CN114836427A

CN114836427A - 一种培育apoaequorin转基因番茄的方法及其应用

Info

Publication number: CN114836427A
Application number: CN202210523208.6A
Authority: CN
Inventors: 刘训言; 滕一波; 刘璐璐; 苏孟柯; 李宁洁
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2022-08-02

Abstract

本发明公开一种培育apoaequorin转基因番茄的方法及其应用，包括如下步骤：(1)构建apoaequorin转基因番茄重组表达载体，包含apoaequorin编码基因(AQ)、35S启动子序列和卡那霉素抗性基因序列；(2)用重组表达载体转化番茄Micro‑Tom，得到F₀代；(3)将F₀代自交后获得F₁代，初步筛选出抗性株系，然后采用AQ片段做引物，PCR筛选阳性株；(4)将阳性F₁植株自交获得F₂代可表达apoaequorin的转基因番茄植株。本发明apoaequorin转基因番茄植株在番茄生长、发育及生物、非生物胁迫活体钙成像研究等方面中起到重要的作用，具有重要的理论价值和实际意义。

Description

一种培育apoaequorin转基因番茄的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种培育apoaequorin转基因番茄的方法及其应用，是一种培育可整株检测番茄胞内钙离子浓度的番茄材料的方法，特别涉及一种培育apoaequorin转基因番茄的方法，为番茄不同器官及整株活体检测胞内钙离子浓度提供一种新型方法，可用于生长、发育及其它生物、非生物胁迫钙浓度变化检测。

背景技术

钙离子作为普遍的第二信使在细胞信号转导过程中起着非常重要的作用，是植物体内转导多种生理过程的胞内胞外信号物质之一。在植物细胞中，Ca²⁺参与调节许多生理过程，能维持细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白的稳定性，参与胞内稳态和生长发育的调节过程，介导植物体内部和外部环境间的信号传递。发育和环境胁迫下，植物体内胞质钙离子浓度升高，传递至钙信号靶蛋白(如钙调素、钙依赖型蛋白激酶及钙调磷酸酶B类蛋白等，引起特异的生理生化反应)，这一系列钙信号调节、应答机制构成了植物的钙信号系统。

Apoaequorin(GI:155652in GenBank)是水母中发现的一种发光蛋白，由196个氨基酸组成，具有3个Ca²⁺结合的EF-hand结构。水母发光蛋白腔肠荧光素(coelenterazine)是一个分子量约400Da的疏水基团，它可以自由穿越细胞膜。Apoaequorin与氧分子和辅基腔肠荧光素(coelenterazine)三部分形成复合物Aequorin。Aequorin可以特异性结合游离钙离子，引起脱辅基水母发光蛋白和腔肠荧光素之间的共价键破裂，腔肠荧光素被氧化为coelenteramide，并释放出CO₂和一个质子，同时发出波长为469nm的蓝色荧光。这种发光强度与Ca²⁺浓度之间呈线性关系，因此能在整体水平上简便而快速通过显微成像仪器可以把这种光信号放大并记录下来。Aequorin作为检测钙离子新型探针来检测钙离子浓度的变化，可以避免细胞内的区域化或聚集，可以很轻松地特异结合于特定细胞或亚细胞结构的合适的调控元件或信号肽段，反应发射出来的光信号不依赖于任何光的激发，能消除自身荧光、光漂白和生物降解等问题。另外，腔肠素具有疏水性，易于通过细胞膜，极大地推动了人们对Ca²⁺在细胞信号转导过程中作用的认识进程。

转基因技术可以把一个外源基因转入植物体中，采用构建的转基因载体中启动子控制外源基因，最终使得其在植物体内可以像植物体的内源基因一样进行表达并稳定遗传。番茄是用于转基因的理想植物材料，遗传转化体系比较成熟，一般采用农杆菌介导的叶盘法获得转基因植株。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术的不足，提供一种培育apoaequorin转基因番茄的方法及其应用。该方法简单、直观，可稳定表达apoaequorin，获得的转基因植株可以直接进行叶片、根系甚至整株植株钙浓度变化的检测。

本发明所采用的技术方案是：

本发明的第一个目的是提供一种培育apoaequorin转基因番茄的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)水母荧光蛋白基因apoaequorin(AQ)，其核苷酸序列见SEQ ID NO：1，水母荧光蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO：2。

(2)构建apoaequorin双元表达载体

将AQ序列与经PstⅠ酶切的pDH51载体通过T4连接酶链接，验证获得外源片段方向正确的质粒pDH51-AQ；将质粒pDH51-AQ经EcoRI酶切获得包含花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、apoaequorin基因、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子的片段；将上述片段、卡那霉素抗性基因编码序列与经EcoRI酶切的pBIN19质粒连接，形成重组植物双元表达载体质粒pBIN19-AQ；植物双元表达载体pBIN19-AQ通过冻融法转化农杆菌LBA4404；

(3)用步骤(2)中的含有双元表达载体的农杆菌侵染转化番茄Micro-Tom，得到F0代；

(4)将F0代自交获得F₁代，卡那初筛后，符合3：1分离比的株系经过AQ片段引物PCR鉴定后获得阳性株系，自交获得F2代可表达apoaequorin的转基因番茄。

作为优选，所述含有双元表达载体的农杆菌侵染转化番茄Micro-Tom采用农杆菌介导的叶盘法。

本发明的第二个目的是提供一种apoaequorin转基因番茄，采用上述方法培育得到。

本发明的第三个目的是提供一种培育apoaequorin转基因番茄的质粒，包括apoaequorin编码基因、35s启动子及其终止子序列和卡那霉素抗性基因编码序列。

作为优选，所述质粒为pBIN19-AQ。

本发明的第四个目的是提供一种apoaequorin转基因番茄在各发育时期整株活体检测番茄胞内钙离子浓度上的应用。

本发明的第五个目的是提供一种非生物胁迫下检测番茄胞内钙离子浓度方法，在apoaequorin转基因番茄整株施加底物腔肠素，然后底物喷施12h后加入NaCl在显微成像仪器上把光信号放大并记录，获得钙成像图并通过钙浓度变化计算，获知番茄在盐胁迫下叶片及根系胞内钙离子浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明的apoaequorin转基因番茄可以稳定表达apoaequorin，重组表达载体中包含35s启动子和卡那霉素抗性，成功的转基因番茄可以采用卡那抗性筛选进行初筛，然后采用AQ上的片段(其正向引物见SEQ ID NO：3，反向引物见SEQ ID NO：4)进行进一步检测。

(2)本发明的apoaequorin转基因番茄能够在番茄各个器官和发育时期大量合成apoaequorin，简便快速测定钙离子浓度变化且对细胞无伤害，能够用于在根系、叶片甚至个体整体水平上对钙信号的研究，以阐明钙信号在番茄不同非生物胁迫过程中的作用。

(3)本发明的apoaequorin转基因番茄与既有的突变体番茄通过遗传育种，可以得到特定基因突变和钙信号异常的关系，在植物生长、发育和生物胁迫、非生物胁迫下信号通路及机制的阐明上有重要的意义。

附图说明

图1是可表达apoaequorin的重组表达载体的物理图谱。

图2是apoaequorin转基因番茄F0幼苗中AQ片段条带检测结果；其中：AQ为apoaequorin的重组表达载体质粒阳性对照；MicroTom为野生型植株阴性对照；AQ1-AQ6为农杆菌侵染的apoaequorin转基因番茄F0幼苗。

图3是apoaequorin转基因番茄不同生物胁迫下钙成像结果，其中(a)500mMSorbitol(干旱胁迫)处理后apoaequorin转基因番茄钙成像；(b)apoaequorin转基因番茄干旱胁迫叶绿素自发荧光成像；(c)800mM NaCl(盐胁迫)处理后apoaequorin转基因番茄钙成像；(d)apoaequorin转基因番茄盐胁迫叶绿素自发荧光成像。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

实施例1、培育表达apoaequorin转基因番茄

培育表达apoaequorin转基因番茄的方法，包括以下步骤：

(1)构建apoaequorin的双元重组表达载体

将克隆得到的分别加入XbaI位点的35S启动子序列与加入PstI位点的apoaequorin编码区片段一起插入到PMD19-T载体中，得到质粒PM19T-AQ。用XbaI和PstI消化质粒PMD19T-AQ，得到约1.6kb的片段。用XbaI和PstI消化质粒PBIN191，得到约11.5kb的片段；连接这两个片段，得到重组载体PBIN191-AQ。

所构建可表达apoaequorin重组载体的物理图谱如图1所示，包含35s启动子及其终止子序列，还有卡那霉素抗性基因编码序列，用于筛选转基因番茄。

(2)重组表达载体PBIN191-AQ转化番茄

植物双元表达载体pBIN19-DR1通过冻融法转化农杆菌LBA4404，用PCR筛选获得了含表达载体的重组农杆菌菌落并提取质粒。MicroTom番茄种子无菌萌发获得无菌苗，切取0.5cm下胚轴或0.4cm×0.6cm大小幼嫩子叶作为外植体，并置于芽再生培养基经28℃暗室预培养三天，农杆菌介导的叶盘法进行番茄遗传转化，采用含50mg/L Kana的筛选培养基筛选重组子，长出愈伤组织，直至形成植株并生根，获得F0代。

(3)转基因番茄的获得

将F0代转基因番茄采用PCR方法进行鉴定筛选，然后收种子后在卡那霉素培养基上进行初筛，后续在apoaequorin序列上设计引物，在转基因植株中使用AQ-L和AQ-R引物进行PCR扩增，筛选获得F1代，结果如图2所示，最终鉴定出表达apoaequorin的转基因番茄。再通过进一步传统的育种方法自交得到转基因番茄纯合体。

(4)转基因番茄钙成像鉴定

将稳定表达apoaequorin的转基因番茄种子点至10cm的圆盘中，9d后子叶刚刚长出后喷施底物腔肠素，然后底物喷施12h左右在显微成像仪器上把这种光信号放大并记录下来，结果如图3所示，表明已经获得稳定表达apoaequorin的转基因番茄，且能够进行干旱/盐胁迫下整株钙成像检测。根据图3能得知：500mM Sorbitol处理后，apoaequorin转基因番茄根系能够检测到荧光信号，显示出根系钙离子浓度的升高；喷施叶片表面活性剂(Silwet L-77)后，采用800mM NaCl处理，apoaequorin转基因番茄叶片也能够检测到荧光信号，显示出叶片钙离子浓度的升高，表明活体检测番茄胞内钙离子浓度的方法适用于非生物胁迫(干旱/盐)下叶片或根系甚至整株植株的钙离子浓度变化。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种培育apoaequorin转基因番茄的方法及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 672

<212> DNA

<213> 人工序列(apoaequorin)

<400> 1

ctttgcacca aaacaccaca tcaaatctcc agttgataaa ctaaatcgtc ccaacggcaa 60

caggccaaca tgaccagcga acaatactca gtcaagctta caccagactt cgacaaccca 120

aaatggattg gacgacacaa gcacatgttt aattttcttg atgtcaacca caatggaagg 180

atctctcttg acgagatggt ctacaaggcg tccgatattg ttataaacaa tcttggagca 240

acacctgaac aagccaaacg tcacaaagat gctgtagaag ccttcttcgg aggagctgga 300

atgaaatatg gtgtagaaac tgaatggcct gaatacatcg aaggatggaa aagactggct 360

tccgaggaat tgaaaaggta ttcaaaaaac caaatcacac ttattcgttt atggggtgat 420

gcattgttcg atatcattga caaagaccaa aatggagcta tttcactgga tgaatggaaa 480

gcatacacca aatctgatgg catcatccaa tcgtcagaag attgcgagga aacattcaga 540

gtgtgcgata ttgatgaaag tggacagctc gatgttgatg agatgacaag acaacattta 600

ggattttggt acaccatgga tcctgcttgc gaaaagctct acggtggagc tgtcccctaa 660

gaaactctgc gg 672

<210> 2

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列(apoaequorin)

<400> 2

Met Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Val Lys Leu Thr Pro Asp Phe Asp Asn

1 5 10 15

Pro Lys Trp Ile Gly Gly Arg His Lys His Met Phe Asn Phe Leu Asp

20 25 30

Val Asn His Asn Gly Arg Ile Ser Leu Asp Glu Met Val Tyr Lys Ala

35 40 45

Ser Asp Ile Val Ile Ile Asn Asn Leu Gly Ala Thr Pro Glu Gln Ala

50 55 60

Lys Arg His Lys Asp Ala Val Glu Ala Phe Phe Gly Gly Ala Gly Met

65 70 75 80

Lys Tyr Gly Val Glu Glu Thr Glu Trp Pro Glu Tyr Ile Glu Gly Trp

85 90 95

Lys Arg Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys Arg Tyr Ser Lys Asn Gln Ile

100 105 110

Thr Leu Ile Arg Leu Leu Trp Gly Asp Ala Leu Phe Asp Ile Ile Asp

115 120 125

Lys Asp Gln Asn Gly Ala Ile Ser Leu Asp Glu Trp Lys Ala Tyr Thr

130 135 140

Lys Ser Asp Gly Ile Ile Ile Gln Ser Ser Glu Asp Cys Glu Glu Thr

145 150 155 160

Phe Arg Val Cys Asp Ile Asp Glu Ser Gly Gln Leu Asp Val Asp Glu

165 170 175

Met Thr Arg Gln His His Leu Gly Phe Trp Tyr Thr Met Asp Pro Ala

180 185 190

Cys Glu Lys Leu Tyr Gly Gly Ala Val Pro

195 200

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(AQ)

<400> 3

aacaagccaa acgtcacaa 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(AQ)

<400> 4

tttcatcaat atcgcacact c 21

<210> 5

<211> 750

<212> DNA

<213> 35s 启动子(Unknow)

<400> 5

caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga 60

agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt 120

ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta 180

caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg 240

tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac 300

gtcttcaaag caagtggatt gatgtgataa catggtggag cacgacactc tcgtctactc 360

caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag 420

ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag 480

gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat 540

cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat 600

cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc 660

cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata 720

aggaagttca tttcatttgg agaggacacg 750

<210> 6

<211> 1026

<212> DNA

<213> 卡那霉素抗性基因编码序列(kanamycin)

<400> 6

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggcattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780

cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

gaatag 1026

Claims

1.一种培育apoaequorin转基因番茄的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)构建apoaequorin双元表达载体

将AQ序列与经PstⅠ酶切的pDH51载体通过T4连接酶链接，验证获得外源片段方向正确的质粒pDH51-AQ；将质粒pDH51-AQ经EcoRI酶切获得包含35S启动子、水母荧光蛋白基因AQ、35S终止子的片段；将上述片段、卡那霉素抗性基因编码序列与经EcoRI酶切的pBIN19质粒连接，形成重组植物双元表达载体质粒pBIN19-AQ；植物双元表达载体pBIN19-AQ通过冻融法转化农杆菌LBA4404；

(2)用步骤(1)中的含有双元表达载体的农杆菌侵染转化野生型番茄，得到F0代；

(3)将F0代自交获得F₁代，卡那霉素初筛后，符合3：1分离比的株系经过AQ片段引物PCR鉴定后获得阳性株系，自交获得可表达apoaequorin的F2代转基因番茄。

2.根据权利要求1所述的一种培育apoaequorin转基因番茄的方法，其特征在于：所述含有双元表达载体的农杆菌侵染转化番茄Micro-Tom，采用农杆菌介导的叶盘法。

3.一种apoaequorin转基因番茄，采用权利要求1或2所述方法培育得到。

4.一种培育apoaequorin转基因番茄的质粒，其特征在于包括apoaequorin编码基因、35s启动子及其终止子序列和卡那霉素抗性基因编码序列。

5.根据权利要求4所述的一种培育apoaequorin转基因番茄的质粒，其特征在于：所述质粒为pBIN19-AQ。

6.根据权利要求3所述的一种apoaequorin转基因番茄在不同非生物胁迫下叶片、根系甚至整株活体检测番茄胞内钙离子浓度上的应用。

7.一种不同非生物胁迫下检测番茄胞内钙离子浓度方法，其特征在于在权利要求3所述的一种apoaequorin转基因番茄植株喷施底物腔肠素，12h后加入山梨醇Sorbitol或NaCl，然后在显微成像仪器上放大光信号并记录下来，获得钙成像图并通过钙浓度变化计算，获知番茄在不同胁迫下胞内钙离子浓度变化。