CN112876551B

CN112876551B - 一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89及其应用

Info

Publication number: CN112876551B
Application number: CN202110384120.6A
Authority: CN
Inventors: 王娟; 郭斌; 王柏柯; 李宁; 胡佳蕙; 杨涛; 余庆辉; 周涛
Original assignee: HORTICULTURE INSTITUTE OF XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCE
Current assignee: HORTICULTURE INSTITUTE OF XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCE
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: CN112876551A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，并且通过转基因技术对SpbHLH89进行功能验证、创制耐旱番茄材料的应用方法，研究发现与野生型番茄植株相比，超表达SpbHLH89的转基因番茄株系的耐旱能力增加，且积累了大量有机渗调物质，提高了抗氧化酶活性，有效缓解了胁迫下活性氧的积累，表明SpbHLH89是调节番茄耐旱的正响应因子，进一步认识植物耐旱的调控机制，对于番茄的耐旱改良具有重要意义。

Description

一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体公开一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89，并且通过转基因技术对SpbHLH89进行功能验证、创制耐旱番茄材料的应用方法。

背景技术

番茄（Solanum lycopersicum）是重要的蔬菜和经济作物，在世界范围内广受欢迎。我国是鲜食番茄第一大生产国，也是加工番茄的第三大生产国，在世界番茄市场中具有举足轻重的地位。近年来，全球人口增长和极端天气频发以及水资源匮乏加剧了干旱胁迫对番茄生产的影响。因此，解析番茄抗旱分子机理，培育抗旱番茄品种已成为其提质增效过程中亟待解决的问题。

植物的生长和发育不可避免地受到许多非生物胁迫的影响。为适应环境，植物本身需要通过各种生理和生化的调节来应对胁迫。bHLH转录因子是一类含有basic helix-loop-helix（bHLH）结构域的转录因子，bHLH家族是第二大植物转录因子，但其在植物胁迫应答中的研究却相对滞后。bHLH类转录因子具有高度保守的碱性/螺旋-环-螺旋结构域，它由碱性氨基酸域和螺旋-环-螺旋区域两部分组成，包含约60个氨基酸。两者在功能上完全不同，碱性氨基酸区位于bHLH结构域的N端，含有约15个氨基酸，主要功能是识别并特异性结合靶基因启动子的DNA基序；螺旋-环-螺旋区位于bHLH结构域的C端，含有约40-50个氨基酸，其中至少含有5个碱性氨基酸，并且在超过50%的植物bHLH中存在高度保守的HER基序（His5-Glu9-Arg13）。研究表明，bHLH蛋白主要与E-box（5’-CANNTG-3’）的核心DNA序列基序结合，其中G-box（5’-CACGTG-3’）是最常见的形式，这决定了不同box的核心识别位点的碱性氨基酸区域中的若干保守氨基酸。bHLH蛋白基于进化关系，并考虑到DNA结合特异性、氨基酸在某些位置的保守性以及除了bHLH结构域之外是否存在保守结构域等多种特性进行分类。最近的系统发育分析结果显示，500多个植物bHLH能够分成26个亚组，而一些非典型bHLH蛋白的系统发育分析将其分类数扩展到32个亚组。根据目前对bHLH蛋白功能的研究，植物bHLH转录因子能调节大量基因的表达，涉及多种重叠和特异性调节途径。如bHLH转录因子能调节心皮、表皮细胞和气孔发育、种子萌发、开花时间和根毛形成。此外，bHLH还参与代谢过程调控，如类黄酮合成。许多bHLH在光信号调节中起作用，并且参与激素信号途径，如ABA、茉莉酸等。此外，bHLH转录因子还参与植物对低温、铁缺乏等非生物胁迫的响应。

目前，现有的一些番茄种质经过长期高压选择，众多有益基因随着不断的种内杂交逐渐流失，致使现代栽培番茄遗传基础变得十分狭窄，且耐旱种质缺乏。在极端的气候条件下，这将使番茄的损失变得更为严重。因此，发掘和利用野生种质资源的有益基因对阐明基因功能、创新番茄育种材料，解析番茄抗旱分子机理、提高番茄耐旱性具有重要的意义。潘那利番茄（Solanum pennellii）为番茄近缘野生种，发现于秘鲁安第斯山脉西坡低地，其表皮覆盖浓密腺毛且分泌粘稠腺体。S. pennellii有别于其它番茄品种的耐旱特性，可以在极度干旱环境中生存，是番茄耐旱性改良育种中一个特别有价值的遗传资源。此外，S. pennellii基因组测序结果的发表，为解析番茄耐旱的分子机制提供了理想的实验模型，使研究者们能够快速识别、鉴定与耐旱性相关的候选基因。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的技术缺陷，提供一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89及应用方法。

本发明的技术方案：一、一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

二、一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89，其cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

三、一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。

四、一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89超表达载体的构建方法，所述的构建方法包括下述步骤：

步骤一：以潘那利番茄叶片cDNA为模板，用KOD酶进行PCR扩增获得目的片段，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，用回收试剂盒回收目的片段，用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pSUP1300空载，回收线性化骨架载体并与目的片段进行同源重组构建超表达载体；

步骤二：利用热激法转化T5-Zero感受态细胞，对单克隆进行菌落PCR鉴定阳性克隆；

步骤三：pSUP1300载体选择性标记基因为卡那霉素，提取PCR阳性克隆质粒进行测序验证，获得SpbHLH89基因的重组表达载体为pSUP1300-SpbHLH89；

步骤四：将pSUP-SpbHLH89表达载体导入农杆菌中GV3101中，得到含有目的片段的超表达载体农杆菌；利用农杆菌侵染叶片；

步骤五：诱导愈伤组织，经卡那霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；

步骤六：获得阳性转基因株系T0代后，提取基因组DNA，分别对超表达植株进行检测；在插入位点的两侧设计引物对，对目的片段进行PCR扩增，纯化PCR扩增产物后进行测序，根据测序结果筛选超表达株系，并利用T2代植株进行干旱表型观察和检测。

其中，上述步骤二中进行菌落PCR鉴定阳性克隆所用的引物序列，其中正向引物如SEQ ID NO：4所示，5’-GCTCTAGAATGGATCCTCATTCTACTATAATGAGTGC-3’，反向引物如SEQ IDNO：5所示：5’-GGGGTACCTGTTGTTCTTTCAAATCCACCA-3’。

其中，上述步骤六中所述在插入位点的两侧设计引物对，该引物对分别为：SpbHLH89-F：5’-GCTCTAGAATGGATCCTCAT TCTACTATAATGAGTGC-3’，SEQ ID NO：6所示，Flag-R：5’-TTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’ SEQ ID NO：7所示。

五、一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89的应用，所述SpbHLH89基因通过影响渗透调节物质、ROS系统及氧化酶，从而使番茄抗旱性增高。

有益效果：本发明利用转录组测序分析从潘那利番茄中克隆获得了SpbHLH（Sopen04g001150）基因。根据Sol genomics和NCBI的比对结果命名为SpbHLH89。该基因的核苷酸序列如列表SEQ ID NO：1所示，它包含3324个碱基对；cDNA序列如列表SEQ ID NO：2所示，它包含684个碱基对；其氨基酸编码区氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，它包含227个氨基酸。本发明根据SpbHLH89基因编码区序列，设计了转基因实验，最终确定了该基因能够用于提高番茄耐旱性选育。

本发明利用转录组测序对正常生长及干旱胁迫下的潘那利番茄（Solanum pennellii）及栽培番茄品种‘M82’（S. lycopersicum）的差异表达基因进行分析，并在S. pennellii中鉴定出一个正响应干旱的基因-gene30159，其表达量在潘那利番茄中显著高于‘M82’，功能注释为bHLH型转录因子，随后在https://solgenomics.net/比对发现其定位于4号染色体上，命名为SpbHLH89。进一步研究发现，与野生型番茄植株相比，超表达SpbHLH89的转基因番茄株系的耐旱能力增加，且积累了大量有机渗调物质，提高了抗氧化酶活性，有效缓解了胁迫下活性氧的积累，表明SpbHLH89是调节番茄耐旱的正响应因子，进一步认识植物耐旱的调控机制，对于番茄的耐旱改良具有重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例提供的调控番茄耐旱性的SpbHLH89基因及应用方法流程图；图2是本发明中SpbHLH89基因的PCR扩增图、酶切鉴定图及菌落PCR图；

图3是本发明实施例提供的转基因实验的流程图，其中A是：农杆菌浸染外植体共培养；B是：筛选及诱导愈伤组织，子叶（左），下胚轴（右）；C是：诱导出芽；D是：诱导生根；E是：炼苗；F是：再生植株；

图4是本发明实施例提供的超表达株系中SpbHLH89基因的检测示意图；

图5是本发明实施例提供的转SpbHLH89基因株系在番茄耐旱过程中的表型图，其中A是：野生型及过表达株系番茄幼苗干旱胁迫处理前；B是：自然干旱14天后；C是：复水恢复24 h后；

图6是本发明实施例提供的干旱胁迫条件下，各转基因株系的渗透调节物质差异显著性分析，其中，A是指脯氨酸含量（μg/g鲜重）：B是指甜菜碱含量（mg/g鲜重）：C是指：可溶性糖含量（mg/g鲜重）；

图7是本发明实施例提供的干旱胁迫条件下，各转基因株系的氧化酶系统及ROS积累差异显著性分析，其中A是指：O₂ ^-含量（mg/g鲜重）；B是指H₂O₂含量（μmol/g鲜重）：C是指：MDA含量（nmol/g鲜重）；D是指：SOD活性（U/g鲜重）；E是指：POD活性（U/g鲜重）；F是指：CAT活性（U/g鲜重）。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂均为常规市售商品。

实施例1、一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2、一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89，其cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例3、一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例4、一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89超表达载体的构建方法，所述的构建方法包括下述步骤：

步骤六：获得阳性转基因株系T0代后，提取基因组DNA，分别对超表达植株进行检测；在插入位点的两侧设计引物对，对目的片段进行PCR扩增，纯化PCR扩增产物后进行测序，根据测序结果筛选超表达株系和纯合突变体，并利用T2代植株进行干旱表型观察和检测。

其中上述步骤二中进行菌落PCR鉴定阳性克隆所用的引物序列，其中正向引物如SEQ ID NO：4所示，5’-GCTCTAGAATGGATCCTCATTCTACTATAATGAGTGC-3’，反向引物如SEQ IDNO：5所示：5’-GGGGTACCTGTTGTTCTTTCAAATCCACCA-3’。

其中上述步骤六中所述在插入位点的两侧设计引物对，该引物对分别为：SpbHLH89-F：5’-GCTCTAGAATGGATCCTCAT TCTACTATAA TGAGTGC-3’，SEQ ID NO：6所示，Flag-R：5’-TTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’ SEQ ID NO：7所示。

实施例5、一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89的应用，所述SpbHLH89基因通过影响渗透调节物质、ROS系统及氧化酶，从而使番茄抗旱性增高。

结合附图对本发明的应用原理做详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的调控番茄耐旱性的SpbHLH89基因的应用方法为：

选取正常生长及干旱胁迫下的S. pennellii及栽培番茄品种‘M82’的叶片进行转录组测序，并对差异表达基因进行分析，在S. pennellii中鉴定出一个正响应干旱的基因-gene30159，其表达量在干旱胁迫下显著增加，功能注释为bHLH型转录因子，随后在https://solgenomics.net/比对发现其定位于4号染色体上，并命名为SpbHLH89。

根据SpbHLH89基因序列，设计了转基因实验，用以确定基因的功能。

本发明提供的SpbHLH89基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，它包含3324个碱基对；cDNA序列如序列表SEQ ID NO:2所示，它包含684个碱基对；其编码区氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，它包含227个氨基酸。

根据SEQ ID NO:2的cDNA全长序列设计引物，以S. pennellii叶片cDNA叶片为模板，利用RT-PCR技术，获得全长PCR产物，如附图2。

PCR反应体系：cDNA模板1 μL，KOD PCR Master Mix (2×) 25 μL，引物SpbHLH89-F 2 μL，引物SpbHLH89-F 2 μL，ddH₂O 20 μL；PCR反应程序：95℃预变性1分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸45秒，30个循环；68℃延伸5分钟。PCR产物回收纯化，进行测序。

将pSUP1300-SpbHLH89重组质粒转化农杆菌GV3101，利用重组农杆菌介导转化栽培番茄品种‘M82’，如附图3。

将鉴定的pSUP1300-SpbHLH89重组农杆菌单菌落于液体YEB培养基震荡培养14 h活化，至菌液OD₆₀₀=0.5。3000 rpm离心5 min收集菌，用改良MS液体培养基悬浮菌体。浸染后的外殖体放回共培养培养基中，于28℃黑暗培养2 d。

进行外植体分化、经卡纳霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性单株3个，分别为OE1、OE2、OE3。

转基因番茄中SpbHLH89基因的检测：根据目的基因，

在以引物SpbHLH89-F和Flag-R为检测引物，序列分别为：SpbHLH89-F：5’-GCTCTAGAAT GGATCCTCAT TCTACTATA ATGAGTGC-3’；

Flag-R：5’-TTCTTGTACAGCTCGTCCAT GCC-3’。

分别提取所获得的3个转基因阳性植株和野生型植株的基因组DNA。以上述DNA为模板进行PCR反应，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，如附图3。

将T2代转基因番茄（OE1、OE2、OE3）三个株系及野生型番茄种子播种于相同体积质量的基质中，16 h光照/8 h黑暗，25℃培养3-4周，正常浇水培养30天后选取长势一致的转基因植株与野生型植株开始自然干旱处理，每天观察记录植株表型。

待植株严重缺水导致萎蔫后（干旱14天左右），恢复浇水24 h后观察植株表型，发现超表达SpbHLH89的转基因番茄增强了植株对干旱的耐受性，如附图5。

干旱胁迫下，SpbHLH89基因与渗透调节物质、ROS积累及氧化酶系统相关性验证。

以甘露醇模拟干旱逆境，浇灌番茄幼苗，检测植株对甘露醇的响应。具体步骤如下：将超表达潘那利番茄SpbHLH89的转基因番茄T2代株系（OE1，OE2，OE3）和野生型材料‘M82’的种子播于育苗盆中，待植株长至6周时，选取长势一致的植株进行干旱胁迫处理。将300 mmol/L甘露醇溶液（用1/2 Hoagland营养液配制）从基质表层往下将育苗盆浇透（避免溅到叶片上），确保将育苗盆中原有的水分全部置换并沥干后，将育苗盆置于盛有相应甘露醇溶液的托盘中，处理24 h后采样备用。以未做任何处理的植株作对照。

根据试剂盒的方法分别检测渗透调节物质（脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖），如附图6所示、ROS积累（MDA、H₂O₂、O^2-）如附图7所示，及氧化酶系统（SOD、CAT、POD）的含量及活性，发现超表达SpbHLH89的转基因株系能够显著增高渗透调节能力、氧化酶活性增加及清除ROS能力增强，表明SpbHLH89能够提高番茄植株的耐旱能力，如附图7所示。

序列表

<110> 新疆农业科学院园艺作物研究所

<120> 一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3324

<212> DNA

<213> SpbHLH89基因()

<400> 1

cctttatcaa attttaaagg gacgacgaat caatcttatc agaaattgaa tggcgggagc 60

tgccgtactg cgaatatcat cactatcttc cttgagatta tactcaataa cttcatcttc 120

tccaatttct cactcgttag ctctcccttt acgaaaaccc agattcacaa attgccatgc 180

caaggtcgat ctcattttgc tttatttgga cctatttaat tttgttgatt taatctcttg 240

cttgtgtttt agtttgatgg atccattgga gaagcagctg aaaggatgta ccgaatgaat 300

tttgaagatg atgaatcatt ggaggatgat gaagagagcg atgaggaaga ggagacggag 360

agcagtattg acttactagt tagatttgtg cagagtatgt tcacaaaggt ttctaagcgt 420

gctaggaaag ctactcgttc tatactgccg gacgtcattt ctccacagct tgtaaatctt 480

caaactcact cttttatctc ttcaataatt tgttcagcat ataaattgat ccaataggtt 540

tcaactttgt gtgaattcta agtgactttg ttcatgaaat cagtgtcctt tcctaggcac 600

aaccataatg ttataggcta tagtgcagct tattctaccc gaattagaaa ctcctatcaa 660

ttcccagggg agacaaaaag cacactaggt gattctagcc ttggtggaca gagttacctg 720

gtacttgttg ctggtgcatc ctgtggaagt agtcatgatg tgtgaaagct gactcggaca 780

ccacagtcct caaaaagaag aactatattt cttggactgg aggtgactaa gtaattgact 840

gtgttaggat gctgaaaaac atggcattct tctggttctt ttgtagatgt atggtggcca 900

ttgtttcgga tggaatgata agctttcttt tatttatgtg tcgagggagg caagggcctt 960

tcttcacctt ttacataaat gttattaggg gtcaactctc ctacagagag agcggccttg 1020

aacgcttttg gtcacgttaa actactaccc agtttactct catctcaagc cttcatacac 1080

aatctggtgc catggtcgtg ggatctaagt aaagtagcag aatactctca tgcttcctag 1140

tgccttaagc atcggctcgg tgaaaatctc atcatggtag agcttgtatt cactggggtt 1200

tttgaatcac atcaggacac tcattcgtgc ttgaagcttt gactataact agttagtata 1260

ctcatggcaa ggaactctta aattgtgtat gtgcatctgt aaatggctaa ggctattggt 1320

tgcctcttcc ttgatactga gcattgctcg agtaaggagt aaggacatat tcagttctta 1380

agtttgtgca cttggcttgt ggttgtgtca acacaaccaa cttatgcatc accataagag 1440

ggtgattctt aagtccttga cttgctttct agtgcatttg tcaataatcc ccactcttag 1500

catgtggggt tacagaacat ttcccaggcc tgatgtattt cacacgatat aatattgctc 1560

ctcaactaca gttctaagcc aattgatcct cctcccaaga ttgaacccta gccaagctca 1620

aaaattaaca catgagattt taaatagtgg tgcctcgagt gtttaaaagc atggaggtga 1680

ttttaactct caaaatttag cctgcaaaac atggccatca catgatgtca catccaacta 1740

ctaacaccca attttagtac taagattgtg tcgtccatat tcaacgcgaa tatgtctagt 1800

tcccaactag gatgggtgca ttctttagcc acccgtttaa aagggaaaat tatgtttaac 1860

caaattgcaa tgacttgtca gattgcatgg tagtaattgt cacatctaca aatgtgtaag 1920

aattatgctt cttagttttc agagttaagt tgatttgtgt tttcatgtca acataagtcc 1980

atccaccttc ataaagtttt aatcagttca caccatctat aatacaatgt ttcttctttt 2040

actaacatat ttgggctact agcgttttcg gtgttttgtt tagttttgat cttctagttg 2100

aattatatac ataaattatg ttcaaaatcc tctcttccat ctgttctcat tgttggagga 2160

atgcaggtaa cttttgcagt tgatggcgtt ctaattttgg ctttactctc catcttgaag 2220

gcatttcttg aggtattact ttgccatgtc attttttgaa tgttttacct gaattaagca 2280

cccccccaaa cacacacact ctgtaattac ttgttgcttg ttttatgaat ttactcattg 2340

accaaatctg gctttctgct gcttttgtgg atgcaagctg cctttaatcc actaattaaa 2400

gtaaacagat atgcaattcg aagaatgcaa tataaaagag atattataat ttatcaaaca 2460

taagacttgc aaaatcaaaa tcttcagcca cttaagaaga tcacagtatt acacatcaca 2520

atttctgaaa gttcttgtac aaaacaattt tatgtcttct attctgattt agagcatggt 2580

tagggtaaat agagcaactt ctcctcttgt gtgggtgaaa tattgatctt caattgaact 2640

ctgctagtga tggttctgtc cttctaggtg gtctgctcac ttggtggtgc cgtctttgta 2700

gcaattctgt tattacgtgt gctctggtcc gctgtttcct actttcagtc taatggttca 2760

gatttcaaca gtgctggaag ttcatatggc agaacacgac ccgctgcatg attgagccta 2820

gtcacatacc tttcatctgg tgaatcatta attccttaaa aaacaaaaga tgttattagc 2880

attagaatgt tctataagta atagtgactt aatttggcaa tgtgaatttt tacatgtgtg 2940

aagatctcag cagatcttat agggagtaga gtgtgtttat aagtttcttt ttgacttcat 3000

tagccttctt cccgtgcttg ggaatcttct ataatgaata gttaagagtc ttaactctta 3060

acacaccact tataatttga gctatatata atactcatgt tgtcgcagca cactaacaac 3120

tgtttaacgc ccaaggctca tattttctag ttgtgatagt tttggcagag caaagcagca 3180

catatgaatg cttttcagag cgcaggcaca tattacagct tcttgatata ccttactaac 3240

catgtcaaat acgcattctc accagtatac tattcattta gcatttttgt ttcagttgat 3300

gtgaaagaaa tgtgctgtta aatt 3324

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> SpbHLH89基因cDNA序列()

<400> 2

atggatcctc attctactat aatgagtgcg tttcaaactg cgactaattt ggcggagatc 60

tggccctatc accatcttat cgaccacaca acaaatcacg ccgccagaaa gcgacgcgac 120

gatgatgaat ctgctattgg agtttcaact agtggaaatg ccttgactga atctgatagt 180

aagcggctga aggccacaag atcaaacgag aatggggaat attcaggagg gaattcagga 240

aaatcttcag aacaacctgc aaagccacca gctgaaccac ctaaggacta catccatgtg 300

cgagcgagga gaggtcaagc taccgatagt catagcctag cagaaagagc cagaagagaa 360

aagattagtg acaggatgaa aatcctacaa gacttggtcc ctggttgtaa caaggttatt 420

ggaaaagctc ttgtccttga tgagataatc aattatgtcc aatcattaca acgtcaagtt 480

gagttcctat caatgaagct tgaagcagtt aatacaagag taaccccaac catcgaagga 540

attcctacta aagactttgg gcagcaaaca ttcgagacaa acgctatggc atttggttca 600

caaggtacaa gggaatatgc tggggggaca tcaccagact ggttgcacat gcagataggt 660

ggtggatttg aaagaacaac ataa 684

<210> 3

<211> 227

<212> PRT

<213> SpbHLH89基因编码的蛋白质()

<400> 3

Met Asp Pro His Ser Thr Ile Met Ser Ala Phe Gln Thr Ala Thr Asn

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ile Trp Pro Tyr His His Leu Ile Asp His Thr Thr Asn

20 25 30

His Ala Ala Arg Lys Arg Arg Asp Asp Asp Glu Ser Ala Ile Gly Val

35 40 45

Ser Thr Ser Gly Asn Ala Leu Thr Glu Ser Asp Ser Lys Arg Leu Lys

50 55 60

Ala Thr Arg Ser Asn Glu Asn Gly Glu Tyr Ser Gly Gly Asn Ser Gly

65 70 75 80

Lys Ser Ser Glu Gln Pro Ala Lys Pro Pro Ala Glu Pro Pro Lys Asp

85 90 95

Tyr Ile His Val Arg Ala Arg Arg Gly Gln Ala Thr Asp Ser His Ser

100 105 110

Leu Ala Glu Arg Ala Arg Arg Glu Lys Ile Ser Asp Arg Met Lys Ile

115 120 125

Leu Gln Asp Leu Val Pro Gly Cys Asn Lys Val Ile Gly Lys Ala Leu

130 135 140

Val Leu Asp Glu Ile Ile Asn Tyr Val Gln Ser Leu Gln Arg Gln Val

145 150 155 160

Glu Phe Leu Ser Met Lys Leu Glu Ala Val Asn Thr Arg Val Thr Pro

165 170 175

Thr Ile Glu Gly Ile Pro Thr Lys Asp Phe Gly Gln Gln Thr Phe Glu

180 185 190

Thr Asn Ala Met Ala Phe Gly Ser Gln Gly Thr Arg Glu Tyr Ala Gly

195 200 205

Gly Thr Ser Pro Asp Trp Leu His Met Gln Ile Gly Gly Gly Phe Glu

210 215 220

Arg Thr Thr

225

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gctctagaat ggatcctcat tctactataa tgagtgc 37

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggggtacctg ttgttctttc aaatccacca 30

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gctctagaat ggatcctcat tctactataa tgagtgc 37

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

ttcttgtaca gctcgtccat gcc 23

Claims

1.一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89超表达载体的构建方法，其特征在于：所述转录因子SpbHLH89，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；转录因子SpbHLH89超表达载体的构建方法包括下述步骤：

步骤六：获得阳性转基因株系T0代后，提取基因组DNA，对超表达植株进行检测；在插入位点的两侧设计引物对，对目的片段进行PCR扩增，纯化PCR扩增产物后进行测序，根据测序结果筛选超表达株系，并利用T2代植株进行干旱表型观察和检测。

2.根据权利要求1所述的一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89超表达载体的构建方法，其特征在于：所述步骤二中进行菌落PCR鉴定阳性克隆所用的引物序列，其中正向引物如SEQ ID NO：4所示，5’-GCTCTAGAATGGATCCTCATTCTACTATAATGAGTGC-3’，反向引物如SEQID NO：5所示：5’-GGGGTACCTGTTGTTCTTTCAAATCCACCA-3’。

3.根据权利要求1所述的一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89超表达载体的构建方法，其特征在于：如步骤六中所述插入位点的两侧设计引物对，该引物对分别为：SpbHLH89-F：5’-GCTCTAGAATGGATCCTCAT TCTACTATAA TGAGTGC-3’，SEQ ID NO：6所示，Flag-R：5’-TTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’ SEQ ID NO：7所示。

4.一种调控番茄耐旱性的转录因子SpbHLH89的应用，其特征在于，SpbHLH89基因通过影响渗透调节物质、ROS系统及氧化酶，从而使番茄抗旱性增高；所述转录因子SpbHLH89，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。