CN117402227A - 一种调控株高及抗旱性的lea基因、蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种调控株高及抗旱性的LEA基因、蛋白及其应用，本发明中GmLEA4_19基因的过量表达可显著促进干旱下拟南芥的株高。此外GmLEA4_19基因在大豆中过量表达可显著促进其抗旱性，该基因在育种等研究领域具有很大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种调控株高及抗旱性的LEA基因、蛋白及其应用。
背景技术
胚胎发生晚期丰度蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA蛋白)是一大类蛋白质家族，该家族蛋白在种子发育后期或营养组织中积累，在帮助植物抵御干旱、盐碱、耐热和寒冷等环境胁迫方面发挥重要作用。例如，AtLEA3-3在拟南芥中的过表达促进营养生长并增强保水能力。同样，OsLEA3-1和OsLEA3-2在转基因水稻植株中的过表达增强了其对干旱的耐受性。小麦LEA3基因(WZY3-1)在拟南芥中的过表达也增强了其对干旱的耐受性。在另一项研究中，TaLEA3在P.amurense中的过表达通过促进干旱胁迫条件下气孔的快速关闭来提高其抗旱性。辣椒脱水素基因CaDHN5(LEA家族基因)的转基因过表达拟南芥植株也显示出对盐和渗透胁迫的耐受性增强。ZmDHN15基因的过表达已被证明能有效提高酵母和拟南芥的冷胁迫耐受性。此外，在盐胁迫和脱落酸处理下，与野生型植物相比，MsLEA4-4在拟南芥中的过表达赋予了较晚的发芽表型和更高的存活率。MsLEA-D34在拟南芥中的过表达导致对渗透和盐胁迫的耐受性增加，并在干旱或充足水分条件下导致早花表型。LEA3基因(Gh_A08G0694)的过表达显著增强了转基因棉花的耐旱性和耐盐性。上述研究证明了LEA蛋白作为提高植物抗逆性的工具的潜力。
LEA蛋白的特征是高亲水性，富含甘氨酸，并且具有低分子量(10-30kDa)。这些蛋白质已被证明可以保护植物代谢免受非生物胁迫，其特性包括抗氧化活性、清除活性氧自由基、金属离子结合、膜和蛋白质稳定、水合缓冲以及DNA和RNA相互作用。它们通过在干燥生物体中保持最低的水合水平和防止细胞质成分变性，因此在保持种子存活方面发挥着至关重要的作用。
大豆是植物蛋白和食用油的主要来源，是我国重要粮油作物。大豆根系呈钟罩状，主要分布在0-20厘米的土层中，对土壤干旱极为敏感，且大豆整个生育期需水量多，是对水分胁迫最为敏感的豆科作物。此外，在年际降水充足的地区也会因降雨量分配不均而出现局部或短时期的干旱。与此同时，随着人口增长、城镇和工业的发展、全球变暖以及环境污染的加重，农业用水量逐渐减少，进一步加剧了干旱对农业生产的影响但其生产受到各种非生物胁迫的严重威胁。但目前从基因层面对调控大豆株高和抗旱性的研究并不多，深入研究大豆GmLEA蛋白在抗旱上的功能，不仅可以全面了解植物对干旱反应的生理生化机制，亦为开发大豆抗旱新品种提供理论及实践依据。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种调控株高及抗旱性的基因LEA、蛋白及其应用，本发明中GmLEA4_19基因的过量表达可显著促进干旱下拟南芥的株高。此外GmLEA4_19基因在大豆中过量表达可显著促进其抗旱性，该基因在育种等研究领域具有很大的应用价值。
本发明提供的技术方案如下：
一种调控株高及抗旱性的大豆LEA蛋白，所述的蛋白包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本发明还提供一种调控株高及抗旱性的大豆LEA基因，所述基因编码上述的调控株高及抗旱性的大豆LEA蛋白。
进一步的，所述基因序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供含有上述基因的表达盒、重组载体、重组微生物。
本发明还提供上述蛋白或基因或含有上述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在提高大豆抗旱性中的应用。
一种培育耐旱性植物品种的方法，将上述的基因转入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物的耐旱性高于所述目的植物；所述植物为大豆或拟南芥。
进一步的，所述基因的扩增引物为：
5'-GAGCTCATGGCATCCCATGGCAAAGC-3'；
5'-TCCCGGGGTAATTTCCGGTTGTCTTG-3'。
进一步的，利用SacI和SmaI将阳性克隆切割制成pRTL2-ABRC3亚克隆载体，与ABRC3启动子(干旱诱导性启动子)融合，将整个表达盒克隆到pPTN200双元表达载体中；将该质粒转化至DH5α感受态细胞，提取质粒，构建含有目的基因的过表达重组载体。
进一步的，利用农杆菌介导的遗传转化法，将权利要求2所述基因导入植物中表达。
进一步的，使用除草剂及PCR方法分析筛选转基因大豆作物。
SEQ ID NO.1：
MASHRQSYEAGQTKGRTEEKTNQTMGNIGEKAQAAKEKTQEMAQAAKEKTQQTAQAAKDKTCDTSQAAKEKTQQNTGAAQQKTSEMGQSTKESAQSGKDNTQGFLQQTGEKVKGAAQGATEAVKQTLGLGEHDQDNRRNY
SEQ ID NO.2:
5’ATGGCATCCCATAGGCAAAGCTATGAAGCTGGTCAAACTAAGGGCCGAACTGAGGAAAAGACGAACCAGACGATGGGCAATATTGGAGAGAAGGCTCAAGCTGCAAAGGAGAAGACCCAGGAAATGGCCCAAGCTGCAAAGGAGAAGACCCAACAAACAGCCCAAGCTGCCAAGGACAAGACTTGCGACACTTCCCAAGCGGCAAAGGAGAAGACCCAACAGAATACAGGAGCTGCTCAACAAAAGACCTCAGAGATGGGCCAGTCCACGAAGGAATCGGCCCAGTCAGGGAAGGACAACACCCAAGGGTTCCTGCAGCAGACAGGGGAGAAGGTGAAGGGCGCAGCCCAAGGTGCTACAGAGGCTGTGAAGCAAACCCTTGGCTTGGGCGAGCATGATCAAGACAACCGCAGAAATTACTAA3’
有益效果
本专利探索了GnLEA4_19在拟南芥和大豆中的功能。结果表明，在轻度干旱胁迫诱导下，拟南芥中过表达GmLEA4_19基因的转基因不同转基因株系较未转基因株系株高显著增加20％；在严重干旱胁迫诱导下，过表达的GmLEA4_19转基因拟南芥株系株高较未转基因株系显著增加100％，因此该基因的应用可显著促进植株干旱下生长如株高的增加。其次，GmLEA4_19转基因大豆干旱胁迫诱导下表现出更耐旱表型，监测干旱条件下叶片水势分析表明转基因大豆叶片水势较非转基因大豆高约30％。在田间种植初步观察亦增强转基因株系的抗旱性及株高。因此该基因在增强大豆抗旱性中发挥重要作用，该基因在育种上应用将有助于开发抗旱性更强、产量更高的转基因大豆。
附图说明
图1是在干旱条件下，过量表达的GmLEA4_19基因的转基因拟南芥比野生型植株高。(A-C)在轻度干旱条件下(D-E)在重度干旱条件下。实验数据从三个生物重复中获得平均值和标准偏差。星号代表在相同处理下野生型和不同转基因株系之间的统计学显著差异。**p<0.05。
图2是过量表达GmLEA4_19转基因大豆表现出耐旱表型。(A)转基因植物在良好的浇水条件下生长在温室里。(B)停止浇水21天后在温室中生长的转基因植物。(C)测量在正常和干旱条件下叶片的水势。从三个生物重复中获得平均值和标准偏差。星号代表在相同处理下野生型和转基因品系之间的统计学显著差异。**p<0.05。
图3是转基因植株在大田种植表型图。(A)转基因株系和对照在田间种植干旱胁迫(未浇水无下雨21天)后表现出抗旱表型，株高未统计。(B)转基因株系和对照在田间种植雨后3天的表型，转基因株系株高较对照增加，地上干重较对照显著增加。
具体实施方式
下述实施例中所用的方法如没有特殊说明，均为本领域常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)，大豆转基因背景为Thorne生态型。本发明的主要研究基础如下。
实施例1：大豆GmLEA4_19基因cDNA的克隆与鉴定
本发明以大豆为材料，提取14天大豆幼苗中的RNA，RNA的提取试剂为RNApurePlant Kit(DNase I，Cat:CW0559S)，反转录按照RNA to cDNA HiScripi III RT SuperMixfor Qpcr(+gDNA wiper)试剂盒说明书进行。设计了基因特异性引物对5'-GAGCTCATGGCATCCCATGGCAAAGC-3'和5'-TCCCGGGGTAATTTCCGGTTGTCTTG-3'，从大豆中分离出GmLEA4_19的全长编码区。将PCR产物(423bp)克隆到Topo载体中进行测序分析。
实施例2：GmLEA4_19基因过表达拟南芥植株和大豆植株的获得
我们的研究结果表明大豆GmLEA4_19基因过表达拟南芥的植株高度生长，增加其生物量。
1.GmLEA4_19基因过表达载体的构建
利用SacI和SmaI将阳性克隆切割制成pRTL2-ABRC3亚克隆载体，与ABRC3启动子融合，该启动子为干旱诱导性启动子。最后将ABRC3：GmLEA4_19整个表达盒克隆到pPTN200双元表达载体中。将该质粒转化至DH5α感受态细胞，提取质粒。对重组质粒进行PCR和酶切鉴定，以确定阳性克隆，并经测序证实构建的过表达重组载体pPTN200-ABRC3:GmLEA4_19构建完全正确。将重组质粒pPTN200-ABRC3:GmLEA4_19用化转转化法分别导入GV3101和LEA4404感受态细胞。
2.过表达GmLEA4_19基因拟南芥株系的获得
根据Clough and Bent(1998)的Floral Dipping方法进行拟南芥转化(即：将上个步骤制备的含有重组质粒的菌液转化拟南芥)。选择生长状况良好5-10cm的拟南芥植株，去其顶生花序和果荚，刺激腋生花序的生长。一周后可用于转化。转化前一天浇足水。将含有转基因载体的农杆菌GV3101于28℃培养过夜，至OD600≈2.0时，4,500rpm离心10min，菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液中，至终浓度OD600≈0.8。转化时将拟南芥地上部分浸泡于菌液中5-15s，确保全部花苞都被浸没。用吸水纸吸去多余的液体，将植物平放并保持湿度，避光过夜。第二天将植物取出，竖直并转移到正常条件下生长收种。转化液：1/2MS和5％蔗糖，0.02％ Silwet L-77。转基因植株T0种子在含25μg/mL潮霉素的抗性培养基上萌发生长，两周后挑取正常生长的转化苗移入土壤中继续生长。
3.过表达GmLEA4_19基因大豆株系的获得
利用改良的大豆子叶节转化系统进行LEA4404农杆菌介导的转化，大豆使用Thorne生态型。使用除草剂(终浓度25μg/L草甘膦)涂抹哎叶片上分析筛选转基因大豆植物。利用基因克隆特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)分析，所获后代T2代纯合株系(除草剂抗性不分离)用于后续表型研究。
实施例3：拟南芥GmLEA4_19过表达株系的表型分析
为了分析转基因拟南芥的表型，将野生型和3个独立的转基因株系(GmLEA4-19#1、GmLEA4-19#2、GmLEA4-19#4)在23℃、16h光/8h暗周期的培养箱中种植。幼苗时期定期浇水2次/周，约2周后开始干旱处理。对于轻度干旱处理，土壤相对含水量保持在55％，并保持4周。对于严重干旱处理，土壤相对含水量保持在40％以下，并保持4周。对比植株生长状况发现，轻度干旱处理下，转基因株系较野生型高株高显著增加20％；在严重干旱胁迫诱导下，转基因拟南芥株系株高较未转基因株系显著增加100％，数据如下表所示：
实施例4：大豆GmLEA4_19过表达株系的表型分析
在温室中将转基因大豆(3个独立转基因株系：7510、7511和7515)和对照(Thorne)大豆种子种植在填充土壤的种植盆中。大豆在水分充足的培养条件下生长至V4-V5阶段(第5-6复叶充分展开时期，约5周)，之后保持21天不浇水。温室昼夜温度均保持在24～26℃。打开遮阳棚，HID灯从早上5点到晚上7点一直打开。对比大豆植株生长状况发现，干旱胁迫后，非转基因大豆叶片萎蔫严重。检测叶片水势发现在正常浇水条件下，转基因与非转基因无显著差异，但是在干旱处理后(在温室中种植持续不浇水21天)，3个转基因株系的叶片水势均显著高于非转基因约30％，数据如下表所示，表明GmLEA4_19的过量表达显著促进了大豆的抗旱性。
将上述转基因株系纯系(7510和7511)和对照种植在实验大田中观察表型，在生殖生长R2-R5阶段，有21天未降水。如图3A所示，转基因株系叶片较对照伸展，表明耐旱性更强。之后下雨后3天观察，转基因株系株高较对照显著增高，如图3B所示。我们分析了转基因和对照植株地上部分单株干重，发现转基因株系较对照植株增多，数据如下表所示：
| 株系 | 植株地上部分单株干重(克) |
| Thorne | 37.94±7.31 |
| 7510 | 65.29±12.72 |
| 7511 | 47.84±10.07 |
| 7515 | 56.57±12.86 |
Claims (10)
1.一种调控株高及抗旱性的大豆LEA蛋白，其特征在于，所述的蛋白包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.一种调控株高及抗旱性的大豆LEA基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的调控株高及抗旱性的大豆LEA蛋白。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO:2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物。
5.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述基因或含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在提高大豆抗旱性中的应用。
6.一种培育耐旱性植物品种的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因转入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物的耐旱性高于所述目的植物；所述植物为大豆或拟南芥。
7.根据权利要求6所述的培育耐旱性植物品种的方法，其特征在于，所述基因的扩增引物为：
5'-GAGCTCATGGCATCCCATGGCAAAGC-3'；
5'-TCCCGGGGTAATTTCCGGTTGTCTTG-3'。
8.根据权利要求6所述的培育耐旱性植物品种的方法，其特征在于，利用SacI和SmaI将阳性克隆切割制成pRTL2-ABRC3亚克隆载体，与ABRC3启动子融合，将整个表达盒克隆到pPTN200双元表达载体中；将该质粒转化至DH5α感受态细胞，提取质粒，构建含有目的基因的过表达重组载体。
9.根据权利要求6所述的培育耐旱性植物品种的方法，其特征在于，利用农杆菌介导的遗传转化法，将权利要求2所述基因导入植物中表达。
10.根据权利要求6所述的培育耐旱性植物品种的方法，其特征在于，使用除草剂及PCR方法分析筛选转基因大豆植株。
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