的序列信息，例如使用自动DNA分析仪来分离。
本发明的分离的多核苷酸包括表1的多核苷酸的同系物。“同系物”在此定义为分别具有相似或基本上相同的核苷酸或氨基酸序列的两核酸或两多肽。同系物包括如下所定义的等位变体、类似物和直向同源物。如在此使用，术语“类似物”指具有相同或相似功能，但在不相关的生物体中分别进化的两核酸。如在此使用，术语“直向同源物”指来自不同物种，但通过物种形成从共同的祖先基因进化的两核酸。术语同系物还包括由于遗传密码的简并性而与表1所示的核苷酸序列之一不同但编码相同多肽的核酸分子。
为了确定两氨基酸序列(例如表1的多肽序列之一及其同系物)的序列同一性百分比，比对两序列用于优化比较的目的(例如可以在用于与一条多肽或者核酸进行优化比对的另一条多肽的序列中引入缺口)。然后比较相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当一条序列中的位置被与另一条序列的相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基占据时，那么两分子在该位置相同。可以在两核酸序列之间进行相同类型的比较。
优选地，本发明多肽的分离的氨基酸同系物、类似物和直向同源物与表1所鉴定的整个氨基酸序列有至少约50-60％，优选至少约60-70％，更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，以及最优选至少约96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在另一优选的实施方式中，本发明的分离的核酸同系物包括与表1所示的核苷酸序列有至少约40-60％，优选至少约60-70％，更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，以及甚至更优选至少约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
为了本发明的目的，使用Align 2.0(Myers和Miller，CABIOS(1989)4：11-17)，用设为默认设定的所有参数或者使用Vector NTI Advance10.3.0(PC)软件包(Invitrogen，1600 Faraday Ave.，Carlsbad，CA92008)来测定两核酸或多肽序列之间的序列同一性百分比。对于用Vector NTI计算的同一性百分比，使用缺口开放罚分15和缺口延伸罚分6.66来测定两核酸之间的同一性百分比。使用缺口开放罚分10和缺口延伸罚分0.1来测定两多肽之间的同一性百分比。所有其他参数都设为默认设定。为了多重比对(Clustal W算法)的目的，利用blosum62矩阵，缺口开放罚分是10，并且缺口延伸罚分是0.05。应理解为了测定序列同一性的目的，当比较DNA序列与RNA序列时，胸苷核苷酸相当于尿嘧啶核苷酸。
对应于表1所列多肽的同系物、类似物和直向同源物的核酸分子可以根据它们与所述多肽的同一性，使用编码各多肽的多核苷酸或基于它们的引物作为杂交探针，根据标准杂交技术在严谨杂交条件下分离。如在此使用，对于DNA与DNA印迹杂交，术语“严谨条件”指在60℃在10X Denhart’s溶液，6X SSC，0.5％SDS，以及100μg/ml变性鲑精DNA中过夜杂交。印迹在62℃顺序冲洗每次30分钟，在3X SSC/0.1％SDS，随后是1X SSC/0.1％SDS，以及最后是0.1X SSC/0.1％SDS。也如在此所使用，在优选的实施方式中，短语“严谨条件”指在65℃在6X SSC溶液中杂交。在另一实施方式中，“高严谨条件”指在65℃在10X Denhart’s溶液，6X SSC，0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中过夜杂交。印迹在65℃顺序冲洗每次30分钟，在3X SSC/0.1％SDS，随后是1X SSC/0.1％SDS，以及最后是0.1X SSC/0.1％SDS。进行核酸杂交的方法是本领域公知的。
本发明使用的分离多核苷酸可以被优化，即，遗传改造以增加它在给定植物或动物中的表达。为了提供植物优化的核酸，可以将基因的DNA序列修饰为：1)包括被高表达植物基因所优选的密码子；2)包括与在植物中基本上发现的核苷酸碱基组成中的A+T含量相同的A+T含量；3)形成植物起始序列；4)除去造成RNA不稳定、不适当聚腺苷酸化、降解和终止，或者形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列；或5)除去反义开放读码框。可以通过利用在全部植物或在特定植物中密码子使用的分布频率来实现核酸在植物中的增加的表达。用于优化植物中核酸表达的方法可见于EPA 0359472；EPA 0385962；PCT申请No.WO 91/16432；美国专利No.5,380,831；美国专利No.5,436,391；Perlack等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3324-3328以及Murray等人，1989，Nucleic Acids Res.17：477-498。
本发明还提供重组表达载体，其包括选自下组的表达盒：a)表达盒，包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸、编码亚细胞靶向肽的分离多核苷酸，以及编码全长磷脂酸胞苷酰转移酶多肽的分离多核苷酸；b)表达盒，包括有效结合的编码能增强叶中表达的启动子的分离多核苷酸，编码线粒体转运肽的分离多核苷酸，以及编码乙酰载体蛋白的分离多核苷酸；和c)表达盒，包括有效结合的编码启动子的分离多核苷酸，编码亚细胞靶向肽的分离多核苷酸，以及编码酰基转移酶多肽的分离多核苷酸。
在另一实施方式中，本发明的重组表达载体包括具有选自下组的序列的分离多核苷酸：SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：47；SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：51。此外，本发明的重组表达载体包括编码具有选自下组的氨基酸序列的多肽的分离核苷酸：SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：22，SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46；SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：52。
本发明的重组表达载体也可包括一或多个调控序列，所述调控序列是基于将要用于表达的宿主细胞来选择，并有效结合待表达的分离多核苷酸。如在此使用，对于重组表达载体，“有效结合”或“有效连接”意指当将载体导入宿主细胞(例如细菌或植物宿主细胞)时，目的多核苷酸与调控序列以允许所述多核苷酸表达的方式相连。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子、和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。
如上所提出，本发明的某些实施方式使用能够增强叶中基因表达的启动子。在一些实施方式中，启动子是叶特异的启动子。在本发明的这些实施方式中可使用任何叶特异的启动子。许多此类启动子是已知的，例如来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(SEQ ID NO：55或SEQ IDNO：56，Baeumlein等人(1991)Mol.Gen.Genet.225，459-67)，光诱导的基因的启动子，例如核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶的启动子(rbcS启动子)，编码叶绿素a/b结合蛋白(Cab)，Rubisco活化酶，来自拟南芥的叶绿体3-磷酸甘油醛脱氢酶B亚基(Kwon等人(1994)Plant Physiol.105，357-67)的基因的启动子，以及其他叶特异的启动子，如Aleman，I.(2001)Isolation and characterization of leaf-specific promoters fromalfalfa(Medicago sativa)，Masters thesis，New Mexico State University，Los Cruces，NM鉴定的那些，以及相似的组成型启动子。组成型启动子在多数条件下是有活性的。适合用于这些实施方式的组成型启动子的实例包括WO 2003/102198中所述的来自欧芹(Petroselinum crispum)的欧芹泛素启动子(SEQ ID NO：53)；CaMV 19S和35S启动子，sX CaMV35S启动子，Sep1启动子，稻肌动蛋白启动子，拟南芥肌动蛋白启动子，玉米泛素启动子，pEmu，玄参花叶病毒35S启动子，Smas启动子，super启动子(美国专利No.5,955,646)，GRP1-8启动子，肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)，来自农杆菌的T-DNA的启动子，例如甘露碱合成酶、胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶，核酮糖双磷酸羧化酶小亚基(ssuRUBISCO)启动子，等等。
在本发明的其他实施方式中，使用根或苗特异启动子。例如，Super启动子(SEQ ID NO：54)在根和苗两者中提供高水平表达(Ni等人(1995)Plant J.7：661-676)。其他根特异启动子包括TobRB7启动子(Yamamoto等人(1991)Plant Cell 3，371-382)，rolD启动子(Leach等人(1991)PlantScience 79，69-76)；CaMV 35S Domain A(Benfey等人(1989)Science244，174-181)等，但不限于此。
根据本发明，叶绿体转运序列指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。叶绿体靶向序列是本领域已知的并且包括核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell等人(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合成酶(Zhao等人(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；铁氧还蛋白NADP+氧化还原酶(Jansen等人(1988)Curr.Genetics 13：517-522)(SEQ ID NO：27)；亚硝酸还原酶(Back等人(1988)MGG 212：20-26)和捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。也参见VonHeijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；以及Shah等人(1986)Science 233：478-481。
如在此所定义，线粒体转运序列指编码线粒体前序列并且将蛋白质指向线粒体的核苷酸序列。线粒体前序列的实例包括ATPase亚基、ATP合成酶亚基、Rieske-FeS蛋白、Hsp60、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸酶、甘氨酸脱羧酶、丝氨酸羟甲基转移酶、异戊酰辅酶A脱氢酶和超氧化物歧化酶组成的组。这样的转运肽是本领域已知的。参见，例如Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；Faivre-Nitschke等人(2001)Eur J Biochem 2681332-1339和Shah等人(1986)Science 233：478-481。
在本发明优选的实施方式中，表1中列举的多核苷酸在高等植物的植物细胞中表达(例如种子植物，例如作物)。多核苷酸可以通过任何手段，包括转染、转化或转导、电穿孔、颗粒轰击、农杆菌感染等被“导入”植物细胞。用于转化或转染植物细胞的适当方法公开于，例如使用美国专利No.4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,302,523；5,464,765；5,120,657；6,084,154等提出的颗粒轰击。更优选地，本发明的转基因玉米种子可按照美国专利No.5,591,616；5,731,179；5,981,840；5,990,387；6,162,965；6,420,630，美国专利申请公开号2002/0104132等所述，使用农杆菌转化来制备。大豆的转化可以使用例如欧洲专利No.EP 0424047，美国专利No.5,322,783，欧洲专利No.EP 0397 687，美国专利No.5,376,543或美国专利No.5,169,770中所述的任一技术来进行。小麦转化的具体实例可见于PCT申请No.WO 93/07256。棉花可使用美国专利No.5,004,863；5,159,135；5,846,797等中公开的方法来转化。稻可使用美国专利No.4,666,844；5,350,688；6,153,813；6,333,449；6,288,312；6,365,807；6,329,571等中公开的方法来转化。卡诺拉可例如，使用如美国专利No.5,188,958；5,463,174；5,750,871；EP1566443；WO02/00900等中公开的方法来转化。其他植物转化方法公开于，例如美国专利No.5,932,782；6,153,811；6,140,553；5,969,213；6,020,539等。根据本发明可使用任何适于将转基因插入特定植物的植物转化方法。
根据本发明，所导入的多核苷酸如果插入非染色体自主复制子中或者整合到植物染色体中则可稳定地保持在植物细胞中。替代地，所导入的多核苷酸可存在于染色体外非复制载体中并且可为瞬时表达的或瞬时有活性的。
本发明也体现在生产包括至少一种表1所列多核苷酸的转基因植物的方法，其中该多核苷酸在植物中的表达使该植物相比于野生型植物品种在正常或水分受限条件下的生长和/或产量增加和/或使该植物对环境胁迫的耐受增加，所述方法包括步骤：(a)将上述表达盒导入植物细胞，(b)从转化的植物细胞再生转基因植物；并从再生的植物细胞筛选较高产量的植物。该植物细胞可以是原生质体、生产配子的细胞以及再生整个植物的细胞，但不限于它们。如在此使用，术语“转基因”指含有上述表达盒的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。根据本发明，表达盒稳定地整合到染色体中或者是稳定的染色体外元件，使得它在连续世代中延续。
可以通过在正常和/或比适当条件稍差的条件下生长该修饰的植物，然后分析植物的生长特征和/或代谢，从而评估遗传修饰对植物生长和/或产量和/或胁迫耐受的效应。此种分析技术是本领域技术人员公知的，并且包括测量干重、湿重、种子重、种子数、多肽合成、碳水化合物合成、合成、蒸腾率、总植物和/或作物产量、开花、繁殖、结籽、根生长、呼吸率、光合作用率、代谢组成等等。
通过下面的实施例进一步说明本发明，然而不应以任何方式将所述实施例理解为对本发明范围进行限制。
实施例1、基因表征
使用标准重组技术克隆氮代谢基因sll0420(SEQ ID NO：1)、YPR060C(SEQ ID NO：19)、slr0657(SEQ ID NO：23)、YMR152W(SEQ ID NO：31)、b2905(SEQ ID NO：37)、b2066(SEQ ID NO：41)和sll0631(SEQ ID NO：51)。通过比较每种基因的编码蛋白的氨基酸序列与其他功能已知的基因来预测每种基因的功能。使用已知方法从各物种的专有(proprietary)文库中分离同源cDNA。使用生物信息分析来进行加工并注释序列。
来自集胞蓝细菌属的sll0420基因(SEQ ID NO：1)编码尿素酶β亚基sll0420(SEQ ID NO：2)。以e-10的e值将这一基因的全长氨基酸序列搜索于cDNA的专有数据库(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。鉴定出一个来自玉米的同系物。这些序列的氨基酸相关性由图1所示的比对来表示。
来自酿酒酵母的YPR060C基因(SEQ ID NO：19)编码分支酸变位酶。以e-10的e值将这一基因的全长氨基酸序列于cDNA的专有数据库搜索(Altschul等人，上文)。鉴定出一个来自大豆的同系物。这些序列的氨基酸相关性由图2所示的比对来表示。
来自酿酒酵母的YMR152W基因(SEQ ID NO：31)编码与大肠杆菌前导肽酶相似的蛋白酶。以e-10的e值将这一基因的全长氨基酸序列于cDNA的专有数据库搜索(Altschul等人，上文)。鉴定出一个来自大豆的同系物以及一个来自玉米的同系物。这些序列的氨基酸相关性由图3所示的比对来表示。
来自大肠杆菌的b2066基因(SEQ ID NO：41)编码氨甲基转移酶。以e-10的e值将这一基因的全长氨基酸序列于cDNA的专有数据库搜索(Altschul等人，上文)。鉴定出一个来自大豆的同系物、一个来自稻的同系物、两个来自玉米的同系物。这些序列的氨基酸相关性由图4所示的比对来表示。
实施例2、引导(lead)基因在植物中的过表达
使用已知方法将实施例1中所述的每种引导基因连接到表达载体上。使用三种不同的启动子来控制在表3-9中所述的转基因在拟南芥中的表达：来自蚕豆的USP启动子(SEQ ID NO：55用来表达来自大肠杆菌的基因；SEQ ID NO：56用来表达来自酿酒酵母的基因)；欧芹泛素启动子(SEQ ID NO：53)，表示为“PCUbi”，用来表达来自集胞蓝细菌属的基因；以及super启动子(SEQ ID NO：54)，表示为“Super”，用来表达来自大肠杆菌的基因。对于靶向的表达，使用命名为“Mito”的来自编码线粒体异戊酰辅酶A脱氢酶(SEQ ID NO：58，60)的拟南芥基因的线粒体转运肽表达来自集胞蓝细菌属物种和大肠杆菌的基因，表达的其他基因没有亚细胞靶向。
使用已知方法，以含有实施例1所述的引导基因的构建体转化拟南芥生态型C24。根据驱动该表达的启动子、基因源物种和靶标类型(线粒体和细胞质)收集来自T2转化植物的种子。在充分供水和水分受限的生长条件下，在初级筛选中使用种子池来筛选生物量。选择来自初级筛选的池中的命中物(hits)，对命中物进行分子分析和种子收集。然后将收集的种子用于二级筛选中的分析，在二级筛选中分析对于每个转基因事件的大量个体。如果来自一个构建体的植物在二级筛选中被鉴定为具有比对照增加的生物量，那么它将进入三级筛选。在这一筛选中，在充分供水和干旱生长条件下测量来自该构建体的所有转基因事件的100株以上的植物。使用标准统计方法比较来自转基因植物的数据与野生型拟南芥植物的数据或者随机选择的转基因拟南芥种子池中生长的植物的数据。
在充分供水的条件下生长的植物每周浇水两次至土壤饱和。在第17和21天使用商品化成像系统对转基因植物成像。或者，通过偶尔浇水至土壤饱和，使植物在水分受限的生长条件下生长，偶尔浇水使得土壤在供水处理之间是干的。在这些实验中，播种后的第0、8和19天给水。在第20和27天使用商品化成像系统对转基因植物成像。
使用图像分析软件来比较在相同实验中生长的转基因和对照植物的图像。使用该图像以像素来测定植物的相对大小或生物量以及以深绿与总面积比来测定植物颜色。后一比率称作健康指数，是叶中叶绿素相对量的测量并因此仅在第27天记录叶老化或变黄的相对量。由于DNA插入的不同位点以及影响基因表达水平或类型的其他因素，因此在含有不同引导基因的转基因植物之间存在变异。
表2至8示出拟南芥植物的测量比较。CD表示植物在周期干旱条件下生长；WW表示充分供水条件。在植物于水分受限条件下生长时，在种植后第20天和第27天以及在植物在充分供水处理条件时，在种植后第17天和第21天通过图像分析来测定生物量。健康指数以图像中的深绿色的相对量来测定。变化百分数以相对于对照植物，将转基因的测量表示为对照非转基因植物的百分数；p值是根据所有独立事件的T检验比较，转基因和对照植物之间的差异统计显著性；事件数表示在实验中检测的独立转基因植物的总数；阳性事件数表示在实验中比对照更大的独立转基因事件的总数；阴性事件数表示在实验中比对照更小的独立转基因事件的总数。NS表示在5％水平的概率时是不显著的。
A.尿素酶
在水分受限的条件下，使在PCUbi启动子控制下没有亚细胞靶向而表达尿素酶亚基β基因sll0420(SEQ ID NO：1)的转基因植物生长。
表2
表2示出水分受限条件下，sll0420基因的表达造成植物比没有表达该基因的对照植物更大。在这些实验中，表达sll0420基因的多数独立转基因事件比对照更大，表明对胁迫环境有更好的适应。
B.分支酸变位酶
在水分受限或充分供水的条件下，使在USP启动子控制下亚细胞靶向线粒体的YPR060C基因(SEQ ID NO：19)表达的转基因植物生长。
表3
表3示出水分受限条件下，YPR060C基因的表达造成植物比没有表达该基因的对照植物更大。在这些实验中，表达YPR060C基因的多数独立转基因事件比对照更大，表明对胁迫环境有更好的适应。在充分供水条件下，YPR060C基因的表达造成植物比没有表达YPR060C的对照植物更大，但与对照的差异在水分受限条件下更大。
C.天冬氨酸激酶
在充分供水的条件下，使在PCUbi启动子控制下没有亚细胞靶向而表达slr0657基因(SEQ ID NO：23)的转基因植物生长。
表4
表4示出充分供水条件下slr0657基因的表达造成植物比没有表达该基因的对照植物更大。在这些实验中，表达slr0657基因的多数独立转基因事件比对照更大，表明更好的植物生长。
D.蛋白酶
在周期干旱条件下，使在USP启动子控制下并亚细胞靶向线粒体而表达YMR152W基因(SEQ ID NO：31)的转基因植物生长。
表5
表5示出水分受限条件下，YMR152W基因的表达造成植物比没有表达该基因的对照植物更大。在这些实验中，表达YMR152W基因的多数独立转基因事件比对照更大，表明对胁迫环境有更好的适应。此外，在水分受限条件下，表达YMR152W的转基因植物比对照颜色更深绿，如增加的健康指数所示。这表明在胁迫期间，该植物产生比对照植物更多的叶绿素或者具有更少的叶绿素降解。
E.氨甲基转移酶
在水分受限或充分供水条件下，使在Super启动子控制下没有亚细胞靶向而表达b2905基因(SEQ ID NO：37)的转基因植物生长。
表6
表6示出水分受限条件下，b2905基因的表达造成植物比没有表达该基因的对照植物更大。在这些实验中，表达b2905基因的多数独立转基因事件比对照更大，表明对胁迫环境有更好的适应。在充分供水条件下，b2905基因的表达没有造成植物比没有表达b2905的对照植物在生物量上的显著差异。
F.尿苷/胞苷激酶
在水分受限条件下，使在Super或USP启动子控制下并靶向亚细胞线粒体而表达b2066基因(SEQ ID NO：41)的转基因植物生长。
表7
表7示出在水分受限条件下，在USP启动子控制下靶向线粒体而表达b2066基因的转基因植物比没有表达b2066基因的对照植物显著更大，表明对胁迫环境有更好的适应。此外，在水分受限条件下，在USP启动子控制下表达b2066的转基因植物比对照颜色更深绿，如增加的健康指数所示。这表明在胁迫期间，该植物产生比对照植物更多的叶绿素或者具有更少的叶绿素降解。当基因b2066在Super启动子控制下靶向线粒体时，在周期干旱检测的最后(第27天)，在水分受限条件下，转基因植物比对照植物更小。
G.L-天冬氨酸氧化酶
在水分受限或充分供水条件下，使在PCUbi启动子控制下没有线粒体靶向或线粒体靶向而表达sll0631基因(SEQ ID NO：51)的转基因植物生长。
表8
表8示出在水分受限条件下，在PCUbi启动子控制下表达sll0631基因的转基因植物比没有表达sll0631基因的对照植物显著更大。这一效应在水分受限条件下，没有亚细胞靶向的转基因植物中观察到。此外，表达sll0631的转基因植物比对照颜色更深绿，如增加的健康指数所示，这表明在胁迫期间，该植物产生比对照植物更多的叶绿素或者具有更少的叶绿素降解。
在充分供水条件下，在PCUbi控制下靶向线粒体的表达sll0631基因的转基因植物比没有表达sll0631基因的对照植物更大。此外，表达sll0631的转基因植物比对照颜色更深绿，如增加的健康指数所示。这表明在充分供水条件下，该植物产生比对照植物更多的叶绿素或者具有更少的叶绿素降解。
Claims (9)
1.一种转化有表达盒的转基因植物，该表达盒包括有效结合的：
a)编码能增强叶中基因表达的启动子的分离多核苷酸；
b)编码线粒体转运肽的分离多核苷酸；以及
c)编码全长分支酸变位酶多肽的分离多核苷酸，
其中相比于不包括该表达盒的相同品种的野生型植物而言，该转基因植物证明有增加的产量。
2.权利要求1的转基因植物，其中所述分支酸变位酶多肽包括选自SEQ ID NO：20的氨基酸16至85和SEQ ID NO：22的氨基酸21至88的CM_2结构域。
3.权利要求1的转基因植物，其中所述分支酸变位酶多肽包括SEQID NO：20的氨基酸1至256或SEQ ID NO：22的氨基酸1至261。
4.一种对于表达盒为纯种的的种子，该表达盒包括有效结合的：
a)编码能增强叶中基因表达的启动子的分离多核苷酸；
b)编码线粒体转运肽的分离多核苷酸；以及
c)编码全长分支酸变位酶多肽的分离多核苷酸，
其中相比于不包括该表达盒的相同品种的野生型植物而言，该转基因植物证明有增加的产量。
5.权利要求4的种子，其中所述分支酸变位酶多肽包括选自SEQ IDNO：20的氨基酸16至85和SEQ ID NO：22的氨基酸21至88的CM_2结构域。
6.权利要求4的种子，其中所述分支酸变位酶多肽包括SEQ ID NO：20的氨基酸1至256或SEQ ID NO：22的氨基酸1至261。
7.一种增加植物产量的方法，所述方法包括步骤：
a)用表达盒转化野生型植物细胞，所述表达盒包括有效结合的：
i)编码能增强叶中基因表达的启动子的分离多核苷酸；
ii)编码线粒体转运肽的分离多核苷酸；以及
iii)编码全长分支酸变位酶多肽的分离多核苷酸；
b)从转化植物细胞再生转基因植物；以及
c)从再生植物中筛选较高产量的植物。
8.权利要求7的方法，其中所述分支酸变位酶多肽包括选自SEQ IDNO：20的氨基酸16至85和SEQ ID NO：22的氨基酸21至88的CM_2结构域。
9.权利要求7的方法，其中所述分支酸变位酶多肽包括SEQ ID NO：20的氨基酸1至256或SEQ ID NO：22的氨基酸1至261。
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